Định lượng staphylococus aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
🙞🙞🙞
NHĨM 7

TIỂU LUẬN
MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCUS AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾ
M KHUẨN LẠC

TP. HCM, NĂM 2022



BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
🙞🙞🙞
NHĨM 7

TIỂU LUẬN
MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI: Định Lượng Staphylococus Aureus Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩ
n Lạc


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. LỜI CẢM ƠN

5

CHƯƠNG 2. MỞ ĐẦU

6

1.1.

LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

6

1.2.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

6

1.3.

BỐ CỤC TIỂU LUẬN NHÓM

6

CHƯƠNG 3. NỘI DUNG
3.1.

Tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus

7
7

3.1.1.

Đặc điểm

7

3.1.2.

Nơi phân bố

8

3.1.3.

Nguồn nhiễm

9

3.1.4.

Khả năng gây bệnh

9

3.2.

Quy trình định lượng Staphylococus aureus

12

3.2.1.

Phạm vi áp dụng

12

3.2.2.

Ngun tắc

12

3.2.3.

Mơi trường và hóa chất

12

3.2.4.

Quy trình phân tích

14

3.2.5.

Các bước tiến hành

16

3.2.6. Báo cáo kết quả
CHƯƠNG 4.

KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

17
19
20


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Hình 2. Nơi phân bố S. aureus trên cơ thể người
Hình 3. Nhiễm khuẩn da
Hình 4. Nhiễm khuẩn huyết
Hình 5. Viêm phổi
Hình 6. Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp
Hình 7. Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)
Hình 8. Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome)

7
9
10
10
10
11
11

12

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Mơi trường và hố chất
Bảng 2. Ví dụ về biểu thị cách tính kết quả S.aureus

13
18


CHƯƠNG 1.

LỜI CẢM ƠN

Nhóm chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Cơ. Cảm ơn Cơ vì đã hướng dẫn chúng e
m tận tình trong suốt quá trình học. Trong q trình thực hiện, nhóm chúng em sẽ khơ
ng tránh khỏi những thiếu sót, mong cơ góp ý để chúng em dần hoàn thiện hơn.
Chúng em xin chân thành cảm ơn đến trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm T
P. HCM đã tạo cho chúng em một môi trường học tập lành mạnh với đầy đủ các điều k
iện để phục vụ cho quá trình học tập của chúng em tại đây.
Chúng em xin cảm ơn đến thầy cô và các anh chị trong khoa đã hướng dẫn, hỗ trợ
cho sinh viên chúng em đầy sự tận tình.
Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các bậc phụ huynh đã ln âm thầm ở phía sau
đồng hành, ủng hộ và quan sát sự trưởng thành của chúng con.
Nhóm thực hiện
Nhóm 7


CHƯƠNG 2.

MỞ ĐẦU

1.1.

LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) có 3 loại -đó là tụ cầu vàng (S.aureus), tụ cầu
da (S. epidermidis) và tụ cầu hoại sinh (S. saprophyticus). Trong 3 loại đó thì tụ cầu và
ng Staphylococcus aureus là loại vi khuẩn gây nhiều bệnh nhất và có khả năng gây ng
ộ độc thực phẩm, đặc biệt, chúng có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh. Gây bệ
nh của tụ cầu rất đa dạng, trong đó cần quan tâm đến một số bệnh mà tụ cầu gây ra hay
gặp trong mùa hè. Vi khuẩn tụ cầu cũng có thể gây nên các bệnh nhiễm khuẩn (nhiễm
khuẩn bệnh viện) như nhiễm khuẩn vết mổ, nhiễm khuẩn bỏng, nhiễm khuẩn đường hô
hấp (viêm họng, viêm phổi), nhiễm trùng tiết niệu (nhiễm khuẩn tiết niệu thường do tụ
cầu hoại sinh), nặng nhất và nguy hiểm nhất là nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn.
Tụ cầu cũng có thể gây nên các bệnh nặng như viêm tủy xương (gặp trong trường hợp
đóng đinh nội tủy do gãy xương), viêm tĩnh mạch xoang hang, viêm nội tâm mạc hoặc
gây viêm màng não mủ.
Đối với thực phẩm nhiễm Staphylococus aureus không thể nhận biết bằng cảm
quan. Vì vậy rất nguy hiểm đối với người tiêu dùng vì thế việc định lượng Staphyloco
cus aureus rất cần thiết. Chính vì thế trong bài tiểu luận này, nhóm chúng em xin giới t
hiệu tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus và quy trình định lượng Staphylococ
us aureus.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Thông qua đề tài “Định lượng staphylococus aureus bằng phương pháp

