Định lượng vitamin b12 bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp

Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

Lời cảm ơn

Để hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo
Th.S. Nguyễn Quang Tuệ, cảm ơn thầy đà giao đề tài và hớng dẫn tận tình,
chu đáo trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Trong quá trình nghiên cứu, hoàn thành đề tài em luôn nhận đợc sự
quan tâm, ủng hộ của các thầy cô giáo giảng dạy ở tất cả các chuyên ngành
trong khoa và các anh chị ở phòng kiểm nghiệm Dợc phẩm thuộc công ty CP
Dợc và thiết bị y tế Hà Tĩnh đà tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin gửi tới gia đình, bạn bè lòng biết ơn về tất cả những
gì đà làm cho em.
Em xin chân thành cảm ơn!
Vinh, tháng 5/2006
Sinh viên:
Lê Minh Đức

Chuyên ngành hoá phân tích

1


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

Mở đầu:

Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có phân tử lợng tơng đối lớn và có bản
chất lý, hoá học khác nhau. Nhóm chất hữu cơ này đặc biệt cần thiết cho hoạt
động sống bình thờng của các cơ thể sinh vật dị dỡng. Tuy nhiên, tác dụng sinh
lý của các Vitamin lên các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật rất khác nhau.
So với nhu cầu về các chất dinh dỡng cơ bản nh Protein, Lipit, Gluxit thì nhu
cầu về Vitamin rất thấp. Trong cơ thể, Vitamin đảm nhiệm vai trò nh những
chất xúc tác.
Vitamin là những chất mà cơ thể con ngời không thể tổng hợp đợc. Phần
lớn phải đa từ ngoài vào trong bằng con đờng ăn, uống. Vitamin có tác dụng lợng nhỏ, đóng vai trò rất quan trọng trong đời sống của con ngời, là những chất
xúc tác không thể thiếu đợc trong chuyển hoá các chất. Nhu cầu Vitamin hàng
ngày của cơ thể rất ít, nhng nếu thiếu sẽ gây ra những rối loạn trầm trọng, sinh
bệnh và nếu kéo dài có thể chết.
Trong những năm gần đây ngời ta đà chứng minh rằng Vitamin còn cần
thiết cho cả các cơ thể tự dỡng nh thực vật là những đối tợng có khả năng tổng
hợp nên hầu hết các Vitamin. Thật vậy một số bộ phận của thực vật xanh không
có khả năng tổng hợp Vitamin, vì thế cần cung cấp thêm cho chúng một số
Vitamin để đảm bảo cho sự sinh trởng và phát triển của chúng.
Cho đến nay ngời ta đà tách ra đợc khoảng 30 loại chất thuộc nhóm
Vitamin, đa số đà đợc xác định đầy đủ cả cấu trúc hoá học cũng nh tính chất lý
hoá học và sinh lý học. Về cách gọi tên, các Vitamin hiện nay ngời ta vẫn duy
trì gọi theo 3 kiểu khác nhau, kiểu thứ nhất dựa theo tác dụng sinh lý của
Vitamin: thêm chữ anti (chống) vào một bệnh đặc trng của hiện tợng thiếu
Vitamin, kiểu thứ 2: là dùng chữ cái để đặt tên, còn kiểu thứ 3 dựa trên cầu trúc
hoá học, hiện này có xu hớng gọi bằng tên hoá học nhiều hơn.
Nguyên nhân thiếu Vitamin thờng do thành phần thức ăn không đầy đủ
hoặc cơ thể mắc bệnh, không chuyển hoá đợc qua thức ăn. Khi đó phải bù đắp
Vitamin cho cơ thể bằng các con đờng dẫn thuốc thích hợp nh: uống, tiêm,
Chuyên ngành hoá phân tích

2

Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

truyền. Cơ thể con ngời thờng thiếu nhiều Vitamin một lúc, nên điều trị cần
phối hỵp nhiỊu Vitamin. Trõ A, D, E dïng liỊu cao và dài ngày có thể gây bệnh
còn các Vitamin nếu thừa, cơ thể sẽ tự đào thải qua mồ hôi, nớc tiểu. Về cảnh
giác thuốc, vẫn cần lu ý dùng đúng liều chỉ định và đờng dùng cho mồi
Vitamin, nhiều khi có tác dụng không mong muốn (nh Vitamin PP, C, B1).
Chính vì việc dùng Vitamin là rất cẩn trọng nên chúng ta phải hết sức
chú ý khi dùng thuốc. ở luận văn này chúng tôi chỉ định lợng Vitamin B12
trong viên thuốc tổng hợp Vitamin 3B (B1, B6, B12) để xác định rõ xem hàm lợng của Vitamin B12 trong thuốc có phù hợp với nhÃn không. ở luận văn này
chúng tôi xin chọn phơng pháp Sắc kí lỏng cao áp. Sắc kí lỏng cao áp là một phơng pháp hiện đại cho ta biết kết quả nhanh và chính xác, có thể tiết kiệm đợc
thời gian và lợng mẫu cần dùng.
Với khuôn khổ luận văn và thời gian ngắn nên ở đề tài này chúng tôi chỉ
định lợng đợc Vitamin B12 trong viên Vitamin 3B.
Nhiệm vụ của đề tài:
Nghiên cứu các điều kiện Sắc kí khi Vitamin B12 tồn tại trong hỗn hợp
áp dụng các điều kiện đà chọn để định lợng trong viên nén Vitamin 3B

