Định lượng e coli bằng phương pháp màng petrifilm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
TÊN ĐỀ TÀI : ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG
PETRIFILM

SVTH: Nhóm 11

GVHD: Đinh Thị Hải Thuận

Trưởng nhóm: Nguyễn Như Mai

Mssv: 2005200137

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

Mssv: 2005201061

Nguyễn Bùi Hạnh Nguyên

Mssv: 2005200600

Trần Lữ Anh Thư

Mssv: 2005201099

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 20


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
TÊN ĐỀ TÀI : Định Lượng E.Coli Bằng Phương Pháp Màng Petrifilm

SVTH: Nhóm 11

GVHD: Đinh Thị Hải Thuận

Trưởng nhóm: Nguyễn Như Mai

Mssv: 2005200137

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

Mssv: 2005201061

Nguyễn Bùi Hạnh Nguyên

Mssv: 2005200600

Trần Lữ Anh Thư

Mssv: 2005201099

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 2022


MỤC LỤC
MỤC LỤC

1

MỤC LỤC HÌNH ẢNH

2

MỤC LỤC BẢNG BIỂU

2

LỜI CAM ĐOAN

3

LỜI CẢM ƠN

4

LỜI MỞ ĐẦU

5

I. TỔNG QUAN VI KHUẨN E.COLI

5

1. Đặc điểm vi khuẩn E.coli

5

2. Tính sinh hóa của E.coli

7

3. Nguồn lây nhiễm E. coli

7

II. PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM

8

III. ĐỊNH LƯỢNG E. COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM

10

1. Phạm vi áp dụng

10

2. Ngun tắc

10

3. Mục đích từng bước trong mơi trường

10

4. Màu khuẩn lạc và gải thích

10

5. Mơi trường và hóa chất

11

6. Thiết bị và dụng cụ

13

7. Chuẩn bị mẫu thử

15

8. Cách tiến hành

16

KẾT LUẬN

18

TÀI LIỆU THAM KHẢO

19

1

MỤC LỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Vi khuẩn E.coli
Hình 2: Đĩa Petrifilm
Hình 3: Khuẩn lạc trên màng petrifilm
Hình 4: Dụng cụ dàn mẫu
Hình 5: Thiết bị đếm khuẩn lạc
Hình 6: Nồi hấp áp lực
Hình 7: Khuẩn lạc trên màng Petrifilm

6
8
11
13
14
15
17

MỤC LỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Mơi trương và hóa chất
Bảng 2: Chất dinh dưỡng VRBGA

11
12

2


LỜI CAM ĐOAN
Chúng em xin cam đoan đề tài: “Định lượng E.Coli bằng phương pháp màn
Petrifilm” này là do chính chúng em thực hiện.

Các nội dung trình bày trong tiểu luận là trung thực, không sao chép. Các tài liệu tham
khảo sử dụng trong bài được trích dẫn nguồn và chú thích rõ ràng.

TP.HCM, ngày 20 tháng 10 năm 2022
Sinh Viên Thực Hiện
Nhóm 11

 

3


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành bài tiểu luận này, nhóm chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Thành phố Hồ Chí Minh
vì đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất với hệ thống thư viện hiện đại, đa dạng các
loại sách, tài liệu thuận lợi cho việc tìm kiếm, nghiên cứu thơng tin.
Nhóm chúng em xin cảm ơn giảng viên bộ môn Cô Đinh Thị Hải Thuận đã giảng dạy
tận tình, chi tiết để chúng em có đủ kiến thức và vận dụng chúng vào bài tiểu luận
này.
Do chưa có nhiều kinh nghiệm về nội dung để tài cũng như những hạn chế về kiến
thức, trong bài tiểu luận chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong
nhận được sự nhận xét, ý kiến đóng góp, phê bình từ phía Cơ và các bạn để bài tiểu
luận của nhóm chúng em được hồn thiện hơn.
Lời cuối, nhóm chúng em xin kính chúc Cơ nhiều sức khỏe và thành công trên con
đường giảng dạy.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 2022
Sinh Viên Thực Hiện