đếm khuẩn lạc” thì chúng em sẽ tìm hiểu:
⇨ Tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus.
⇨ Quy trình định lượng Staphylococus aureus.
1.3.

BỐ CỤC TIỂU LUẬN NHÓM
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG
CHƯƠNG 3. KẾT LUẬN


CHƯƠNG 3.
3.1.

NỘI DUNG

Tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus

3.1.1. Đặc điểm
Staphylococcus aureus là một khuẩn cầu Gram dương (+) mà có dạng hình cầu
những tế bào dạng trứng có đường kính khoảng 1µm. Sự phân chia tế bào ở một mặt p
hẳng để tạo thành những khối tế bào không đồng đều giống như chùm nho. Thành tế b
ào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentag
lycin của tụ cầu. S.aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme c
atalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:
H2O2 catalase → H2O + O2

Hình 1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme c
oagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S. aureus, là tiêu chuẩn để phân biệ
t S. aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase: coagulase-cố định (-bound coa
gulase) gắn vào thành tế bào và coagulase-tự do (-free coagulase) được phóng thích kh
ỏi thành tế bào. Có hai phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện tr
ên lam kính và trong ống nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagul

ase-cố định bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm ph
át hiện những coagulase-tự do bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp v
ới những yếu tố khác trong huyết tương tạo thành từng khối hay thành cục.
Huyết tương coagulase→ Khối Fibrin

Cơ chế thơng thường biểu diễn q trình đơng tụ huyết tương như sau:
Prothrombin Ca2+¿↓ → Thrombokinaseenzym Thrombin ↓ Fibrinogen → Fibrin ¿

Ngồi ra, chúng cịn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khả năn
g lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều nh
ạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% muối Na
Cl. Một số dịng S. aureus có khả năng gây tan máu trên mơi trường thạch máu, vịng
10


tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vịng tan máu hẹp hơn so với đ
ường kính khuẩn lạc. Hầu hết các dòng S. aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các sắc tố
này ít thấy khi q trình ni cấy cịn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày ni cấy ở n
hiệt độ phịng. Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong mơi trường có hiện diện lactose hay
các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng.
3.1.2. Nơi phân bố
S.
aureus là vi khuẩn gây bệnh cơ hội cư trú bình thường ở da và màng nh
ày ở người. S. aureus được ước tính cư trú thường xuyên ở 20-30% dân cư và cư trú k
hông liên tục ở 60% dân cư nói chung. S. aureus thường có ở trên bề mặt da do khả nă
ng chịu được độ ẩm thấp và nồng độ muối cao lên đến 15%. S. aureus có khả năng s
ống sót trên các mơi trường khơ và có nhiều chất ức chế như mũi người, da và c
ác bề mặt môi trường, quần áo. S. aureus dễ lây truyền từ người sang người qua đường
tiếp xúc trực tiếp. Nó có thể xâm nhập vào sâu trong tế bào da do bị bỏng, có các vết t
hương hở, có vết cơn trùng cắn hoặc bị mắc các bệnh về da như trứng cá, vẩy nến, ecz

ema...tạo thành các mụn mủ trên da, các ổ apxe. Khi mụn mủ hoặc ổ apxe vỡ sẽ giải p
hóng ra vi khuẩn và độc tố. Vì S. aureus khơng có tính cạnh tranh cao với hệ vi sinh vậ
t trong thực phẩm sống nên sự nhiễm vào thực phẩm chủ yếu là do bàn tay người chế b
iến thực phẩm, tiếp theo là do q trình bảo quản khơng thích hợp giúp cho vi khuẩn p
hát triển và sinh độc tố. Tuy nhiên, S. aureus cũng có mặt trong các thực phẩm nguồn
gốc động vật, sữa động vật, đặc biệt sữa vắt từ các động vật bị viêm vú. Khơng khí, bụ
i và các bề mặt tiếp xúc cũng là đường truyền S. aureus vào thực phẩm.

