Nghiên Ứu Điều Kiện Táh Và Tinh Sạh Peptide Ó Hoạt Tính Hống Oxy Hóa Từ Sản Phẩm Đậu Nành Thủy Phân.pdf
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.49 MB, 59 trang )
B GIÁO DO
I HC BÁCH KHOA HÀ NI
--------------------------
LUC
CÔNG NGH SINH HC
ng dn khoa hc:
PGS.TS Qun Lê Hà
Hà Ni 2017
17083300129438e5ccef1-2d86-414c-bdc6-b00ee3c887ac
17083300129437d3336d0-cce9-472d-abd0-7cadfef6edb0
1708330012943490f0b03-d754-465e-9b8f-60a05b4ce457
Hà Nội ngày 27 tháng 09 năm 2017
MC LC ..................................................................................................................1
DANH MC CÁC KÝ HIU, CÁC CH VIT TT..........................................3
DANH MC BNG ..................................................................................................4
DANH MC CÁC HÌNH V TH ............................................................5
M U ....................................................................................................................6
TNG QUAN ...................................................................................8
1.1. Các cht chng oxy hóa ....................................................................................8
1.1.1. Khái niệm hoạt tính chống oxy hóa ............................................................8
1.1.2. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong tự nhiên .................................9
1.1.3. Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa ..................................................10
u nành và các sn phu nành thy phân .............................................12
1.2.1. Thành phần của đậu nành và bã đậu nành ..............................................12
1.2.2. Quá trình thủy phân .................................................................................14
u kin tách và tinh sch các peptide có hot tính chng oxy hóa .............16
1.3.1. Các nghiên cứu về điều kiện tách các peptide có hoạt tính chống oxy hóa ..16
1.3.2. Các nghiên cứu về tinh sạch peptide có hoạt tính chống oxy hóa ...........18
VT LIU .....................24
2.1. Vt liu ............................................................................................................24
2.1.1. Nguyên liệu ...............................................................................................24
2.1.2. Thiết bị ......................................................................................................25
2.1.3. Hóa chất ...................................................................................................21
u ................................................................................21
2.2.1. Phương pháp thủy phân bã đậu ...............................................................21
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu điều kiện tách chiết các peptide có hoạt tính
chống oxy hóa .....................................................................................................22
2.2.3. Phương pháp tách các phân đoạn peptide có hoạt tính chống oxy hóa ..23
2.2.4. Các phương pháp phân tích .....................................................................25
1
KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN ............................30
3.1. La chn mu .................................................................................................30
3.2. Các yu t ng ti quá trình tách chit peptide ...................................31
3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian chiết tới hoạt tính chống oxy hóa ....................31
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới hoạt tính chống oxy hóa ......................33
3.2.3. Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới hoạt tính chống oxy hóa ......................35
3.2.4. So sánh hiệu quả thu hồi peptide có hoạt tính chống oxy hóa .................36
3.3. Kt qu tinh sch peptide có hot tính chng oxy hóa ca dch chit peptide
t u thy phân bng neutrase.........................................................................38
KT LUN VÀ KIN NGH ................................................................................42
I. Kt lun ..............................................................................................................42
II. Kin ngh ...........................................................................................................42
TÀI LIU THAM KHO ......................................................................................43
PH LC
2
Da:
Dalton
kDa:
kilo Dalton
ROS:
