Phương pháp ly trích rna tổng số phục vụ giám định bệnh tristeza trên cậy có múi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

CHỦ ĐỀ

PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH RNA TỔNG SỐ PHỤC VỤ GIÁM
ĐỊNH BỆNH TRISTEZA TRÊN CÂY CĨ MÚI

Mơn: Thiết bị và Kỹ Thuật CNSH
GV: Huỳnh Văn Biết

Thủ Đức, Thứ sáu, ngày 26 tháng 10 năm 2023

Thành viên Nội dung Tài liệu tham khảo

Phạm Nguyễn Vĩ Ân
21126270

Phan Bá Quốc Anh Phạm Hồng Lâm
21126278 21126385

1

Thành viên Nội dung Tài liệu tham khảo

1. Giới thiệu 2. Vật liệu và
phương pháp

3. Kết quả 4. Kết luận

2

1. Giới thiệu

• Tristeza là một bệnh virus quan trọng trên cây có múi (CCM),
khoảng hơn 100 triệu cây phải tiêu hủy vào những năm 1930,
gây thiệt hại đáng kể cho ngành sản xuất CCM tại nhiều nước
trên thế giới.

• Ở Việt Nam, tỷ lệ CCM nhiễm bệnh Tristeza đang ngày càng
tăng cao tại các tỉnh phía Bắc trải dài đến Đồng bằng sông Cửu
Long.

3

1. Giới thiệu

• Trước tình hình đó, sản xuất và trồng cây giống sạch bệnh virus
được khuyến cáo có hiệu quả trong chiến lược ngăn chặn mầm
bệnh và để nhận biết được sự hiện diện Citrus tristeza virus
trong các giống cây người ta đã sử dụng các que thử nhanh
CTV, kỹ thuật ELISA hoặc phân tích RT- PCR.

• Các phương pháp này chưa tối ưu được kinh phí để giám định
sự hiện diện của Citrus tristeza virus.

• Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định phương pháp ly
trích RNA tổng số hiệu quả cho chẩn đoán CTV bằng kỹ thuật
RT-PCR.

4

Thành viên Nội dung Tài liệu tham khảo

1. Giới thiệu 2. Vật liệu và
phương pháp

3. Kết quả 4. Kết luận

5

2. Vật liệu và phương pháp

2.1 Vật liệu

• Các mẫu lá cam sành biểu hiện triệu chứng gân lá bị sưng
mô lá bị vàng được thu về từ vườn cam sành tại xã Tân
Quới, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.

• Que thử nhanh CTV

• Hóa chất ly trích RNA tổng số
• Bộ The qScript®XLT One-Step RT-PCR Kít (QuantaBio,

Hoa Kỳ)
• Cặp mồi T36CPF-T36CPR

• Loading buffer 6X (PHUSAbiochem, Việt Nam)

• Ladder 1kb của hãng Thermo Fisher (Hoa Kỳ), agarose

(Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ- A9539)

• Dung dịch đệm chạy điện di TAE 1% (Tris-HCI, acid

acetic, EDTA)

ã Ethium bromide (0,5 àg/mL). 6

2.1 Vật liệu

Hóa chất ly trích RNA tổng số

• Dung dịch ly trích TRIzol™ Reagent của hãng Invitrogen, Hoa Kỳ (Catalog
numbers: 15596026)

• Bộ NEXprep™ plant RNA extraction mini kít (NEX-Diagnostics, Hàn Quốc)
• Bộ dung dịch ly trích tự pha theo phương pháp SDS_x0002_Phenol:

Chloroform (Zhang et al., 2016)
• Bộ dung dịch ly trích tự pha theo phương pháp Rapid_x0002_CTAB

(Gambino et al., 2008).

7

2. Vật liệu và phương pháp

2.2 Phương pháp

Có 3 bước cơ bản
• Thu mẫu
• Xác định cây bị nhiễm CTV để làm mẫu đối chứng

bệnh trong nghiên cứu
• Ly trích RNA tổng số từ mơ lá cam sành bị bệnh

Tristeza:

8

2.2 Phương pháp

• Thu mẫu
- Các mẫu lá được thu có độ tuổi từ 1,5-2 tháng (lá thứ 2 hoặc 3 từ đọt tính xuống), vì
có nồng độ virus thường tập trung cao, thuận lợi cho phân tích RT-PCR

• Xác định cây bị nhiễm CTV để làm mẫu đối chứng bệnh trong nghiên cứu

- Thực hiện thu mẫu lá từ cây cam sành có triệu chứng kém phát triển, cơ đọt non màu
vàng, gân lá sưng về phịng thí nghiệm.
- Sau đó dùng que thử nhanh CTV (Agdia, Hoa Kỳ) để xác định cây bị bệnh Tristeza
mẫu dương tính với CTV dựa vào sự xuất hiện hai vạch trên que thử, từ đó định vị cây
nhiễm bệnh và được dùng làm mẫu đối chứng trong chẩn đoán CTV trên các mẫu cam
quýt bằng kỹ thuật RT-PCR trong nghiên cứu

