Quy trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC………………………………………………

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
  

Đề tài

GVHD: …………………………….
Nhóm …..

Tp. Hồ Chí Minh, ngày ….. , tháng …. , năm ….

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

DANH SÁCH NHÓM

STT HỌ VÀ TÊN MSSV LỚP

1

2

Nhóm 10 Trang 2

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

MỤC LỤC

Lời mở đầu ......................................................................................................................... 5
Chương 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME – ENZYME PECTINASE........................... 6

1.Giới thiệu chung về enzyme pectinase .......................................................................... 6

1.1 Cơ chất pectin....................................................................................................... 6
1.2 Phân loại pectin ................................................................................................... 7
2 Enzyme pectinase....................................................................................................... 8
2.1 Cấu tạo enzyme pectinase ....................................................................................... 8
2.2 Phân loại enzyme pectinase .................................................................................... 8

2.2.1 Enzyme hydrolase............................................................................................. 8
2.2.2 Transeliminase (TE) ......................................................................................... 9
3 Các nguồn thu nhận enzyme pectinase.................................................................... 9
3.1 Sơ lược chung ....................................................................................................... 9
3.2 Thu nhận enzyme pectinase .............................................................................. 10
3.2.1 Thu nhận theo chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt10
3.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu.......... 11
Chương 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME TỪ VI SINH VẬT ...................... 13
2 Nguyên liệu sản xuất..................................................................................................... 13
2. 1 Nguyên liệu từ thực vật ........................................................................................ 13
2.1 Nguyên liệu từ vi sinh vật .................................................................................. 14
2.2 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng và nguồn cacbon. ....................................... 15
2.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ................................................................................ 16
2.4 Ảnh hưởng của các yếu tố khác ........................................................................ 17
3 Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme pectinase và thuyết minh .............................. 19
3.1 Quy trình tách chiết và làm sạch ......................................................................... 22
3.1.1 Giới thiệu chung .......................................................................................... 22
3.1.2 Kết tủa enzyme pectinase............................................................................... 23

Nhóm 10 Trang 3

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

3.1.3 Ứng dụng phương pháp thẩm tích trong tinh sạch pectinase................. 24

3.1.4 Kết tủa ái lực................................................................................................ 24

3.1.5 Phương pháp sắc ký. ...................................................................................... 25

3.1.5.1 Giới thiệu chung .......................................................................................... 25

3.1.5.2 Sắc ký lọc gel ................................................................................................ 26

3.1.5.3 Sắc ký trao đổi ion ....................................................................................... 27

3.2 Xác định hoạt độ của enzyme pectinase .............................................................. 30

CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PECTINASE TRONG CÔNG NGHÊ
THỰC PHẨM – NƯỚC QUẢ ........................................................................................ 32

3.1 Tình hình ứng dụng enzyme trong cơng nghiệp trên thế giới ............................... 32

3.2 Ứng dụng của enzyme Pectinase .............................................................................. 34

3.2.1 Giới thiệu về ứng dụng ezyme Pectinase .......................................................... 34

3.3 Ứng dụng enzyme pectinase sản xuất nước quả ..................................................... 35

3.3.1 Các chế phẩm enzyme ........................................................................................ 35

3.3.2 Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả ................................ 36

3.4 Các nhãn hàng nước quả đang có trên thị trường ............................................. 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 44

Nhóm 10 Trang 4

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

Lời mở đầu

Từ trước thế kỉ 17, lồi người chưa biết gì về enzyme, người ta đã biết sử dụng rộng rãi
các quy trình enzyme trong thực tế như làm bánh mì, rượu, bia, muối dưa…Việc sử dụng
enzyme trong giai đoạn này mang tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme
thông qua hoạt động sống.

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme được sản xuất ngày càng nhiều được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: chế
biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…Hàng năm lượng enzyme sản xuất trên thế
giới được sản xuất ra rất nhiều, phục vụ hoạt động sống của con người và nghiên cứu.

Trước đây, nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày nay, người ta
nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng và rẻ tiền.

Với đề tài “Tìm hiểu quy trình sản xuấ enzyme pectinase và ứng dụng trong Cơng
nghệ thực phẩm (nước quả)”, tìm hiểu về enzyme pectinase và enzyme này thường
được sử dụng trong Công nghệ thực phẩm trong sản xuất nước quả, sản xuất rượu
vang….