Reactive oxygen species
MWCO:
microweight cut-off
TLTK:
BHA:
butylated hydroxyanisole
BHT:
butylated hydroxytoluen
OD:
MeOH:
methanol
MW:
DPPH:
2,2 diphenyl -1-picrylhydrazyl
3
Bng 1.1. Thành phng cu nành tính theo cht khơ ........................12
Bng 1.2. Thành phn cu tính theo cht khơ ...............................................13
Bng 1.3. Ngun gc, thành phn axit amin và
hot tính chng oxy hóa ca mt s n peptide có hot tính chng
oxy hóa .......................................................................................................20
Bng 2.1. M quang OD ti các n L-Glutathion ......................................25
Bng 2.2. M quang OD và hot tính chng oxy hóa ca BHA .........................29
Bng 3.1 S i hot tính chng oxy hóa ca dch chiu sau khi tinh
sch ............................................................................................................40
4
Hình 1.1. Cu to cng có trong các peptide có hot tính chng
oxy hóa. ....................................................................................................16
c tinh sch peptide có hot tính chng oxy hóa b
lc màng. ..................................................................................................24
ng chun L-Glutathion .......................................................................26
PPH ..............................................................................26
+ ..........................................27
Hình 3.1. Hot tính chng oxy hóa ca các mu thy phân bng các tác nhân
khác nhau (%DPPH) ................................................................................30
Hình 3.2.1 Hot tính chng oxy hóa ca dch chic ti các mc thi gian
khác nhau (%DPPH) ................................................................................31
Hình 3.2.2. Hot tính chng oxy hóa ca dch chi t
khác nhau(%DPPH) ............................................................................33
Hình 3.3. Hot tính chng oxy hóa ca dch chi
khu ...............................................................................35
u kin tách chit
Hình 3.4. Hot tính chng oxy hóa c
khác nhau(%DPPH) .................................................................................36
Hình 3.5. Hot tính chng oxy hóa ca dch chit tu kin tách chit thích hp
u kin tách ching (%DPPH) .......................................37
Hình 3.6. Hot tính chng oxy hóa ca dch chi c khác
nhau(%DPPH) .........................................................................................38
Hình 3.7 Hot tính chng oxy hóa ca dch chic >10 kDa,
3kDa, 1 kDa(%DPPH) .............................................................................39
n ng vi DPPH ca mt s n peptide ..........41
5
Trong nh an toàn sc khe và an toàn thc phm
c quan tâm nhiu ti Vit Nam, trong c quan tâm nhiu là các hp
cht thiên nhiên có hot tính sinh hi ci thin sc khc s
dc phm ch các hp cht tng hp khác khơng có
li cho sc khe trong bo qun và ch bin thc phm.
Trong s các hp cht thiên nhiên có hot tính sinh hc, cht chng oxy hóa
có vai trị quan trng vì va có th bo v sc khi va bo qun thc
phm. Trong khi có nhng báo cáo v s nguy hi khi s dng các cht chng oxy
hóa tng hp thì vic s dng các cht chng oxy hóa t nhiên là gii pháp hiu qu
và an tồn. Các peptide có hot tính chng oxy hóa chính là mt trong s các cht
chng oxy hóa t c nhiu nhà khoa hc trên th gii quan tâm nghiên cu.
Có nhiu nghiên cu cho thy kh n phm peptide có hot tính sinh hc
t u nành thy phân là hoàn toàn kh thi. Bã u là ph
phc s dng làm thc tip, sn có và r tin. Tuy vy bã
ng các axit thionine, valine, tyrosine,
ng axit amin
có trong cu trúc ca các peptide có hot tính chng oxy hóa. Chính vì vy vic
nghiên cu tách chit và tinh sch các peptide có hot tính sinh hc t du
thy phân là r ng dng thc ti
chúng tôi thc hi u kin tách và tinh sch
peptide có hot tính chng oxy hóa t sn phu nành th
Peptide có hot tính chng oxy hóa tách chit t sn phu nành thy phân
c mt s nhà khoa hc trên th gii nghiên cu t nha th k
20. Tuy nhiên v này còn khá mi m c ta. Vy nên mu
c tài là:
- Nghiên cu kin tách chit ti vng là dch sn
ph u nành thy phân sao cho hot tính chng oxy hóa trong dch chit thu
6
c là cao nht; t p tc nghiên cu tinh sch dch chit sao cho sn phm
thu v là thun khit nht và có hot tính chng oxy hóa cao nht.
thc hic m i dung chính cn thc hi
tài gm:
- La chc mu dch thy phân có hot tính chng oxy hóa cao nh
s dng cho vic nghiên cu kin tách và tinh sch peptide;
- Nghiên cu các yu t ng ti quá trình tách chii
gian chit, nhi , ch khuy;
- Nghiên c ch peptide và áp d tinh sch
n nào có hot tính chng oxy hóa cao nht.
