Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN
Phát triển SCAR marker
(Sequence Characterized Amplified
Region) giống cà phê Robusta

Ngành học

: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Sinh viên thực hiện

: Nhóm 1 – DH21SHC

Niên khóa

: 2021 – 2025

TP. Thủ Đức, 10/2023

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

Phát triển SCAR marker
(Sequence Characterized Amplified Region)
giống cà phê Robusta

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. HUỲNH VĂN BIẾT

NGUYỄN THIÊN ÂN
LÊ THỊ KIỀU GIANG
PHAN TẤN PHÁT
CAO NGUYỄN BẢO ÂN

TP. Thủ Đức, 10/2023

2


MỤC LỤC
Trang

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU.........................................................................................5
1.1.

Đặt vấn đề..............................................................................................................5

1.1.

Mục tiêu báo cáo...................................................................................................6

1.2.

Nội dung thực hiện................................................................................................6

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................8
2.1. Tổng quan về cà phê Robusta..................................................................................8
2.1.1 Khái quát chung..................................................................................................8
2.2.1. Vị trí phân loại..................................................................................................8
2.1.3. Đặc điểm hình thái của cà phê Robusta..........................................................8
2.1.4. Thành phần cơ bản trong cà phê Robusta.....................................................9
2.2. Giới thiệu về một số hợp chất quan trọng trong cà phê Robusta........................9
2.2.1. Các Axit hữu cơ.................................................................................................9
2.2.2. Lipid – dầu trong cà phê...................................................................................9
2.2.3. Các Alcaloit (Caffein và Trigonelline).............................................................10
2.2.4 Chất khoáng......................................................................................................10
2.2.5. Protein trong cà phê........................................................................................10
2.2.6. Chất thơm trong cà phê....................................................................................11
2.3. Phân bố và đặc điểm thực vật học của cà phê Robusta.........................................11
2.3.1. Phân bố.............................................................................................................11
2.3.2. Đặc điểm thực vật học.....................................................................................11
2.2.1. Sự đa dạng sinh học.........................................................................................12
2.2.2. Đa dạng di truyền............................................................................................12
2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền...........................................12

2.3.1. Phương pháp sử dụng dấu hiệu hình thái.....................................................12
2.3.2. Phương pháp sử dụng chất đánh dấu isozyme.............................................12
2.3.3. Phương pháp sử dụng marker phân tử.........................................................13
2.4. Tổng quan về điểm đánh dấu SCoT......................................................................13
2.4.1. Khái niệm về điểm đánh dấu SCoT...............................................................13
2.4.2. Ứng dụng điểm đánh dấu SCoT.....................................................................13
2.5. Kỹ thuật tách chiết DNA thực vật.........................................................................14
2.5.1. phương pháp tách chiết DNA.........................................................................14
2.5.2. Phương pháp DNA định tính và định lượng.................................................14
2.6. Phân tích phát sinh loài..........................................................................................14
3


2.7. Tổng quan về điểm đánh dấu SCAR....................................................................15
2.7.1. Khái niệm về điểm đánh dấu SCAR..............................................................15
2.7.2. Ứng dụng điểm đánh dấu SCAR....................................................................15

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.................................................16
3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu....................................................................16

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................17
4.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước..........................................................17
4.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước...................................................................17
4.1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước...................................................................17

4


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước nơng nghiệp đang trên đà phát triển với nhiều loại
hình sản xuất. Ngồi cây lúa, cao su, điều… thì Việt Nam cịn là nước chú trọng
trong việc ni trồng và sản xuất cây cà phê. Cây cà phê đóng một vai trị vơ cùng
quan trọng trong sản xuất nơng nghiệp ở nước ta. Cà phê là một thức uống phổ biến
và ngày càng phát triển trên thế giới. Lượng tiêu thụ gần 9.012.540 tấn trên một
năm. Việt Nam là nước sản xuất Robusta lớn nhất thế giới. Theo các báo cáo trước
đây, diện tích trồng cà phê ở Việt Nam là 695.600 ha và sản lượng là 1,76 triệu tấn
vào năm 2020, trong đó khu vực Tây Nguyên chiếm khoảng 73% diện tích trồng và
sản lượng. Vì vậy, vùng này được mệnh danh là thủ đô trồng và sản xuất cà phê của
Việt Nam. Cây cà phê Robusta chỉ cần từ 3 đến 4 tuổi đã có thể bắt đầu thu hoạch.
Tuổi thọ của cây kéo dài từ 20 đến 30 năm.
Cà phê Robusta, còn được biết đến với tên gọi khác là cà phê Canephora.
Ở Việt Nam Robusta còn có tên gọi là cà phê Vối. Đây là một trong những loại cà
phê được bán phổ biến và được ưa chuộng ở thị trường Việt Nam. Cây cà phê
Robusta lần đầu tiên được phát hiện ở Congo những năm 1800. Sau đó, giống cây
này được tự nhiên hóa tại nhiều quốc gia như Borneo, Polynesia, Costa Rica,
Nicaragua, Jamaica,… Cây cà phê Robusta du nhập đến Đông Nam Á vào năm
1900 và được nhân giống, trồng trọt rộng rãi. Robusta cũng dần du nhập và được
trồng phổ biến tại Việt Nam. Các tỉnh trồng cà phê Robusta phổ biến nhất gồm có
Đăklăk, Đăk Nơng, Lâm đồng, Gia Lai với diện tích lên đến 90% trên tổng diện
tích canh tác cà phê. Những tỉnh nói trên ở Việt Nam sở hữu diện tích lớn đất đỏ
bazan trù phú. Loại đất này có độ tơi xốp cao, khả năng giữ nước tốt. Điều kiện khí
hậu, nhiệt độ, ánh sáng thuận lợi cũng góp phần giúp cây hấp thu dinh dưỡng tốt
hơn. Hằng năm, người ta lại thu hoạch sản lượng lớn hạt cà phê Robusta từ đây và
phân phối đến các tỉnh thành khác tại Việt Nam và trên thế giới. Chính vì thế, loại
cây này phát triển rất tốt và cho năng suất cao mỗi năm. Sản lượng Robusta
khoảng 30% sản lượng cafe của thế giới, trải khắp Tây và Trung Phi, Đông Nam