Trong thời gian tìm hiểu và làm đề tài, nhóm 10 xin cảm ơn sự giúp đỡ của Cô và nhóm
cũng khơng tránh khỏi những sai sót, nhóm 10 kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến

của Cơ, để bài tiểu luận được hoàn thiện hơn.

Nhóm 10

Nhóm 10 Trang 5

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME – ENZYME PECTINASE

Trong cơ thể sống, hầu hết các phản ứng xảy ra đều nhờ tác dụng của một chất xúc tác
đặc biệt, đó là enzyme. Các enzyme có bản chất hóa học là những protein có khả năng
điều hịa, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa nên cịn gọi là các xúc tác sinh học.

Vào đầu thế kỉ thứ 19 từ những ghi nhận đầu tiên về enzyme trong q trình tiêu hóa ở
tuyến nước bọt, dạ dày và ruột – cho đến nay người ta đã biết và phân loại khoảng 3500
enzyme. Các chế phẩm enzyme thu được trong sản xuất đã được ứng dụng vào nhiều
mục đích khác nhau: trong chẩn đốn và điều trị y học, trong cơng nghệp hóa học, trong
chế biến thực phẩm và sản xuất nơng nghiệp.

Các enzyme có bản chất là protein nên thường được cấu tạo nên từ các L - α – amino acid
vã cũng có các tính chất tương tự như protein. Enzyme có khối lượng phân tử từ 12000
đến hàng triệu dalton.

1.Giới thiệu chung về enzyme pectinase
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester hoặc liên kết glucoside có
trong mạch polymer của pectin.

1.1 Cơ chất pectin

Hình 1 Cơ chất pectin

Nhóm 10 Trang 6

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của acid galacturonic
qua các liên kết α – 1,4 – glucoside. Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối
lượng phân tử từ 80000 – 200000. Pectin khơng hịa tan trong rượu và các dung mơi hữu
cơ khác, pectin hòa tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri và trong
glycerine nóng. Độ hịa tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hóa trong
phân tử tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.

Pectin là tên chung được gọi cho những hỗn hợp chứa các hành phần rất khác nhau, trong
đó pectinic acid là thành phần chủ yếu. Các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có
thể liên kết với các cấu trúc polysacaride và protein để tạo thành các proto pectin khơng
hịa tan. Có thể phân hủy để làm cho pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin
trong mơi trường acid, vì thế các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân hủy
phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau.

1.2 Phân loại pectin

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hòa tan, pectinic acid và protopectin.

Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có
khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hóa bằng methanol.
Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường
có nồng độ 0,06%. Enzyme pectinase tác động lên pectin có khối lượng phân tử khác
nhau và cấu trúc hóa học khơng đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là α – D-
galcturonan hay α - D – galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị D-

galactonosyluronic acid (liên kết theo kiểu α -1,4). Mặt khác, mức độ oxy hóa trong các
phân tử polumer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định các nhóm carboxyl bị
ester hóa bới các nhóm methoxyl. TRong một số trường hợp, chẳng hạn trong pectin củ
cải đường, có sự ester hóa giữa các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl.

Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hóa
bằng methanol. Pectinase là muối của pectinic acid. Pectic acid là polygalacturonic đã
hồn tồn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự
do trên một đơn vị polygalacturonic acid. Pectate là muôi của pectic acid.

Protopectin tạo độ cứng cho quả màu xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hóa học
phức tạp. Trong thành phần pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion
Ca2+, Mg2+, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phân
bằng acid thì giải phóng pectin hịa tan.

Nhóm 10 Trang 7

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

2 Enzyme pectinase

2.1 Cấu tạo enzyme pectinase
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin, sản phẩm của quá trình này là
acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol…Đây là một trong nhóm enzyme được
ứng dụng rỗng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Enzyme này ban
đầu được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch.

2.2 Phân loại enzyme pectinase
Hiện nay hệ thống enzyme pectinase được chia thành 2 nhóm chính: hydrolase,
transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và làm

giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành.