7
1.1.1. Khái niệm hoạt tính chống oxy hóa
i cht c, các gc oxy hong (ROS) hoc các
gc t c sn xut t nhiên bi các phn ng oxy hóa thông qua hô hp.
dàng
ng gây ra nhiu
bnh m nh ting mch, viêm khp và
trình peroxy hóa cht béo gây ra bi ROS là mt
trong nhng nguyên nhân chính gây gim chng lipid trong thc các
loi m phm [36].
Cht ch t cht có th làm gi
hoc làm chng bt li ca các loi phn ng gây ra bi các gc t do
hay các gc oxy ho i vi các ho ng sinh h ng ca con
i, và trong các h thng sinh hc thc phm. [19]. Các cht chng oxy hoá là
các hp cht hoc h thng làm chm s oxy hóa bng cách c ch s hình thành
các gc t do hoc b n hot tính ca gc t do bng mt
(nhi: (1) loi b nhng th khng phn ng peroxit, (2) gi các ion
kim loi (4) phá v phn ng oxy hóa t ng theo dây chuyn hoc (5) làm gim
n c. Có hai loi cht chng oxy hố: cht chng oxy hố chính
có tác dng dng các phn ng dây chuyn to ra các gc t do (kh các gc t do);
và các cht chng oxy hóa th cp có tác dng loi b các phn ng oxy hóa bng
cách hình thành các cht oxy hóa hong (các cht chng oxy hoá bo
v) [19].
8
Hot tính chc hiu là kh ng oxy hố ca ch
c s d u qu ca cht chng oxy hoá t nhiên thơng qua hai
hóa hc chính. Qt sch các gc t do là vai trị chính ca cht chng oxy
u này có th thc hi c b n s di chuyn electron
(electron migration - EM) và s chuyn giao nguyên t hydro (hydrogen atom
transfer - HAT) [39, 48]. Hot tính chng oxy hóa chu ng bi nhiu yu t
ng oxy hóa và trng thái vt lý ca cht có kh
cht chng oxy hố hiu qu nht là nhng chn phn ng chui gc
t ng chc vịng phenol. Nhng cht chng oxy hố này
hin H cho các gc t do.
Có nhi nh hot tính chng oxy hóa. Trong tài liu
[39, 48], có b c s
dng cho các phn ng d Radical Absorbance
Parameter
Crocin Bleach Lipid
i vi phn ng oxy hóa da trên EM, mt s
nh hot tính chc s d
Antioxidant Capacity (TEAC); 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) và Coper II
Reduction Capacity (CRC).
1.1.2. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong tự nhiên
Trong t nhiên, các cht chng oxy hoá này bao gm flavonoid, axit phenolic,
carotenoid và tocopherol có th c ch q trình oxy hóa, loi b các gc t do, và hot
t kh [20, 34]. Các cht phenolic chng oxy hố ch yu có th c chia
thành 4 nhóm chung: axit phenolic (gallic, protochatechuic, caffeic, rosmarinic acids),
phenolic diterpenes (carnosol và carnosic acid), flavonoid (quercetin và catechin; ), và
du d -ng
hot chng oxy hoá bng cách by các gc t do; Flavonoids có th
quét các gc t do và loi b các kim loi khá tt[17].
9
Nhng hp cht này nm trong mt s loi qu (táo và cherry), h dâu tây
(dâu tây, qu các loi ht u nành
và cacao) và v ca nhiu cây[12, 7, 3].
Mt s gia v và tho mc có cha các hp cht này. Cht chit xut ca
nhiu thành phn thuc h
ng phenol cao [9]. Trong s mt s loi tho mc và gia v o, cây
húng qu, kinh gii, qu, rau mùi và bc hà) có t l cao nht các hp cht phenolic
n (96%) [29].
