Chuẩn hoá quy trình định lượng malondialdehyde nhằm đánh giá tình trạng stress oxy hoá trên mẫu mô cơ và máu

lOMoARcPSD|11346942

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

Nguyễn Thu Hà

CHUẨN HỐ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
MALONDIALDEHYDE NHẰM ĐÁNH GIÁ
TÌNH TRẠNG STRESS OXY HỐ TRÊN MẪU

MÔ CƠ VÀ MÁU

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Sinh học

(Chương trình đào tạo chuẩn)

Hà Nội - 2020

lOMoARcPSD|11346942

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

Nguyễn Thu Hà

CHUẨN HỐ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
MALONDIALDEHYDE NHẰM ĐÁNH GIÁ TÌNH
TRẠNG STRESS OXY HỐ TRÊN MẪU MƠ CƠ VÀ

MÁU

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Sinh học

(Chương trình đào tạo chuẩn)
Cán bộ hướng dẫn: TS. Đỗ Minh Hà

Hà Nội - 2020

lOMoARcPSD|11346942

LỜI CẢM ƠN

Tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Đỗ Minh Hà, người thầy đã
tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và thực
hiện khóa luận này. Tơi vơ cùng trân trọng những đam mê, tính kiên trì và cẩn thận,
phương pháp tư duy, trách nhiệm cùng tình yêu khoa học mà thầy muốn gửi gắm
cho thế hệ của chúng tôi!

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Trịnh Hồng Thái đã luôn giúp đỡ,
tạo điều kiện về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian tôi học tập và
làm việc tại phịng thí nghiệm.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh
Học,trường Đại học Khoa học tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ mơn

Sinh lý học & Sinh học người đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tơi trong suốt thời
gian học tập tại trường!

Trong quá trình học tập và làm việc tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc
thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học
Khoa học tự nhiên, tôi đã nhận được sự chỉ bảo tận tình, chia sẻ kinh nghiệm làm
việc của TS. Nguyễn Thị Tú Linh, ThS. Lê Lan Phương, TS. Bùi Phương Thảo cùng
các anh, các chị và các bạn sinh viên cùng khóa. Tơi xin chân thành cảm ơn!

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học sự sống - Khoa Sinh học và
Trung tâm khoa học vật liệu - Khoa Vật Lý, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG
HN vì đã tạo điều kiện cho tơi sử dụng các thiết bị nghiên cứu, giúp đỡ, hỗ trợ tơi rất
nhiều trong q trình học tập, làm việc và thực hiện khoa luận tốt nghiệp.

Tôi cũng xin bày tỏ lịng cảm ơn tới Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ tơi
trong q trình làm khóa luận này. Cuối cùng, tơi vơ cùng biết ơn gia đình và bạn bè
đã khích lệ, động viên và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Viết tắt lOMoARcPSD|11346942
AA
MG Nguyễn Thu Hà
GSIS
HNE DANH MỤC VIẾT TẮT
HPLC
MDA Tên đầy đủ

PUFAs Axit Arachidonic (Arachidonic acid)
ROS Methyl Glyoxal
TBA Glucose stimulate insulin secretion
TBARS Hexanal-4-hydroxynonenal
TMP High performance liquid chromatography
Malondialdehyde
Polyunsaturated fatty acids
Reactive Oxygen Species
Thiobarbituric acid
Thiobarbituric acid reactive substance
1,1,3,3-tetramethoxypropane

lOMoARcPSD|11346942

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Các giá trị hằng số hấp thụ phân tử [26].......................................................................................18
Bảng 2. Danh sách các hóa chất dùng trong nghiên cứu.......................................................................20
Bảng 3.Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu......................................................................................21

lOMoARcPSD|11346942

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Các dạng cấu hình của MDA [19]................................................................................................10
Hình 3. Q trình hình thành và chuyển hóa MDA................................................................................12
Hình 4. Phản ứng hình thành MDA từ TMP............................................................................................13
Hình 5. Phản ứng hình thành MDA từ TEP.............................................................................................14
Hình 6. Phản ứng tạo dẫn xuất màu TBARS của hai phân tử TBA với MDA [19]...............................16
Hình 7. Phương pháp chung....................................................................................................................22