Chuyên ngành hoá phân tích

3


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

Phần I. Tổng quan tài liệu
I. Vitamin B12
I.1. Nguồn gốc
- Vitamin B12 là loại Vitamin hầu nh độc nhất đợc tổng hợp bởi các sinh
vật.
- Thùc vËt chØ chøa rÊt Ýt Vitamin B12, Vitamin B12 chỉ phát hiện thấy
một lợng nhỏ ở hạt cũng là nguồn vi sinh vật phát triển trên bề mặt của hạt.
- ở một số loài tảo cũng có Vitamin B12 do các vi sinh vật cộng sinh tạo
ra.
- ở động vật, các vi khuẩn của ruột có khả năng tổng hợp Vitamin B12
và cung cấp nó cho động vật chủ, vì vậy các sản phẩm động vật thờng giàu
Vitamin B12. Gan, thịt, cá, trứng, sữa là các sản phẩm giàu Vitamin B12.
- Năm 1948 thu đợc Vitamin B12 ở dạng kết tinh từ dịch gan.
I.2. Tính chất
- Công thức nguyên: C63H88CoN14O14P
- Khối lợng phân tử: 1355
- Vitamin B12 đợc dùng làm thuốc ở 2 dạng chính: Cyanocobalamin và
Hyđroxocobalamin. Riêng Hyđroxocobalamin đợc dùng ở 3 dạng muối kết hợp
với axit: axit axetic, axit sufuric, axit clohiđric.
Cấu trúc hoá học của Cyanocobalamin và Hyđroxocobalamin

Chuyên ngành hoá phân tích

4


Khoá luận tốt nghiệp

H2N COCH2 CH2

Lê Minh Đức

Me

H

CH2 CONH2

Me

H2 NCOCH2

CH2 CH2 CONH2

CN

Me

H

N
N

Me

Co

N

Me

H
N

N
Me

H
H2 NCOCH2

N

Me

Me
H

Me

CH2 CH2 CONH2

NH2

OO

P

N

H

H

H
O

O

H
H

O

Me

H

OH

CH2OH

Cyanocobalamin
H2N COCH2 CH2

Me

H

CH2 CONH2

Me

H2 NCOCH2

CH2 CH2 CONH2
o

CN

Me

R

H

N

N
Me

Co

N

Me

H
N

N
Me

H
H2 NCOCH2

N

Me

Me
H

Me

CH2 CH2 CONH2

NH2

O-

O

H

H
OH

O

P

N

H
H

H

O

Me

O

O
H

Hydroxo Cyanocobalamin
H.axetat R là CH3COOH

Chuyên ngành hoá phân tích

5

CH2OH


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

H. sunfat R là H2SO4
H. cloric R là HCL
- Vitamin B12 tồn tại ở dạng bột kết tinh hoặc tinh thể màu đỏ đậm
- Hoà tan trong nớc và trong etanol 96%, không hoà tan trong axeton và
ete.
- Dạng khan rất hút ẩm.
- Vitamin B12 bền trong tối và ở nhiệt độ thờng; ở ngoài ánh sáng nó lại
dễ dàng bị phân huỷ.
- Vitamin B12 có tính hấp thụ quang lớn. Cực đại hấp thụ riêng có khác
nhau chút ít do có sự khác nhau về cầu trúc cũng nh khối lợng phân tử giữa các
dạng.
Bảng độ hấp thụ quang của các dạng.
1%
Dạng
Cực đại hấp thụ (nm)
Độ hấp thụ riêng ( E1cm )
Cyanocobalamin
278; 361; 550
ë 361nm: 207
Hy®roxocobalamin axetat
274; 351; 525
ë 351nm: 187
Hy®roxocobalamin sunfat
274; 351; 525
ë 351nm: 188
Hy®roxocobalamin clorit
274; 351; 525
ë 351nm: 190

- Vitamin B12 chuyển vào cơ thể gắn với một hợp chất glucoprotit của dạ

dày để tạo nên một phức hợp dễ hấp thụ cho cơ thể.
- Vai trò của Vitamin B12 đợc nghiên cứu rất nhiều, song vẫn còn những
chi tiết cha râ.
+ NhiỊu dÉn liƯu ®· chøng minh r»ng nã tham gia vào quá trình tổng hợp
protein ở cơ thể.
+ Vitamin B12 là thành phần của các coenzim, xúc tác cho các quá trình
tổng hợp protein ở trên.
+ Vitamin B12 cũng tham gia vào sự trao đổi các hợp chất chứa một
cacbon và thờng phối hợp, tác dụng với axit folic trong các phản ứng metyl hoá;
Ví dụ trong quá trình tổng hợp metionin từ homo xistin.

Chuyên ngành hoá phân tÝch

6


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

S

S

S

+ 2H

(CH2)2

(Vitamin B12)

CHNH2

(CH2)2

(CH2)2

CHNH2

CHNH2

COOH

COOH

HCHO

AX tetra hydro folic

COOH
Homoxistein

Homoxistin
O
S

(CH2)2

C

S

CH3

+ 2H

H

(CH2)2

(Vitamin B12)

CHNH2

CHNH2

COOH

COOH

- Các phản ứng chuyển hoá Metyl hoá khác trong đó có sự tham gia của
Vitamin B12 là phản ứng tổng hợp N-Metyl Nico Tiamit hoặc tổng hợp
Creatin,...
- Vitamin B12 còn liên quan tới sự chuyển hoá của các hợp chất
Sunfidryl, nó tham gia vào sự khử các hợp chất Đisunfit thành các hợp chất
Sunfidryl do đó nó duy trì hoạt tính của các Enzim chứa nhóm SH và ảnh hởng
tới sự trao đổi Protein, Gluxit cũng nh Lipit.

