Định lượng bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
-----o0o---TIỂU LUẬN MƠN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

Định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm KL
Nhóm

:08

Sinh viên thực hiện

:Mã số sinh viên

1.THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – THÁNG 10 NĂM 2022


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU.......................................................................................................................1
NỘI DUNG...................................................................................................................2
1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus cereus.......................................................................2
1.1 Đặc điểm.............................................................................................................. 2
1.2 Nguồn thu nhập B. cereus....................................................................................2
1.3 B. cereus trong thực phẩm và trong các ngành khác............................................3
1.3.1 Tác hại của B. cereus:...................................................................................3
1.3.2 Vai trò của B. cereus trong nuôi trồng hải sản:.............................................4
2 Phương pháp đếm khuẩn lạc.......................................................................................4
2.1 Định nghĩa phương pháp:.....................................................................................4

2.2 Phương pháp thực hiện........................................................................................5
2.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công:.........................................................5
2.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động:...........................................................6
2.3 Phương pháp có thể áp dụng cho những loại vsv :...............................................6
3 Định lượng B. cereus bằng phương pháp đếm KI:......................................................7
3.1 Mơi trường và hóa chất:.......................................................................................7
3.1.1 Mơi trường MYP:.........................................................................................7
3.1.2 Chuẩn bị các đĩa thạch:...............................................................................10
3.1.3 Thạch huyết cừu:.........................................................................................11
3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm:.........................................................................12
3.3 Quy trình thực hiện:...........................................................................................14
3.3.1 Sơ đồ thực hiện:..........................................................................................14


3.3.2 Giải thích quy trình.....................................................................................15
3.3.3 Đếm khuẩn lạc và khẳng định.....................................................................16
3.3.4 Khẳng định..................................................................................................17
3.4 Tính tốn kết quả...............................................................................................18
KẾT LUẬN.................................................................................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................21


MỞ ĐẦU
Ngay cả khi có Pháp lệnh về thực phẩm, hàng năm nước ta vẫn ghi nhận được
hàng vạn ca mắc bệnh truyền qua đường thực phẩm. Đó là một vấn đề cấp thiết của
xã hội cần được quan tâm nhiều hơn nữa.
Nguyên nhân chính của việc ngộ độc thực phẩm là do ý thứccủa con người còn
quá kém và thực phẩm được sử dụng khơng an tồn. Vi khuẩn là nguồn gây bệnh
chính qua con đường thực phẩm (các vi sinh vật gây bệnh) mà cơ quan thuốc và
thực phẩm Mỹ khuyến cáo dân chúng về tác hại, cách phát hiện, cơ chế lây nhiễm

và cách đề phòng. Một trong số những loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm đó là
Bacillus cereus. Là một vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử.
Bacillus cereus có thể làm người bị ngộ độc ói mửa tiêu chảy và trường hợp nặng
hơn có thể gây tử vong. Bất cứ ai cũng có nguy cơ lây nhiễm Bacillus cereus. Thực
phẩm nhiễm Bacillus cereus là rất phổ biến. Người ăn phải thực phẩm này thường
mắc hai bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn mửa.
Dạng ngộ độc gây tiêu chảy bị gây ra bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus có cấu
trúc phân tử protein lớn. Loại vi khuẩn này rất dễ dính lên các nhóm thực phẩm như
thịt, sữa, rau và cá. Triệu chứng chính của loại ngộ độc này là đại tiện ra nước và cơ
bụng bị chuột rút khoảng sau 615 tiếng kể từ lúc ăn phải. Triệu chứng này kéo dài
khoảng 24 tiếng. Nơn mửa cũng có thể đi kèm nhưng thường hiếm gặp đối với loại
ngộ độc gây tiêu chảy bởi Bacillus cereus trọng lượng phân tử lớn. Vì vậy chúng ta
cần định lượng để phát hiện, kiểm xoát và loại bỏ B. cereus.
Đối tượng nghiên cứu là Bacillus cereus .
Hình thức nghiên cứu : định lượng .
Phương pháp nghiên cứu : Phương pháp đếm khuẩn lạc.