9

2.2 Phương pháp

• Phương pháp ly trích RNA tổng số từ mô lá cam sành bị bệnh Tristeza
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại gồm 3 nghiệm thức lần
lượt là 3 phương pháp: NEXprep™, Rapid-CTAB (rCTAB),
SDS_x0002_PhenokChloroforme (SDS-P:C) và một đối chứng là TRIzol™.
+ Phương pháp ly trích TRIzol™ và Phương pháp ly trích NEXprep™ được thực
hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất
+ Phương pháp ly trích rCTAB
+ Phương pháp ly trích SDS-P:C

10

2.2 Phương pháp Bổ sung 900 µl dung
dịch ly trích rEB
+ Phương pháp ly trích rCTAB
ủ mẫu ở 650C, 15
Nghiền nhanh 200 mg phút.
gân lá trong nitơ lỏng
11
chuyển vào ống
eppendorf 2,0
ml.

2.2 Phương pháp Thêm 500 µL hỗn hợp C:I

+ Phương pháp ly trích rCTAB Chuyển phần nổi sang ống
Thêm 900 µL hỗn hợp Chloroform (C): eppendorf 2,0 mL mới.
Isoamy alcohol (I)
Trộn đều và ly tâm
Chuyển 500 µL phần nổi sang 11.000g, 40C, 10 phút.
ống eppendorf 2,0 mL mới.

Trộn đều và ly tâm
11.000g, 40C, 10 phút.

12

2.2 Phương pháp

+ Phương pháp ly trích rCTAB
Thêm 500 µL LiCI2 (3M)

Loại bỏ phần nổi phía trên Hòa tan lại kết tủa bằng Chuyển 400 µL phần nổi sang
và thu kết tủa RNA. cách thêm 500 µL ống eppendorf 2,0 mL mới.
SSTE buffer, 500 µL
ủ ở thùng đá 30 phút và ly hỗn hợp C:l Trộn đều và ly tâm
tâm 16.000g, 40C, 20 phút. 11.000g, 4°C, 10 phút

13

2.2 Phương pháp

+ Phương pháp ly trích rCTAB:
Bổ sung 280 µL isopropanol
(lạnh)

Loại bỏ phần nổi phía trên Rửa kết tủa RNA với 1 Loại bỏ phần nổi phía
và thu kết tủa RNA. ml ethanol 70% và ly trên, thu kết tủa RNA lần
tâm 7.500g, 40C, 5 phút cuối.
ly tâm 16.000g, 40C, 15
phút.

14

2.2 Phương pháp

+ Phương pháp ly trích rCTAB:

Hoà tan lại kết tủa RNA trong 40 µL nước khơng chứa
RNAase và lưu mẫu ở -800C.

15

2.2 Phương pháp Bổ sung 600 µL dung dịch ly trích spcEB và 600 µL hỗn
hợp Phenol (P): Chloroform (C)
+ Phương pháp ly trích SDS-P:C
chuyển 500 µL phần nổi sang ống
Nghiền nhanh 200 mg eppendorf 2,0 mL mới
gân lá trong nitơ lỏng Ly tâm 11.000g, 40C, 10 phút

chuyển vào ống
eppendorf 2,0
ml.

16

2.2 Phương pháp

+ Phương pháp ly trích SDS-P:C
Bổ sung 280 µL isopropanol (lạnh)

Loại bỏ phần nổi phía trên, Rửa kết tủa RNA với 1 ml Loại bỏ phần nổi
thu kết tủa RNA. ethanol 70% và ly tâm 7.500g, phía trên, thu kết
40C, 5 phút. tủa RNA lần cuối.
Ly tâm 16.000g, 40C,
20 phút

17

2.2 Phương pháp

+ Phương pháp ly trích SDS-P:C

Hoà tan lại kết tủa RNA trong 40 µL nước khơng chứa
RNAase và lưu mẫu ở -80°C.

18

2.2 Phương pháp

+ Chỉ tiêu ghi nhận: chi phí ly trích/mẫu (dựa vào giá thành từng loại hóa chất tại thời điểm
hiện tại từng loại hóa chất), thời gian ly trích một mẫu, nồng độ RNA tổng số, tỷ lệ tinh sạch
(A260:280), mức độ RT-PCR thành công.
+ Sau khi ly trích xong thì ta sẽ tiến hành giám định bệnh Tristeza bằng RT-PCR

• Phản ứng RT- PCR được thực hiện bằng bộ hóa chất The qScript® XLT One-Step
RT-PCR Kít và cặp mồi chuyên tính T36CPF-T36CPR

• Sản phẩm RT-PCR sẽ được điện di trên gel agarose 1,5% ở dung dịch đệm TAE 1X
với hiệu điện thế 70 Vol trong 50 phút và hiển thị băng DNA trên máy chiếu UV
với thuốc nhuộm ethidium bromide (0,5 µg/ml). Kết quà dương tính khi sản phẩm

RT-PCR hiển thị trên gel có kích thước 672 bp.

19