- Khi bảo quản các sản phẩm giàu Vitamin B12 nh: sữa, gan, trứng,... ngời ta nhận thấy, hàm lợng Vitamin B12 trong sản phẩm có thể thay đổi ít nhiều
tuỳ theo điều kiện xử lý trớc khi bảo quản và trong khi bảo quản. Những dẫn
chứng cho ta biết:
+ Khi tiệt trùng sữa bằng phơng pháp làm nóng trực tiếp (hoặc sục hơi nớc vào sữa) hoặc gián tiếp (hấp trong các thiết bị vô trùng) sự hao hụt Vitamin
B12 thay đổi từ 40 - 20%. Khi quấy sữa cô đặc không thêm đờng ở nhiệt độ
thấp, sau 4 năm sẽ mất đi khoảng 35% lợng Vitamin B12.
+ Trứng cũng là sản phẩm rất quan trọng về phơng diện Vitamin nói

Chuyên ngành hoá phân tích

7


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

chung và Vitamin B12 nói riêng. Trong 7 tháng đầu khi bảo quản trứng,
Vitamin B12 khá bền, trứng sau thời gian đó hàm lợng Vitamin B12 sẽ giảm đi
rõ rệt và mất đi tới 32%. Sau 1 năm ở lòng trắng trứng chỉ có ít Vitamin B12.
Do trọng lợng phân tử của Vitamin B12 lớn nên không có sự di chuyển từ lòng
đỏ sang lòng trắng trong quá trình bảo quản.
- Trong kỹ nghệ, ngời ta lợi dụng khả năng sinh tổng hợp Vitamin B12
bởi hàng loạt vi sinh vật, đặc biệt các loại xạ khuẩn, nấm mốc loại
Streptomyces, các vi khuẩn lên men Propinic để sản xuất Vitamin B12.
* Trong quá trình ủ thức ¨n cho gia sóc, c¸c vi sinh vËt ph¸t triĨn ở thức
ăn cũng tổng hợp đợc một lợng đáng kể Vitamin B12. Thêm muối Cacbon vào
đó nuôi cấy của chúng hoặc thức ăn ủ kích thích sự tổng hợp Vitamin B12.
- Vitamin B12 cã ý nghÜa quan träng ®èi víi chăn nuôi gia súc. Nó làm
tăng sự hấp thụ thức ¨n Protein thùc vËt, t¨ng trëng vµ tÝch l mì. Vitamin B12

cũng làm tăng sinh sản đẻ trứng và nở trứng ở gà mái. Ngoài ra còn có những
dẫn liệu chứng minh rằng tác dụng của Vitamin B12 sẽ tăng lên nhiều nếu phối
hợp thêm vào thức ăn của gia súc một ít chất khoáng sinh Biomixin.
I.3. Công dụng
- ở ngời, thiếu Vitamin B12 sẽ gây rối loạn sản xuất máu ở trong xơng,
dẫn đến thiếu máu nguyên bào khổng lồ (Biermen) do hồng cầu không trởng
thành đợc.
- Theo những nghiên cứu mới đây cho thấy:
+ ở những phụ nữ mang thai có hàm lợng Vitamin B12 trong máu thấp,
thai nhi rất dễ tật nứt đốt sống - hiện tợng này gây liệt chân và chậm phát triển
trí nÃo ở trẻ.
+ Uống bổ sung Vitamin B12 là một trong các phơng pháp hữu hiệu để
ngăn ngừa hội chứng Alzheimer (suy giảm trí nhớ) ở ngời cao tuổi.
+ Nghiên cứu của Israel cho thÊy phơ n÷ thiÕu Vitamin B12 cã nguy cơ
bị vô sinh hay sẩy thai liên tiếp. Đa số họ đà có thai và sinh con bình thờng sau

Chuyên ngành hoá phân tích

8


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

khi điều trị bằng Vitamin B12.
- Vitamin B12 thờng đợc dùng chữa chứng thiếu máu nguyên bào khổng
lồ, rối loạn về thần kinh, viêm đa dây thần kinh (thờng đợc dùng phối hợp với
Vitamin B1, Vitamin B6) nhất là ở ngời nghiện rợu hoặc đái tháo đờng, cũng đợc dùng cho bệnh nhân suy nhợc.
- Vitamin B12 có tác dụng tốt với nhiều quá trình, nó tham gia gia vào

phản ứng tổng hợp Thymidylate, một thành phần trong phân tử AND, cung cấp
nguyên liệu để tổng hợp AND, góp phần vào quá trình phân chia và trởng thành
của tế bào trong cơ thể.
II. Các phơng pháp định lợng Vitamin B12.
II.1. Vitamin B12 trong thuốc đơn thành phần.
Hoà tan 25,00 mg chế phẩm trong nớc và pha loÃng đến 1000,0 ml bằng
dung môi. Đo độ hấp thụ tử ngoại ở bớc sóng cực đại 361 nm ®èi víi Cyano
Cobalamin vµ 351 nm ®èi víi Hi®roxo Cobalamin, tính kết quả dựa vào độ hấp
thụ riêng (E1%/1cm ).
Phơng pháp này chính xác, áp dụng cho các chế phẩm, tá dợc tan trong
nớc không hấp thụ tử ngoại.
II.2. Vitamin B12 trong thuốc đa thành phần.
II.2.1. Phơng pháp vi sinh vật.
Phơng pháp này dựa vào nguyên tắc: Vitamin B12 làm ph¸t triĨn nhanh
chãng chđng vi sinh vËt Lactobacililus bichmanic trong môi trờng và điều kiện
nuôi cấy thích hợp đà quy định, tiến hành song song với một dÃy mẫu chuẩn:
0.01ng đến 0.04 ng Vitamin B12.
Để tính kết quả ngời ta ®o ®é ®ơc cđa mÉu thư vµ mÉu chn so với mẫu
trắng là chủng vi sinh vật đợc nuôi cấy trong cùng môi trờng nuôi cấy không có
Vitamin B12.
Phơng pháp này đợc sử dụng để định lợng Vitamin B12 trong các chế
phẩm có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ : từ hàng ng đến hàng à g/ viên, ml.
Tuy nhiên chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic rất hiếm và khó