Á, các vùng của Nam Mỹ. Nền kinh tế sản xuất cà phê đã thay đổi trong những
năm gần đây, với giá trên thị trường quốc tế giảm và chi phí đầu vào tăng. Đồng
thời, nhu cầu về cà phê đặc sản đang ở mức cao nhất mọi thời đại. Để sản xuất cà
phê bền vững, cần chú ý cải thiện chất lượng cà phê bằng cách tham gia vào các
biện pháp canh tác bền vững, thân thiện với mơi trường, cuối cùng có thể thu được
lợi nhuận rịng cao hơn.
Sản xuất các kiểu gen có thuộc tính chất lượng cà phê được cải thiện là mục
tiêu chính của các chương trình cải tiến di truyền cà phê. Những tiến bộ trong bộ
gen là cung cấp các công cụ mới để phân tích chất lượng cà phê ở cấp độ phân tử.
Gần đây báo cáo về trình tự bộ gen của cà phê Robusta, Coffea canephora, là một
nghiên cứu quan trọng phát triển trong nghiên cứu cà phê. Với những tiến bộ trong
cơng nghệ gen và giải trình tự, khả thi để hiểu bộ gen cà phê và cơ chế di truyền
phân tử cơ bản chất lượng cà phê, từ đó giúp nâng cao hiệu quả của chương trình
nhân giống. Đánh giá này sẽ thảo luận về kiến thức hiện tại về di truyền của các hóa
sinh đó các hợp chất được coi là yếu tố quyết định chất lượng, được sử dụng làm
5


nền tảng cho nâng cao chất lượng cà phê bằng cách nhân giống. Nguồn gen sẵn có
cho việc nghiên cứu di truyền của các hợp chất sinh hóa có khả năng đóng vai trị
trong hương vị cà phê cũng sẽ được thảo luận. Ngoài ra, giá trị tiềm năng của việc
nghiên cứu di truyền cây cà phê chất lượng bằng cách sử dụng trình tự thế hệ tiếp
theo và phân tích di truyền liên kết sẽ được cải thiện được xem xét.
Những hạn chế về hóa học và hình thái, phương pháp xác thực bằng kính hiển vi đã
tạo ra nhu cầu về các phương pháp mới hơn trong việc kiểm sốt chất lượng các
cơng thức và thuốc thảo dược. SCAR, một điểm đánh dấu dựa trên PCR, đại diện
cho một locus xác định về mặt di truyền được xác định bằng cách khuếch đại DNA
bộ gen với một cặp mồi oligonucleotide cụ thể. Các điểm đánh dấu SCAR có thể
chứa số lượng bản sao cao và trình tự bộ gen đã cạn kiệt trong vùng được khuếch
đại. Do đó, chúng có giá trị trong các ứng dụng quy mơ lớn và dành riêng cho từng

địa phương như sàng lọc được hỗ trợ bằng điểm đánh dấu và nhân bản gen dựa trên
bản đồ. Điểm đánh dấu SCAR, được tạo từ các vùng đa hình có kích thước khác
nhau giữa các loài, cho phép xác thực mẫu dựa trên sự thay đổi kích thước SCAR.
Các dấu hiệu dựa trên DNA khác nhau viz. AFLP, SSR, ISSR và RAPD có thể
được sử dụng để tạo ra các điểm đánh dấu này. Tuy nhiên, độ tin cậy cao của dấu
SCAR có thể dẫn đến sự dịch chuyển của AFLP và các dấu hiệu dựa trên DNA
khác, tốn kém, mất thời gian và tẻ nhạt và sử dụng một số vật liệu phóng xạ trong
bước phát hiện. Ngoài ra, độ nhạy phát hiện cao và khả năng điện di có thể tránh
được làm cho nó trở thành một cơng cụ phân tử kinh tế. Như vậy, cho đến nay
SCAR marker dường như là công nghệ phù hợp nhất để xác thực dược liệu cổ
truyền. Đặc tính phân tử bằng các dấu hiệu SCAR cho phép xác định và phân biệt
các loại thảo mộc một cách hiệu quả và đáng tin cậy với các loại tạp chất và xác
định các loại thực phẩm cao cấp. Các lồi thực vật có hình thái tương tự nhau có thể
được phân biệt bằng cách sử dụng các dấu hiệu phân tử này. Khi điểm đánh dấu
SCAR được phát triển cho một lồi cụ thể, nó có thể được sử dụng để phát hiện các
công thức giống nhau và không đồng nhất được sử dụng trong hệ thống thuốc
truyền thống để xác thực các loại thuốc thảo dược truyền thống.
1.1. Mục tiêu báo cáo
Tìm hiểu về vật liệu và phương pháp phát triển SCAR marker (Sequence
Characterized Amplified Region) giống cà phê Robusta
1.2. Nội dung thực hiện

6


7


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cà phê Robusta

2.1.1 Khái quát chung
Cà phê Robusta (Coffea canephora) có tiếng là dịng cà phê có hương vị mạnh,
nồng đặc trưng. Điều làm cho vị cafe robusta khác biệt chính là hàm lượng caffeine
có trong hạt, hàm lượng này cao chiếm từ 3% – 4% khiến mùi vị cafe đậm đặc. Hạt
cà phê Robusta khi cịn ngun sẽ có mùi giống như hạt đậu phộng tươi, khi rang lên
sẽ thơm nồng và có vị đắng đặc trưng khiến người uống thấy sảng khoái, tinh thần
phấn chấn. Cà phê Robusta phù hợp để trồng trong điều kiện khí hậu nhiệt đới. Cây
thường được trồng ở độ cao dưới 1000m so với mực nước biển. Nhiệt độ lý tưởng
dao động từ 24 đến 29 độ C. Cây cà phê Robusta là loại cây ưa nước với yêu cầu
lượng mưa hàng năm trung bình trên 1000mm. Đặc biệt, so với cà phê thơng
thường, cây cà phê Robusta phải được trồng trong điều kiện ánh sáng thuận lợi
hơn.
So với các giống cà phê khác, Robusta có khả năng chống các loại sâu bệnh rất
tốt, năng suất cao, dễ chăm sóc. Tuy nhiên, Robusta có đặc điểm là chịu hẹn, chịu
lạnh kém, sản lượng không ổn định.
2.2.1. Vị trí phân loại
Cà phê Robusta là một lồi thực vật có hoa trong họ Thiến thảo. Lồi này dược
Pierre ex A.Froehner mô tả khoa học đầu tiên năm 1897.
 Giới:
Plantae
 Ngành

