định lượng coliforms – e.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

GVHD: Hoàng Xuân Thế
Nhóm: 12 MSSV
1.Nguyễn Thị Thảo Trang 2205112096
2.Trương Thị My 2205112043
3.Nguyễn Thị Loan 2205112028
4.Nguyễn Ngọc Mai Trâm 2205112097
MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
Đề tài: Định lượng Coliforms – E.coli
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
NỘI DUNG

Coliform

Định nghĩa
- Coliforms là những trực khuẩn gram
âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ
khí tùy ý, có khả năng lên men lactose
sinh acid và sinh hơi ở 37
o
C trong 24- 48
giờ.
- Trong thực tế phân tích, Coliforms còn
được định nghĩa là các vi khuẩn có khả
năng lên men sinh hơi trong khoảng 48
giờ khi được ủ ở 37
o
C trong môi trường
canh Laury Sulphate và canh Brilliant
Green Lactose Bile Salt.
gram âm

Nhuộm gram
Năm 1884 H.Christian Gram đã khám phá
ra một phương pháp nhuộm VSV bằng phẩm
nhuộm pararosaniline. Thông qua việc sử dụng
theo trình tự 2 loại phẩm nhuộm có 2 màu khác
nhau, ông đã nhận thấy vi khuẩn được chia thành
2 nhóm: nhóm vi khuẩn Gram dương (giữ màu
phẩm nhuộm đầu tiên: crystal violet) và nhóm vi
khuẩn Gram âm (bị mất màu phẩm nhuộm đầu
tiên sau khi được rửa bằng một dd tẩy màu rồi
được tiếp tục nhuộm bằng phẩm nhuộm thứ 2 là
safranin hay carbon fuchsin).
Nhuộm gram
Đó là do có sự khác biệt về thành phần hóa sinh
của thành tế bào vi khuẩn. Phương pháp nhuộm
Gram về sau được sử dụng rộng rãi khi định loại vi
sinh vật. Thành phần hoá học của 2 nhóm này khác
nhau chủ yếu như sau :
Gram dương Gram âm
Thành phần
Tỷ lệ % đối với khối
lượng
khô của thành tế
bào
Peptidoglycan 30-95 5-20
Acid teicoic Cao 0
Lipid Hầu như không có 20
Protein Không có hoặc có ít Cao
Nhuộm gram
Nhuộm gram

Nhuộm gram
GRAM +
GRAM -
Không màu
Không màu
Không màu
Màu tím
Màu tím
Màu tím
Màu tím
Màu tím
Màu tím
Màu hồng
Fixation
Crystal Violet
Iodine treatment
Decolorization
Counter stain
(safranin)
Sự bắt màu của tế bào vi khuẩn khi nhuộm Gram
Nhuộm gram
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu
hồng
E.coli, Gram (-)
Staphylococcus
epidermidis,
Gram (+)
Bacillus cereus,
Gram (+)
-

Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:
+Escherichia (E.coli)
+Citrobacter.
+Klebsiella.
+Enterobacter.
Escherichia coli
Citrobacter freundii
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakazakii
- Tính chất sinh hóa đặc trưng của
nhóm này được thể hiện qua các thử
nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR),
Voges- Proskauer (VP) và Citrate
(iC) thường được gọi tóm tắt chung
là IMViC.

Coliform

Coliforms chịu nhiệt:
-
Là những Coliforms có khả
năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24h khi được ủ
ở 44
o
C trong môi trường EC.

Coliforms phân (E.coli giả
định):

- Là Coliforms chịu nhiệt có
khả năng sinh indole khi
được ủ khoảng 24h ở 44.5
o
C
trong môi trường Trypton.
Feacal Coliform

E.coli
Là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm
IMViC là ++ (Indol +, Methyl Red +,
Voges Proskauer -, Citrate -).
E.coli
–
Coliforms là trực khuẩn Gram âm,
không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị
khí tùy ý, lên mem lactose sinh acid
và sinh hơi ở 37
o
C trong 24 – 48
giờ.
–
Coliforms chịu nhiệt = coliforms +
lên men lactose và sinh hơi trên môi
trường canh EC ở 44
o
C trong 24
giờ.
–
Coliforms phân = coliforms chịu

nhiệt + sinh indol trong canh
Trypton ở 44,5
o
C trong 24 giờ
–
E.coli = coliforms phân + IMViC
(++ )
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
Tóm lại

Định lượng Coliforms, Coliform phân
bằng pp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc:
-Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một
lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc
thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên
men lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1
o
C trong

24-48h. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho
Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn
gram dương và chất chỉ thị như neutral red,
crystal violet.
-Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu
đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm. Xung
quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật.

Định lượng Coliforms, Coliform phân
bằng pp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc:
-Việc khẳng định được thực hiện bằng cách
nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL.
Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự
nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 44
0
C.
-Mật độ Coliforms hay Coliforms phân được
tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm
được, tỉ lệ khẳng định và độ pha loãng mẫu trước
khi cấy vào đĩa.

Định lượng E.coli bằng pp đếm
khuẩn lạc

Định lượng E.coli bằng pp đếm
khuẩn lạc

Nguyên tắc:

Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một
lượng nhất định lên môi trường có chứa
lactose, ủ ở 44
o
C trong 24h, đếm các khuẩn
lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms.
Khẳng định các khuẩn lạc đã đếm là E.coli
bằng các thử nghiệm IMViC.

Định lượng Coliforms, Coliform phân và
E.coli bằng pp đếm khuẩn lạc
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng
10
-1
, 10
-2
, 10
-3
…
Cấy 1ml dd mẫu vào đĩa petri, bổ sung 5ml MT TSA, lắc đều,
Để yên 1-2h
Rót vào mỗi đĩa 10-15ml MT thạch VRB, để đông, ủ ở 37
o
C
trong 24-48h
Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến màu đỏ đậm, có vòng tủa muối mật,
đường kính ≥0,5mm, chọn 5 khuẩn lạc.
Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở
37

o
C, 24-48h
Cấy vào ống canh EC, ủ ở
44
o
C, 24-48h
Đếm số ống canh(+) (sinh
hơi).Tính tỉ lệ khẳng
định Coliforms
Chọn ống canh (+)
(sinh hơi)
Mật độ Coliforms
Cấy vào ống canh Trypton,
MR-VP, thạch SC Citrate,
ủ ở 44
Oc
, 24h
Thử nghiệm Indol
Đếm số ống canh EC(+)& Indol(+),
tính tỉ lệ khẳng định
Coliforms phân
Thử nghiệm IMViC
Mật độ Coliforms phân
Đếm số ống canh EC(+)&IMViC
++ , tính tỉ lệ khẳng định E.coli
Mật độ E.coli
Quy trình định lượng Coliforms, Coliforms phân, E.coli bằng
pp đếm khuẩn lạc
Ống nuôi cấy
ban đầu

(ống gốc)
10
-1
10
1
10
-2
10
2
10
-3
10
3
10
-4
10
4
Pha loãng
Độ pha loãng
10
-5
10
5
Độ pha loãng cuối
Mẫu được đồng nhất hóa và pha loãng, sao cho
chứa < 100 tế bào Coliforms trong 1ml dd pha loãng.
Pha loãng mẫu

Quy trình phân tích Coliforms và
Coliforms phân