Chuyên ngành hoá phân tích

9


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

nuôi cấy. Nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có đợc để thực hiện phơng pháp này cho nên phơng pháp này rất hạn chế.
II.2.2. Phơng pháp quang phổ khả kiến.
Phơng pháp quang phổ khả kiến có thể dùng để tính hay định lợng
Vitamin B12 trong các chế phẩm dợc.
Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc đo quang phổ ở bớc sóng khả kiến
(548 2 nm) song song với chuẩn.
Dung dịch thử đợc chiết trong môi trờng Etanol 95 % và làm sạch để loại
bớt Vitamin B1 và Vitamin B6. Không làm lạnh hoặc chiết trong môi trờng đệm
Axetat.
Phơng pháp này không có tính chọn lọc do không loại trừ đợc chất màu,
nhất lµ phÈm mµu hång thêng cã trong chÕ phÈm vµ vấn còn nhiều Vitamin B1,
B6 trong mẫu thử. Do đó phơng pháp này chỉ áp dụng đợc với các chế phẩm có
hàm lợng Cyano cobanlamin lớn (trên 500 à g/viên.ml) và tá dợc không có chất
màu.
II.2.3. Phơng pháp đo quang phổ tử ngoại.
- Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc ®o quang phỉ ë cùc ®¹i vïng tư
ngo¹i 361 ± 1nm, song song với chuẩn.
Dung dịch thử đợc chiết nhiều lần trong hỗn hợp Phenol + Butanol hoặc
chỉ với Butanol trong môi trờng Axit Boric.
- Phơng pháp này có khả năng áp dụng hạn chế vì kiểm nghiệm viên phải
tiếp xúc lâu với dung môi độc và Vitamin B1, B6 vẫn còn ảnh hởng lớn.
Chỉ nên áp dụng với các chế phẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin cao
(từ 1000 à g/viên,ml).
II.2.4. Phơng pháp sắc kí định lợng Vitamin B12.
Phơng pháp sắc kí là phơng pháp rất căn bản để đạt tới việc định lợng
Vitamin B12 trong các nguyên liệu thiên nhiên, và nh vậy cả phơng pháp sắc kí
lớp mỏng, phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao.

II.2.4.1. Sắc kí lớp mỏng.
Chuyên ngành hoá phân tích

10


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

Trong sắc kí lớp mỏng, quá trình tách hỗn hợp các chất xẩy ra khi cho
pha ®éng chun qua pha tÜnh. ChÊt hÊp thơ (pha tĩnh) đợc rải thành lớp mỏng
trên tấm kính hoặc tấm kim loại. Trong quá trình chuyển giao chất hấp thụ, nhờ
các quá trình hấp thụ - giải hấp thụ đợc lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác
nhau các cấu tử đợc dịch chuyển trên lớp mỏng theo hớng chuyển động, với
những tốc độ khác nhau. Kết quả ta thu đợc một sắc đồ trên lớp mỏng. Sắc kí
lớp mỏng đợc thực hiện theo phơng pháp rửa giải. Có thể tóm tắt nguyên tắc
tiến hành nh sau:
+ Rải một lớp chất hấp thụ trên một tấm kính (hoặc tấm kim loại) rồi
chấm một giọt dung dịch các chất phân tích lên gần một đầu mép lớp mỏng
(điểm xuất phát). Sau đó, nhúng kính đà có lớp mỏng (bản mỏng) chất hấp thụ
vào dung môi đến mức dới điểm xuất phát.
+ Do tác dụng của lực mao quản, đun thấm theo lớp mỏng giao điểm xuất
phát. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp đợc phân chia theo 1 vùng riêng.
Sơ đồ tách bằng sắc kí lớp mỏng.

B
A

B

A

Điểm xuất phát

a

b

c

II.2.4.2. Phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao.
Đợc dùng để tách các Vitamin hoà tan trong nớc.

Chuyên ngành hoá phân tích

11

Dung môi


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

+ Với Đelecter uv/vis
+ Cột tách: Lichrosorla 18 (5 - 10 à m, 250 x 4 mm)
+ Pha tÜnh (chÊt nhåi ) Silicagel
+ Dung m«i: Meltanol + nớc (35: 65)
+ Tốc độ dòng: 1.5 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 20 ml