Nhóm 11
 

4


LỜI MỞ ĐẦU
Escherichia coli (viết tắt: E. coli) là một lồi vi khuẩn gram âm, phân bố rất rộng
trong mơi trường sống trên Trái Đất, hay có mặt ở thực phẩm, nguồn nước, thường kí
sinh trong ruột già của người và hầu hết các loài thú đẳng nhiệt. Đa số các chủng E.
coli là vơ hại mặc dù kí sinh, chỉ một số dịng có thể gây ngộ độc thức ăn, gây bệnh
đường ruột. Trong những trường hợp nhất định, chúng còn giúp vật chủ nhờ sản
xuất vitamin K2, và chống sự xâm lấn của một vài mầm bệnh khác, tạo nên một mối
quan hệ cộng sinh.
E. coli thường được nhắc đến chủ yếu vì nó là lồi sinh vật vơ hình rất quan trọng
trong sinh học hiện đại, đặc biệt trong di truyền phân tử. Ngồi ra, sự có mặt của
chúng trong nguồn nước là một chỉ tiêu quan trọng để đo độ sạch của nước, do E.
coli bị thải ra mơi trường qua phân, có khả năng tiếp tục tạo nên các quần thể sống tự
do, sinh trưởng mạnh trong phân tươi ở điều kiện hiếu khí vài ba ngày rồi mới giảm
tăng trưởng.
Để định lượng E. coli có nhiều phương pháp như: Đếm khuẩn lạc, màng lọc, MPN,
màng petrifilm. Bài cáo cáo này nhóm chúng em xin phép sẽ trình bày về đề tài:
“ĐỊNH LƯỢNG E. COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM”

I. TỔNG QUAN VI KHUẨN E.COLI
1. Đặc điểm vi khuẩn E.coli
Escherichia coli (còn được gọi là E. coli) là một trong những vi sinh vật
thường gặp trong môi trường. Nhiều người không coi E.coli là vi sinh vật gây bệnh do
thực phẩm song những nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng của chúng thực sự
có khả năng lây bệnh lây lan qua thực phẩm rất nghiêm trọng.

E. coli là dạng trực khuẩn gram âm kị khí tuỳ nghi, khơng sinh bào tử, khá phổ
biến trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hoá của người và động vật. Chúng
thuộc loại glucose và lactose dương tính, indol và methyl red dương tính song có phản
ứng VP và citrate âm tính.
Tế bào Escherichia coli thường rộng 1,1–1,5 μm, dài 2–6 μm và đường kính m, dài 2–6 μm, dài 2–6 μm và đường kính m và đường kính
0,25–1,0 μm, dài 2–6 μm và đường kính m, với thể tích tế bào là 0,6–0,7 μm, dài 2–6 μm và đường kính m3 tồn tại dưới dạng các que thẳng đơn
5


lẻ. Chúng có thể di động hoặc khơng di động, và khi chuyển động sẽ tạo ra một bên,
chứ không phải là lơng roi phân cực. Ngồi trùng roi, nhiều chủng tạo ra fimbriae
hoặc pili, là những cấu trúc protein (hoặc phần phụ hoặc sợi) kéo dài ra ngoài từ bề
mặt vi khuẩn và đóng vai trị gắn kết tế bào với các tế bào khác hoặc với mô vật chủ.