NỘI DUNG
1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus cereus
1.1 Đặc điểm

Bacillus cereus là một vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí và dễ sinh độc tố.
1


B. cereus phát triển trong khoảng từ 10 đến 50 ° C, với nhiệt độ tối đa từ 30
đến 40 ° C. Tuy nhiên, các chủng chịu lạnh cũng có thể nhân bản ở nhiệt độ từ 4
đến 6 ° C; trong những trường hợp này, thời gian nhân bản thường dài hơn đáng kể.
Dưới độ pH 4,8, các dòng B. cereus không thể nhân bản được. Tuy nhiên, sự
dung nạp axit giữa các chủng thay đổi đáng kể. Giá trị giá trị aw (sinh sôi trong

nước) tối thiểu cho phép nhân bản là xấp xỉ 0,92.

Hình 1 Cấu tạo B. cereus
1.2 Nguồn thu nhập B. cereus

Nhiều loại thực phẩm được coi là môi trường lý tường của B. cereus. Chúng
bao gồm cơm luộc hoặc cơm chiên, nấu chín; rau và thịt; mì ống; sốt vani; sữa
trứng, thịt hầm, bánh ngọt, xà lách, súp, kem và các loại thảo mộc và gia vị.
Hình B. cereus được và hội chứng
cơm chiên

1.3 B. cereus trong thực phẩm và trong các ngành khác
1.3.1
Tác hại của B. cereus:

Có hai loại bệnh đường ruột chính do B. cereus gây ra. Loại đầu tiên, do độc tố
gây nôn, dẫn đến nôn mửa, trong khi loại thứ hai, do độc tố ruột gây ra, gây tiêu
2


chảy. Trong một số ít trường hợp, cả hai loại triệu chứng đều được ghi nhận, có thể
là do sản sinh cả hai loại độc tố.
PGS Nguyễn Duy Thịnh đặc biệt nhấn mạnh, trong gạo có thể có Bacillus
cereus. Bào tử này sẽ chết ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên, nếu bạn bảo quản cơm nguội
ở nhiệt độ phịng bình thường sẽ tạo điều kiện cho bào tử và các vi khuẩn sinh sôi
và phát triển. Khi nhiễm khuẩn, cơm nguội có thể gây rối loạn tiêu hóa; nặng thì
ngộ độc cấp; nhẹ thì rối loạn tiêu hóa. “Người ăn phải cơm có chứa vi khuẩn
Bacillus cereus có thể buồn nôn và nôn hoặc tiêu chảy sau khoảng từ 1 đến 5 tiếng.
Phần lớn các triệu chứng ở mức độ tương đối nhẹ và thường kéo dài trong khoảng
24 tiếng”

Hình 3 Các triệu chứng của B. cereus
1.3.2

Vai trò của B. cereus trong nuôi trồng hải sản:

B. cereus mạnh về khả năng phân giải protein, tinh bột, cellulose… góp phần

làm sạch đáy ao, giúp tiêu hóa thức ăn. Với nhiều nghiên cứu cho thấy số lượng vi
khuẩn hữu ích là nhân tố duy nhất thúc đẩy làm tăng hiệu quả xử lý và tăng trọng
và tỉ lệ sống của tôm nuôi.

3


Hình 4 Men vi sinh xử lí đáy ao tơm hiệu quả
2 Phương pháp đếm khuẩn lạc.
2.1 Định nghĩa phương pháp:
Khuẩn lạc là một “tập đoàn” vi khuẩn, một sinh khối của vi khuẩn phát triển trên bề
mặt của một giá thể cứng. Trong trường hợp khuẩn lạc phát triển từ 1 tế bào gốc duy nhất,
thì bộ gen của chúng đều giống nhau y hệt, và chúng được gọi là một dòng.
Phương pháp đếm khuẩn lạc: Một trong những cách cổ điển để xác định mật độ vi
sinh vật trong một mẫu là pha loãng mẫu, cấy lên đĩa thạch và sau đó đếm các khuẩn lạc
mọc trên đó. Vi khuẩn được cấy trên đĩa phát triển hình thành các khuẩn lạc từ một hoặc
một số vi khuẩn ban đầu.