2.2.1 Enzyme hydrolase
Thuộc nhóm này có 2 enzyme chủ yếu: pectinesterase và polygalacturonase.

Pectinesterase - gọi tắt là PE: enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester trong phân tử
pectin hóa acid pectinic để giải phóng sản phẩm là methanol và acid polygalacturonic. PE
chỉ phân cắt các nhóm metoxyl đứng cạnh nhóm –COOH tự do. Pectinesterase thu được
từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu thu nhận từ nguồn vi sinh vật
thì pH tối ưu từ 4,5 – 5,5 còn nếu thu nhận từ thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0 – 8,5.
Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 300 - 450 và bị vô hoạt ở 550 – 620.
Pectinesterase thường được vô hoạt bởi các ion Ca2+, Mg2+.

Polygalacturonase - gọi tắt là PG: xúc tác sự phân cắt các muối liên kết α – 1,4-
glycoside. Các exo - PG phân cắt từ các đầu không khử, và endo – PG tấn công ngẫu
nhiên vào giữa mạch cơ chất.

Enzyme này ít gặp trong thực vật, chủ yếu gặp trong vi khuẩn và nấm mốc. Đây là một
phức hệ enzyme và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Dựa vào đó người ta chia
ra 4 kiểu sau:

Polymetyl – galcaturonase (PMG – poly – α -1,4- galacturozit – metyl este
glucanhydrolase). PMG được phân thành 2 nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắt liên
kết α – 1,4 ở trong hay ở cuối và đầu mạch.

+ Endo glucozidase polymetyl galcatunase kiểu I (endo – PMG – 1). Đây là enzyme có
tính chất dịch hóa, pectin có mức độ metyl hóa cao (nhiều gốc metoxy – OCH3) thì bị

Nhóm 10 Trang 8

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

thủy phân càng nhanh và triệt để. Trong môi trường khi có mặt pectinesterase (PE) thì
enzyme này càng bị giảm hoạt lực.

Endo – PMG – 1 rất phổ biến trong các nấm mốc: Asp. Niger; Asp.Awamori; Botrytis
cinezea; Neurispora crassa.

+ Exo – glucozidase polymetyl galacturonase kiểu III (exo – PMG – III). Đây là enzyme
có tính chất đường hóa, có khả năng cắt từng gốc monomer acid galacturonoc ra khỏi
mạch bắt đầu từ đầu khơng khử có nhóm metoxy (-OCH3).

Enzyme tác dụng lên acid pectinic hay acid pectid - gọi là polygalacturonase (PG) cũng
được phân thành hai nhóm nhỏ:

+ Endo glucozidase poly galacturonase kiểu II (endo – PG –II). Đây là enzyme có tính
chất dịch hóa, chỉ thủy phân cơ chất khi có mặt nhóm -COOH tự do. Hoạt độ của endo –
PG – II tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý trước bằng pectinesterase (để tạo ra nhiều
gốc –COOH tự do). Nấm mốc và vi khuẩn tổng hợp được enzyme này.

+ Enxo – glucozidase polygalacturonase kiểu IV (exo – PG –IV). Thủy phân các liên kết
gắn với nhóm -COOH tự do ở đầu hay nối mạch.

2.2.2 Transeliminase (TE)
Đây là nhóm enzyme được tìm ra cách đây chưa lâu lắm (khoảng năm 1960-1961) bao
gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban, galactan khỏi protopectin để tạo thành
pectin hòa tan và enzyme transeliminase phân cắt phi thủy phân (khơng có sự tham gia
của phân tử nước) pectin để tạo ra các gốc galacturonoc có nổi kép giữa C4 và C5. Phản
ứng xảy ra dễ dàng ở mơi trường trung tính hay kiềm yếu.

3 Các nguồn thu nhận enzyme pectinase
3.1 Sơ lược chung

Có hai loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme địi hỏi phải có phương pháp tách
và thu nhận tiêng:

+ Enzyme ngoại bào (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong mơi trường ni cấy
ngồi tế bào, thường hịa tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch.

+ Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và khơng
được tiết ra mơi trường bên ngồi. Những tế bào vi sinh vật sau khi được nuôi cấy sẽ
được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là giải phóng tồn bộ các chất có
trong tế bào gồm enzyme nội bào. Hốn hợp thu nhận được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và

Nhóm 10 Trang 9

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

những chất có phân tử lượng lớn, còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối.
Enzyme sau đó sẽ được đem tinh sạch.

Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào

Khó tách Dễ tách

Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào

Thường lẫn chung với các chất khác của tế Không lẫn chung với thành phần nội bào,

bào sau khi bị phá vỡ ( acid nucleic, chất nếu có chỉ là một vài enzyme ngoại bào

nguyên sinh, lipid..) khác.

Chỉ bền vững ở trong môi trường nội bào. Bền vững hơn

Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn.

trình cơng nghệ phức tạp, giá thành đắt

Bảng 1 So sánh enzyme nội bào và enzyme ngoại bào

3.2 Thu nhận enzyme pectinase

Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Có hai phương pháp sản xuất
pectinase:

+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt.

+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu.

3.2.1 Thu nhận theo chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt

Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase để thu nhận pectinase
thường là cám gạo hay cám mì, bã củ hay thóc mầm. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường
ammonium, photphoric. Độ ẩm thường phải nằm trong khoảng 60%.

Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 300C trong thời gian 4 giờ, sau đó giảm
xuống 240C và ni cấy trong thời gian 48 – 52 giờ. Sản phẩm lên men được sấy khô
thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế.

Để thu nhận được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thơ phải được trích
ly bằng phương pháp kết tủa nhờ enzyme pectinase có thể là rượu enthanol (72,5 – 75%)
hoặc isopropanol (55-57%). Muối ammonium sunfat sử dụng có độ bão hịa 0,79, khi kết
tửa bằng rượu ethanol chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết 99%, cịn nếu bằng
muối thì độ tinh khiết 75%. Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc

Nhóm 10 Trang 10

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa
trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản.

3.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu

Phương pháp hiếu khí

Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu sự phát triển của VSV gần đạt đến pha
ổn định, khi môi trường khi bị acid hóa mạnh và khi lượng photpho vơ cơ được sử dụng
hồn tồn, pH của mơi trường ni cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với nấm
mốc pH kiềm kìm hãm sự tống hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase, pH=4 ức
chế hồn tồn sự tích lũy của enzyme pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi
pH nằm trong khoảng 4,5 -5,0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự
tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên pH mơi trường ni cấy của các
A.niger và A.awamori 16 có thể dịch về 3,5 -3,8 và 2,9 – 3,2 theo thứ tự.

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48 giờ với hàm lượng từ 2-10%. Đối với
A.niger và A.awamori, vật liệu gieo là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi trường dinh
dưỡng cho đến khi bắt đầu sinh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng
cho đên skhi bắt đầu sinh bào tử. THời gian ủ sơ bộ thường là 38-42 giờ, lượng sợi nấm

gieo cấy thường là 2%. Trong q trinh ni cấy, hàm lượng chất hịa tan trong mơi
trường thường giảm từ 6% xuống cịn 1,5-1,8%. Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm
ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất
khô đạt từ 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun, điều khiện sấy phun là nhiệt độ chất
tải nhiệt đi vào phải đạt từ 165-1800C và đi ra đạt 60-700C. Thời gian lưu của chế phẩm
enzyme trong thiết bị sấy phun không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy không
quá 400C. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm, có thể thu
được chế phẩm enzyme pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc
canh trường với ethanol theo tỷ lệ 4:1; với aceton theo tỉ lệ 2:1, với isopropan theo tỉ lệ
1,3:1 hoặc với muối amoni sunfat (50-80%) trong muối kết. Nếu kết tủa bằng ethanol,
hoạt độ pectin trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-89% so với hoạt độ của dịch canh trường
ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối amoni sunfat. Cần tách muối ra khỏi enzyme bằng
phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khơ. Khi độ bão hịa
của (NH4)2SO4 có độ bão hịa 1,0 thì sẽ có kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại
có hoạt độ pectinase cao.

Phương pháp yếm khí

Mơi trường:

Nhóm 10 Trang 11

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….
+ Bã củ cải 2%.

+ (NH4)2HPO4 0,75%

+ KH2PO4 0,1%.

