Giống hoa huệ (polianthes tuberosa l ) nuôi cấy mô do xử lý đột biến bằng tia gamma

ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC
THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SỬ DỤNG CHỈ THỊ ISSR TRONG VIỆC ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI
TRUYỀN CÁC DÒNG/GIỐNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa
L.) NUÔI CẤY MÔ DO XỬ LÝ ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA

Hướng dẫn khoa học: Nhóm sinh viên thực hiện:
TS. HUỲNH VĂN BIẾT TRƯƠNG THỊ MINH THẠNH
ThS. TRƯƠNG QUANG TOẢN PHẠM LÊ TƯỜNG VY
NGUYỄN LÊ THANH VY

TÊN BÀI BÁO

SỬ DỤNG CHỈ THỊ ISSR TRONG VIỆC ĐÁNH
GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG/GIỐNG
HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) NUÔI CẤY
MÔ DO XỬ LÝ ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA.

Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam – Số 6(79)/2017

TÁC GIẢ
Đào Thị Tuyết Thanh
Nguyễn Bảo Toàn

NỘI DUNG

1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHỈ THỊ ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE

REPEAT)

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1

1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHỈ THỊ ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE
REPEAT)

• ISSR là các đoạn DNA có kích thước khoảng 100-3000
bp nằm giữa các vùng vi vệ tinh liền kề, có hướng
ngược nhau.

• Khuếch đại bằng PCR sử dụng các chuỗi vi vệ tinh làm
mồi với một số nucleotide chọn lọc làm neo vào các
vùng lân cận không lặp lại (16-18 bp).

• Một mồi duy nhất.

2

ƯU ĐIỂM

• Khơng cần biết trước trình tự đoạn
mồi.

• Dựa trên PCR nên chỉ cần một
lượng nhỏ ADN mẫu.

Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn kĩ thuật PCR- NHƯỢC ĐIỂM
ISSR
• Kỹ thuật đa điểm nên có khả năng
không tương đồng của các mảnh
có kích thước tương tự.

• ISSR, giống như RAPD, có thể gặp
vấn đề về khả năng tái tạo. 3

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu
Đối chứng: Mẫu lá của giống hoa huệ 6 cánh và 12 cánh từ An
Giang.
Mẫu lá của 2 giống hoa huệ được xử lý đột biến từ giống hoa huệ
12 cánh bằng tia gamma kết hợp với kỹ thuật nuôi cấy mô 22 cánh
và 36 cánh.

a b c d

Hình 2.1. Giống hoa huệ địa phương và giống hoa huệ đột biến. a) Giống hoa huệ 4

có 6 cánh; b) Giống hoa huệ có 12 cánh; c) Giống hoa huệ có 22 cánh; d) Giống hoa huệ 36

2.2. Phương pháp nghiên cứu Bảng 2.1. Thể tích các chất được hút
Ly trích DNA tổng số vào eppendorf 0,2 ml để thực hiện
phản ứng PCR
Thực hiện phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 16,25µl

Buffer 2,5µl
2µl
dNTPs 0,5µl
Mồi xi 0,5µl
Mồi ngược 0,25µl
Taq DNA
polymerase 3µl
DNA bộ gene

25µl/ 1 phản ứng

6

2.2. Phương pháp nghiên cứu Mẫu lá của từng giống được thu thập
Ly trích DNA tổng số riêng rẽ và tách chiết DNA sử dụng
2% dung dịch đệm CTAB.

5

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng 14 mồi ISSR do cơng ty TNHH Sinh Hóa Phù Sa sản xuất và cung cấp.

Bảng 2.2. Thông tin các mồi ISSR được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền các
dòng hoa huệ đột biến

STT Tên mồi Trình tự (5’- 3’) STT Tên mồi Trình tự (5’- 3’)

1 3A01 (GA)8TC 8 808 (AG)8C
2 3A07 (AG)7CTT 9 836 (AG)8YA

3 3A21 (TG)7ACC 10 840 (AG)8YT
4 3A39 (CA)7GTA 11 842 (AG)8YG
5 3A42 (GACA)4C 12 855 (AC)8YT
6 3A62 (TG)7ACT 13 857 (AC)8YG
7 UBC873 GACAGACAGACAGACA 14 P23SR1 GGCTGCTTCTAAGC
CAAC

7

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Ly trích DNA tổng số Bảng 2.3. Chương trình nhiệt của các phản ứng
Thực hiện phản ứng PCR PCR

Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian (phút, Số
(℃) giây) chu kỳ
Tiền biến tính 92 5 phút
Biến tính 92 1 phút 1
Bắt cặp 35 30 giây 45
Kéo dài 72 1 phút 45
72 5 phút 45
Hậu kéo dài 1