4


Hình 5 Khi đếm khuẩn lạc sẽ đếm những khuẩn lạc rời

Ưu điểm :
Cho phép xác định số tế bào sống
Định lượng chọn lọc được vsv
Nhược điểm :
Độ chính xác của việc tính mật độ vi khuẩn từ số khuẩn lạc thực sự có một số hạn
chế.
Đếm khuẩn lạc khơng tính được tế bào chết.
2.2 Phương pháp thực hiện
2.2.1
Phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công:

Cách thức trong phương pháp đếm
khuẩn lạc là đếm mỗi chấm khuẩn lạc
một lần. Một cách tiếp cận là đặt đĩa
petri lên một lưới ô và đếm các khuẩn
lạc trong mỗi ơ. Nhìn chung, bạn sẽ cần
đếm ít nhất ba đĩa; chỉ khi sử dụng đĩa
chứa 30 tới 300 khuẩn lạc để giúp đưa
ra kết luận tin cậy. Các đĩa mà quá H
nhiều hoặc quá ít khuẩn lạc đều khơng
thích hợp và cần pha lỗng và cấy lại
mẫu

5


2.2.2

Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động:

Máy đếm khuẩn sẽ chụp một ảnh của đĩa, tách các khuẩn lạc khỏi nền và sau đó
sử dụng một thuật tốn để đếm các khuẩn lạc trên đĩa. Thuật tốn có thể gặp có
khăn trong việc phân biệt các khuẩn lạc khi hai hoặc nhiều khuẩn lạc chồng lấn ở
vùng rìa, đây là một lĩnh vực của sự phát triển phần mềm hiện tại.

H
2.3 Phương pháp có thể áp dụng cho những loại vsv :

Thường dùng cho mẫu thử nghiệm dạng rắn (thực phẩm, nguyên liệu thực
phẩm…)
Dùng cho mẫu thử nghiệm ở dạng dung dịch như mẫu nước nuôi trồng thủy
sản, nước trái cây…
3 Định lượng B. cereus bằng phương pháp đếm KI:
3.1 Mơi trường và hóa chất:
TÊN

Mục đích

6


SPW

dùng để pha lỗng mẫu thử

Mơi trường thạch MYP ( Mannitol-Egg

là mơi trường chính cho việc nuối cấy

Yolk- Polymixin)

B.cereus .

Thạch huyết cừu

thử hồng cầu xác định phản ứng

Hóa chất phụ : NaCl, HCl

Điều chỉnh pH

Bảng 1 Mơi trường và hóa chất nuôi cấy B.cereus
3.1.1

Môi trường MYP:
Môi trường cơ
bản

Môi trường
thạch bao gồm

Dung dịch
polymyxin B
Dung dịch nhũ
tương lịng đỏ
trứng

Thành phần
Peptone

Mục đích
Cung cấp nitơ, vitamin và các yếu tố tăng trưởng

Bột chiết thịt bị
D-mannitol

Đường có thể lên men, D-mannitol tạo ra q trình lên
men acid.

NaCl

Duy trì trạng thái cân bằng thẩm thấu

Agar

Làm chất đông tụ

7


Phenol đỏ

Làm chất chỉ thị pH

Egg Yolk

Lịng đỏ trứng có chứa lecithin,lecithin tạo vòng kết tủa
bằng enzyme Bacillus cereus xung quang khuẩn lạc.

Polymyxin B

Ức chế sự phát triển vi khuẩn.
Bảng 2 Môi trường MYP

3.1.1.1

Môi trường cơ bản:

Nguyên liệu

Chuẩn bị

Cao thịt bị

Hịa tan các thành phần hoặc mơi
trường hồn chỉnh khơ trong nước,
đun nóng nếu cần.

