Quy trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong làm nước quả

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO TIỂU LUẬN
MÔN: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Đề tài: QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PECTINASE
VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÀM NƯỚC QUẢ
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
SVTH: Trần Thị Mỹ Nhung 3004110234
Nguyễn Thị Ngọc Thi 3005110299
Phạm Thị Kim Tươi 3005110263
Phùng Thị Hằng 3005110064
Vũ Ngọc Khiêm 3005110125
Vũ Thị Tuyết Trang 3005110357
Nhóm 20Trang 1
Tp.HCM 06/2014
TPHCM. T04/2013TPHCM. T04/2013
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay nước ta đang trong thời kỳ phát triển mạnh, cùng với xu thế hội nhập nền
kinh tế quốc tế, thì các ngành khoa học kỹ thuật và dịch vụ ngày càng phát triển, theo
đó ngành công nghệ thực phẩm cũng từng bước được cải tiến để cung cấp các sản
Nhóm 20Trang 2
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
phẩm đầy đủ chất dinh dưỡng, đẹp mắt, tiện lợi đáp ứng những nhu cầu ngày càng cao
của con người.
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống đã trở thành phổ biến trong ngành sản

xuất thực phaamt và mang lại lợi ích khá lớn.
Trước đây, nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày nay,
người ta nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú và đa dạng và rẻ
tiền. Và được ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản xuất khác nhau.
Để hiểu sâu hơn về nguồn enzyme này nhóm em thực hiện đề tài tiểu luận quy
trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong sản xuất nước quả.
Vì thời gian hoàn thành báo cáo không nhiều, cũng như kiến thức còn hạn chế nên
không tránh khỏi những sai sót, em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của cô,
các bạn để bài báo cáo của em được hoàn thiện hơn và giúp em tiến bộ hơn trong
những bài làm sắp tới.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PECTINASE
1.1. Enzyme là gì?
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin , sản phẩm của
quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol… đây là một
nhóm ezyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase
Nhóm 20Trang 3
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
và protease. Enzyme này ban đầu được phát hiện trong các dịch chiết trái cây
như cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đầu tiên phải kể đến là phát hiện của E.fremi
(1840) trên đối tượng cà rốt.
1.2. Cấu tạo
Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc
acid –α–D–1,4 galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic còn
gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic. Pectine hòa tan trong tự nhiên là
ester metylic của acid pectic.
Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose
cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị
decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại,
cũng có lúc giữ nguyên dạng –COO. Người ta cho rằng protopectine là hợp
chất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột.

Trọng lượng phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC.
1.3. Phân loại
Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng:
Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase
St Enzym (tên gọi theo
hệ thống)
Enzym(tên
thường
gọi)
Phản ứng xúc tác
1 Pectin-pectinhydrolase pectinesterase
Pectin + H2O = n metanol +
pectic acid
2
Poly--1,4 galacturonid-
glycano hydrolase-PG
Endopoly
galacturonase
(endo-PG)
Thủy phân liên kết -1,4-D-
galacturonid trong
galacturonid không theo một
trật tự nào
3
Poly--1,4-D-
Exopoly
Thủy phân liên kết -1,4-D-
Nhóm 20Trang 4
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
galacturonidgalacturon-

hydrolase
galacturonase
(exo-PG)
galacturonid trong pectat,
trong galacturonic với sự đứt
mạch của acid galacturonic
4
Poly--1,4-D-
galacturonidmetilester-
glycanohydrolase
Endopolymetil-
galacturonase
(Endo-PMG)
Thủy phân liên kết -1,4-D-
galacturonid trong pectin
không theo một trật tự nhất
định.
5
Poly--1,4-D-
galacturonid
digalacturonoliase
Exo-pectatliase
(exo-PKTE)
Thủy phân liên kết -1,4-D-
galacturonid trong pectat với
sự tạo thành -4,5
aciddegalacturonic không theo
một trật tự nhất định.
6
Poly--1,4-D-