Angeosperma

 Lớp:

Asteridae

 Bộ:

Gentianales

 Họ:

Rubiaceae

 Chi:

Coffea

 Lồi:

C. Canephora

Hình 2.1 Hạt cà phê Robusta
2.1.3. Đặc điểm hình thái của cà phê Robusta
Đặc điểm của loại cà phê này chính là có quả hình trịn, hạt cà phê Robusta
thường nhỏ hơn loại cà phê khác, có hình bầu dục hoặc tròn với phần rãnh ở giữa
thường là đường thẳng, nhân nhỏ hơn cà chè và cà mít. Thường có 2 nhân trong
mỗi quả. Hàm lượng caffein 2-4% nhưng ít thơm, khi uống có vị chát và đắng gắt.
Cây Robusta là dạng cây bụi kích thước lớn, phát triển tốt ở độ cao khoảng 0 –
800m so với mặt nước biển. Do đó, loại cây này rất phù hợp với điều kiện địa hình
và khí hậu Việt Nam. Lá cà phê Robusta thường to, cây phát triển nhanh, tán
rộng, Mật độ trồng thưa hơn (2,5 – 3,5m). Cây trưởng thành hoang dã có thể cao
8


đến 8m, còn trong canh tác thường chỉ để từ 2-2,5m. Cây thân gỗ dạng bụi, cành
nhánh phát triển mạnh. Những cây lâu năm thường có nu, chu vi gốc lên đến 80100cm. Lá hình ơ van dài từ 15-22cm, rộng 10-14cm, mép lá thường gợn sóng,
phiến lá xanh đậm và bóng.

2.1.4. Thành phần cơ bản trong cà phê Robusta
Về mặt hóa học, cà phê rất phức tạp và thành phần chính xác của nó phụ thuộc
vào nhiều yếu tố như giống, điều kiện rang, xay và ủ. Sự biến đổi của cà phê được
nhấn mạnh bởi một n ghiên cứu gần đây đã phân tích thành phần hóa học của hạt
cà phê bao gồm:
Hàm lượng lớn nhất là hàm lượng carbohydrate khơng hịa tan chiếm 34-44%
(trong đó bao gồm Hemicelluloses chiếm 3-4% và Xenluloza, β (1-4) mannan
chiếm 32-40%). Kế tiếp là Lipid với hàm lượng 8-12% (trong đó bao gồm sáp
chiếm 0.2 – 0.3% và dầu chiếm 8-11.7%). Hàm lượng Cảbonhydrate hịa tan cũng
chiếm tỉ lệ khơng nhỏ 6-11.5% (hỗn hợp bao gồm Monosaccharid 0.2-0.5%,
Oligosaccharides 3-7% và Polysaccharid 3-4%). Bên cạnh đó, cà phê Robusta cịn
các thành phần Axit và Phenol, hỗn hợp này bao gồm Axit không bay hơi chiếm
1.3-2.2% và Axit Chlorogenic chiếm 7.1-12.1%. Cung các hợp chất chưa nitơ bao
gồm Axit amin tự do 0.2-0.8%, protein 7.5-9.5%, Caffeine 1.7-4%, Trigonelline
0.3-0.9% và khoáng chất 3.0-5.4%.
Cà phê Robusta thường chứa một lượng caffeine cao, hàm lượng này cao chiếm
từ 3% – 4% khiến mùi vị cafe đậm đặc.
2.2. Giới thiệu về một số hợp chất quan trọng trong cà phê Robusta
2.2.1. Các Axit hữu cơ
Thành phần axit trong cà phê bao gồm một tập hơp khoảng hơn 30 loại axit hữu
khác nhau, với một số loại axit quan trọng như: Axit Acetic, axit Citric, axit
Chlorogenic, axit Phosphoric.. Các axit hữu cơ này góp phần tạo nên đặc
tính Acidity (độ chua) của cà phê. Thành phần, và hàm lượng axit trong cà phê phụ
thuộc vào giống cà phê đồng thời thay đổi liên tục trong quá trình chế biến, mà
phần lớn là trong quá trình lên men, và rang cà phê. một số loại axit sẽ mất đi đáng
kể, một số loại khác lại được sinh ra.
2.2.2. Lipid – dầu trong cà phê
Lipid hay gọi đơn giản chất béo, đóng một vai trị quan trọng trong chất lượng tách
cà phê bạn, chủ yếu bao gồm triacylglycerol, sterol và tocopherols (vitamin E).
Hàm lượng lipid trong cà phê khác nhau tùy thuộc vào giống lồi. Thơng

thường Arabica chứa nhiều lipit hơn so với người anh em Robusta, trung bình lần
lượt là 15-17% và 10-11,5%
2.2.3. Các Alcaloit (Caffein và Trigonelline)
Hạt cà phê có chứa một số loại alkaloids (một hợp chất hữu cơ có chứa ít nhất một
ngun tử nitơ) bao gồm, Caffeine, Putrescine, Theophylline, Trigonelline. Trong
số này, Caffeine có trong cả cà phê và trà, nhưng Trigonelline chỉ có trong cà phê là
9