Hình 2. Nơi phân bố S. aureus trên cơ thể người

Thực phẩm có nguy cơ cao ngộ độc thực phẩm do S. aureus bao gồm thịt và sả
n phẩm thịt, gia cầm, trứng và sản phẩm từ trứng, sữa và sản phẩm sữa, salad, bánh ph
ủ kem, sandwich,... những thực phẩm cần có giai đoạn chuẩn bị bằng tay và được giữ
ở nhiệt độ cao hơn 4°C trong một thời gian dài sau khi chế biến.

4


3.1.3. Nguồn nhiễm
S.aureus có mặt ở khắp nơi, sự lây truyền trực tiếp từ các thương tổn mờ hoặc g
ián tiếp từ khơng khí, dụng cụ hoặc từ nhân viên y tế. Các chủng S.aureus gây nhiễm tr
ùng bệnh viện kháng với kháng sinh cao đặc biệt chủng S.aureus kháng methicillin (M
RSA: Methicilline resistance Staphylococcus aureus).
Yếu tố nguy cơ: những người dễ nhiễm S.aureus là trẻ em, người già, suy dinh
dưỡng, suy giảm miễn dịch hoặc những người làm mất các phương tiện bảo vệ (chích,
nặn non các mụn nhọt...).
3.1.4. Khả năng gây bệnh
Staphylococcus aureus là một trong những nguyên nhân thường xuyên nhất trên
toàn thế giới gây ra bệnh tật và tử vong do một tác nhân truyền nhiễm. Tác nhân gây b
ệnh này có thể gây ra nhiều loại bệnh, từ nhiễm trùng da vừa phải nghiêm trọng đến vi

êm phổi và nhiễm trùng huyết gây tử vong. Điều trị nhiễm trùng S. aureus rất phức tạp
do kháng thuốc kháng sinh và khơng có sẵn vắc xin hoạt động. Người ta đang ngày cà
ng quan tâm nhiều đến số lượng độc tố và các yếu tố quyết định độc lực khác mà S. au
reus tạo ra và cách chúng tác động đến bệnh tật. Vi khuẩn này gây bệnh cho những ng
ười bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực. Staphylococcus aureus là
vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau:
- Nhiễm khuẩn da: Do Staphylococcus ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên n
ó có thể xâm nhập qua lỗ chân lơng, chân tóc hoặc các tuyến dưới da. Sau đó gây n
ên các nhiễm khuẩn sinh mủ : mụn nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối. Mức độ các
nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn. N
hiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch. Đinh râu c
ó thể gây nên những biến chứng nguy hiểm.

Hình 3.

-Nhiễm khuẩn huyết: Staphylococcus aureus là vi khuẩn thường gây nhiễm kh
uẩn đường huyết nhất. Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễ
m khuẩn ngoài da, từ đây vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường
huyết. Ðây là một nhiễm trùng rất nặng. Từ nhiễm khuẩn đường huyết Staphylococ
cus đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc
5


viêm nội tâm mạc. Có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch. Một số nhiễm trùng khu
trú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương.

Hình 4. Nhiễm khuẩn huyết

-Viêm phổi: Do Staphylococcus aureus rất ít gặp. Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đư
ờng hô hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết. Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên

phát do tụ cầu vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu. Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân
này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nguy hiểm.

Hình 5. Viêm phổi

-Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp: Ngộ độc thức ăn do Staphylococcus có t
hể do ăn uống phải độc tố ruột của Staphylococcus, hoặc do Staphylococcus cư trú
ở ruột chiếm số lượng ưu thế. Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùn
g kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí bình thường của đường ru
ột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện cho Staphylococcus aureus
(kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng. Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do t
ụ cầu vàng thường rất cấp tính. Sau ăn phải thức ăn nhiễm phải độc tố Staphylococ
cus 2-8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và
chất nôn chủ yếu là nước. Do mất nhiều nước và chất điện giải nên có thể dẫn tới s
ốc. Ngoài bệnh nguyên nhân do Staphylococcus một số trường hợp có thêm vai trị
của Clotridium diffiticile, sau khi dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng.