+ CaCO3 0,3%

+ Nước chiết ngơ 0.5%

Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở
pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy enzyme sẽ tối
đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60 giờ, pH ban đầu của môi
trường dung dịch là 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường
chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình ni cấy được tiến hành ở
nhiệt độ 350C.

Cl. Felsineum cũng có thể được ni cấy yếm khí thu được pectinase. Thành phần mơi
trường gồm có: (NH4)2SO4 0,4%; KH2PO4 0,3%; K2HPO4 0,7%; NaCl 0,1%; MgSO4
0,025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0.5%; dịch nấm men tự phân 0,05%; ascorbic acid
0,5%.

Có thể tiến hành thu phế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết hợp kết tủa enzyme
với dung môi hữu cơ hoặc muối amoni sunfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của
dung dịch đã xử lý là 6,5 – 6,8, nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã
xử lý là 6,5 – 6,8. Nếu kết tủa bằng 2 -2,5 thể tích axeton thì hoạt độ của enzyme trong
kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.

Khi kết tủa bằng amoni sunfat có độ bão hịa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa
pectinesterse và pectintranseliminase và exopolygalacturonase.

Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo các bước
cơ bản sau đây:

+ Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel P100)

+ Tách protein bằng phương pháp trao đổi ion (DEAE Biogel A) hay trao đổi cation (CM

Biogel A).

+ Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang.

+Tinh sạch FPLC

Nhóm 10 Trang 12

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tính điện thay thế
pectate liên kết ngang.

Chương 2: CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME TỪ VI SINH VẬT

2 Nguyên liệu sản xuất

2. 1 Nguyên liệu từ thực vật
Pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá, trong một số loại
quả. Thường có nhiều enzyme pectinesterase.

Đặc điểm của pectinesterase thực vật:

Bên cạnh pectinesterase (PE) vi sinh vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzyme
PE. Enzyme này thường tốn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế
bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim
loại ở nồng độ thấp như Ca2+ có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme.

Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả hai PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của
quá trình chin, khi bước vào gai đoạn chin, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2

tích lũy dẫn cho trái cây có màu đặc trưng của trái chin. PE2 có khối lượng phân tử 32
kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 670C. Các ion Ca2+ và
Na2+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M theo thứ tự.
PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33 kD, hoạt động tối ưu tại pH gần
bằng 8. Polygacturonic acid sản phẩm hình thành do q trình để metyl hóa là một chất
ức chế cạnh tranh.

Trong thịt quả chuối có 3 isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân tử là 30kD,
nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt động ở pH tối ưu
là 7,5, hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M và đưa pH
của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại polyol có khối lượng phân
tử thấp như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galctose.

PE trong quả cam có hai loại: Đó là 2 enzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36 kD,
nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và lớn hơn 11,00 theo thứ tự, pH tối ưu của
PE1 là 7,6 còn của PE2 là 8,0.

Nhóm 10 Trang 13

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

Thịt quả cũng chứa 2 isoenzyme, một trong hai enzyme này có tính bến nhiệt hơn, cịn
enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi tác động của protease. Độ ổn định của enzyme có thể
liên quan đến mức độ của glucosyl hóa của các phân tử enzyme. Enzyme bèn nhiệt hơn
và enzyme kia có khối lượng là 51 kD và 36 kD theo thứ tự.

Cả táo và kiwi cũng chứa 2 isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối lượng phân
tử là 57 kD và cũng có điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên chúng khác nhau về mức độ bền
nhiệt, một điểm đáng lưu ý là tất cả enyme vi sinh vật đều không phải là protein kiềm, PE
của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3 – 9,5 và pH tối ưu là

7,6. Tuy nhiên PE của Aspergilus có điểm đẳng điện và pH tối đa ở 4,5 ở 400C. Các PE
acid và kiềm có thể metyl hóa và pectin này có thể tạo gel yếu với ion Ca2+, PE acid tạo
ra pectin để ester hóa có khả năng tạo gel mạnh với ion Ca2+.

2.1 Nguyên liệu từ vi sinh vật

Nhiều vi sinh vật sống trong đất, trong nước có khả năng phân giải pectin. Chúng có ý
nghĩa quan trọng khơng những đối với vịng tuần hồn 2 cacbon trong tự nhiên mà cịn
đối với một số ngành sản xuất trong công nghiệp.