Hình 1: Vi khuẩn E.coli
Sáu chủng E. coli khác nhau được biết là nguyên nhân gây tiêu chảy. Các
chủng này là:
1. E. coli sinh độc tố Shiga (STEC): Đây là loại vi khuẩn được biết đến
nhiều nhất đối với việc ô nhiễm thực phẩm do E. coli. Chủng này còn được gọi
là E. coli sinh ruột (EHEC) và E. coli sinh verocytotoxin (VTEC).
2. Enterotoxigenic E. coli (ETEC): Chủng này thường được biết đến như
một nguyên nhân gây tiêu chảy cho khách du lịch.
3. E. coli tiêu hóa đường ruột (EAEC).
4. E. coli xâm nhập (EIEC).
5. E. coli sinh đường ruột (EPIC).
6. E. coli bám dính phân tán (DAEC).
E. coli là một nhóm vi khuẩn lớn và đa dạng. Mặc dù hầu hết các chủng E. coli
đều vô hại, nhưng một số khác có thể gây bệnh cho người bệnh. Một số loại E. coli
gây bệnh bằng cách tạo ra một loại độc tố gọi là độc tố Shiga. Vi khuẩn tạo ra các độc
tố này được gọi là “E. coli sản xuất độc tố Shiga”, viết tắt là STEC, có thể phát triển ở

nhiệt độ từ 7°C đến 50°C, với nhiệt độ tối ưu là 37 °C. Một số STEC có thể phát triển
6


trong thực phẩm có tính axit, độ pH xuống tới 4,4 và trong thực phẩm có hoạt độ nước
tối thiểu (aW) là 0,95. STEC nổi tiếng nhất ở Bắc Mỹ và thường được gọi là E. coli
O157: H7, hoặc chỉ E. coli O157.
Có những loại STEC khác được gọi là STEC không thuộc O157. Các chủng
này gây bệnh tương tự như chủng O157 nhưng ít có khả năng dẫn đến các biến chứng
nghiêm trọng.

2. Tính sinh hóa của E.coli
E. coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E. coli
đều lên men lactose và sinh hơi trừ E. coli trơ (trong đó có EIEC) không hoặc lên men
rất chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên men
nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp vào
một nhóm vi khuẩn có tên chung là Coliform.
E. coli có khả năng sinh indole, khơng sinh H2S. Chúng thuộc loại glucose và
lactose dương tính indol và đỏ methyl, VP âm tính, citrat âm tính, urease âm tính,
H2S âm tính.

3. Nguồn lây nhiễm E. coli
Một số thực phẩm bị ô nhiễm như:
Thịt: Thịt bị nhiễm vi khuẩn E. coli trong quá trình giết mổ, khi vi khuẩn E.
coli trong ruột động vật dính vào các vết cắt của thịt và đặc biệt là khi thịt của nhiều
con vật được xay cùng nhau. Thịt chưa nấu chín (E. coli bị giết khi thịt được nấu chín
kỹ) có thể bị nhiễm E. coli.
Sữa chưa tiệt trùng (nguyên liệu): E. coli trên bầu vú của bị và / hoặc thiết bị
vắt sữa có thể xâm nhập vào sữa. Uống sữa tươi bị ô nhiễm có thể dẫn đến nhiễm
khuẩn E.coli vì nó chưa được đun nóng để tiêu diệt vi khuẩn.

Phơ mai mềm làm từ sữa tươi.
Trái cây và rau: Các loại cây trồng gần các trang trại chăn ni có thể bị ô
nhiễm khi phân động vật chứa E. coli kết hợp với nước mưa và nước chảy tràn vào
các cánh đồng và đất sản xuất.
7


Nước bị ô nhiễm
Môi trường bị nhiễm phân hay chất thải hữu cơ
E. coli trong phân của cả động vật và con người có thể tồn tại trong tất cả các
loại nguồn nước bao gồm ao, hồ, suối, sông, giếng, bể bơi trẻ em và thậm chí trong
các nguồn cung cấp nước của thành phố địa phương chưa được khử trùng.

II. PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM
Môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định vào các màng mỏng gọi là
Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào một 1ml
dịch mẫu rồi đậy lại. Một đĩa petri nhựa được đặt lên màng bảo vệ để tạo một khn
trịn. Mơi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian
ủ. Có thể đếm trực tiếp số khuẩn lạc trên Petrifilm
Kỹ thuật màng pêtri (Petrifilm) là phương pháp có thể dùng để kiểm tra nhanh
vi sinh vật. Trong kỹ thuật này môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định
trên một giá thể mỏng và được phủ bằng một màng bảo vệ. Môi trường dinh dưỡng sẽ
hỗ trợ cho sự tăng trưởng của vi sinh vật trong thời gian ủ và số khuẩn lạc xuất hiện có
thể được đếm trực tiếp. Đây là phương pháp đang được áp dụng phổ biến tại các nước
Châu Âu và đang được các nhà khoa học, các công ty trong nước đặc biệt quan tâm.

Hình 2: Đĩa Petrifilm

Khơng như các phương pháp kiểm tra vi sinh khác, đĩa Petrifilm được chuẩn bị
sẵn giúp cho quá trình kiểm tra đạt năng suất cao hơn. Đặc điểm thiết kế chuyên biệt

8


của chúng như một tấm film được phủ chất dinh dưỡng và chất gel, đĩa Petrifilm sẵn
sàng để sử dụng bất cứ khi nào.
Sử dụng đĩa Petrifilm sẽ tiết kiệm được cơng lao động, vì vậy sẽ có nhiều thời
gian giám sát các điểm tới hạn CCP (Cretical Control Point) thường xuyên hơn. Kết
quả cuối cùng là kiểm soát quá trình sản xuất tốt hơn và chất lượng sản phẩm được
nâng cao hơn.
Quá trình thực hiện bao gồm 3 bước:
Bước 1: Cấy và trải đều 1 ml mẫu trên đĩa.
Bước 2: Ủ ở nhiệt độ thích hợp.
Bước 3: Đếm số khuẩn lạc.
Vì đĩa Petrifilm được làm đồng nhất và dễ dàng sử dụng nên ít xảy ra sai sót so
với các phương pháp khác. Ngồi ra, đĩa có kẻ ơ thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc.
Cho kết quả nhanh, chính xác và nhất qn. Có thể sử dụng máy đếm khuẩn lạc
Quebec-type hoặc nguồn sáng phóng đại.
Đĩa Petrifilm là dụng cụ sẵn sàng lấy mẫu thay thế thạch thông thường, đĩa
petri, miếng đệm môi trường và phễu lọc, dùng một lần và thường được sử dụng trong
thử nghiệm vi sinh vật trong nước.
Một số ưu điểm của đĩa Petrifilm:
- Dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản.
- Thời hạn sử dụng lâu do dùng môi trường đông khô và không cần xử
lý nhiệt như phương pháp thơng thường.
- Có thể dùng nước cất vơ trùng để làm ướt lại môi trường đông khô.
- Sau khi môi trường đơng lại, có thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạp
khuẩn bề mặt.

III. ĐỊNH LƯỢNG E. COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG
PETRIFILM

9


1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa đếm Petrifilm TM để định
lượng coliform và Escherichia coli trong thực phẩm.
Phương pháp này đã được đánh giá liên phòng thử nghiệm.

2. Nguyên tắc
Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất
tạo đông tan được trong nước lạnh. Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha
loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa. Dàn đều dung dịch
huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm2. Chất tạo đơng có trong thành phần của đĩa sẽ
làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lạnh. Đĩa được ủ ấm ở 35°C ± 1°C trong
thời gian thích hợp rồi đếm khuẩn lạc.

3. Mục đích từng bước trong mơi trường
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Mục đích: chuẩn bị trong q trình phân tích thực hiện chính xác hơn
Bước 2: Ủ mẫu
Mục đích: phát hiện sự có mặt của VSV trong các nguyên liệu cần nghiên cứu.
Tiến hành nhân giống VSV.
Bảo tồn các giống VSV thuần khiết.
Nghiêm cứu các đặc tính sinh học và hệ thống sinh học của VSV
Bước 3: Đếm số khuẩn lạc
Mục đích: tính tốn và biểu diễn kết quả

4. Màu khuẩn lạc và gải thích
Hầu hết E.coli (khoảng 97%) sinh beta-glucuronidase, chất này tạo tủa màu
xanh gắn kết với khuẩn lạc.