6


Hình 6. Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp

-Nhiễm khuẩn bệnh viện do Staphylococcus: Thường rất hay gặp, nhất là đối
với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng từ đó đẫn tới nhiễm khuẩn đường huyết. Các chủ
ng Staphylococcus này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh và phải dùng đến v
ancomycin. Tỷ lệ tử vong ở bệnh này rất cao.
- Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome): Một số chủng Staphyloc
occus aureus tiết ra độc tố exfoliatin, gây viêm da hoại tử và phồng rộp. Bệnh này t
hường gặp ở trẻ em mới đẻ và tiên lượng xấu
Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)

Hình 7. Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)

-Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome): Hội chứng này thường gặ
p ở phụ nữ sử dụng bơng gạc khơng sạch khi có kinh nguyệt. Bệnh khư trú ở âm đạ
o và căn ngun là Staphylococcus aureus. Cấy máu khơng tìm thấy Staphylococc
us aureus. Các dấu hiệu lâm sàng và vi khuẩn cho thấy rằng cơ chế của bệnh là sự
nhiễm độc ngoại độc tố sinh mủ. Năm 1980, ở Mỹ có 940 trường hợp bị hội chứng
này, trong đó có tới 99% là phụ nữ và 98% có liên quan đến việc sử dụng bơng gạc
khơng sạch khi có kinh nguyệt.

7


Hình 8. Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome)

3.2.

Quy trình định lượng Staphylococus aureus

3.2.1. Phạm vi áp dụng
- Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1:1999) dùng đ
ể định lượng S.aureus cho tất cả các loại thực phẩm.
- Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và định lượng Staphylococcus au
reus trong phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc.
- Phương pháp này thích hợp để phân tích mẫu dự kiến chứa trên 100 tế bào S. aure
us trên gam. Nếu nghi ngờ số lượng tế bào thấp hơn giới hạn nêu trên thì nên sử dụng
phương pháp đếm số có xác suất lớn nhất theo TCVN 11039-7:2015.
3.2.2. Nguyên tắc
- Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc một lượng huyền phù quy định ban đầu (s

ản phẩm ở dạng mẫu hoặc huyền phù). Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch p
ha loãng thập phân của huyền phù ban đầu.
- Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 37°C và kiểm tra sau thời gian từ 24h đến 48h.
- Tính số lượng Staphylococcus có phản ứng coagulase dương tính trong một mililit
hoặc một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và khơng điển hình trên các đĩa ở
các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả cố ý nghĩa và được khẳng định bằng kết quả
thử coagulase dương tính.
- Định lượng Staphylococcus aureus được thực hiện bằng cách cấy trang một lượng
mẫu đã biết lên môi trường thạch Baird Parker, vi khuẩn cho những khuẩn lạc đặc trưn
g và được xác định bằng phản ứng coagulase. Một vài chủng cho coagulase âm tính nh
ưng cũng tạo độc tố đường ruột.
3.2.3. Mơi trường và hóa chất

Bảng 1. Mơi trường và hố chất
8


Mơi trường và h
óa chất

Thành phần mơi tr
ường

Mục đích

NaCl (8.5g)

Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu

Dung dịch Saline Peptone (1g)

Peptone Water (S
PW)
Nước cất (100ml)

Nguồn cung cấp nitrogen và carbon, các
amino acid chuỗi dài, vitamin và các chấ
t dinh dưỡng cần thiết khác.

