Thiết bị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN MÔN HỌC

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH

Chẩn đoán sự hiện diện của Sarcoptes Scabiei từ vết
xước da ở bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ bằng

phương pháp PCR

Giảng viên hướng dẫn:
TS. Huỳnh Văn Biết
ThS. Trương Quang Toản

Hồ Chí Minh, thứ 7, ngày 28 tháng 10 năm 2023 1

THÀNH VIÊN NHÓM

Họ và tên MSSV
Dương Phạm Phương Nguyên 21126428
Trang Thị Tường Vi 21126236
Nguyễn Hùng Cường 21126295

2

NỘI DUNG THỰC HIỆN

1 • Đặt vấn đề
2 • Tổng quan

3 • Vật liệu và phương pháp
4 • Kết quả và kết luận

3

1. Đặt vấn đề

• Bệnh ghẻ do ký sinh trùng Sarcoptes
scabiei hominis gây nên có ở người và
các động vật khác.

• Bệnh ghẻ được tìm thấy từ thế kỷ XVI
nhưng mãi đến năm 1934 mới tìm được
ký sinh trùng gây bệnh ghẻ ở người.

• Kí sinh trùng ghẻ lây lan từ người này qua

người khác do dùng chung quần áo,... hoặc

khi quan hệ tình dục. Hình 1.1. Tổn thương do Sarcoptes Scabiei gây nên.

4

Mục tiêu và nội dung thực hiện

Xác định chính xác kí sinh trùng con ghẻ Sarcoptes scabiei có xuất hiện trên da của
bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ.

Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng
phản ứng PCR.

Hình 1.2. Ứng dụng phản ứng PCR trong xét nghiệm

5

2. Tổng quan
2.1. Một số đặc điểm của Sarcoptes Scabiei

Sarcoptes scabiei var. hominis thuộc giới động vật tiết túc, ngành chân khớp
Arthropoda, bộ Sarcoptiformes, họ Sarcoptoidae, giống Sarcoptes, loài S. Scabiei.

Ghẻ trưởng thành có hình bầu dục, màu xám, miệng rất ngắn, lưng gồ, bụng
phẳng, không mắt, không lỗ thở, có bốn cặp chân, mỗi chân có 5 đốt.

Ghẻ cái dài 0,3 - 0,45 mm và rộng 0,25 -
0,35 mm, kích thước con đực khoảng ¾
con ghẻ cái.

Hình 2.1. Hình thái con ghẻ trưởng thành

6

2.2. Chu kỳ sinh sản và cơ chế xâm nhập của Sarcoptes Scabiei

Con ghẻ Sarcoptes scabiei var. hominis trải qua 4 giai đoạn:
Trứng → ấu trùng → nhộng → con trưởng thành

Tùy thuộc vào nhiễm vật chủ nào, các con cái thường hay đào hầm trong da, chủ
yếu lớp ngoài da, ghẻ cái đẻ 2 - 3 trứng mỗi ngày.

Hình 2.2. Trứng Sarcoptes scabiei. Hình 2.3. Cái ghẻ đào hang dưới da và đẻ

trứng. 7

2.3 Triệu chứng lâm sàng

Thời kỳ ủ bệnh từ 2 - 40 ngày, trung bình từ 10 - 15 ngày.
Tổn thương đặc hiệu của bệnh ghẻ là luống ghẻ và mụn nước, thường do ngứa gãi gây
nên.
Người bị nhiễm ký sinh trùng ghẻ lần đầu tiên trong vịng 2 tuần đầu hồn tồn chưa
có biểu hiện ngứa.

Hình 2.4. Vị trí đặc hiệu xuất hiện ghẻ

8

2.4. Chẩn đoán Hình 2.5. Chu kỳ phản ứng PCR
9
Triệu chứng lâm sàng.
Dịch tễ: gia đình, đơn vị, tập thể nhiều người bị.
Soi tươi: kính hiển vi thấy trứng hoặc cái ghẻ.
IgE tăng cao.
Phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp PCR.

2.5. Kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR cho phép khuếch đại số lượng lớn
đoạn gen mục tiêu.
Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất của biến tính,
hồi tính của DNA và sự tổng hợp DNA.

Qua 3 giai đoạn: Biến tính – Bắt cặp – Kéo dài.

3. Vật liệu và phương pháp

3.1. Vật liệu, dụng cụ và hóa chất

Các dụng cụ, thiết bị sử dụng: máy đo OD, bộ điện di và máy chụp gel GelDoc It2,
các Micropipette, máy Votex mixer, máy gia nhiệt... và các dụng cụ, thiết bị trong
phịng thí nghiệm.