Những vi sinh vật có khả năng phân giải pectin mạnh mẽ nhất:

+ Nấm mốc: Asp. Ficuum; Asp.niger; Asp.oryza; Asp.awamori; Asp.terrus; Asp.saitoi;
Pen.glaucum; Pen.chrlichii; Mucor mucedo; Rhizopus tritici…

Trong số các biến chủng của nấm mốc đáng chú ý là Asp.niger và Asp.awamori.

+ Nấm men: Sac.fraglis; Sac.ellipsoideus; Sac.ludwigii…

+ Vi khuẩn: Bac.polymyxa; felseneus; Clostridium roserum; Pseudomonas flurescens…

Tất cả các vi sinh vật dùng để thu enzyme pectinase đều là vi sinh vật hiếu khí.

Đặc điểm phân bố enzyme pectinase ở vi sinh vật:

Sự phân bố các kiểu enzyme pectinase ở vi sinh vật không giống nhau: có cơ thể chỉ tạo
được một số enzyme song đa số cơ chế khác lại ra được một phức hệ enzyme pectinase
khác nhau mà tùy theo loài.

Sac.fragilis: chế tạo ra duy nhất 1 loài enzyme phân giải pectin dài nhất là endo –

polygalacturonase.

Các nấm mốc Asp.niger; Asp.awamori; Asp.foelidus; Asp,saitoi…thường tạo ra được một
phức hệ enzyme pectinase khác nhau.

Nhóm 10 Trang 14

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

Enzyme pectinesterase: chủ yếu được tạo ra từ Asp.niger. Ngược lại ở Pencitrimin;
Asg.campestris lại không tạo được enzyme này.

Các enzyme pectin – hydrolase (pectinesterase và polygalacturonase): chủ yếu được tạo
ra từ vi khuẩn Erwina caralovona; Bac.polymxa; Klebsiella acrogens; Flawobact
pectinovorum; Actinomyces.

Enzyme pectin – transeliminase: chủ yếu do Bac.species; Asp. Fonseaner;
bac.polymyxa…

Các enzyme polygalacturonase thường được tạo ra chủ yếu bởi Con.diplodiella;
Ag.campestris; Pen.citrimin…

Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng, hoặc chỉ là enzyme bán
thể. Theo F.Moran và M.P.Starr các vi sinh vật Erwinia eurolovora và Erwinia aroidease
chỉ tạo ra enzyme polygalacturonat – transeliminase bán thể song sẽ tạo ra enzyme này
cảm ứng khi có mặt acid Polygalacturonic hoặc các sản phẩm phân giải của nó. Ngược lại
D.K nosel thì cho rằng các acticomyces chỉ có khả năng sinh tống hợp ra enzyme
polygalacturonat - transelominase cảm ứng.

Một điểm khác cũng đáng lưu ý là các enzyme pectinase ở các vi sinh vật không những

khác nhau về đặc điểm phân bố mà cịn khác nhau về tính chất.

Điều kiện hình thành enzyme pectinase bởi các vi sinh vật

Sự sinh trưởng tốt của vi sinh vật trên môi trường này hay môi trường khác chưa thể coi
là tiêu chí của sự tân tạo tối đa của 1 enzyme nào đó. Mơi trường mà trước hết nguồn C,
N, P được chọn một cách đặc hiệu sẽ đảm bảo được sự định hướng tổng hợp các enzyme,
không những vậy môi trường dinh dưỡng còn sẽ tác động đến các enzyme trong chế
phẩm thu được. Theo P, Kontio, với enzyme pectinase, chế phẩm enzyme thu được khi
nuôi cấy Aspergillus niger trên môi trường dinh dưỡng khác nhau sẽ khác nhau về vị trí
số pH tối ưu trên cơ chất.

2.2 Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng và nguồn cacbon.

Chất cảm ứng pectin bắt buộc.

Nguồn cacbon: polysaccharide; disaccharide; monosaccharide.

Nếu sử dụng hỗn hợp glucide trong đó có pectin để ni cấy vi sinh vật thì hoạt lực của
pectinase ngoại bào có thể tăng 4 -6 lần so với khi nuôi cấy không có pectin.