+ Nồng độ dung dịch tiêm: 1mg/ml
Phơng pháp này có u điểm là xác định nhanh và tốt các Vitamin cùng
một lúc. Hiện nay ngời ta thờng dùng phơng pháp này trong kiểm định dợc
phẩm.
II.2.5. Kết luận chọn phơng pháp phân tích Vitamin B12.
Thông qua tổng quan về các phơng pháp xác định Vitamin B12 trong
viên nén Vitamin3B, chúng ta thấy nó khá phong phú. Mỗi phơng pháp có một u nhợc điểm riêng và khả năng áp dụng khác nhau.
- Phơng pháp vi sinh vật có độ chọn lọc và độ nhạy cao nên áp dụng cho
các mẫu Vitamin 3B có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ mà các phơng pháp khác
không định lợng đợc.
- Phơng pháp đo quang tử ngoại khả kiến có thể áp dụng khi phòng kiểm
nghiệm không có máy HPLC, với các mẫu Vitamin3B có hàm lợng Vitamin
B12 cao nhng đòi hỏi kỹ thuật chiết tách cao để tránh ảnh hởng của Vitamin B1,
B6 và tá dợc chất màu.
- Phơng pháp HPLC với các chơng trình sắc kí lỏng pha đảo khác nhau
chiếm tỷ lệ lớn trên 80% trong số các tiêu chuẩn cơ sở của thuốc 3B đang lu
hành hiện nay. Phơng pháp HPLC có độ chính xác và tin cậy cao, tiến hành đơn
giản, khả năng áp dụng rộng rÃi trên nhiều loại chế phẩm.
Với ý nghĩa này, đề tài này đợc thực hiện bằng phơng pháp sắc kí lỏng
hiệu suất cao. Chúng tôi hy vọng rằng các kết quả thu đợc đáp ứng yêu cầu của
phép phân tích và có độ tin cậy cao.
III. Một số vấn đề khi áp dụng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao

Chuyên ngành hoá phân tích

12


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

để xác định Vitamin B12 trong viên nén Vitamin 3B.
III.1. Cơ sở lý thuyết của phơng pháp HPLC.
III.1.1. Khái niệm:
Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phơng pháp chia tách trong đó pha động
là chÊt láng vµ pha tÜnh chøa trong cét lµ mét chất mang rắn đà đợc phân chia
dới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một
chất mang đợc biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình
sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo
kích cỡ.
III.1.2. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột.
- Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc
kí và loại sắc ký.
+ Nếu pha tĩnh là chât hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ pha thuận hoặc
pha đảo.
+ Nếu pha tĩnh là chât trao đổi Ion thì ta có sắc kí trao đổi Ion.
+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc kí phân bố hay sắc kí chiết.
+ Nếu pha tĩnh là gen thì ta có sắc kí gen hay sắc kí Rây phân tử.
- Cùng với pha tĩnh, để rữa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần
có một pha động.
Nh vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C,...
vào cột tách, kết quả là các chất A, B, C,.. sẽ đợc tách ra khỏi nhau sau khi đi
qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng của các tơng tác.
III.1.3. Các đặc trng của Pic sắc kí.
Đờng cong rữa giải (tín hiệu phụ thuộc thời gian). Sau một quá trình sắc
kí tách đợc gọi là sắc đồ, nó thờng có các dạng sau:

Chuyên ngành hoá ph©n tÝch

13


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

Trong đó:
t0: Thời gian chết là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
tách.
tR: Thời gian lu: thời gian cần thiết kể từ khi chất đợc bơm vào cột cho
đến khi đạt đợc nồng độ cực đại của nó, xuất hiện ở thời điểm cuối của hệ thống
tách.
tR: thời gian lu thực b»ng thêi gian lu tR - thêi gian chÕt t0
δ t : độ lệch chuẩn = độ rộng rữa Pic tại các điểm uốn tơng ứng.
0.5 : độ rộng Pic ë nưa chiỊu cao = 2.354 δ t
ωb : ®é rộng đáy Pic

Từ các thông số của các Pic trên đây, nhiều đại lợng đặc trng về lý thuyết
đợc đa ra để đánh giá một quá trình sắc kí. Sau đây chúng tôi chỉ đề cập đến
những đại lợng thờng dùng trong thực tế và cách làm thay đổi giá trị các đại lợng có lợi cho việc phân tích b»ng HPLC.
III.1.3.1. Thêi gian lu tR
Thêi gian lu cña mét chÊt lµ thêi gian tÝnh tõ lóc bá mÉu vµo cột đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời

Chuyên ngành hoá phân tÝch

14

Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

gian lu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện HPLC đà chọn. Vì vậy thời gian lu là đại lợng đặc trng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lu phụ thuộc vào các yếu tố:
+ Bản chất sắc kí của pha tĩnh
+ Bản chất thành phần, tôc độ của pha động
+ Cấu tạo và bản chất phân tích của chât tan.
+ Trong một số trờng hợp còn phụ thuộc và PH của pha ®éng.
tR = to (dd) (1 + K’)
- Trong mét phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn tR lớn quá
(tR> 20phút) thì Pic bị loÃng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài. Để thay
đổi thời gian lu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố trong các yếu tố phụ
thuộc trên đây.
III.1.3.2. Hệ số dung lợng K
Hệ số dung lợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chÊt ®ã
trong 2 pha céng víi søc chøa cđa cét, tức là tỷ lệ số giữa lợng chất tan trong
pha tĩnh và lợng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.
Hệ số dung lợng K phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tính
của pha tĩnh và pha động, K thờng đợc tính theo công thức:

K' =

t R t R − to t R
=
= −1
to
to

to

NÕu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. K lớn thì Pic bị loÃng, độ
nhạy kém. Trong thực tế K từ 1 đến 5 là tối u.
III.1.3.3. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách cđa hƯ thèng s¾c kÝ, khi hai chÊt A,
B cã KA và KB khác nhau thì mới có khả năng tách , mức đọ tách biểu thị ở độ
chon lọc .