Pepton từ casein
D-mannitol

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng,
pH của mơi trường hồn chỉnh
(1.2.4) đạt 7,2 ± 0,2 ở 25 0C, nếu
cần.

Natri clorua (NaCl)
Phenol đỏ
Thạch

Phân phối các lượng 90 ml mơi
trường vào các bình cầu dung tích
thích hợp.

Nước

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp
lực ở 121 0C.
a : tùy vào sức sống của thạch
Bảng 3 Cách chuẩn bị môi trường cơ bản của MYP

3.1.1.2 Dung dịch polymyxin B:
Nguyên liệu

Chuẩn bị

Polymyxin B sunfat ( IU a))

Hòa tan Polymyxin B sunfat trong
nước. Lọc để khử trùng.

Nước
a) : IU là đơn vị quốc tế

Bảng 4 Cách chuẩn bị dung dịch polymyxin B

8

3.1.1.2.1 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng:
Nguyên liệu

Chuẩn bị

Sử dụng các quả trứng gà còn nguyên
vẹn.

Dùng bàn chải, rửa trứng trong dung
dịch tẩy rửa. Tráng sạch dưới dòng
nước chảy, ngâm trong etanol 95 %
(theo thể tích) trong 30 giây rồi để
khô. Bằng kỹ thuật vô trùng, đập vỡ
từng quả trứng và tách riêng lòng đỏ
bằng cách chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ
quả này sang nửa vỏ quả còn lại. Cho
các lịng đỏ sang ống đong vơ trùng
và thêm bốn phần theo thể tích nước
vơ trùng. Chuyển một cách vơ trùng
sang bình cầu vơ trùng và khuấy
mạnh.
Đun nóng hỗn hợp 2 h trong nồi cách
thủy để ở 44 0C đến 47 0C. Sau đó để
yên 18 h đến 24 h ở 5 0C ± 3 0C để tạo
kết tủa.
Bằng cách vơ trùng thu lấy nhũ tương
phía trên.
Dung dịch nhũ tương này có thể bảo
quản đến 72 h ở 5 0C ± 3 0C.

Bảng 5 Cách chuẩn bị dung dịch nhũ tương lịng đỏ trứng

3.1.1.2.2 Mơi trường hồn chỉnh (thạch MYP):
Ngun liệu

Chuẩn bị

Môi trường cơ bản (1.1.1)

Chuẩn bị dung dịch :

Dung dịch polymyxin B (1.1.2)

Làm tan chảy môi trường cơ bản và
làm nguội trong nồi cách thủy để ở 44
0
C đến 47 0C.

Dung dịch nhũ tương lòng
đỏ trứng (1.1.3)

Cho các dung dịch còn lại vào, trộn
kỹ sau mỗi lần thêm.
Làm nguội mơi trường hồn chỉnh
trong nồi cách thủy để ở 44 0C đến
47 0C.
9


3.1.2

Chuẩn bị các đĩa thạch:

Rót các phần từ 15 ml đến 20 ml mơi trường hồn chỉnh (1.1.4) sang các đĩa
Petri vơ trùng và để cho đơng đặc.
Các đĩa có thể được bảo quản đến 4 ngày ở nhiệt độ 5 0C ± 3 0C trước khi làm
khô.
Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa, tốt nhất tháo bỏ nắp ra và úp bề mặt
thạch xuống, đặt trobng tủ sấy hoặc tủ ấm để ở 37 0C cho đến khi bề mặt thạch khô.
3.1.3

Thạch huyết cừu:

Thạch huyết
cừu bao gồm

Môi trường
cơ bản

Huyết cừu đã
khử sợi huyết

Thành phần
Agar

Mục đích
Làm chất đơng tụ

Sản phẩm thủy phân Tạo mơi trường kỵ khí
gan

Peptone

Cung cấp nitơ, vitamin và các yếu tố tăng trưởng

NaCl

Duy trì trạng thái cân bằng thẩm thấu

10


Cao nấm men

Cung cấp vitamin, tạo điều kiện cho việc ni
dưỡng các vi sinh vật kỵ khí.
Bảng 6 Thạch huyết cừu.