10


Tấm film phía trên giữ bọt khí sinh ra từ q trình lên men lactose của E.coli.
Khoảng 95% E.coli có sinh bọt khí, cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm
theo bọt khí trên đĩa Petrifilm.

Hình 3: Khuẩn lạc trên màng petrifilm
Không sử dụng đĩa này riêng rẽ để phát hiện E.Coli O157 như hầu hết các mơi
trường kiểm tra E.coli khác.

5. Mơi trường và hóa chất
Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượng
tương đương, trừ khi có quy định khác.
Nước dùng để pha lỗng (dung dịch nước đệm phosphat)
Hòa tan 34 g kali dihydro phosphat (KH2PO4) vào 500 ml nước đựng trong
bình định mức 1 lít, chỉnh pH đến 7,2 bằng khoảng 175 ml dung dịch natri hydroxit 1
M và thêm nước đến vạch. Pha loãng 1,25 ml dung dịch này đến 1 lít bằng nước đã
đun sôi và để nguội, rồi hấp áp lực 15 phút ở 121°C.
Nước dùng để pha lỗng khơng được chứa xitrat, bisulfit hoặc thiosulfat vì có
thể gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật.
Bảng 1: Môi trương và hóa chất

Mơi trường - Hóa chất

Mục đích

Photphat đệm KH 2 PO 4

Dung dịch đệm

Nước cất

Pha loãng mẫu
11


NaOH 1 M

Chỉnh pH

2,3,5 - triphenyltetrazolium clorua

Chất chỉ thị

5 - brom - 4 - clo – 3 – indolyl - ß

Chất chỉ thị

- D - glucuronid
Chất dinh dưỡng mật đỏ - tím (violet red

Cung cấp dinh dưỡng,

bile nutrients)

chọn lọc E. coli

Chất tạo đông

Làm đông môi trường

Peptone và chiết xuất nấm men đóng vai trị là nguồn cung cấp carbon, nitơ,
vitamin và các chất dinh dưỡng tăng trưởng thiết yếu khác. Lactose là carbohydrate có
thể lên men, việc sử dụng chúng dẫn đến sản xuất axit. Chất chỉ thị màu đỏ trung tính
phát hiện độ axit được tạo thành. Tinh thể tím và hỗn hợp muối mật giúp ức chế hệ vi
khuẩn gram dương và không liên quan đi kèm. Natri clorua duy trì trạng thái cân bằng
thẩm thấu. Violet Red Bile Agar khơng hồn tồn đặc hiệu cho ruột; các vi khuẩn
khác đi kèm có thể cho phản ứng tương tự. Các xét nghiệm sinh hóa khác là cần thiết
để xác định dương tính.
Bảng 2: Chất dinh dưỡng VRBGA
Thành phần

Mục đích

Peptone

Cung cấp protein

Chiết xuất men

Cung cấp vitamin

Natri clorua

Cung cấp các ion
Kích thích phát triển VSV, ức chế vi

Hỗn hợp muối mật

khuẩn gram (+)

Glucose

Cung cấp chất dinh dưỡng

Neutral Red

Chất chỉ thị màu
12


Chất chỉ thị màu, ức chế vi khuẩn gram

Crystal Violet

(+)

Agar

Làm rắn môi trường

6. Thiết bị và dụng cụ
- Đĩa đếm E. coli/coliform PetrifilmTM
Đĩa chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím, chất tạo đông tan được trong nước
lạnh, chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua và chất chỉ thị hoạt độ
glucuronidase là 5-brom-4-clo-3-indolyl-ß-D-glucuronid, có thể đếm coliform và E.
coli trên cùng một đĩa. Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng
hai mươi ơ vng, mỗi ơ có diện tích 1 cm2 trên màng nền.

