Định Lượng E.coli Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩn Lạc.pptx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
KHOA: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
KHUẨN LẠC
GVHD: Đinh Thị Hải Thuận
SVTH: NHÓM 09


Lê Thị Ngọc Hân
Nguyễn Ngọc
Diễm Hằng

Đào Thị
Lan

Thành viên
nhóm 09
Tơ Thành Đạt

Nguyễn Trường
Vũ


NỘI DUNG
1

Tổng quan về
E.coli

3
3 Các bước tiến hành

2

Mơi trường và
hóa chất

4 Tính tốn kết quả


1
Tổng quan về E.coli


PHẠM VI ÁP DỤNG:

Phương pháp được tham chiếu theo ISO 16649-2:2001
được áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.


Trực khuẩn nhỏ uốn
cong gram âm

Không sinh bào tử
và di động, kỵ khí
khơng bắt buộc

VI KHUẨN
E.coli là gì?

Tồn tại lâu trong các
thực phẩm: cá hồi,
phomai, thịt, sữa

Hội chứng dung
huyết, phân có máu


2
Mơi trường và hóa chất


Mơi trường và
hố chất

Mục đích

SPW

Pha lỗng mẫu

TBX

Ni cấy E.coli

HCl 10%
NaOH 10%

Chỉnh pH

SPW
Mụ
c
đích

Chuẩn bị

Dùng
để pha
lỗng
mẫu

Phân phối
90ml dịch
pha lỗng
vào các
bình và 9ml
vào các ống
nghiệm.

Hấp
khử
trùng

Hịa
tan các
thành
phần

Thành phần

Nước
cất
1lít

Pepton
1g

NaCl
8,5g


Thành phần môi trường Saline Peptone Water (SPW)
Thành phần

11/10/2022

Khối lượng

Vai trị

NaCl

1g

Duy trì cân bằng áp suất thẩm
thấu của mơi trường

Peptone

8.5 g

Cung cấp protein (nitơ)

Nước cất vừa đủ

1000 ml

Hòa tan NaCl và Pepton

10


Thành phần & lợi ích mơi trường
TBX
THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG TBX

TÁC DỤNG

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym (pepton)

Cung cấp Nitơ

Muối mật No.3

Kích thích sự phát triển VSV
Dùng để phát hiện E. coli (đổi màu
•Nước cất vơ trùng. xanh)

Ngồi
ra, cịn
Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid
(BCIG)

Thạch
Nước

•Cồn 96o
Xác định tính di động & ni dưỡng
•Mẫu
VSV
- Mơi trường sử dụng: Plate count agar (PCA), pH=7.0 ± 0,2

Dùng để pha chế môi trường


MÔI TRƯỜNG TBX

Tham chiếu theo TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649:2001)

Thành phần

Chuẩn bị

•
•
•
•
•

Sp thuỷ phân casein = ezyme: 20g
Muối mật:1,5g
Acid 5-bromo-4-clo-3-indolyl-Dglucuronid (BCIG)
Thạch: 9g -18g
Nước:1000ml

• Hịa tan BCIG trong dimety sulfoxit hoặc trong dung dịch lỗng
• Chỉnh pH
• Khử trùng mơi trường

• Dùng làm mơi trường ni cấy E.coli

Mục đích


3
Các bước tiến hành


Gồm 4 bước:
Chuẩn bị
mẫu thử,
huyền phù
ban đầu
Cấy & ủ
mẫu

Pha loãng
mẫu

Đếm,
chọn KL
để khẳng
định


Bước 1:

Chuẩn bị
mẫu thử và
huyền phù
ban đầu

Mục đích: Để hịa tan
mơi trường và đo
dung dịch mẫu ở 10-1

Cân chính xác 10g/25g (mẫu rắn)
hoặc 10ml/25ml (mẫu lỏng)

dd pha loãng SPW 90ml/225ml

Đồng nhất mẫu trong máy dập mẫu (60s)
hoặc lắc đều bình tam giác (2÷3’).


Bước 2:
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu vào ống
nghiệm chứa 9ml SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5-10 phút thì thu được

dung dịch pha lỗng 10-2

PHA
LỖNG
MẪU
Mục đích: Làm giảm
mật độ VSV (để đếm
được VSV chính xác
hơn)


Bước 3:

Dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu (hộp đổ) cho vào đĩa
petri (2 đĩa petri với mỗi đĩa 2 nồng độ liên tiếp)
Rót vào mỗi đĩa khoảng 15ml TBX.
Lập úp đĩa và ủ ở 44C trong 24 giờ.

CẤY VÀ Ủ MẪU

Mục đích: Tạo mơi
trường cho vsv phát
triển trên mặt đĩa


Bước 4:

Đếm và chọn khuẩn lạc để khẳng
định

Đếm đĩa có số khuẩn lạc < 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc
E.coli đặc trưng trên mơi trường TBX có màu xanh. Đếm các
khuẩn lạc E.coli đặc trưng trên những đĩa. Tính giá trị trung bình
từ các độ pha lỗng để qui về số E.coli trong 1g mẫu.

Mục đích: Đếm số khuẩn lạc có màu xanh trên
đĩa để tính tốn.


Màu khuẩn lạc trong môi trường TBX
Khuẩn lạc E.coli đặc trưng trên mơi trường TBX có màu xanh

Màu khuẩn lạc E.coli
Sự có mặt của enzyme βD-glucuronidase giúp phân
biệt hầu hết E.coli

Có acid 5-bromo-4chloro-3indolyl--D glucuronide

Enzym β-glucuronidase
chia đơi liên kết

Có màu từ màu xanh
lam đến màu xanh
lam lá cây


4
Tính tốn kết quả