Tryptone (10g)
Nguồn carbon và nitơ trong thạch Baird
Parker Agar

Cao thịt bò (5g)
Cao nấm men (1g)
Natri
(10g)

Cung cấp các vitamin B kích thích sự sin
h trưởng vi khuẩn

pyruvat
Kích thích sự sinh trưởng của Staphyloco
ccus

Môi trường Baid- Glycine (12g)
Parker Agar ( BP
Lithium Chloride (5
A)
Ức chế sự sinh trưởng của các sinh vật k
g)

hác không phải Staphylococcus
Agar (20g)

Tác nhân làm đông cứng

Nước cất (1000ml)

Mơi tường cơ bản
(100ml)
Nhũ tương lịng đỏ t Phân biệt vi khuẩn Staphylococcus dươn
Egg yolk tellurite rứng (5ml)
g tính với coagulase dựa trên lòng đỏ trứ
emulsion
ng
Dung dịch Kali tell
urite 3,5% vô trùng Ức chế sự sinh trưởng của các sinh vật k
(1ml)
hác

9


Sterile saline (64 m
l)

Pancreatic Digest of
Casein (15g)

Làm cho môi trường giàu dinh dưỡng bởi
cung cấp nitơ hữu cơ, đặc biệt amino aci

Peptic Digest of So
d và các peptide chuỗi dài
ybean Meal (5g)
Môi trường Trypti
case Soy Agar (T Sodium Chloride (5
g)
Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu
SA)
Agar (15g)
Tác nhân làm cứng mơi trường
Tryptone (10,0g )
Bột não bị (12,5g)

Cung cấp nitơ, vitamin, khoáng chất, axi
d amin cần thiết cho sự phát triển của hầu
hết các vi sinh vật

Bột tim bò (5,0g)

Natri clorua (5g)

Duy trì sự cân bằng thẩm thấu

Brain heart broth
(BHI)
Natri hydro phosph
ate (Na2HPO4) (2.5 Duy trì hoạt động đệm của môi trường
g)

Glucoza (2g)

Huyết tương thỏ đ
ông khô

Nguồn năng lượng cacbon

Khẳng định S.aureus

10


HCl và NaOH 10
%

Chỉnh pH mơi trường

3.2.4. Quy trình phân tích

11


Chuẩn bị mẫu: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ

Phân lập trên môi trường chọn lọc: cấy trải trên đĩa thạch BPA, ủ ở 37
24

Quan sát và đếm số khuẩn
lạc điển hình

Quan sát và đếm số khuẩn

lạc khơng điển hình

Khẳng định:

Cấy khuẩn lạc khơng điển
hình vào môi trường BHI,
ủ ở 37 , 24 giờ

Cấy khuẩn lạc điển hình v
ào mơi trường BHI, ủ ở 3
7 ±1℃, 24 giờ

Thử nghiệm ngưng kết coagulase (37 ±1℃)

Tính kết quả

Tính tỷ lệ khuẩn lạc điển
hình phản ứng coagulase
(+) trên tổng số khuẩn lạc
điển hình thử nghiệm

Tính tỷ lệ khuẩn lạc điển
hình phản ứng coagulase
(+) trên tổng số khuẩn lạc
điển hình thử nghiệm

Mật độ Staphylococcus aureus trung bình (CFU/g ha
y CFU/ml)

12

3.2.5. Các bước tiến hành
− Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong 10ml/25ml thẻ tích đối với
mẫu lỏng, cho vào túi nhựa PE vô trùng.
Cho dung dịch pha lỗng SPW 90ml/225ml vơ trùng túi nhựa chứa mẫu.
Dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 2-3 phút.
− Bước 2: Pha lỗng mẫu
Dùng pipet vơ trùng hút 1ml huyền phù ban đầu cho vào một ống nghiệm chứa
9ml SPW vơ trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Trộng đều bằng máy vortextrong 5-10 giây để thu được dịch pha loãng 10-2. Nế
u cần, lặp lại thao tác trên để được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,… cho đến khi đ
ạt được độ pha lỗng thích hợp.
− Bước 3: Phân lập trên môi trường chọn lọc
Hút 0,1 ml dung dịch mẫu ở các nồng độ pha lỗng vào giữa đĩa mơi trường BP
A đã được chuẩn bị trước, mỗi nồng độ lặp lại 2 đĩa, dùng que trang trải đều dịch mẫu
trên mặt thạch. Lật ngược các đĩa đã cấy và ủ ở 37 ±1℃, 24 ±3 giờ, hoặc 48 ±4 giờ
− Bước 4: Quan sát và đếm số khuẩn lạc
Sau 24 ±3 giờ, tiến hành đếm số khuẩn lạc S.aureus điển hình và khơng điển hì
nh trên mơi trường thạch BPA. Khuẩn lạc S.aureus điển hình có đường kính 1-1,5mm,
màu đen sang, lồi. Mỗi khuẩn lạc có vầng sang rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn
lạc điển hình được đánh dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa nữa. Sa
u 48 ±4 giờ, Khuẩn lạc S.aureus dương tính có đường kính 1,5-2mm, màu đen, sang, l
ồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là vùng sáng, trong rộng 2-4mm.
Cịn những khuẩn lạc khơng điển hình thì không tạo vầng sáng bao quanh và cũng khô
ng tạo vùng đục bao quanh khuẩn lạc. Những khuẩn lạc không điển hình này cũng đượ
c đánh dấu ở mặt sau của đĩa.
− Bước 5: Phục hồi
Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc khơng điển hình từ BPA sang các ống