hai alkaloids chính được biết đến như một chất kích thích ở người và làm nên sự
yêu thích đối với cà phê của chúng ta.
Caffeine (còn được gọi là trimethylxanthine), một alkaloid có thể là lý do khiến
bạn thích uống cà phê. Ancaloit có tác dụng kích thích thần kinh trung ương làm
tăng sự tỉnh táo, chúng có hương vị đắng ở dạng tinh khiết. Caffeine góp phần tạo
nên sức mạnh tổng thể và vị đắng là đặc trưng của cà phê. Tùy thuộc vào loài và
giống, caffeine chiếm từ 0,6 đến 4% khối lượng hạt. Đồng thời, trái với niềm tin
chung, q trình rang khơng làm giảm hàm lượng caffeine trong hạt. Trong quả cà
phê, Caffeine có vai trị là một chất chống cơn trùng, Hàm lượng Caffeine trung
bình trong Cà phê Robusta cao hơn so với cà phê Arabcia nên khả năng chống chịu
sâu bệnh cũng tốt hơn. Mặc dù được nhiều nghiên cứu công nhận là lành tính, và
khơng tác động xấu đến sức khỏe, Song liều lượng sử dụng Caffeine cũng khác
nhau với mỗi người tùy thuộc vào cơ địa, mức độ mẫn cảm.
Trigonelline là một alkaloid khác được tìm thấy trong hạt cà phê ở nồng độ thấp
hơn một chút so với caffeine. Nó bắt đầu bị phân hủy ở 60°C nên trong quá trình
rang (nóng hơn 200°C), hơn một nửa lượng trigonelline bị biến chất và tạo ra một
số hợp chất, bao gồm cả axit nicotinic, hay được gọi là vitamin B3, phần còn lại
của trigonelline khi đi vào chiết xuất tạo ra mùi thơm ngọt, caramel và mùi đất.
2.2.4 Chất khống
Khơng thể khơng kể đến một lượng rất nhỏ các chất khống có trong cà phê, gồm
khoảng 3-5% chủ yếu là Kali, Nito , Magie , Photpho, Clo. Ngồi ra cịn có các chất

nhôm, sắt, đồng, lưu huỳnh, chỉ tồn tại dạng vêt. Những chất này ảnh hưởng không
tốt đến mùi hương cà phê. Chất lượng cà phê càng cao thì khống chất càng thấp và
ngược lại.
2.2.5. Protein trong cà phê
Hàm lượng protein trong cà phê khơng cao nhưng đóng vai trị quan trọng giúp hình
thành hương vị của cà phê trong quá trình rang qua phản ứng Maillard với các loại
đường có trong cà phê. Bằng các phương pháp định tính người ta nhận thấy trong
thành phần protein có những axit amin chính
như: cystein, alanie ,phenylalanine, histidine, leucine, lysine, derine..
Các axit amin này ít thấy ở dạng tự do, chúng được giải phóng ra và tác dụng với
nhau hoặc tác dụng với những chất tạo mùi và vị cho cà phê rang.Trong các chất
axit amin kể trên đáng chú ý nhất là những axit amin có chứa lưu huỳnh như
cystein , methionine và proline… chúng góp phần tạo hương đặc trưng của cà
phê sau khi rang. Đặc biệt , methionine và proline có tác dụng làm giảm oxy hóa
các chất thơm, làm cho cà phê rang giữ được mùi vị khi bảo quản.
2.2.6. Chất thơm trong cà phê
Các thành phần của phần này khơng có chung một đặc tính hóa học, nhưng đặc tính
vật lý là dễ bay hơi. Đây là nguyên nhân tạo ra phần lớn hương thơm của cà phê và
thường đến từ các phản ứng trong quá trình rang, nhưng việc bảo quản cũng có thể
ảnh hưởng đến chúng. Việc nghiên cứu tất cả các hợp chất này là một công việc
phức tạp và vẫn đang được tiến hành, vì có hơn 1000 hợp chất dễ bay hơi được tìm
thấy trong một tách cà phê điển hình. Chúng dễ bay hơi theo tên gọi và bản chất –
chúng có xu hướng bay đi trước khi có thời gian để đo lường chúng. Trong cà phê
hàm lượng chất thơm rất nhỏ, nó được hình thành và tích lũy trong hạt. Sự tích lũy
chịu nhiều yếu tố như đất đai, khí hậu và nhất là chủng loại cà phê. Sự tích lũy chất
thơm trong hạt nói riêng và cấu trúc hương vị cà phê chịu ảnh hưởng rất lớn bởi độ
cao, vì vậy các loại cà phê được trồng càng cao, thì phẩm chất hạt càng tốt hơn
10

2.3. Phân bố và đặc điểm thực vật học của cà phê Robusta
2.3.1. Phân bố
Hoạt động canh tác Robusta đã được bắt đầu vào đầu thế kỷ 19 – như đã nêu trên –
vì những thiệt hại đáng kể do CLR gây ra đối với các đồn điền C. rabica ở châu Á.
Theo các tài liệu đáng tin cây (Charrier and Eskes, 1997), cà phê Robusta đã được
mang đến Java, Indonesia vào năm 1901 Cộng hòa Dân chủ Congo (Cộng hịa
Congo). Những cây Robusta này đã nhanh chóng có mặt tại Châu Phi và được
những người nông dân châu Phi đầu tiên chấp nhận nhờ sức sống, năng suất và khả
năng chống lại CLR. Đồng thời, một số loài haong dã khác của Robusta
như Kouillou, Maclaudi & Game, Niaouli hoặc Coffea ugandae cũng được triển
khai ở các quốc gia khác nhau như Bờ biển Ngà, Guinea, Togo hoặc Uganda, tương
ứng.
Từ sau những năm 1960, các đặc dịng nhân giống vơ tính mới của Robusta đã
được phát triển ở Uganda, Congo, và sau đó ở Bờ Biển Ngà. Tuy nhiên, khơng có
nhiều thay đổi về tính so với các cây ban đầu. Ngày nay, chỉ có một số quốc gia tiếp
tục với chương trình tuyển chọn cho thương mại, với một số cải thiện. Điển hình là
ở Bờ Biển Ngà – Nơi năng suất được tăng từ 30% đến 110% và kích cỡ hạt tăng
50%. Một số giống mới cũng được phát triển ở Brazil nơi nó được gọi là Conillon.
2.3.2. Đặc điểm thực vật học
Ngay cả khi một số cây cà phê được tìm thấy ở nơi cách mực nước biển lên đến
2300m, thì hầu hết các lồi (67%) đều thích nghi với phạm vi giới hạn độ cao dưới
1000m. Và Robusta là điển hình trong nhóm “dễ thích nghi” đó, nên chúng được
trồng ở các khu vực thấp hơn Arabica (chỉ trong tầm 0 – 800m). Bù lại Robussta
yêu cầu lượng mưa khá lớn (từ 1200 – 2500mm) do đó, hầu hết các lồi có phân bố
rộng ở lục địa châu Phi (tức là C. canephora, C. eugenioides) thường được tìm thấy
trong mơi trường ẩm ướt.
Cà phê Robusta có một số ưu điểm nổi trội so với cây cà phê Arabica như khả
năng chống bệnh gỉ sắt (Coffee Leaf Rust), sâu đục thân, các bệnh tuyến trùng,.. và
cho năng suất cao hơn cà phê Arabica nhiều. Vì những lý do này, chi phí trồng
Robusta tương đối thấp so với giống Arabica. Mặt khác, khơng có khả năng chịu