galacturonid glicanoliase
Endopectatliase
(PETE)
Thủy phân liên kết -1,4-D-
galacturonid trong pectat,
trong galacturonic với sự tạo
thành nối đôi không theo một
trật tự nhất định
7
Poly--1,4-D-
galacturonid metylester
glicanoliase
Endopectinliase
(Endo-PTE)
Thủy phân liên kết -1,4-D-
galacturonid trong pectin với
sự tạo thành nối đôi không
theo một trật tự nhất định
• Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester.
Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate
nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH
3
)
đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và
methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu
khác nhau. Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn
thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối
Nhóm 20Trang 5
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
ưu là 30-40

o
C và bị vô hoạt ở 55-62
o
C. Pectinesterase thường được hoạt hoá
bởi các ion Ca
2+
và Mg
2+
.
• Polygalacturonase: còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase,
xúc tác sự phân cắt các mối liên kết –1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4
D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và
endo-PG (endo-poly1,4 D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu
nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có
chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ
enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất.
Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzym
polygalacturonase được chia làm bốn loại:
• Polymethylgalacturonase hay còn gọi là -1,4-galacturonite-
methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được
methoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ
phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin,
đó là endo-glucosidase-polymethyl galacturonase kiểu I và exo-glucosidase-
polymethylgalaturonase kiểu II.
• Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng được
chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-
glucosidase-polygalacturonase kiểu IV. Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-
galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có
mức độ methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và
càng có hiệu quả. Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì

hoạt độ của enzyme này thường bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các
VSV, đặc biệt là nấm mốc A. niger, A, awamori.
• Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị
ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4 D-galac turonide) lyase) và
endo-PEL (endo-poly(1,4 D-galacturonic lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin
có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này.
Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ
8,0-11, đều cần ion Ca
2+
để hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong
cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng
Nhóm 20Trang 6
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân
hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật.
Ngoài ra còn có:
• Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly –1,4-galaturonite
methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid.
• Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly -1,4D-galaturonite –
glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid.
Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester
hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme.
1.4. Đặc điểm của Enzyme pectinase:
1.4.1. Enzym pectinase từ nguồn thực vật:
 Pectinesterase:
Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enyme
PE.Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong
phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi
kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca
2+

chẳng hạn, có khuynh
hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme.
- Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai
đoạn đầu của quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme
PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc
trưng của trái chín. PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme
này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67
o
C. Các ion Ca
2+
và Na
+
làm tăng hoạt
độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo thứ tự.
- PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối
ưu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình thành do quá
trình để methyl hoá các phân tử galacturonic acid.
- Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng
phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme
này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung
Nhóm 20Trang 7
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này
bị ức chế bởi nhiều loại.
- Polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose,
maltose và galactose.
PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng
phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là
- 10,05 và 11,0, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0.
- Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyem,

một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm
hơn khi bị tác động của protease. Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến
mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và
enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự.
Hình 2.1: Cấu trúc của pectinesterase từ carrot
- Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng
khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng
khác nhau về mức độ bền nhiệt.
 Polygalacturonase:
Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG
thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi
khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger,
Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các
Nhóm 20Trang 8
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong
thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín.
Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều
là endo-enzyme.PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất
hoạt ở nhiệt độ 78
o
C.PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất
hoạt ở 57
o
C. PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở
pH 5,6.
Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra
galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế.Sự thủy phân polymer
này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ
phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối

với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh
sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất.
Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy
galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan.
1.4.2. Enzym pectinase từ vi sinh vật
Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn.
Nấm mốc: penicillium glaucum, p.ehrlichii, p.chrysogenum, p.expanam,
p.cilrimim, aspergillus awamori, a.foetidus, a.niger, a.terrus, a.saitoi, a.aureus,
a.oryzae, a.wentii, fusarium moniliforme,…
Nấm men: saccharomyces fragilis
Vi khuẩn: bacillus polymyxa, flavobacterium pectinovorum, klebsiella
aerogenes…
Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các
bộ phận khác của thực vật. khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ
cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật.
Nhóm 20Trang 9
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bề
sâu của nấm mốc.
Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime này a.niger chủ
yếu tổng hợp ra pectinnesterase. con.diplodiella, pen.citrimin tạo ra chủ yếu là
polygalacturonase.
Nấm men sacch.fragilis dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase.
Vi khuẩn bac.polymyxa, bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase.
 Pectinesterase:
Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị PH tối ưu
khác nhau: PH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn
của chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có PH tối ưu từ 2,0 đến
6,5. Trái lại ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6
đến 7,5 – 8.

Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 45
0
C.từ 55 đến 62
0
C
thì enzime bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime pectinesterase từ
thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 60
0
C
Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có
nhiệt độ tối ưu là 30 – 45
o
C, PH
opt
= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62
o
C và từ thực
vật (ph
opt
=7,5-8, t
o
opt
= 55-60
o
C). khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào
nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt là ion canxi,
cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc
conithyrium diplodiella và từ a.niger.trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủy
ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của
pectinesterase

Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái đông
thể. và người ta cũng đã xác lập được rằng n-axit cuối trong phân tử enzime là
phenylalanin.
Nhóm 20Trang 10
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm
methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do. và enzime sẽ thủy phân lần
lượt cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin. hoạt động của pectinesterase phụ
thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester
hóa. Chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm mốc a.niger, cần
thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%.
 Polygalacturonase:
Hầu hết các nghiên cứu về Polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn
Vi sinh vật. Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại
bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: saccharomyces
fragilis, asperigillus niger, lactobacillus plantarum, cochlibolus carbonum,
neurosrora crassa, các loài ascomycete, rhizopus arrchizus và fusarium
oxysrorum.
PH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào
nguồn thu và cơ chất. Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa
(endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu nằm trong
khoảng từ 4,0 – 5,5. cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có
ph tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng
trên pectin thì ph tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối
ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6
Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6
Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa
bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5
Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40
-45

0
C.trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạt
hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 65
0
C.
1.5. Trung tâm hoạt động của pectinase
Nhóm 20Trang 11
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng xoắn kép về phía phải với
2 vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất.
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate và
Lysine. Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả
năng xúc tác của enzyme
Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45 – 55
0
C.
1.6. Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase
Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mục
đích cơ bản.
- Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả.
- Làm trong và ổn định chất lượng nước.
 Phá vỡ thành tế bào. Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào
(thành tế bào). Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho
tế bào. Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như
chất ciment gắn các tế bào với nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho
các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào. Các chế phẩm enzym có chứa
không chỉ pectinase mà còn chứa các enzym trong nhóm cellulase. Các loại
enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá trình thu nhận dịch tế bào
tốt hơn.
 Làm trong nước quả. Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào

thường chứa nhiều chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể
và pectin thường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả.
Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào. Pectin chứa
polygalacturonic acid, araban và galactan.Trong đó lượng polygalacturonic
acid chiếm tới 40-60%. Khi bị thủy phân, pectin tách thành hai phần:
- Phần trung tính – phức chất galactanoraban
- Phần acid – acid pectic.
Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào và gian
bào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng
gian bào có chứa lượng kim loại khá lớn và một lượng nhóm metocyl đủ để
Nhóm 20Trang 12
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
làm protopectin bền vững. Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim
loại không nhiều, có độ metocyl hóa cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng
trương nở tốt.
Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào khó liên kết
với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra.Pectin thường có mối liên kết hydro và
liên kết nguyên tử yếu hơn so với cellulose. Tham gia phân hủy pectin gồm
nhiều loại enzym : cellulose, pectinase,…
1.7. Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase
Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người
đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp. Số
lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào
công nghiệp cũng ngày càng nhiều.
Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm
pectinase dưới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh
trường nấm mốc sấy khô. Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng
nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%.
Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm
sau:

- Sản xuất rượu vang.
- Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn;
- Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,
- Sản xuất nước giải khát.
- Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan.
• Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các
nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả.
Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất
dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu
nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép lên tới 15 – 25%. Bởi lẽ
khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả
Nhóm 20Trang 13
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
không thoát ra được. Nhờ pectinase phân giải các cơ chất pectin, làm các chất
chiết trong dịch bào dễ thoát ra ngoài hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, hơn
nữa dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy,
enzym pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những
chất hòa tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm.
Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu
sau:
- Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được gây ảnh
hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm; nghĩa là chế phẩm phải
được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chất
lượng vang.
- Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ chế
quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu suất chung và
đặc biệt là hiệu suất của phần tự chảy có chất lượng cao. Để tăng nhanh và tốt
quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzym chính như endo
– PMG là 55,0.10
2

đơn vị/mg protein chứa trong chế phẩm, còn enzym Cx là
57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít dung dịch. Trong trường hợp này không cần
có mặt PE. Nhưng nếu hoạt độ của endo – PMG ở trong chế phẩm là 31,0.10
2
đơn vị/mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vị/mg protein.
Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng enzym endo – PMG va Cx phải có sự
tương quan nhất định. Khi chế phẩm có hoạt độ endo – PMG là 28,2.10
2
đơn
vị/mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh
hơn khi có hoạt độ endo – PMG là 25,4.10
2
đơn vi/mg P và Cx là 55,0 đơn
vị/mgP.
- Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phải chứa
enzym proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin và
140 đơn vị/g theo anbumin.
- Để tránh gây tổn thất các chất màu cùa vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối
trong vang trắng thì hoạt độ của các enzym oxy hoá trong chế phẩm không
Nhóm 20Trang 14
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
được vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chế
phẩm.
- Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo toàn được hoạt độ trong
điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điều kiện
có độ pH nhất định.
- Để xử lý dịch hoặc bã nghiền ở trạng thái dòng có thể dùng chế phẩm pectinase
có hoạt độ cao (12000đv/g) hoặc dùng chế phẩm pectinase không tan.
Chẳng hạn trong sản xuất vang nho, khi sử dụng chế phẩm
pectawamorin PM

10x
, người ta thấy có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32%.
Trung bình thể tích của phần dịch tự chảy có thể tăng được 10%, còn hiệu suất
chung của dịch tăng lên 1 – 2%. Hoặc khi ép bã nghiền nho trắng đã được xử lý
bằng pectinol thì thấy quá trình ép tiến hành nhanh hơn. Hiệu suất dịch khi đó
tăng lên 9,6%. Vậy dùng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng tốc độ làm trong và
tốc độ lọc của dịch.
Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch như protein,
pectin … sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt do đó làm tăng tốc độ lọc. Trong 1 giờ
dịch thu được từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽ qua
lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không được xử lý.
Khi dịch không được xử lý bằng enzym thì trong quá trình lắng, các hạt
vẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống. Khi sử dụng enzym thì các chất cao
phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độ
làm trong đều tăng.
Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của
vang.
Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phần
hóa học của bã thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol.
Người ta thấy rằng khi xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng
hàm lượng catesin ở trong dịch. Khi đó quá trình trích ly sẽ vượt lên trước quá
trình oxy hoá catesin ngay cả khi nhiệt độ tăng. Điều này rất quan trọng, vì các
Nhóm 20Trang 15
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
hợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường
có họat tính của vitamin P. Như vậy xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase
sẽ làm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang.
Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bã
bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn. Người ta
cho thấy rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc, Botrylis cinerea gây ảnh hưởng

rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương thơm mạnh và dịu do hàm
lượng glyxerin và ester ở trong vang cao.
Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế phẩm
enzym bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulase. Trong đó, enzym
pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất. Trong hỗn hợp chế phẩm
enzym trên, tuyệt đối không được có mặt enzym polygalacturonase, đặc biệt
không được chứa enzym endopolygalacturonase. Những enzym này thường
làm giảm độ nhớt của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả.
CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME
PECTINEASE
2.1. Nguồn gốc thu nhận
• Từ vi sinh vật : Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì
ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú.Vi sinh vật phân giải pectine
hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:
 Nấm mốc: Asp.niger, Asp.oryase, Asp.terreus, Asp.saito,
Asp.japonicus…
 Nấm men: sac.ellipsoideus, sac.fragilis, sac.ludwigii …
 Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum…
2.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
 Quy trình sản xuất
Môi trường
Dụng cụ nuôi cấy
Hấp khử trùng
Hấp khử trùng
Nhóm 20Trang 16
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Để nguội
Để nguội
Phối vào dụng cụ
Cấy vào môi trường