nghiệm tương ứng chứa 5ml môi trường BHI. Ủ 37 ±1℃, trong 24 ±3 giờ.
− Bước 6: Khẳng định bằng phản ứng đông tụ huyết tương

13


Nguyên tắc: thử nghiệm khả năng của một số sinh vật làm đông tụ huyết tương
bởi hoạt động của enzyme coagulase. Coagulase được S.aureus tiết ra bên ngoài tế bào
và chúng dễ dàng bất hoạt bởi các protease.
Coagulase là enzyme đóng vai trị đơng tụ huyết tương, chúng kết hợp các cấu t
ử trong huyết tương thành từng khối hay từng cục.
Cách tiến hành: Hút 0,1ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm 10mm × 75mm
đã chứa 0.3ml huyết tương thỏ , ủ ở 37 ±1℃. Kiểm tra sự đông tụ của huyết tương sau
4, 6, 8, 24 giờ. Phản ứng được coi là dương tính khi thể tích đơng tụ chiếm

3
.
4

3.2.6. Báo cáo kết quả
3.2.6.1. Tính tốn kết quả
− Tính tỷ lệ giữa số khuẩn lạc điển hình cho thử nghiệm phản ứng coagulase dươ
ng tính (+) trên tổng số khuẩn lạc điển hình và tỷ lệ giữa khuẩn lạc khơng điển
hình cho thử nghiệm coagulase dương tính (+) trên tổng số khuẩn lạc khơng điể
n hình.
− Tính mật độ S.aureus trung bình trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu:
Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) ¿

10×( N t × H t + N a × H a)
F 1 + F2

Trong đó:
F1 và F2: là hai độ pha lỗng liên tiếp
Nt: tổng số khuẩn lạc điển hình trên một đĩa ở các độ pha loãng F1 và F2
Na: tổng số khuẩn lạc khơng điển hình trên một đĩa ở các độ pha loãng F
1

và F2
Ht: tỷ lệ giữa số khuẩn lạc điển hình cho thử nghiệm coagulase khẳng đị

nh (+) so với khuẩn lạc điển hình
Ha: tỷ lệ giữa số khuẩn lạc khơng điển hình cho thử nghiệm coagulase kh
ẳng định (+) so với số khuẩn lạc khơng điển hình
3.2.6.2. Biểu thị kết quả
Ví dụ:

14


Bảng 2. Ví dụ về biểu thị cách tính kết quả S.aureus

Độ pha l Số khuẩ Số khuẩ Số khuẩn Số phản ứ Ht
ỗng

Ha

n lạc điể n lạc khơ lạc thử ng ng coagul
n
(Nt)

hình ng điển h hiệm phả ase (+)
ình (Na)

gulase
5

5

47

5

2

8

5
5

5
1

30
10-2
5
10-3

n ứng coa

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) ¿

ay CFU/ml)

15

5/5
2/5
5/5
1/5

10×( N t × H t + N a × H a)
=10 ׿ ¿ (CFU/g h
F 1 + F2