Các loi gia v ng, ngha nhiu hp cht chng
oxy hóa.
1.1.3. Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa
Peptide là sn phm ca s liên kt axit amin hoc thy phân protein. Các
c và trng phân t nh n protein t nhiên ca
c t quá trình thng. Chúng có
dài, thành phn axit amin, và ch
Các peptide có hot tính sinh hn protein c th
có ng tích cn các chu kin c và có th
n sc kho. Hong ca peptide da trên thành phn và trình t axit
amin vn có ca chúng. Kích c ca các trình t peptide hong có th i
t n 20 axit amin, và nhiu peptide có th có hot tính sinh hc.
Nhng protein và các peptide có hot tính sinh hc sin
th, trong ng nghim, và trong quá trình ch bin thc phm. Các peptide hot tính
c tìm thy trong quá trình thu phân protein bng enzyme và các sn phm
s c to thành trong q trình tiêu hóa các
protein ca d dày-rut [25].
Các peptide có hot tính sinh hc bao gm các peptide có ho t tính
chng oxy hóa, các peptide ch ng viêm, các peptide h huyt áp, các peptide
cht qu
10
ng nghiên cu v các peptide có hot tính chng oxy hóa có trong
sn phm thu nành [15] hay các peptide có hot tính chng oxy hóa có
trong sn phm thy phân nhau thai cu. Mt s nghiên cc thc hi
nh các cht chng oxy hoá peptide ti
mt s dch thy phân protein t ngung vt và thc vc tìm thy
có hong chng oxy hố [46] .
Các peptide có hot tính ch c nghiên cu rng rãi, ng
du tr các bnh thối hóa mãn tính khơng truyn nhim và trong bo
qun thc phm. Mi quan h cu trúc-ho ng cc t các
c nghiên cc tính khác nhau ca cu trúc hóa hc
ng phân t nh, thành phn các axit amin (His, Trp, Phe, Pro, Gly, lys,
Ile và Val) vi tính k t c u có
n hong chng oxy hố ca peptide. Trong s n và
chung nhiu nhn hong chng oxy hố.
Các peptide có hot tính chng ng t n
650 Da, chim 70% trong s 42 peptide có hot tính ch c xác
c chit tách t phn bã trong sn xut du oliu bng alcalase
có tr ng nh có kh so vi các phân
n có trng phân t n peptide
ca dch th c bng cách s dng siêu lc màng vi
MWCO ln peptit <3 kDa có hot tính
chng oxy hóa cao nhi 1000 Da th hin hot tính chng
oxy hố dài tt nhc t dch thy phân
protein lòng trng trng bng enzyme alcalase vi MW <1 kDa có kh ng
oxy hóa mnh nht so vn peptide khác [22].
11
1.2.1. Thành phần của đậu nành và bã đậu nành
u nành lc phát hin c
Công nguyên. K t c dn dn lan rng trên tồn cu, ch yu
là thơng qua vic thu a ca Anh. Các sn phm t u nành, bao g c
nên ph bin Châu Âu và Mu nhi ta
nhn ra ru nành là mt ngun protein và du có giá tr, và cht
ng trc ti n ch ng c u nành [32]. Tr u
c qung bá trên khp th gii do giá tr ng cu nành
c (8- u (2030%). T u tc sn xut trên
toàn th gi
góp trên 80% s ng tồn cu [13]. Canada chim 1,3% s
toàn cu. Thành phn dinh dng cc cung cp trong Bng 1.1 [13]
u nành có trng 16 - 19 g / 100 ht [13]. Mu nành
ng protein cao (~ 40%), chúng ch y c tr sn xut du (~
khô).