đựng các điều kiện hạn hán kéo dài, chịu lạnh kém (nhiệt độ tối thích trong khoảng
(18 – 36oC), sản lượng khơng ổn định so với Arabica, đây là một số thuộc tính tiêu
cực của cà phê Robusta.
2.2.1. Sự đa dạng sinh học
Thuật ngữ "đa dạng sinh học" dùng để chỉ sự đa dạng và phong phú của các dạng
sống hiện tại trên Trái đất. Quỹ Động vật Hoang dã Thế giới (WWF) (2022), một tổ
chức chuyên bảo tồn động vật hoang dã, đã định nghĩa đa dạng sinh học như sau:
“Đa dạng sinh học là tất cả các dạng sống khác nhau mà bạn sẽ tìm thấy trong một
khu vực - sự đa dạng của động vật, thực vật, nấm , và thậm chí cả các vi sinh vật
như vi khuẩn tạo nên thế giới tự nhiên của chúng ta. Mỗi loài và sinh vật này phối
hợp với nhau trong hệ sinh thái, giống như một mạng lưới phức tạp, để duy trì sự
cân bằng và hỗ trợ sự sống”. Tổng hợp các gen, loài và hệ sinh thái được gọi là đa
dạng sinh học. Khi các loài khác biến mất, những lồi mới xuất hiện trong mơi
trường sinh thái mới do sự thay đổi tiến hóa đang diễn ra.
2.2.2. Đa dạng di truyền
Mỗi người đều có một bộ gen riêng và sự đa dạng về bộ gen là kết quả của sự
đa dạng này. Sự thay đổi nhỏ nhất trong các alen của gen có thể gây ra sự khác biệt
về sinh lý ở mỗi đồng tử. Các giống cây trồng và vật nuôi lai từ các bộ gen được
11


chọn có thể tạo ra cây giống và vật ni có năng suất cao có khả năng kháng sâu
bệnh. Sự tái tổ hợp xảy ra trong quá trình sinh sản hữu tính dẫn đến sự gia tăng kiểu
gen của các cá thể trong quần xã. Các kiểu gen dị hợp tử xuất hiện trong quần thể là
kết quả của các gen đa hình. Các cá thể trong quần thể có kiểu gen khác nhau làm
cho quần thể này có khả năng thích ứng tốt hơn với những thay đổi của mơi trường
( Vedantu ). Mỗi lồi cần có sự đa dạng di truyền để đảm bảo khả năng sinh sản,
khả năng chống chịu bệnh tật và khả năng thích ứng với các điều kiện môi trường
luôn thay đổi. Việc bảo tồn nguồn gen là cần thiết không chỉ để tránh sự tuyệt
chủng của một lồi mà cịn ngăn ngừa sự mất mát các gen, phức hợp gen và kiểu

gen, thậm chí là tránh sự tuyệt chủng của các giống địa phương. Tiềm năng di
truyền của loài này bị suy giảm đáng kể và trong những tình huống khắc nghiệt, lồi
sẽ bị tuyệt chủng do nguồn gen của chúng bị suy giảm nghiêm trọng đến mức một
số gen và một số phức hợp gen có thể bị mất.
2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền
2.3.1. Phương pháp sử dụng dấu hiệu hình thái
Bằng cách sử dụng các biểu hiện hình thái, người ta có thể xác định được sự
đa dạng di truyền. Gen biểu hiện tính di truyền sẽ liên quan đến một đặc điểm hình
thái có thể phát hiện được; do đó, nó có thể được gọi là gen đánh dấu. Tuy nhiên, số
lượng các chỉ tiêu hình thái xuất hiện trong tự nhiên cũng rất hạn chế, chưa đáp ứng
được nhu cầu của nhiều chương trình nhân giống và chỉ tồn tại ở một giai đoạn phát
triển cụ thể của cá thể hoặc ở quy mô hình thái. Các dấu hiệu hình thái ít được
mong muốn hơn trong việc cải thiện giống vì biểu hiện của chúng bị kiểm sốt bởi
các yếu tố mơi trường.
2.3.2. Phương pháp sử dụng chất đánh dấu isozyme
Isozyme là các protein trải qua phản ứng enzyme giống nhau nhưng có điện di
khác nhau. Bằng cách sử dụng điện trường đồng nhất và một khoảng thời gian cụ
thể, điện di được sử dụng để đánh giá độ linh động của protein. Điện di có thể được
sử dụng để phân biệt các protein đột biến có điện tích khác nhau do chúng di
chuyển theo nhiều cách khác nhau. Kích thước và sự biến đổi cấu trúc của các phân
tử protein thể hiện rõ ở sự khác biệt này. Do đột biến từ alen này sang alen khác, nó
thường liên quan đến việc thay thế một axit amin trong phân tử protein. Mặc dù việc
sử dụng chỉ thị isozyme đã cải thiện việc nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng số
lượng chỉ thị isozyme vẫn chưa đủ và chưa đạt yêu cầu để đáp ứng nhu cầu nghiên
cứu.
2.3.3. Phương pháp sử dụng marker phân tử
Cho rằng chúng có số lượng nhiều hơn nhiều so với các dấu hiệu isozyme và
các dấu hiệu hình thái, các dấu hiệu phân tử đã được chứng minh là có ý nghĩa hơn
về lâu dài (Tanksley và cộng sự, 1980). Về cơ bản, điểm đánh dấu phân tử là bất kỳ
chuỗi mã hóa DNA nào giúp phân biệt giữa hai cá thể, họ hoặc lớp riêng biệt. Chỉ

thị dựa trên kỹ thuật lai DNA (DNA – DNA hydridizationbased ) và chỉ thị dựa trên
kỹ thuật PCR bao gồm hai nhóm chỉ thị phân tử chính. Các dấu hiệu phân tử có một
số ưu điểm so với các dấu hiệu hình thái và isozyme, bao gồm khả năng đo trực tiếp
vật liệu di truyền, sự hiện diện của nhiều chỉ số trong quần thể và thực tế là phép đo
không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường hoặc các giai đoạn phát triển.