Nhân giống
Giống vi sinh vật
Nuôi cấy trong 36h
Thu nhận enzyme thô
 Thuyết minh quy trình:
• Môi trường nuôi cấy
Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô
mảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng. Môi trường rắn thường dùng
Nhóm 20Trang 17
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và
khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiều
enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải đường,
bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao. Bên cạnh
đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khí tốt, giúp cho
sự phát triển của nấm. Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấy gồm có: 70%
cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dd khác ( mầm mạ, nước khoai
tây, … để cung cấp thêm nguồn Nitơ, Photphat, Kali, … ). Môi trường rắn cần
được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì nhiều loại vi khuẩn phát
triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi trường nhanh khô, sinh
bào tử mạnh.
• Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi
có sẵn các giá.
• Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở 121
0
C/1atm/30
phút để tránh tạp nhiễm.
• Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay đã
được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 30
0

C thì tiến
hành cấy giống.
• Giống
Sử dụng nấm mốc.Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng
để tránh nhiễm tạp.giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môi
trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân giống thường để
cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theo
phương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín. Tỉ
lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào 10kg
môi trường.
• Nuôi cấy
Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các
giá.Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió.Nhiệt
độ thích hợp với đa số mốc là 30-32
0
C.Nếu nhiệt độ xuống dưới 24
0
C thì nấm
Nhóm 20Trang 18
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy sẽ làm
giảm khả năng sinh tổng hợp Enzyme.
Qúa trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3 giai
đoạn:
• Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14h đầu: giai đoạn này có những thay đổi sau:
 Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa.
 Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ cần
làm thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ.
 Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự
thay đổi.

• Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18h: giai đoạn này có những thay đổi
sau:
Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường,
lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi trường kết
bánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần.Các chất dinh dưỡng trong môi trường
tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống
hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ. Làm nhiệt độ môi
trường tăng lên 40
0
- 45
0
C. Thời kì này cần phải thông khí mạnh tới 60 thể tích
khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O
2
cho mốc thở và đuổi CO
2
ra khởi môi
trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai
đoạn này cần giữ ở 28 - 30
0
C và độ ầm trong phòng khoảng 90%.
Các loại Enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được hình
thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng.
• Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20h: giai đoạn này có những
biến đổi
Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm
lại. Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khí không quá
20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng nuôi duy trì ở
30
0

C.
Nhóm 20Trang 19
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy có thể
kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, Enzyme vẫn được hình
thành ở giai đoạn này.
Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền nhỏ,
đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm.Sản phẩm này là chế phẩm
enzyme thô.
2.3. Tách và làm sạch
2.3.1. Phương pháp thu nhận
Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phương
pháp tách và thu nhận riêng:
• Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi
trường nuôi cấy ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và
tinh sạch.
• Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật
và không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh vật sau khi
được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là giải
phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào. Hỗn hợp thu
được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; còn
enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ được đem tinh
sạch.
Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào
Khó tách Dễ tách
Phài phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào
Thường lẫn chung zới các chất
khác của tế bào sau khi bị phá vỡ
(acid nucleic, chất nguyên sinh,
lipid…)

KHông lẫn chung với các thành
phần nội bào, nếu có chỉ là một
vài enzyme ngoại bào khac
Chỉ bần vững trong môi trường
nội bào
Bền cững hơn
Nhóm 20Trang 20
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Phương pháp tinh sạch khó thực
hiện, quy trình công nghệ phức
tạp, giá thành đắt
Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ
hơn
2.3.2. Từ môi trường nuôi cấy bề mặt
Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung
dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton).Nhiều kết quả thí
nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và dể được dùng
rộng rãi trong sản xuất.Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết
được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất
không tan. Nước thường dung khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 28
0
C. Để tránh tạp
nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết
thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được
làm lạnh kịp thời xuống 10 – 12
0
C.
Phương pháp tách chiết và làm sach enzyme được sử dụng rộng rãi nhất
hiện nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol,
izopropanol và axeton). Các dung môi hữu cơ này làm giãm hằng có điện môi