Bng 1.1. Thành phn dinh ng cu nành tính theo cht khơ
Thành phng
T l (% khng)
Ví d
Cht béo
18 21
Protein
36 40
-conglycinin
ng hòa tan
10 11
Gluco, saccaro
ng khơng hịa tan
21 25
Xenlulo, pectin
Khống cht
5
St, pht pho, ma giê
12
c xem là ngun protein chng cao, vì chúng cha
tt c 9 axit amin thit yu vi s ng vt cn dinh
ng hp lý [43]. Nhiu li ích sc kho quan trng t vic tiêu th u
c bit là phòng ngu tr b
c báo cáo [28]. Vic s du nành trong thc phm có tính hp dn
v mt kinh tt.
m cu nành
Protein c u nành có ba ch m các protein tham gia vào quá
i cht, protein cu trúc, và các protein d tr u nành là
các protein d tr- conglycinin (~ - conglycinin
(~ 3%). Các hn hu nành, kc tách ra thành nhiu
n protein bao g - - - conglycinin), 11S
(glycinin), 9S và 15S globulins [16].
u (Okara) là mt sn phm ph ca quá trình ch biu ph, su
nành hoc sn xut pu ch c coi là cht thi cơng nghip
vi giá tr thp trên th ng vì tui th ngn. Tuy nhiên trong thc t u
ng có chn 25,4-28,4% (tính theo cht khơ) vi chng dinh
ng cao, có th thy nó là mt ngun protein thc vt tii
vi chi phí thp [33].
Thành phn c u t nh và th hin Bng
1.2[38].
Bng 1.2. Thành phn cu tính theo cht khơ
Thành phng
T l (% khng)
Ch
12,2
Protein
Cht béo
25,52
12
Cacbonhydrate
32,6
Cht tro
3,96
13
1.2.2. Q trình thủy phân
u nành có th c sn xut bng cách thy phân protein. Thy
phân protein là k thuc s dng ph bin nh sn xut các peptide có hot
tính sinh hc. Thy phân bng axit ít t
ki bic li, q trình thy phân
enzyme ít khc nghin tính axit amin tuy nhiên t
y phân enzyme v y chun b các
peptide hot tính sinh hc t protein; Lên men là m thy phân
c coi là ít hiu qu
và hn h c s dng trong sn xut các peptide hot tính
sinh hc [44]. Nhiu enzyme khác và s kt hp c
Flavourzyme, có th c s d sn xut các peptide t protein. Trong nghiên
cu cng m thy phân (DH) ca collagen bng
i khác nhau (neutrase, alcalase, papain và acid protease).
i ta phát hin ra r
t tính chc tp trung nghiên cc t
s thy phân bng neutrase [37].
Neutrase là lo c thu nhn t vi khun Bacillus
amyloliquefaciens; trong khi Alcalase là loi endoprotease c thu nhn t vi
khun Bacillus licheniformis; Flavourzyme là ch phm enzyme kt hp c hai loi
edoprotease và exopeptidasec thu nhn t nm mc Aspergillus oryzae.
Các v trí ct trên peptide c : glutamate,
methionine, leucine, tyrosine, lysine, và glutamine [1]. Ch thy phân bi
alcalase là 30oC- 65oC, pH = 7-9, thi gian t 90 phút ti 6 gi.
Flavourzyme bao gm endo-và exopeptidases [4]. Dch thc to
bi flavourzyme có v ng c ng
dng nhi c phm. Các v tách chit bi enzyme
14
c nghiên cu rng rãi. Ch thy phân bi flavourzyme là
30oC- 55oC, pH = 6-7, thi gian t 90 phút ti 6 gi.
i vi neutrase, ch thy phân là 30 oC- 55 oC, pH = 5,5-7,5, thi
gian t 90 phút ti 6 gi.
ã có mt s nghiên cu v s dng các chng vi sinh v thy phân
u nành thành các peptide có hot tính chng oxy hóa. Issoufou Amadou
(2010) dng chng vi khun Lactobacillus plantarum Lp thu
nành. Ch thy phân là 37oC trong 72 gi [2]. Mt nghiên cu khác ca Mona
M. Rashad (2011) dng nm men Candida albicans, Pichia pinus,
Saccharomyces cerevisiae lên thu. Ch thy phân là 30oC trong
72 gi [27]. Mai.M.M. Naeem (2015) dng chng nm mc Aspergillus
oryzae thu. Ch thy phân là 30oC trong 10 ngày [24].