12


2.4. Tổng quan về điểm đánh dấu SCoT
2.4.1. Khái niệm về điểm đánh dấu SCoT
nhắm mục tiêu mã khởi đầu ( SCoT ) là các điểm đánh dấu trội và có thể tái
tạo, có nền tảng từ vùng được bảo tồn ngắn của các gen thực vật bao quanh codon
khởi đầu (hoặc khởi đầu) dịch mã ATG và có một mồi 18 mer duy nhất trong phản
ứng chuỗi polymerase (PCR) . Phương pháp được mô tả ở trên phù hợp với một số
lượng đáng kể các phịng thí nghiệm nghiên cứu thực vật với thiết bị thơng thường
vì nó cho phép hiển thị các dấu hiệu bằng cách sử dụng điện di và nhuộm trên gel
agarose. Khả năng sử dụng trực tiếp các dấu SCoT trong các chương trình nhân
giống được hỗ trợ bằng dấu hiệu trở nên khả thi nhờ tỷ lệ tái tổ hợp giữa các dấu
SCoT và gen/tính trạng thấp hơn so với các dấu ngẫu nhiên như RAPD, ISSR hoặc
SSR. (David J. Mackill & Bertrand CY Collard, 2008).
2.4.2. Ứng dụng điểm đánh dấu SCoT
Một số loài thực vật như lúa, tritordeums , mía, nho, khoai tây, xoài, myrica
rubra, đậu phộng và garbanzo đã đạt được lợi thế từ việc ứng dụng chỉ thị SCoT để
đánh giá sự đa dạng và cấu trúc di truyền, xác định giống cây trồng, lập bản đồ tính
trạng định lượng. loci (QTL) và dấu vân tay DNA.
Atika Agarwal và các đồng nghiệp của cô đã phát hiện ra nhiều loại giống hoa
hồng ở Ấn Độ vào năm 2017 về màu sắc, hình dạng và kích thước do các giống này
trải qua quá trình nhân giống khác nhau. Hơn nữa, sự phân bố địa lý và tính đa bội
cũng khiến việc nghiên cứu và chọn lọc giống hoa hồng trở nên khó khăn hơn. Để

mô tả và xác định sự khác biệt di truyền của 29 giống hoa này, họ đã tiến hành
nghiên cứu sử dụng chỉ thị SCOT trên 29 giống hoa. Điều này dẫn đến kết luận rằng
chỉ số SCOT có mức độ cao hiệu quả trong việc hỗ trợ cải tiến giống hoa hồng
thơng qua phân tích đa hình, giúp nâng cao hiệu quả kinh tế.
Ứng dụng chỉ thị phân tử SCOT (Start Codon Targeted) để đánh giá đa dạng di
truyền các giống xoài (Mangifera) trồng ở Duyên hải Nam Trung Bộ và Nam Bộ là
trọng tâm nghiên cứu của Lê Thị Thanh Nga năm 2019 tại Khoa Công nghệ sinh
học trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trường đại học. Ứng dụng chỉ thị phân tử
SCOT (Start Codon Targeted) để đánh giá đa dạng di truyền các giống xoài
(Mangifera) sản xuất ở vùng duyên hải Nam Trung Bộ và Nam Bộ là trọng tâm của
Lê Thị Nghiên cứu của Thanh Nga năm 2019 tại Khoa Công nghệ sinh học trường
Đại học Nguyễn Tất Thành.
Kết quả là DNA từ 30 giống xoài khác nhau đã được chiết xuất và 22 mồi
SCOT đa hình đã được chọn và khuếch đại. Đánh giá di truyền của hơn 30 loài
xoài. Cây phát sinh chủng loại lồi được xây dựng và phân thành hai nhóm: giống
xồi địa phương và giống có tiềm năng xuất khẩu (Mai, 2020).
2.5. Kỹ thuật tách chiết DNA thực vật
2.5.1. phương pháp tách chiết DNA
Bước đầu tiên trong mọi nghiên cứu hoặc ứng dụng sinh học phân tử là đạt
được độ tinh khiết và lượng axit nucleic thích hợp cho các xét nghiệm. Mục tiêu
chính của phương pháp chiết xuất axit nucleic là thu được các phân tử này ở dạng
ngun vẹn nhất có thể mà khơng cần tạo ra các tác nhân cơ học để phá vỡ chúng.
Có ba bước cơ bản liên quan đến quá trình tách DNA từ tế bào thực vật:
Bước 1: Vỡ màng tế bào. Trong hầu hết các trường hợp, đệm chiết được trộn với
nhau trong khi nghiền tế bào hoặc mô. Màng tế bào và nhân sẽ bị hỗn hợp này làm
13


sập , đồng thời sẽ phân hủy các protein gắn DNA và giải phóng DNA ra mơi trường
xung quanh.