- Dụng cụ dàn mẫu bằng chất dẻo
Gồm có một mặt gờ và một mặt láng, được cung cấp cùng đĩa đếm. Dùng để
dần đều huyền phù lên khắp các vùng sinh trưởng của đĩa.

Hình 4: Dụng cụ dàn mẫu

- Pipet
Sử dụng pipet đã được hiệu chuẩn, dùng để phân tích vi sinh vật hoặc pipet
dạng xyranh có thể phân phối 1.0 ml, chia vạch đến 0.1 ml hoặc có thể dùng pipet tự
động.
Pipet phải phân phối được chính xác các thể tích u cầu. Khơng sử dụng pipet
để phân phối thể tích nhỏ hơn 10 % dung tích của pipet.
13


Ví dụ: Khơng dùng pipet có dung tích lớn hơn 10 ml để phân phối 1 ml.
- Thiết bị đếm khuẩn lạc
Lựa chọn loại chuẩn hoặc loại có độ khuếch đại hoặc độ nhìn thấy tương đương
có thể dễ dàng đếm chính xác khuẩn lạc trên đĩa.

Hình 5: Thiết bị đếm khuẩn lạc
- Cân
Sử dụng cân chính xác đến 0,1g.
- Thiết bị phối trộn cao:
Phải có bình chứa vơ trùng.
- Tủ ấm
Duy trì được nhiệt độ ở 35°C ± 1°C.
- Nồi hấp áp lực
Có thể duy trì nhiệt độ ở 121°C.

14


Hình 6: Nồi hấp áp lực

7. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị tất cả các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo từ 90 ml nước
dùng để pha loãng và 10 ml dung dịch mẫu thử pha lỗng trước đó, trừ khi có quy
định khác. Lắc các dung dịch pha loãng 25 lần với biên độ dao động 30 cm.
Thực phẩm nói chung
- Cân vơ trùng 50 g mẫu thử, chính xác đến 0.1 g, cho vào bình trộn vơ trùng
của thiết bị trộn tốc độ cao. Đối với mẫu đông lạnh, cân mẫu chưa rã đông. Ổn định
mẫu thử đông lạnh ở 2°C đến 5°C trong thời gian không quá 18 h để lấy 50 g phần
mẫu thử, nếu cần. Thêm 450 ml nước dùng để pha loãng và trộn trong 2 phút. Thời
gian trộn mẫu thử đến khi cấy mẫu lên đĩa môi trường không được quá 15 phút.
- Nếu tổng khối lượng mẫu không đủ 50 g thì lấy khoảng một nửa rồi thêm thể
tích nước dùng để pha lỗng cần thiết để có dung dịch pha lỗng 10-1. Tổng thể tích
trong bình trộn phải phủ hồn tồn dao trộn.
Hạt vỡ
- Cân vơ trùng 50 g mẫu thử, chính xác đến 0.1 g, cho vào bình trộn vô trùng
của thiết bị trộn. Thêm 50 ml nước dùng để pha loãng và lắc mạnh (lắc 50 lần với biên
độ dao động 30 cm) để thu được dung dịch pha loãng 100. Để yên trong 3 min đến 5
min và lắc ngay trước khi chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo và
trước khi cấy mẫu.
Bột từ các loại hạt
15


- Cân vơ trùng 10 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn vơ trùng
của thiết bị trộn.Thêm 90 ml nước dùng để pha loãng và lắc mạnh (lắc 50 lần với biên

độ dao động 30 cm) để thu được dung dịch pha loãng 10-1. Để yên trong 3 phút đến 5
phút và lắc ngay trước khi chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo và
trước khi cấy mẫu.