Chuyên ngành hoá phân tích

15


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

'
K A t RB to
α= ' =
K B t RA − to (K’ > K’ )
A
B

III.1.3.4. Sè ®Üa lý thuyÕt N
Sè ®Üa lý thuyÕt là đại lợng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện
sắc kí nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc kí nh là một lớp pha tĩnh có
chiều cao là H, tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ
phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động đợc thiết lập giữa nồng độ

trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Vì vậy với một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cùng hằng định
đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định:
Số đĩa lý thuyết N đợc tÝnh theo c«ng thøc:
2

2

2
 t 
t 
 tR 
N =  ÷ = 5,54  R ÷ = 16  R ữ
ữ

b
0,5

III.1.3.5. Độ phân giải R.
Độ phân giải là một đại lợng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau
trên điều kiện sắc kí đà cho. Độ phân giải của 2 Pic cạnh nhau đợc tính theo
công thức:

R=

2 ( t R 2 − tR1 )

ω b,1 − ωb,2

=

1,177 ( tR 2 − tR1 )

0,5.1 0,5.2

Nếu nồng độ ở đáy Pic b,1 và b,2 xấp xỉ bằng nhau thì độ phân giải biểu
thị bằng số lần độ rộng của Pic.
ở độ phân giải R = 0,5, các đỉnh của Pic vẫn có thể thu đợc một cách
riêng biệt. Đối với các Phơng pháp phân tích định lợng ngời ta mong muốn độ
phân giải 1,5. Các giá trị của R lớn hơn 1,5 cũng không cần thiết vì thời gian
phân tích dài.
Độ phân giải phụ thuộc vào các hằng số K2 (hệ số dung lợng của cấu tử
ra sau), độ chọn lọc và số đĩa lý thuyết N của cột.

Chuyên ngành hoá phân tích

16


Khoá luận tốt nghiệp

R=

Lê Minh Đức

N 1 K 2
.
.
4
1 + K2

Nếu R nhỏ thì các Pic cha tách hẳn, việc tính diện tích Pic sẽ không
chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau đây:
+ Làm thay đổi K bằng cách thay đổi lực rữa giải của pha động (thay đổi
độ phân cực nếu là RP-HPLC, thay đổi cờng độ nếu là IE-HPLC,...)
+ Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột
có kích thớc hạt nhỏ hơn,...
+ Làm tăng độ chọn lọc bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá
trình tách, hoặc thay đổi thành phần pha động.
Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, dộ nhạy
sẽ kém, lúc này phải tìm cách làm giảm R bằng cách: ứng dụng quá trình rữa
giải Gradient để cho chất thứ 2 ra nhanh hơn, nếu thiết bị không có khả năng
này thì phải thay đổi thành phần hoặc tỷ lệ pha động.
III.1.3.6. Hệ số không đối xứng T.
Hệ số ®èi xøng T cho biÕt møc ®é kh«ng ®èi xøng của Pic trên sắc độ thu
đợc. T đợc tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nữa Pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều
cao của Pic

T = b/a
Pic dạng đối xứng hình Gaus trên thực tế khó đạt đợc, vì vậy phải quan
tâm đến hệ số không đối xứng T, khi T 2,5 thì phép định lợng đợc chấp nhận,
nếu T > 2,5 thì điểm cuối của Pic rất khó xác định, vì vậy cần thay đổi các điều
kiện sắc kí để làm cho Pic cân xứng hơn theo các cách sau:

Chuyên ngành hoá phân tích

17


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

+ Làm giảm thể tích chết, tức là đoạn nối từ cột đến Đetecter.
+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rữa giải tăng lên.
+ Giảm bớt lợng mẫu đa vào cột bằng cách pha loÃng mẫu phân tích hoặc
giảm thể tích thân.
III.2. Đánh giá Pic (diện tích, chiều cao) và các phơng pháp định lợng
thờng dùng trong HPLC.
III.2.1. Đánh giá diện tích Pic.
Diện tích Pic của một chất là tơng ứng với lợng chất đó. Để tính diện tích
Pic, hiện nay ngời ta thờng dùng tích phân kế. Phơng pháp này có thể dùng cho
các Pic không bị trôi đờng nền và cả Pic có đờng nền bị trôi. Phơng pháp này đo
chỉ cần điểm đầu và cuối của Pic đợc nhận ra chính xác và nó cho kết quả tốt
đối với nồng độ trung bình và cao.
Việc xác định diện tích Pic phải đợc sử dụng trong các trờng hợp yếu tố
dung lợng không thay đổi vì ảnh hởng của các chất khác.
Việc tính toán diện tích Pic sẽ không gặp khó khăn khi Pic có cờng độ
quá cao hoặc quá loÃng, không đối xứng và Đetecter bị nhiễu.
III.2.2. Xác định chiều cao Pic.
- Khi Pic có dạng không đổi thì chiều cao Pic (khoảng cách giữa đờng
nền và đỉnh Pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích và nó cũng có thể đợc dùng
để đánh giá sắc phổ.
- Chiều cao Pic đợc xác định dễ dàng bằng tay vì thế nó là phơng pháp đợc chọn nếu sắc đồ đợc vẽ trên một máy ghi.
- Một điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao Pic là các chỉ số
K hằng định.
- Để đo độ tuyến tính, việc đo chiều cao Pic chỉ thích hợp khi nồng độ
mẫu từ thấp đến trung bình. Khoảng tuyến tính sẽ rộng hơn đối với các cấu tử đợc rữa giải chậm hơn so với trờng hợp các cấu tử này đợc rữa giải nhanh.
- Với các Pic có đờng nền bị nhiễu, việc xác định chiều cao Pic sẽ dễ
dàng hơn xác định diện tích Pic.