của môi trường. như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện
mới. Vì vậy các enzyme, các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp
trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.
Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn,
nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme. Để tránh
mất họat tính của enzyme tất cả phải được làm lạnh xuống 3 – 5*C. Khi trộn
phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa và lắng xuống dưới cần tách ly ngay.
Sơ đồ tinh sạch Enzyme từ canh trường nấm mốc.
2.3.3. Từ môi trường nuôi cấy bề sâu
• Phương pháp hiếu khí
Nhóm 20Trang 21
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh
vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng
phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường
đạt từ 6-7.2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp sinh khối
và sự tích luỹ enzyme pectinase.Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm
trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự
tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ 2-
10%.Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ
trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ
sơ bộ thường là 38-42h.Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá
trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường giảm từ 6% xuống
còn 1.5-1.8%
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân
không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên
thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt
165-180 độ C và đi ra đạt 60-70 độ C. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme
trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy

phải không quá 40 độ C. Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để tránh
hút ẩm.
•
Phương pháp yếm khí
Môi trường: bã củ cải 2%; (NH
4
)
2
HPO
4
0.75%; KH
2
PO
4
0.1%; CaCO
3
0.3%;
nước chiết ngô 0.5%
Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách
mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự
tích luỹ sinh khối. Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của
sự sinh trưởng qua 55-60h, pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6.5-7.0.
Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh trường chứa bào tử
và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở
Nhóm 20Trang 22
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
nhiệt độ 35%
Cl.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần
môi trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH
4

)
2
HPO
4
0.4%; K
2
HPO
4

0.7%; KH
2
PO
4
0.3%; NaCl 0.1%; MgSO
4
0.025%; FeSO
4
dạng vết; CaCO
3

0.5%; dịch nấm men tự phân 0.05%; ascorbic acid 0.5%
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa
enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat. Nếu kết tủa
bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8.Nếu kết tủa bằng
2-2.5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt
độ ban đầu.
Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm
chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là 0.9-1.0 thì sẽ
thu được chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase và exopolygalacturonase.
2.4. Phương pháp tinh sạch

Có rất nhiều kỹ thuật và phương pháp tinh sạch khác nhau để tinh sạch
enzyme. Các kỹ thuật này được áp dụng chủ yếu dựa vào tính chất của phân tử
protein như kích thước, khối lượng phân tử, khả năng tích điện, Mỗi kỹ thuật
tinh sạch đều có ưu và nhược điểm riêng trong việc chiết tách các loại protein-
enzyme khác nhau. Trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi xin giới thiệu
một số kỹ thuật cơ bản và thường được áp dụng trong tinh sạch pectinase
2.4.1. Giới thiệu chung
Các dạng chế phẩm enzyme:
• Chế phẩm thô: chế phẩm thô từ canh trường lỏng và chế phẩm thô từ
canh trường bề mặt.
• Chế phẩm kỹ thuật: là chế phẩm được tinh chế sơ bộ, trong đó một số
protein và enzyme tạp đã được tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa
một vài enzyme chủ yếu.
• Chế phẩm tinh khiết: là chế phẩm trong đó chỉ chứa một loại enzyme
nhất định với hàm lượng cao.
Nhóm 20Trang 23
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Thường tinh sạch enzyme từ các chế phẩm enzyme thô. Chế phẩm thô thường
chứa những thành phần cơ bản sau:
• Nước –chiếm khối lượng lớn nhất.
• Protein không có hoạt tính sinh học.
• Các tạp chất từ tế bào (nếu là nguồn động, thực vật), từ môi trường nuôi
cấy (nếu là nguồn VSV).
• Enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học cao).
Quá trình tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ ba phần đầu, chỉ nhận
sản phẩm cuối là enzyme mong muốn (trong đó phần lớn enzyme tạp đã được
loại bỏ). Việc loại ba thành phần đầu không thể cùng thực hiện trong một giai
đoạn mà phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ
loại bỏ được một phần không phải là enzyme mong muốn ra khỏi hỗn hợp,
khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo.

Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme:
• Khối lượng chế phẩm enzyme được giảm dần qua từng bước tinh sạch.
• Tăng hoạt tính enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình sử dụng
sau này.
• Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm.
• Tạo những chế phẩm tinh khiết nhằm mục đích nghiên cứu hoặc ứng
dụng trong y học
Tóm tắt quá trình tinh sạch
2.4.2. Phương pháp kết tủa
 Kết tủa bằng cách thay đổi lực ion.
• Nguyên tắc
Enzyme hòa tan trong dung dịch dựa vào sự cân bằng giữa lực tĩnh điện và
tương tác kỵ nước. Sự kết tủa enzyme xảy ra khi ta thêm muối trung tính vào
dung dịch với nồng độ thích hợp. Khi đó, enzyme kết tủa thuận nghịch và có
thể thu lại dung dịch enzyme bằng cách tách (ly tâm) và hòa tan lại kết tủa.
Ngoài ra, trong một số trường hợp, khi bổ sung muối còn có tác dụng làm bền
enzyme, chống lại sự biến tính và phân hủy hoặc nhiễm vi sinh vật
• Tác nhân kết tủa
Nhóm 20Trang 24
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Để kết tủa enzyme có thể sử dụng nhiều loại muối khác nhau. Trong thực tế,
ammonium sulfate được dùng phổ biến nhất vì muối này có độ hòa tan cao
trong nước, đạt được lực ion cao và giá thành rẻ. Tỷ trọng của dung dịch bão
hoà khoảng 1.235 g/mL, thuận lợi cho quá trình ly tâm để tách kết tủa.
• Các yếu tố ảnh hưởng
 Nồng độ muối: ở nồng độ thấp, sự có mặt của muối làm bền nhóm mang
điện trong phân tử enzyme và làm tăng tính tan của enzyme. Khi nồng
độ muối tăng thì độ tan của protein cũng tăng. Nếu tiếp tục tăng nồng độ
muối thì độ tan của enzyme sẽ giảm và enzyme bắt đầu kết tủa vì khi
thêm muối vào dung dịch, một số phân tử nước sẽ solvat phân tử muối

 Tính chất ion: sự ảnh hưởng của muối đến quá trình kết tủa được xác
định qua tính chất của các ion, trong đó điện tích ion là yếu tố ảnh
hưởng nhiều nhất. Hiệu quả ảnh hưởng của các ion âm giảm dần theo
trật tự sau: phosphate, sulphate, acetate, chloride… Những ion dương
hóa trị một có ảnh hưởng mạnh hơn ion dương hóa trị hai. Hiệu quả ảnh
hưởng xếp theo thứ tự giảm dần của các ion dương như sau: NH
4
+
, K
+
,
Na
+
.
 Thành phần, nồng độ dịch protein, nhiệt độ quá trình cũng có ảnh hưởng
đến sự kết tủa protein. Nhiệt độ càng cao thì tính tan của protein càng
giảm
• Phương pháp tiến hành
Nồng độ muối tối ưu cần sử dụng thay đổi tùy theo từng trường hợp và được
xác định bằng thực nghiệm. Khi thực hiện thí nghiệm, cần tiến hành bổ sung
ammonium sulphate chậm và khuấy đều. Kết tủa có thể tách ra bằng ly tâm hay
lọc. Phương pháp lọc chỉ được áp dụng khi tỷ trọng của protein kết tủa gần
bằng với tỷ trọng trong dung dịch.
Trong một số trường hợp, có thể sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn để
tinh sạch protein. Người ta bổ sung ammonium sulfate vào dịch trích đến nồng
độ mà protein mong muốn không tủa, các kết tủa xuất hiện sẽ được tách bỏ.
Sau đó bổ sung muối vào dịch để đạt đến nồng độ mà protein mong muốn kết
tủa. Cuối cùng, tách và thu nhận kết tủa.
Nhóm 20Trang 25