Nhóm 10 Trang 15

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

Giống Asp. Niger được ni cấy trên mơi trường có nhiều nguồn cacbon như pectin, tinh
bột, isulin, lactose, saccarose, manose, galactose nồng độ 2,4,6% sẽ cho monosacchride
và glyxerin thì hồn tồn khơng thể sinh tổng hợp này. Đường glucose sẽ có tác dụng kìm
hãm sự sinh tổng hợp enzyme pectinase trên mơi trường ni cấy là pectin và lactose đối
với lồi Asp.niger, Asp.awamori.

Nguồn pH cuối Khối lượng sợi Hoạt độ pectinase đơn vị
cacbon ở nấm khô (g)
trong môi 5,9 Trên 100ml Trên 100g sợi
trường 6,0 0,320 môi trường nấm khô
7,0 0,510 1206
Pectin 2% 7,0 0,020 385,9 1250
Pectin 4% 4,2 0,020 640,2 00
Lactose 2% 4,5 0,300 00
Lactose 4% 3,0 0,500 00 21
Saccarose 2% 1,120 00 40
Saccarose 4% 65 1600
Lactose 2% + 20
Pectin 2% 1894,2
Saccarose 2%
+ Pectin 2% 3,5 1,125 864,3 690

Bảng 2 ảnh hưởng của nguồn cacbon

2.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nếu dùng kết hợp nitơ hữu cơ và vơ sơ sẽ có tác động tốt đến quá trình sinh tổng hợp
pectinase. Tuy nhiên, muối natri kim loại kiềm lại kìm hãm enzyme này.

Ví dụ: Đối với Asp. niger thì sử dụng muối photphat diamond (NH4H2PO4) để sinh tổng
hợp enzyme pectinase tốt nhất.

+ Đối với Asp.awamori thì nguồn nitơ thuận lợi nhất là (NH4)2SO4.

+ Đối với nấm mốc Asp. Foetidus thì (NH4)2SO4, nước chiết nấm men có tác dụng nâng

cao hoạt lực polygalacturonase.

Khi sử dụng các nguồn nitơ tối ưu này ta nhận thấy dịch canh trường bị acid hóa đến pH
= 2,5-3,0 và có sự tích lũy enzyme pectinase tốt hơn.

Nói chung tỷ lệ thích hợp nhất đối với C/N khi tổng hợp pectinase trong khoảng 7/1 –
13/1.

Nhóm 10 Trang 16

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

Nguồn nitơ Lactose 2% + Pectin 2%
(0,15% tính
theo nitơ) Khối lượng Hoạt độ Hoạt độ PE Hoạt dộ Hoạt độ PG
sợi nấm khô
(NH4)2HPO4 đơn vị/10ml PMG 0,885
NaNO3 (gam) 0,560
NH4NO3 Đơn vị/g 9,560
Pepton 1,200 0,750
Dịch thủy 0,890 1820,7 0,491 0,560 0,800
phân casein 0,850
1,500 880,6 0,917 0,310 0,580
(NH4)2HPO4 1,550 0,520
NaNO3 810,9 0,163 0,278 0,320
NH4NO3 0,500
Pepton 1620,0 0,418 0,410 0,530
Dịch thủy
phân casein 1350,0 0,340 0,450

Saccharose 2% + Pectin 2%

1,150 820,2 0,163 0,420
0,920
0,890 590,4 0,083 0,280
1,300
1,450 94,8 Vết 0,060

750,7 0,160 0,340

7,003 0,120 0,370

Bảng 3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

2.4 Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Ngoài nguồn C, N các ngun tố vơ cơ cũng có ảnh hưởng quan trọng đến sự tạo thành
phức hơp hệ enzyme này. Trong số đó P là cấu tử vơ cơ cần thiết của môi trường, hàm
lượng P trong môi trường phải là 8 -10%. Khi sử dụng nguồn N của photphat diamond
thì nhu cầu về P của nầm mốc hồn tồn được thỏa mãn. Các yếu tố khác như pH của
môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều ảnh hưởng đến
sự tạo ra enzyme pectinase.

Môi trường lên men giống

Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường Czapek.