Chuyên ngành hoá ph©n tÝch

18


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

III.2.4. Phơng pháp chuẩn ngoại.
- So sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diƯn tÝch Pic hc chiỊu cao
Pic) trong mÉu thư cho biết với một dung dich chuẩn của chất đó là một phơng
pháp phổ biến trong sắc kí.
- Phơng pháp này yêu cầu bơm các thể tích xác định trong điều kiện sắc
kí. Các chất đợc bơm vào dới dạng dung dich chuẩn có khoảng nồng độ nh
trong mẫu thử.
- Phơng pháp này có thể tiến hành ở các nồng độ khác nhau ( chuẩn hoá
một điểm, 2 điểm, nhiều điểm). Trong phơng pháp chuẩn 1 điểm nồng độ của
mẫu có thể đợc tính nh sau:

Ca = S a .

Cst
S st

Trong ®ã: Ca : nång ®é mÉu thö
Cst : nång ®é mÉu chÊt chn
Sa : ®é lín cđa Pic mÉu thư (diện tích hoặc chiều cao Pic)
S st : độ lớn của Pic mẫu chuẩn.

- Với phơng pháp xác định 2 điểm hay nhiều điểm, phân tích chuẩn phải
đợc xác định đầu tiên. Thờng đợc mô tả bằng đờng chuẩn thu đợc từ các điểm
đo, cùng với Phơng pháp phân tích håi quy.

S st = So + mC st
So : Giao ®iĨm cđa ®êng chn vµ trơc tung

m: ®é dèc cđa ®êng chn
Trong thÝ nghiƯm nµy, nång ®é cđa mÉu thư đợc tính theo công thức sau:

Ca =

S a So
m

Độ lớn của Pic mẫu thử Sa nên nằm giữa độ lớn của Pic chuẩn thấp nhất
và cao nhất bởi vì đờng chuẩn đợc xác định trong vùng nồng độ đà nghiên cứu

Chuyên ngành hoá phân tích

19


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

này.
III.2.4. Phơng pháp chuẩn nội.

- Để giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong định lợng bằng HPLC, ngời ta
sử dụng Phơng pháp chuẩn hoá với chất thứ hai thêm vào chất chuẩm ngoại và
mẫu thử. Chất này gọi là chuẩn nội
- Trong cùng điều kiện sắc kí nó có thời gian lu gần thời gian lu của chất
cần phân tích trong mẫu thử. Nó đợc tách hoàn toàn, và có nồng độ gần bằng
nồng độ của chất cần phân tích và có cấu trúc hoá học tơng ứng.
- Độ nhạy của chất chuẩn nội và chất cần phân tích là khác nhau, vì thể
yếu tố hiệu chỉnh Fx phải đợc xác định đầu tiên với dung dịch chuẩn tinh khiết.
Nếu gọi: Cx là nồng độ của dung dich chuẩn
Cis là nồng độ của dung dich chất chuẩn nội
Sx là độ lớn Pic chuẩn (chuẩn ngoại)
Sis là độ lớn Pic chuẩn nội
Thì:

Fx =

Sis .C x
S x .C is

- NÕu yÕu tè hiÖu chØnh Fx là hằng số trong vùng nồng độ nghiên cứu,
nồng ®é Ca cđa mét mÉu mµ trong ®ã ngêi ta thªm chÊt chn néi cã thĨ tÝnh
nh sau:

Ca =

Sa
.Cis .Fx
Sis

III.2.5. Phơng pháp thêm chuẩn.

- Phơng pháp thêm chuẩn đợc sử dụng trong HPLC chủ yếu khi có vấn đề
ảnh hởng của chất phụ.
- Dung dịch mẫu thử đợc thêm vào một lợng xác định chất chuẩn.
- Các Pic thu đợc của cả 2 dung dich mẫu thử và mẫu thử thêm chất
chuẩn phải đợc đo trong cùng một điều kiện sắc kí.

Chuyên ngành hoá phân tích

20


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

- Phơng pháp thêm chất chuẩn có thể đợc thực hiện 1 lần, 2 lần, nhiều
lần:
+ Trong trờng hợp đơn giản nhất đối với một lần chất thêm chuẩn , nồng
độ cho biết của mẫu Ca đợc tính bằng sự chênh lệch nồng độ
chuẩn thêm vào) và độ tăng của độ lớn Pic
Ca =S a .

s

c

(lợng chất

theo công thức sau:

c

s

+ Với phơng pháp thêm nhiều lần, nồng độ của mẫu chuẩn đợc ít tốn
kém bằng Phơng pháp phân tích hồi quy.
- u điểm của phơng pháp thêm chất chuẩn là có độ chính xác cao và loại
trừ đợc các yếu tố ảnh hởng khác. Sự thay đổi về nhiệt độ, áp suất đà đợc mô tả
bù trừ trong đồ thị chuẩn và ảnh hởng đến kết quả đo đạc.
- Nhợc điểm: đòi hỏi nhiều thời gian phân tích vì phải chuẩn hoá đối với
từng mẫu mà không chuẩn hoá định kỳ nh khi dùng Phơng pháp chuẩn ngoại.
III.2.6. Phơng pháp quy về 100% diện tích Pic.
- Kỹ thuật này đơn giản nhng trong HPLC thì việc ứng dụng bị hạn chế,
thờng hay đợc dùng trong sắc kí khí. Nó đòi hỏi cấu tử trong hỗn hợp chất cần
phân tích đều đợc rửa giải và đợc phát hiện.