8

2.2. Phương pháp nghiên cứu
Ly trích DNA tổng số

Thực hiện phản ứng PCR

Điện di sản phẩm PCR trên gel
agarose 1,5%

Ghi nhận kết quả và xử lí số liệu 9

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

M1 2 3 4 M1 2 3 4

3000bp 3000bp
2000bp
Hình 3.1. Ảnh điện di của các mồi ISSR đối 1250bp
với các dòng/giống hoa huệ được nghiên 850bp 900bp
600bp

cứu. a) Mồi UBC 873; b) Mồi P23SR1; c) Mồi 300bp

3A39; d) Mồi 808. 1: giống hoa huệ 6 cánh; b
2: dòng hoa huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ a
M1 2 3 4
36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M:
1250bp
Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : M1 2 3 4 700bp

băng DNA mất 1000bp

600bp

c d 10

M12 3 4 MỒI UBC 873

3000bp M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng
DNA có kích thước khoảng 200-
1250bp 3000bp.
850bp Giếng 2:
• Xuất hiện các băng ở vị trí

250bp và 1000 bp.

300bp

Hình 3.2. Ảnh điện di của mồi UBC 873 đối với các dòng/giống

hoa huệ được nghiên cứu. 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa

huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: 11

Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất

M12 3 4 MỒI UBC 873

3000bp M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng
1250bp DNA có kích thước khoảng 200-
850bp 3000bp.
Giếng 2 :
300bp • Xuất hiện các băng ở vị trí

250bp và 1000 bp.
• Mất các băng ở vị trí

300;350;850;1250;3000bp.

Hình 3.2. Ảnh điện di của mồi UBC 873 đối với các dòng/giống

hoa huệ được nghiên cứu. 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa

huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: 12

Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất

MỒI UBC 873

M12 3 4 M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng
DNA có kích thước khoảng 200-
3000bp 3000bp.
1250bp Giếng 2 :
850bp • Xuất hiện các băng ở vị trí

300bp 250bp và 1000 bp.
• Mất các băng ở vị trí
Hình 3.2. Ảnh điện di của mồi UBC 873 đối với các dòng/giống
hoa huệ được nghiên cứu. 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa 300;350;850;1250;3000bp.
Giếng 3 :
huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: • Xuất hiện các băng ở vị trí
Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất
1000bp và 2750 bp.

13

MỒI UBC 873

M12 3 4 M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng
DNA có kích thước khoảng 200-
3000bp 3000bp.
1250bp Giếng 2 :
850bp • Xuất hiện các băng ở vị trí

300bp 250bp và 1000 bp.
• Mất các băng ở vị trí
Hình 3.2. Ảnh điện di của mồi UBC 873 đối với các dòng/giống
hoa huệ được nghiên cứu. 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa 300;350;850;1250;3000bp.
Giếng 3 :
huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: • Xuất hiện các băng ở vị trí
Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất
1000bp và 2750 bp.
• Mất các băng ở vị trí

300;350;850;1250bp.

14

M12 3 4 MỒI P23SR1

3000bp M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng
DNA có kích thước khoảng 150-
2000bp 3000bp.
Giếng 2 và giếng 3 so xuất hiện các
900bp băng ở vị trí 500;600;800;1750 và
2000bp.

600bp

Hình 3.3. Ảnh điện di của mồi P23SR1 đối với các dòng/giống

hoa huệ được nghiên cứu. 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa

huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: 15

Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất

MỒI 3A39 VÀ 808

Cho sản phẩm khuếch đại cũng có sự xuất hiện mới và mất đi các bang DNA nhưng
số lượng ít hơn chỉ với 1 băng khác biệt so với đối chứng.

M 1234 M 1234

1000bp 1250bp
600bp 700bp

a b

Hình 3.4. Ảnh điện di của mồi 3A39 và 808 đối với các dòng/giống hoa huệ được nghiên cứu.

a) Mồi 3A39; b) Mồi 808. 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 16

cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hệ số tương đồng

Bảng 3.1. Bảng hệ số tương đồng di truyền của các dòng/giống hoa huệ nghiên
cứu với 4 cặp mồi ISSR.

Giống/dòng Giống hoa 6 Dòng đột biến Dòng đột biến Giống hoa 12
hoa cánh
1,000 22 cánh 36 cánh cánh
Giống hoa 6
cánh 0,643 1,000 1,000 1,000
0,571 0,500 17
Dòng đột biến 0,786 0,375
22 cánh
0,429
Dòng đột biến
36 cánh

Giống hoa 12
cánh

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hệ số tương đồng

• Hệ số tương đồng biến thiên trong khoảng 0,375 đến 0,786.
• Chỉ số tương đồng thấp nhất là 0,375 được ghi nhận giữa giống hoa

huệ gốc 12 cánh và dòng hoa huệ đột biến 22 cánh.
=> Có sự khác biệt lớn về mặt di truyền.
• Chỉ số tương đồng cao nhất là 0,786 được ghi nhận giữa giống hoa huệ

6 cánh và dòng hoa huệ 36 cánh.
=> Có mối quan hệ di truyền gần nhau.

18