Chuẩn bị bột carrot: carrot xay nhuyễn, sấy ở nhiệt dộ 600C cho đến khi độ ẩm carrot đạt
4% (nguồn pectin – chất cảm ứng).

Thành phần môi trường ni cấy thu nhận enzyme pectinase gồm:

Cám gạo 65,5%

Trấu 21,5%

Nhóm 10 Trang 17

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….
Bột carrot 11%
(NH4)2SO4 2%
Độ ẩm 55%

Nhóm 10 Trang 18

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….

3 Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme pectinase và thuyết minh

Nguyên liệu

Trộn Giống
Làm ẩm Nhân giống
Thanh trùng
Làm nguội, làm tơi
Cấy giống vi sinh vật
Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy

Thu nhận phế phẩm enzyme thô

Chế phẩm ezyme thô đem tinh chế

Nghiền mịn Thành phẩm
Trích ly
Lọc

Kết tủa enzyme
Thu nhận, sấy kết tủa

Tinh chế kết tủa
Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết

Nhóm 10 Trang 19

Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: …………………………….
Thuyết minh quy trình

Trộn: Nguyên liệu được trộn với nhau.

Làm ẩm: có ý nghĩa quan trọng trong điều kiện sản xuất lớn, hàm ẩm tối ưu của môi
trường cám là 58 – 60%, khi nuôi cấy trong điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt thì đạt hoạt
độ enzyme cao nhất khi hàm ẩm 65 -68%. Tuy nhiên nếu môi trường quá ẩm thì sẽ bị
dính kết (khi hấp thanh trùng, làm tơi, khi nuôi cấy), dễ bị nhiễm vi sinh vật tạp nhiễm (bị
lên men rượu…). Để làm ẩm có thể dùng nước trộn với nguyên liệu rồi thanh trùng hoặc
làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng để điều chỉnh lại độ ẩm của khối
nguyên liệu. Cách sau có thể rút ngắn thời gian làm nguội, khống chế được độ ẩm chính
xác hơn nhưng địi hỏi phải thanh trùng ở nhiệt độ và áp suất cao hơn.

Thanh trùng bằng hơi nhiệt: làm cho môi trường được tinh khiết hơn, về phương diện
vi sinh vật và làm cho chín mơi trường (tinh bột, protein). Thơng thường người ta thanh

trùng bằng hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120 -1300C trong 2 -3 giờ.

Làm nguội và làm tơi môi trường để gieo giống: Khối môi trường vừa hấp xong cịn
nóng và dính kết. Vì vậy phải làm nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và
phân phối vào các dụng cụ nuôi cấy. Yêu cầu thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm
khuẩn từ nên ngoài. Nhiệt độ yêu cầu cần đạt được để gieo giống là 25 – 300C.

Nuôi cấy nấm mốc: Nhằm đủ lượng bào tử giống cho tồn bộ mơi trường ni cấy. Quy
trình cơng nghệ thực hiện tương tự như trong sản xuất lớn nhưng phải thực hiện các điều
kiện kĩ thuật đặc biệt và khắt khe hơn: nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn,
điều kiện nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài hơn ( gần gấp đơi)
để nấm mốc hình thành bào tử và đều.

Tiến hành q trình ni cấy: Sau khi gieo giống và phân phối vào các dụng cụ ni
(mành hay khay đục lỗ) rồi chuyển vào phịng ni có điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm
tương đối của khơng khí cũng như mức độ thơng khí. Q trình nuôi cấy nấm mốc kéo
dài 33-48 giờ/mẻ được trải qua 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: Từ khi nuôi cấy nấm mốc giống đến giờ nuôi cấy thứ 10-12, xảy ra sự
trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm. Để đảm bảo bào tử nảy mầm nhanh và hạn chế
nhiễm tạp, cần giữ độ ẩm nguyên liệu từ 55 – 60%, 𝜑 = 96 -100%, T = 30-320C.

+ Giai đoạn 2: Kéo dài trong 10 -1 8 giờ, nấm mốc phát triển mạnh, lan khắp bề mặt và
trong toàn khối môi trường ( khuẩn ti ăn sâu vào cơ chất ) dẫn đến hiện tượng kết bánh.
Q trình hơ hấp và tỏa nhiệt mạnh làm môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2,

Nhóm 10 Trang 20