Các sn ph u nành có cha m ng hp ch c
chng minh là có kh ng oxy hố. Ngày nay, các sn phu nành lên
c ph bin rng rãi nhi gi
ví d -nao (Thailand), Natto (Nht Bn), Tempe (Indonesia) và Kinema
() [27].
Mt trong nhng peptide có kh nh trong
dch th u nành là chui peptide leucine - leucine - proline histidine - histidine (leu - leu - pro - his - his) [8]. Da trên peptide này, rt nhiu
cht chc tng hp. Chen và cng s phát hin ra
rng pro-his-t peptide cá th, có kh ng oxy hố cao nh
na, s tn ti ca m ng leucine hoc proline t u N ca mt peptide
ch ng kh ng oxy hố và tính k c ca các peptide.
Histidine và các axit amin vịng n kh ng oxy hố, do
cu trúc vòng ca chúng [8, 31].
15
Hình 1.1. Cu to cng có trong các peptide có hot tính
chng oxy hóa.
1.3.1. Các nghiên cứu về điều kiện tách các peptide có hoạt tính chống oxy hóa
Trong nghiên cu ca Mai.M.M. Naeem (2015) v s dng chng nm mc
Aspergillus oryzae và Trichodema harzium thu thành các peptide
có hot tính chng oxy hóa, dch th c tách b c và dung môi
c tách chit bc thc
hic b c ct, hn dng
hóa b bt hot enzyme, gi 60oC
trong 1 gi vi t khu ch 3000 vòng/phút
trong 15 phút thu dch, lc qua giy lc Whatman No 1 và bo qun dch.
Vt bc sy khô 60oC
trong 24 gi sung dung mơi vi t l 1:5(khng/th tích), gi 55oC
16
trong 3 gi vi t khuy 100 vòng/phút. Lc qua giy lc Whatman No1 thu
dch lc và sy khô.
Kt qu cho thy hot tính chng oxy hóa ca dch chit bc cao nht
so vi các dch chit bng dung môi. T l quét gc DPPH (%) ca các dch chit
b c, methanol, ethanol, aceton, diethyl ether (2mg/ml) khi thy phân bng
A.oryzae lt là 92,8%, 84,2%, 88,4%, 81,4%, 75,7%. [24].
Trong nghiên cu ca W. Samruan (2012) v hot tính chng oxy hóa ca
u nành và dch chit t u nành lên men t Bacillus subtilis SB-MYP- s
dng 2g dch thy phân dng c ct hoc methanol,
trn bng vontex trong 1 phút, ly tâm vi t 3200 vòng/phút trong 30 phút,
phc ra li v c ct hoc methanol. Hai phn dch thy phân
c trc. Vi mu tách bc su tách
by khơ bi nhi phịng.
Kt qu cho thy dch chit bc có hot tính ch
dch chit bng methanol. Giá tr IC50 (mg/ml) ca dch chit bc và dch
chit bng methanol ca mu nành thy phân lt là 14,277 và 29,468 [40].
Trong nghiên cu ca Ferial M. Abu-Salem v các peptide có hot tính
chng oxy hóa thu nhn t dch thu nành bng enzyme papain, cách thu
dch chic thc hiy dch thy phân nhi
bt hoi t 4000 vòng/phút trong
20 phút thu ly dch trong là dch chit các peptide [15].
Trong nghiên cu ca Mona M. Rashad 2011 v các peptide có hot tính
chng oxy hóa thu nhn t dch th u bng các chng nm men
Candida albicans NRRL Y-12, Candida guilliermondii NRRL Y-2075,
Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632, dch chic thu nhn bng cách:
c sy khô 60oC và nghin thành bt, bc trn
vi methanol theo t l 1:5 (khng/th tích) ti 55oC trong 2 gi trong b n
17