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là protein. Protein và
polysacarit có thể được tạo phức trong dung dịch CTAB/NaCl trước khi kết tủa.
Protein sẽ bị biến tính bởi phenol và cloroform. Cloroform cịn hỗ trợ thêm trong
việc tách các pha hữu cơ và nước. Trong quá trình chiết xuất, rượu isoamyl ngăn
ngừa sự tạo bọt. Sau khi ly tâm, các protein bị biến tính, khơng hịa tan trong pha
nước có chứa axit nucleic, tạo thành một lớp giữa pha nước và pha hữu cơ.
Bước 3: Kết tủa DNA. Có hai cách điển hình để xảy ra hiện tượng mưa. Ethanol
tuyệt đối lạnh được sử dụng để kết tủa. DNA trọng lượng phân tử thấp có thể được
loại bỏ bằng cách kết tủa trong isopropanol vì chúng không kết tủa. Kết tủa tiếp
theo phải được rửa trong etanol 70° để loại bỏ muối còn lại, cặn isopropanol và vết.
2.5.2. Phương pháp DNA định tính và định lượng
Một số kỹ thuật, bao gồm đo mật độ quang học và quang phổ kế, đã được sử
dụng để phân tích DNA thu thập được cả về mặt định tính và định lượng.
Định lượng dựa trên máy đo quang phổ: Kỹ thuật này cho phép ước tính nồng độ
tương đối của axit nucleic trong mẫu sau khi chiết. Dựa trên mối tương quan, mật
độ quang học của các mẫu ở bước sóng 260 nm cho phép ước tính nồng độ axit
nucleic trong mẫu: Đối với dung dịch chứa DNA và RNA chuỗi đơn, nồng độ là 40
ng/l, trong khi dung dịch chứa DNA chuỗi kép là 50ng/l. Một giá trị bổ sung
OD280 nm được đo để xác định độ tinh khiết của dung dịch. DNA tinh khiết có tỷ
lệ OD260/OD280 là 1,8, trong khi RNA tinh khiết có tỷ lệ OD260/OD280 là 2.
Máy quang phổ UVS-99 cho phép kiểm tra chính xác các mẫu cực nhỏ khi đo
DNA. Cả hai phép đo UV và VIS đều có thể thực hiện được bằng máy quang phổ
UVS-99. Thể hiện phạm vi đo quang phổ rộng.
2.6. Phân tích phát sinh lồi
Tất cả các kỹ thuật nghiên cứu đa dạng quần thể đều dẫn đến dữ liệu phân tử
bảng điện di cực kỳ phức tạp. Theo phương trình Nei, các thơng số về đa dạng kiểu
gen, đa dạng kiểu hình và khoảng cách gen giữa các quần thể đã được xác định.
Trước tiên, chúng ta cần hiểu một số thuật ngữ liên quan đến cây phát sinh gen để
cung cấp thông tin cần thiết để hiểu và giải thích cây phát sinh gen trước khi tìm
hiểu cách chọn phương pháp và phần mềm thích hợp. Các thuật ngữ này có ý nghĩa

như sau: cùng một điểm (để biểu thị các cá nhân, còn được gọi là OTU), điểm giữa
(để phân loại hoặc biểu thị tổ tiên của một cá nhân), nhánh (để biểu thị cách các cá
nhân hiện có liên hệ với tổ tiên của họ), độ dài nhánh (để thể hiện thời gian tiến hóa
của lồi) và rễ (để thể hiện tổ tiên chung của tất cả các cá thể có trong cây phát sinh
lồi).
Có rất nhiều cách để vẽ một cây phát sinh gen. Có thể vẽ cây phát sinh chủng loại
với thời gian tiến hóa được hiển thị ở bên cạnh cành hoặc có chiều dài nhánh tương
ứng với thời gian tiến hóa. Có thể vẽ cây phát sinh chủng loại có hoặc khơng có rễ.
Hiện nay, UPGMA và Neighbor-joining là hai phương pháp được sử dụng thường
xuyên nhất. Cả hai phương pháp đều sử dụng ma trận khoảng cách gen và độ tương
tự bộ gen giữa các quần thể để tạo ra cây tiến hóa. Hiện nay, UPGMA và Neighborjoining là hai phương pháp được sử dụng thường xuyên nhất. Cả hai phương pháp
đều sử dụng ma trận khoảng cách gen và độ tương tự bộ gen giữa các quần thể để
tạo ra cây tiến hóa. UPGMA: Sử dụng ma trận được cung cấp, thuật toán sẽ ghép
nối hai đơn vị tiến hóa bất kỳ với khoảng cách gần bằng hoặc bằng khoảng cách
14


giữa hai OTU. Sau đó, cặp đơn vị tiến hóa này được coi là OTU mới. Cuối cùng,
UPGMA sẽ tạo ra một cây tiến hóa có rễ. Nguyên tắc đằng sau cách tiếp cận này là
rút ngắn cây tiến hóa thơng qua việc tìm kiếm những cây lân cận có vẻ hợp lý nhất.
2.7. Tổng quan về điểm đánh dấu SCAR
2.7.1. Khái niệm về điểm đánh dấu SCAR
Các vùng khuếch đại đặc trưng trình tự (SCAR) được phát triển dưới dạng các
dấu hiệu di truyền dựa trên PCR. Khi một đoạn DNA bộ gen ở một locus xác định
về mặt di truyền được khuếch đại bằng PCR sử dụng một cặp mồi oligonucleotide
nhất định, kết quả được gọi là SCAR. Bằng cách nhân bản và giải trình tự hai đầu
của sản phẩm khuếch đại của các dấu phân tử cụ thể , SCAR có thể được tạo ra. Khi
sử dụng nhiệt độ ủ cao, trình tự này được sử dụng để tạo ra các cặp mồi
oligonucleotide 24 mer dẫn đến sự khuếch đại có khả năng tái tạo của các locus đơn
lẻ. SCAR có một số ưu điểm so với các dấu hiệu chính, bao gồm khả năng chuyển