%X =

AX .100
AX + AY + AZ

%X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z
AX, AY, AZ: diƯn tÝch Pic cđa cÊu tư X, Y, Z
- Trong HPLC, các công thức này chỉ đúng khi sự đáp ứng của Detector
trên các cấu tử X, Y, Z là nh nhau. Nếu không nh nhau, mỗi cấu tử cần có hệ số
điều chỉnh f(x), f(y), f(z)

%X =

AX . f ( x ) .100
AX . f ( x ) + AY . f ( y ) + AX . f ( z )

Chuyên ngành hoá phân tích

21


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

Muốn xác định f(x) phải cã chn cho c¸c c¸c cÊu tư.
VÝ dơ:
f( x ) =

Ac .Wx . f ( x )
AX .Wc

Ac, Ax: diÖn tÝch Pic cđa chn vµ cÊu tư X
Wc, WX: lƯch chuẩn và lợng cấu tử X đà dùng
f(x): hệ số điều chỉnh của chuẩn.

Chuyên ngành hoá phân tích

22


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

Phần II. Thực nghiệm
I. Dụng cụ - hoá chất
I.1. Dụng cụ:
I.1.1. Máy sắc kí:
- Máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC của hÃng Shimadzu Nhật Bản)
+ Detecter: uv/vis
+ Cột tách: Lichrosorb RP 18 (5-10 à m, 150 x 4 mm)
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
+ Bớc sóng phát hiện: 550 nm
+ Thể tích tiêm: 20 à l
+ Cột nhồi Silicagel
+ Pha tĩnh: Silicagel
Sơ đồ:

Thiết bị cã thĨ hiƯn mét khèi hay nhiỊu khèi riªng biƯt lắp ráp vào nhau.
Các bộ phận của thiết bị gồm:
+ (1), (4) Bộ phận kiểm tra bơm và chơng trình hoá
+ (2) Bình chứa dung môi

Chuyên ngành hoá phân tích

23


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

+ (3) Bơm cao áp
+ (4) Bộ phận bÃo hoà dung môi
+ (6) áp kế
+ (7) Bé phËn ®a mÉu
+ (8) Bng ®iỊu nhiƯt
+ (9) Cột tách
+ (10) Bộ phận đo dòng
+ (11) Detecter
+ (12) Máy ghi
+ (13) Máy tính xử lý các kết quả do bé phËn ghi ®a ®Õn
+ (14) Bé phËn ®Ĩ thu các cấu tử cần tách.
I.1.2. Các dụng cụ khác
- Bình cầu
- ống nghiệm
- Giấy lọc
- Máy lắc siêu âm
- Cân phân tích
- Máy hút chân không
I.2. Hoá chất.
- Thuốc viên nén Vitamin 3B
- Dung dịch Cyanocobanlanic chuẩn: 5 à g/ml
- Etanol: 2%
- Níc cÊt 2 lÇn
- Metanol: 2%
II. Kû thuật sắc kí lỏng cao áp
- Sơ đồ sắc kí lỏng cao áp đợc mô tả trên. Thiết bị gồm một bơm cao áp
(3) đẩy chất lỏng pha trộn qua cột tách, bình chứa dung môi (2), bộ phận bÃo

Chuyên ngành hoá phân tích

24


Khoá luận tốt nghiệp

Lê Minh Đức

hoà dung môi vật chất lỏng pha tĩnh hoặc với nớc (5) trớc khi vào cột tách để
làm giảm sự thay đổi tính chất của cột tách do pha động gây nên, bộ phận đa
mẫu (7), cét t¸ch (9) detecter (11), m¸y ghi 12.
- Khi rữa giải Gradien ngời ta lắp ráp thêm bộ phận (1) và (4) để kiểm tra
bơm và chơng trình hoá. áp suất vào cột tách đợc đo bằng áp kế 6. Cột tách và
hệ thống đa mẫu vào cột tách qua bộ phận bơm mẫu (7). Để chính xác ngời ta
lắp thêm phân đoạn (14) để thu các cấu tử cần tách, bộ phận máy tính (13) để
xử lý các kết quả đo đạc do bộ phận ghi đa đến.
- Khi sư dơng ta cÇn cã kü tht tõ viƯc sử dụng bơm cho đến yêu cầu
của pha động rồi tốc độ dòng, áp suất, cách đa mẫu vào cột tách, rồi cột tách,
cột nhồi phải nh thế nào, cách sử dụng lợng mẫu, rồi cách tăng tốc độ, các loại
detecter khi dùng trong sắc kí lỏng cho hợp lý. Vậy ta xét lần lợt các bộ phận.
II.1. Bơm
Trong sắc kí lỏng cao áp, bơm áp suất cũng nh detecter là những bộ phận
rất quan trọng. Rất nhiều hệ tách phải tiến hành với áp suất lớn hơn 100 atm.
Dung môi rữa giải (pha động) cần phải chuyển thành dòng qua cột tách
liên tục và không có xung ở áp suất cao.
Công suất cần thiết của bơm cho mục đích phân tích (đờng kính bên
trong cột tách 5 mm) khoảng 0,1 - 10ml/phót ë ¸p st 300 - 400 atm, còn mục
đích điều chế công suất đòi hỏi lớn hơn nhiều (100 ml/phút).
Với bơm pitông cơ học, tốc độ dòng đạt đợc một giá trị ứng với áp suất tơng ứng. Thay thế bơm bằng áp suất khi đầy dung môi thì áp suất bên trong là
thông số kiểm tra và tốc độ dòng có thể thay đổi theo áp suất.
Bơm kiểu Pitông nhỏ tao ra xung không mong muốn ví ảnh hởng đến độ

ổn định của detecter, độ phân giải của cột tách và độ lặp lại của quá trình làm
việc.
Để loại trừ nhiều của đờng nền thờng ngời ta có thể sử dụng bơm nhiều
Pitông, để làm phẳng nền là sử dụng ống nilong có đờng kính trong 1,5 mm và
dài vài mét lắp giữa bơm và cột sắc kí.
Chuyên ngành hoá phân tích

25