3.1.3.1 Môi trường cơ bản:

Nguyên liệu
Pepton proteoza hoặc pepton
Sản phẩm thủy phân gan
Cao nấm men

Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần hoặc mơi
trường hồn chỉnh khơ trong nước
bằng cách đun sơi.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng
là 7,0 ± 0,2 ở 25 0C, nếu cần.

Natri clorua (NaCl)
Thạch

Phân phối vào các bình cầu và khử
trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở
121 0C.

Nước
a) Tùy thuộc vào sức đông của thạch

Bảng 7 Cách chuẩn bị môi trường cơ bản của Thạch huyết cừu.
3.1.3.2 Mơi trường hồn chỉnh:

Ngun liệu

Chuẩn bị

Mơi trường cơ bản

Sau khi làm nguội đến nhiệt độ từ
44 0C đến 47 0C, bổ sung huyết cừu
đã khử sợi huyết vào môi trường cơ
bản . Trộn đều.

Huyết cừu đã khử sợi huyết

Rót các phần ít nhất 12 ml mơi
trường hồn chỉnh sang các đĩa Petri
và để cho đông đặc.

Bảng 8 Môi trường hồn chỉnh.
3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm:

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Thiết bị để khử trùng khơ (lị sấy)
hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp
lực)

Tác dụng
Khử trùng môi trường nuôi cấy, Thiết
bị quy định cho phép nhiệt độ trong
buồng được duy trì trong vịng ± 3 °C
11


của nhiệt độ đích (để tính đến độ
khơng đảm bảo đo kết hợp với cặp
nhiệt đo)
Tủ sấy hoặc tủ ấm,

Được thơng gió đối lưu, để làm khơ
các đĩa thạch, có khả năng hoạt động
ở 37 0C ± 1 0C và 55 0C ± 1 0C.

Tủ ấm,

Có thể làm việc ở 30 0C ± 1 0C.

Nồi cách thủy,

Có thể duy trì nhiệt độ ở 44 0C đến 47
0
C.

pH met,

Có độ chính xác ± 0,1 đơn vị pH ở 25
0
C.

Đĩa Petri,

Bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo có
đường kính từ 90 mm đến 100 mm,
hoặc 140 mm, nếu cần.

Pipet chia vạch,

Được hiệu chuẩn chỉ dùng cho vi
khuẩn học, có dung tích danh định 10
ml và 1 ml, được chia vạch 0,5 ml và
0,1 ml tương ứng và có lỗ xả với
đường kính danh định từ 2 mm đến 3
mm.

Dụng cụ dàn mẫu (dạng que gạt)

Que bằng thủy tinh hoặc bằng chất
dẻo có đường kính khoảng 3,5 mm và
dài 20 cm, một đầu được uốn thành

góc vng với đoạn dài khoảng 3 cm;
các đầu được làm nhẵn bằng nhiệt.

Lấy mẫu

Điều quan trọng là phịng thử nghiệm
nhận được đúng mẫu đại diện và
khơng bị hư hỏng hoặc biến đổi trong
suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo
quản.
Việc lấy mẫu không qui định trong
tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn riêng
về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng.
Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng thì các
12


bên liên quan tự thỏa thuận với nhau
về vấn đề này
Bảng 9 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.
3.3 Quy trình thực hiện:
3.3.1
Sơ đồ thực hiện:

Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung
dịch pha loãng
Pha loãng mẫu
Cấy và ủ
Đếm khuẩn lạc và khẳng định
3.3.2

Giải thích quy trình
3.3.2.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng liên quan tới sản phẩm.
Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong 10ml đối với mẫu lỏng, sai số
cho phép ± 5 %, cho vào túi nhựa vô trùng.
Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5 %) vơ trùng vào túi
nhựa (bình tam giác) chứa mẫu.
SPW
NaCl

1g

Peptone

8,5g

Nước cất vừa đủ

1 lí
t

Bảng 10 Lượng pha SPW ( có thể thay đổi tùy theo cách pha mỗi phịng thí nghiệm)
13


3.3.2.2 Pha loãng mẫu

Hút 1ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha lỗng
SPW vơ trùng ở nhiệt độ thích hợp.

Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 -10s để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (độ
pha lỗng thích hợp để ni cấy). Nếu cần, có thể lặp lại thao tác trên để có được
dung dịch pha loãng 10-3, 10-4,… cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.
Để định lượng các bào tử Bacililus cereus giả định, cần làm nóng dung dịch
pha loãng ban đầu ở 800C trong 10 phút trên nồi cách thủy sau đó tiến hành cấy.
3.3.2.3 Cấy và ủ

Lấy hai đĩa thạch (5.2.5), dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử
nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.
Lặp lại qui trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần.
Đối với một số sản phẩm nhất định, tốt nhất để ước tính B. cereus với số lượng
nhỏ, là tăng các giới hạn phát hiện lên 10 lần bằng cách kiểm tra 1,0 ml mẫu thử
nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc 1,0 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở
dạng khác. Phân phối 1 ml dịch cấy lên bề mặt của đĩa Petri lớn (140 mm) hoặc lên
khắp bề mặt của ba đĩa nhỏ (90 mm) sử dụng dụng cụ dàn mẫu vô trùng trong cả
hai trường hợp, chuẩn bị cho phép xác định kép sử dụng hai đĩa lớn hoặc sáu đĩa
nhỏ. (2)
Cẩn thận dùng que dàn mẫu dàn đều dịch cấy trên khắp bề mặt đĩa thạch càng
nhanh càng tốt mà không chạm vào các mép đĩa. Sử dụng một que dàn mẫu vô
trùng cho mỗi đĩa. Để các đĩa có đậy nắp khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng để chất
cấy bám vào thạch.
Lật úp các đĩa đã chuẩn bị và để 18 h đến 24 h trong tủ ấm ở 30 0C. Nếu khơng
thể nhìn thấy rõ các khuẩn lạc thì ủ các đĩa thêm 24 h trước khi đếm.

Hình 8 Mơ hình cấy và ủ Bacililus cereus
14


3.3.3 Đếm khuẩn lạc và khẳng định

Sau giai đoạn ủ, chọn các đĩa, tốt nhất là ở hai độ pha lỗng liên tiếp, có ít hơn
150 khuẩn lạc.
Đếm các khuẩn lạc B. cereus giả định trên mỗi đĩa. Các khuẩn lạc giả định là
các khuẩn lạc lớn, màu hồng (cho thấy khơng lên men mannitol, xem chú thích 1)
và thường được bao quanh bởi một vùng kết tủa (cho thấy hình thành lexitinase
xem chú thích 2).
Nếu có ít hơn 15 khuẩn lạc đặc trưng trên các đĩa được cấy sản phẩm ở dạng
lỏng hoặc các sản phẩm ở dạng khác ở độ pha lỗng thấp nhất, thì có thể lấy số
đếm ước tính như mơ tả trong điều 10.
CHÚ THÍCH 1: Nếu các đĩa chứa nhiều vi sinh vật lên men mannitol dẫn đến
sinh axit, thì màu hồng đặc trưng của khuẩn lạc B. cereus có thể bị nhạt đi hoặc
biến mất hồn tồn.
CHÚ THÍCH 2: Một số chủng B. cereus chỉ sinh ít hoặc khơng sinh lexitinase.
Các khuẩn lạc thuộc các chủng này sẽ khơng có vùng kết tủa bao quanh. Các khuẩn
lạc này cũng cần được thử khẳng định.
Nếu 1,0 ml dịch cấy được dàn trên khắp ba đĩa [xem (2)], thì xử lý các đĩa này
như nhau ở các qui trình đếm và khẳng định.
3.3.4 Khẳng định
3.3.4.1 Chọn và lọc khuẩn lạc để khẳng định
Từ mỗi đĩa đã chọn theo 3.2.3, lấy năm khuẩn lạc giả định. Nếu trên đĩa có ít
hơn năm khuẩn lạc, thì lấy tất cả các khuẩn lạc giả định có mặt. Khẳng định các
khuẩn lạc này theo qui định trong 3.2.4.1 và 3.2.4.2.
Nếu trên các đĩa, khuẩn lạc mọc quá dày và khơng thể chọn các khuẩn lạc phân
lập tốt, thì cấy ria năm khuẩn lạc giả định lên các đĩa đựng mơi trường hồn chỉnh.
Để từ 18 h đến 24 h trong tủ ấm ở 300C.
Chọn trên mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc có màu hồng phân lập tốt. Khẳng định
khuẩn lạc này như qui định trong 3.2.4.1 và 3.2.4.2.
3.3.4.2 Thử hồng cầu trên thạch huyết cừu

Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn (3.2.4) lên mặt thạch

huyết cừu theo cách sao cho thể hiện được tốt phản ứng hồng cầu.
Ủ ở 300C trong 24 h ± 2 h và giải thích phản ứng hồng cầu.

15


3.3.4.3

Giải thích phản ứng sinh hóa

Phép thử

Kết quả khẳng định Bacillus

Thạch

Cách tiến hành
cereus
Chúng có màu hồng trên nền đỏ Kết quả được thể hiện sau khi

MYP

thẫm và có quầng kết tủa bao được ni cấy B.Cereus

thành

quanh (phản ứng của lịng đỏ cơng.
Thử hồng

trứng) rộng đến 5 mm.

Phản ứng dương tính a

Khẳng định B.Cereus

cầu

trên môi

trường thạch huyết cừu bằng phản
ứng Haemolysin (ủ trong 300C
trong vòng 24h)

a

độ rộng của vùng hồng cầu có thể thay đổi

3.4 Tính tốn kết quả.
3.4.1.1 Cơng thức tính số khuẩn lạc:
❑

X=

C. R
∑
(CFU/g hay CFU/ml)
❑
❑

*Trong đó:
∑C là tổng số khuẩn lạc trên hai đĩa petri có độ pha loãng liên tiếp. VD 10−1, 10−2

n1,n2 là số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn.
V là thể tích mẫu được đưa vào mỗi đĩa, đơn vị ml.
d là độ pha loãng tương ứng với n1 (độ pha loãng nhỏ hơn).
R là tỉ lệ khẳng định dương tính
3.4.1.2 Giới hạn cho phép .
Bảng 11 giới hạn cho phép B.cereus trong sản phẩm.

ST
T

1

SẢN PHẨM

GIỚI HẠN
(trong 1g hoặc 1ml sản
phẩm )
102

Sữa dạng bột
16


2

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu
đỗ : bột, miến, mỳ sợi ( có xử lý nhiệt trước
khi sử dụng )

102

3

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu
đỗ : bột, miến, mỳ sợi ( dùng trực tiếp, không
quá xử lý nhiệt trước khi sử dụng )

10

4

Rau quả muối, rau quả khô

102

5

Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ
em, thức ăn thay thế đặc biệt ( phải xử lí
nhiệt trước khi sử dụng )

102

6

Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ
em, thức ăn thay thế đặc biệt ( dùng trực tiếp,
không quá xử lý nhiệt trước khi sử dụng )

10

3.4.1.3 Biểu thị kết quả:

Đối với độ pha lỗng mơi trường tăng sinh lỏng chọn lọc đã được cấy, ghi lại
số lượng ống nghiệm có mặt Bacillus cereus giả định đã được khẳng định.
Chỉ ra rõ các ống này là các ống dương tính.
Chọn những đĩa có từ 15 đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha lỗng liên tiếp
để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.

17