đổi thành các dấu hiệu đồng trội, khả năng phát hiện một locus và khả năng khuếch
đại ít nhạy hơn với các trường hợp phản ứngv . I. Paran * và RW Michelmore 1992
2.7.2. Ứng dụng điểm đánh dấu SCAR
Họ đã phát triển các dấu hiệu SCAR dành riêng cho loài, dựa trên trình tự ITS2,
tạo ra các bộ khuếch đại dưới 200 bp với mục đích tạo ra các phương pháp nhanh
chóng và đáng tin cậy để phát hiện di truyền của Zanthoxyli đích thực.
Pericarpium . Các dấu hiệu SCAR dành riêng cho lồi được phát triển, dựa trên
trình tự ITS2 , tạo ra các bộ khuếch đại dưới 200 bp với mục đích tạo ra các phương
pháp nhanh chóng và đáng tin cậy để phân loại di truyền Zanthoxyli chính xác
Pericarpium . Những dấu hiệu này được sử dụng để phát triển các kỹ thuật xét
nghiệm PCR thông thường và thời gian thực có thể phân biệt các mẫu ở cấp độ loài.
Họ xác nhận rằng một số sản phẩm thảo dược bị nhiễm Z. armatum đang được bán
ở thị trường Hàn Quốc và Trung Quốc với tên gọi Zanthoxyli Pericarpium và đánh
giá khả năng của chất đánh dấu SCAR trong việc xác thực dầu ăn và thuốc thảo
dược. Các dấu hiệu SCAR và kỹ thuật PCR được trình bày ở đây là những công cụ
hiệu quả để ngăn ngừa sự tạp nhiễm và đảm bảo chất lượng ổn định của thực phẩm
chế biến và thuốc thảo dược.

15


CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Phương pháp
Nội dung 1: Tìm ra band đa hình dựa trên chỉ thị SCoT
Ly trích DNA theo phương pháp của Doyle & Doyle (1987) có hiệu chỉnh
Đo OD
PCR với 10 chỉ thị ScoT
Điện di trên gel Agarose và phát hiện band khác biệt
Nội dung 2: Tạo dòng đoạn DNA đa hình

Thu hồi và tinh sạch các đoạn khuếch đại từ Agarose gel bằng Gel Extraction Kit
Sản phẩm DNA được tạo dòng bằng vector pJET1.2/blunt và biến nạp vào tế bào
Escherichia coli TOP10 theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Khuẩn lạc dương tính được xác định bằng PCR( dùng phương pháp biến nạp và
khả nạp)
Nội dung 3: Xác định trình tự band đa hình Tách plasmid và gửi giải trình tự đoạn
đặc hiệu
Nội dung 4: Thiết kế cặp primer dựa trên trình tự nhận được
Sử dụng các ứng dụng sinh tin chuyên dùng thiết kế primer dựa trên trình tự nhận
được
Nội dung 5: Kiểm tra xác định độ đặc hiệu của cặp primer
Xây dựng quy trình PCR cho SCAR primer thiết kế
Kiểm tra độ đặc hiệu của SCAR primer trên cà phê robusta

16


CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước
4.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Cùng với việc xác thực danh tính lồi, việc dự đốn nồng độ các chất thực vật
có hoạt tính có thể cần thiết để kiểm soát chất lượng trong việc sử dụng nguyên liệu
thực vật cho mục đích dược phẩm. Việc phát triển các dấu hiệu SCAR có thể tương
quan giữa dữ liệu dấu vân tay DNA với số lượng dấu hiệu hóa học thực vật được
chọn liên quan đến loại dược liệu cụ thể đó sẽ có ứng dụng rộng rãi trong việc kiểm
sốt chất lượng ngun liệu thơ. Những điểm đánh dấu được thiết kế này sẽ hoạt
động như một cơng cụ định tính/định lượng
4.1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước
So với các dấu hiệu phân tử thơng thường, SCAR đã được chứng minh là đơn giản
hơn, có khả năng tái tạo cao hơn và đáng tin cậy hơn khi được sử dụng để nhận

dạng thực vật ở cấp độ nội bộ và/hoặc liên loài. Ngoài ra, SCAR khơng u cầu
đồng vị phóng xạ và chỉ phát hiện một locus duy nhất, cho thấy SCAR có khả năng
tái sản xuất cao và đặc trưng cho từng locus và có thể được áp dụng trong các
nghiên cứu lập bản đồ và lựa chọn hỗ trợ đánh dấu cho các đặc điểm kinh tế nơng
nghiệp di truyền như tính kháng sinh học ở các loại cây trồng khác nhau.
Nhìn chung, điểm đánh dấu SCAR là phương pháp phân biệt kết hợp hiệu quả về
mặt chi phí nhờ ít thủ tục hơn và chi phí thấp
Overall, the SCAR marker is a cost-effective combined differentiation method due
to fewer procedures and lower costs than the CAPS marker
Dấu SCAR dễ sử dụng, đáng tin cậy và có thể tái tạo, do đó có lợi thế hơn dấu
RAPD trong việc xác thực dược liệu được sử dụng trong bào chế thuốc cổ truyền.
Tuy nhiên, những dấu hiệu này chỉ được phát triển cho một số loại dược liệu. Đánh
giá này là một nỗ lực nhằm đánh giá nghiêm túc vai trò của các dấu hiệu SCAR
trong việc xác thực dược liệu được sử dụng trong các cơng thức truyền thống.
Nó nhanh, đáng tin cậy, ít nhạy cảm với các điều kiện phản ứng và dễ thực hiện
trong bất kỳ phịng thí nghiệm nào. Nó có thể được thực hiện bằng cách sử dụng
DNA bộ gen chưa xác định từ bất kỳ giai đoạn phát triển và bộ phận cơ thể nào [5].
Do đó, các điểm đánh dấu SCAR, sau khi được phát triển, sẽ đưa ra một phương
pháp thực tế để sàng lọc nhiều mẫu, chính xác cùng một lúc, do đó làm tăng thêm
hiệu quả chi phí của thí nghiệm [6]. SCAR cho phép phát triển điểm đánh dấu
nhanh chóng, mặc dù chúng khơng có tính đa hình cao. Chúng có thể được sử dụng
làm xét nghiệm mồi liên kết đặc hiệu với alen (ASAP) để phát hiện sản phẩm, ví
dụ: xác định phân loài thực vật [7]. DNA bộ gen được khuếch đại bằng cách sử
dụng ASAP ở nhiệt độ ủ nghiêm ngặt, tạo ra một đoạn DNA duy nhất ở những cá
thể sở hữu alen thích hợp, do đó loại bỏ nhu cầu điện di để giải quyết các khuếch
đại.

17