Hình 3.1. Máy ly tâm Eppendorf Hình 3.2. Máy luân nhiệt Hình 3.3. Tủ an toàn sinh học

10

3.1. Vật liệu, dụng cụ và hóa chất

Bảng 3.1. Các hóa chất sử dụng Tên hóa chất
Bộ kit tách chiết DNA
Số thứ tự Bộ kit PCR MyTaq Mix 2X
1 H2O nuclease - free water
2
3 Agarose
4 GelRed 6X (TBR)
5 Ladder 100 bp
6 Dung dịch đệm TAE 50X
7 Gel Loading Dye Purple 6X
8

11

3.2. Phương pháp nghiên cứu

3.2.1. Nhận diện bằng kính hiển vi

1ml

Mẫu bệnh phẩm Đồng nhất và bảo quản mẫu
trong ethanol

Mẫu sẽ được đổ vào đĩa petri và kiểm tra dưới kính hiển vi (địi hỏi phải
hình dung được con ghẻ hoặc trứng của chúng).

12

3.2.2. Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

Proteinase K WB1

CL Buffer Ethanol Ly tâm
(96-100%) 13000rpm 1 phút

Vortex đều Trộn đều Ly tâm WB2
Ủ 10 phút 13000rpm 1 phút

Mẫu mô da được đồng Ly trích mẫu - chiết xuất DNA
nhất trong dung dịch
PBS

EB

DNA được sử Ủ 1 phút Làm khô cột
dụng ngay hoặc Ly tâm
bảo quản ở -20o C Ly tâm
13000rpm 1 phút 13000rpm 1 phút

13

3.2.2. Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

Kiểm tra chất lượng DNA

Điện di: mẫu DNA vừa ly trích được kiểm tra trên gel agarose 1 % với thang chuẩn 100 bp ở
hiệu điện thế 100V trong 15 phút.
Đo quang phổ: DNA sẽ được định lượng bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 260 và 280
nm để xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA.

Hình 3.5. Thiết bị điện di Cơng thức tính nồng độ DNA

cDNA = OD260*50 ng/µL
Trong đó: cDNA: Nồng độ DNA (ng/µL)

OD260: Chỉ số OD ở bước sóng 260nm

14

3.2.2. Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

Phản ứng PCR

Bảng 3.2. Trình tự primer

Primer Trình tự (5’ - 3’) Số nu Ta (oC) Kích thước
sản phẩm
Forward (F) CTGGTAGAGGAACTGGCTG 19
58 374 bp
Reverse (R) GTAAACTTCCGGGTGTCC
18 Thể tích (µL)
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR Hóa chất 5
My Taq Mix 2X 0,5
Primer F,R Primer R (10 pmol/µL) 0,5
Primer F (10 pmol/µL) 2
H2O nuclease My Taq Mix 2X H2O nuclease - free water 3
DNA (10 ng/µL) 11
Mẫu DNA sau chiết xuất Tổng

15

3.2.2. Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

Bảng 3.4. Chu trình nhiệt của phản ứng

Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian (giây) Số chu kì

Tiền biến tính 95 600 1

Biến tính 95 15 35

Bắt cặp 58 30 35

Kéo dài 72 60 35

Hậu kéo dài 72 420 1
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di kiểm tra trên gel agarose 1,8 % với

thang chuẩn 100 bp.

Sau đó, miếng gel được chụp và quan sát trên máy chụp gel

16

4. Kết quả và kết luận

4.1. Kết quả kiểm tra DNA dự kiến
Kết quả dự kiến của mẫu được ly trích cho thấy tỷ số OD260/OD280 trung bình là 1,8; cho
thấy chất lượng DNA sau ly trích đảm bảo về độ tinh sạch.
Ngồi ra, kết quả đo OD cịn cho thấy nồng độ DNA trung bình đạt 296,2 ng/µL.

Hình 4.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 1 %. M:

ladder 100bp (Nguồn: Naz và ctv, 2013) 17

4.2. Kết quả khuếch đại gen mục tiêu bằng phản ứng PCR dự kiến

4.2.1. Kết quả PCR tiến hành thử trên web Primer-BLAST

Hình 4.2. Kết quả PCR được tiến hành trên Primer BLAST.

18

4.2.2. Kết quả sản phẩm PCR

374bp

Hình 4.3. Hình ảnh đại diện cho điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen mục tiêu trên
gel agarose 1,8 %. M: ladder 100 bp; Sản phẩm PCR: 374 bp, Giếng 1-5: Sản phẩm
PCR khuếch đại từ các mẫu DNA thu từ bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ; Giếng 6:
đối chứng dương; Giếng 7: đối chứng âm. (Nguồn: Tamieka và ctv, 2018).

19

4.3. Kết quả thống kê so sánh

Bảng 4.1. Kết quả thống kê và so sánh số bệnh nhân dương tính và âm tính từ hai
phương pháp nhận diện bằng kính hiển vi và nhận diện bằng phản ứng PCR dự kiến.

Phương pháp Tổng số bệnh Tổng số bệnh Tổng bệnh nhân
nhận diện nhân âm tính nhân dương tính được thu thập mẫu

(người) (người) (người)

Kính hiển vi 13 17 Phản ứng PCR 9 21 30

Kết quả

Có thể thấy sự chênh lệch kết quả âm và dương tính từ các mẫu thu cùng nhau giữa 2
phương pháp nhận diện Sarcoptes scabiei

Độ đặc hiệu của phản ứng PCR trong quá trình nhận

diện và kiểm soát bệnh ghẻ Sarcoptes scabiei. 20