8. Cách tiến hành
Cấy
Đặt đĩa đếm E. coli PetrifilmTM lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm màng mỏng phía
trên ra và nhỏ 1 ml huyền phù mẫu thử vào chính giữa màng nền. Đậy cẩn thận tấm
màng mỏng phía trên xuống chất cấy, cuộn tấm film trên xuống tránh tạo bọt khí.
Dàn đều huyền phù trên diện tích 20 cm2 bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ
dàn mẫu (mặt láng của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới). Lấy dụng cụ dàn mẫu ra
và để yên đĩa trong 1 phút cho gel đông đặc lại.
Ủ
Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang với nắp hướng lên trên, không
chồng cao quá 20 đĩa. Đĩa E. coli 3M Petrifilm được ủ ở 35℃ trong 24 ± 1 h (AOAC
998.08, mẫu thịt, gia cầm và hải sản) hoặc 48 ± 4 h (AOAC 991.14, tất cả các mẫu
thực phẩm khác).
Đếm khuẩn lạc
3M Petrifilm (môi trường mật đỏ đã biến tính) chứa 2,3,5-triphenyltetrazolium
clorua và chỉ thị glucuronidase tạo thành kết tủa xanh lam xung quanh bất kỳ khuẩn
lạc E. coli nào có thể có mặt. Khoảng 95% E. coli tạo ra khí, như được chỉ ra bởi các
khuẩn lạc kết hợp với khí bị cuốn vào (trong khoảng một đường kính khuẩn lạc). Tất
cả các khuẩn lạc màu xanh lam kết hợp với bọt khí được tính là E. coli.

16


Hình 7: Khuẩn lạc trên màng Petrifilm
Khơng đếm các khuẩn lạc phát triển ngồi vịng trịn giới hạn của mơi trường
chọn lọc, khơng đếm các bọt khí giả có thể được tạo ra do thao tác chưa đúng trong

quá trình cấy mẫu lên đĩa.
Tính và biểu thị kết quả
Để tính số lượng E. coli, nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số
lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ
pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên
các đĩa kép của các độ pha lỗng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho
mỗi độ pha lỗng trước khi xác định trung bình số đếm E. coli.
Kết quả sẽ được tính như sau:
N=n×

1
d

Trong đó:
n: là số đếm chính xác trên đĩa
d: là độ pha lỗng tương ứng
Nếu khơng có đĩa nào có số đếm lớn hơn 15 khuẩn lạc với màu đặc trưng kèm
bọt khí trở lên (màu xanh đối với khuẩn lạc E. coli) thì ghi lại số đếm chính xác trên
đĩa có độ pha lỗng thấp nhất (tương ứng với dung dịch ít pha lỗng nhất).
Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 150 thì xác định số đếm ước tính bằng
cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình
17


trên một ô vuông và nhân số đếm này với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20
cm2). Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính.
Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả
được báo là “quá nhiều để đếm”.

KẾT LUẬN

Định lượng E. coli bằng phương pháp màng Petrifilm được đánh giá là nhanh chóng,
có độ tin cậy cao đưa đến kết quả tương đối chính xác từ đó giúp giảm thời gian trong
khâu chuẩn bị. Đây là phương pháp hiện đại và đang được hướng đến áp dụng rộng rãi
hiện nay. Sử dụng đĩa Petrifilm cho kết quả đáng tin cậy. Tất cả các đĩa Petrifilm đều
được sản xuất theo qui trình được chứng nhận tiêu chuẩn ISO 9001 và qui trình quản
lý chất lượng khắc khe. Phương pháp kiểm tra bằng đĩa Petrifilm đã được kiểm định
và công nhận tại Official Methods of Analysis, AOAC. Bộ sản phẩm đĩa cấy Petrifilm
giúp quản lý chất lượng gồm: High-sensitivity Coliform Counts, Rapid Coliform
Counts, Aerobic Counts, E.coli Counts, Yeast and Mold Counts và Enterobacteriaceae
Counts.

18