Hình 8. Đồ thị dải phổ hấp thụ của MDA được tạo từ chất chuẩn TMP....................................................26
Hình 9. Đồ thị dải phổ hấp thụ của chất chuẩn TMP.................................................................................26
Hình 10. Giá trị OD của TBARS tại các pH và nhiệt độ ủ khác nhau với thời gian ủ là 30 phút...............27
Hình 11. Giá trị OD của TBARS tại các pH và nhiệt độ ủ khác nhau với thời gian ủ là 60 phút...............28
Hình 12. Biểu đồ so sánh giá trị độ hấp thụ trung bình tại các điểm pH, nhiệt độ khác nhau....................29
Hình 13. Giá trị độ hấp thụ trung bình của TBARS khi có mặt của Hemoglobin......................................30
Hình 14. Giá trị OD trung bình của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của MSU.....................31
Hình 15. Giá trị trung bình độ hấp thụ của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của Sucrose......32
Hình 16. Giá trị OD trung bình của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của Glucose................33
Hình 17. Giá trị trung bình của độ hấp thụ khi ủ các mẫu máu vào các dung dịch PBS, MSU 200 mM,
MSU 800mM, Glucose 75 mg/L, Glucose 150 mg/L................................................................................34
Hình 18. Giá trị độ hấp thụ khi cho các mẫu gan chuột vào trong mơi trường PBS, MSU, Glucose........36
Hình 19. Giá trị độ hấp thụ khi ủ các mẫu cơ đùi trong môi trường PBS, MSU,Glucose..........................37

lOMoARcPSD|11346942

MỞ ĐẦU

Stress oxy hóa được ghi nhận là một đặc điểm nổi bật của nhiều bệnh lý cấp và
mãn tính cũng như các bệnh gây ra do q trình lão hóa ở người như bệnh tim mạch, ung
thư, rối loạn thần kinh, đái tháo đường. Trạng thái stress oxy hóa của cơ thể có thể được
đánh giá thông qua việc định lượng các biomarker chính của q trình Peroxit hóa lipid
như: MDA, HNE, Acrolein, F2-IsoProstane, Pentane, Ethane. Trong đó, MDA là một
trong số các biomarker được nghiên cứu nhiều nhất trong các trạng thái sinh lý và bệnh lý
cả trên mơ hình động vật và trên người.

Có rất nhiều phương pháp định lượng MDA khác nhau, trong đó phương pháp phản
ứng TBAR là một trong những phương pháp đơn giản, và thông dụng nhất. Ưu điểm của
phương pháp phản ứng TBARS là dễ thực hiện, năng suất cao, khơng địi hỏi các trang
thiết bị hiện đại và có thể định lượng bằng phương pháp quang phổ. Tuy nhiên, kết quả

phản ứng TBARS chịu nhiều ảnh hưởng bởi các hóa chất, quy trình cũng như các sản
phẩm phụ gây nhiễu đến kết quả. Để khắc phục một phần các nhược điểm của phương
pháp phản ứng TBARS truyền thống, các thiết bị phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC), Sắc ký khí (GC), Khối phổ (MS) đã được áp dụng để cải tiến phản ứng
TBARS. Nhưng trên thực tế, khơng phải phịng thí nghiệm nào cũng được trang bị các
thiết bị phân tích hiện đại này.

Trên cơ sở các vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: "Chuẩn hóa quy trình định
lượng Malondialdehyde nhằm đánh giá tình trạng stress oxy hóa trên mẫu mơ cơ và
máu" với mục đích:

- Chuẩn hóa và kiểm sốt quy trình phản ứng TBARS để có một phương pháp định
lượng sơ bộ Malondialdehyde tốt nhất.

- Phân tích ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa tới quy trình tạo MDA và định
lượng MDA từ chất chuẩn và trong mô cơ và máu bằng phản ứng TBARS.

Đề tài được tiến hành tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phịng thí
nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội.

lOMoARcPSD|11346942

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là một thuật ngữ chỉ trạng thái mất cân bằng giữa sự sản xuất, hoạt
động của các "gốc tự do có nguồn gốc oxy" hay cịn được gọi là các "hình thái oxy hóa
hoạt động" (Reactive oxygen species - ROS) và khả năng của cơ thể sống trong việc khử

các hợp chất trung gian hoạt tính cao, cũng như sửa chữa hư hại do những chất này gây
nên. Ngày nay, stress oxy hóa được ghi nhận là một đặc điểm nổi bật của nhiều bệnh lý
cấp và mãn tính, cũng như các bệnh gây ra do quá trình lão hóa như bệnh tim mạch, ung
thư, rối loạn thần kinh, đái tháo đường [17, 41].

Gốc tự do có thể được định nghĩa là các phân tử hoặc mảnh vỡ phân tử có chứa một
hoặc nhiều electron độc thân trong orbital nguyên tử hoặc phân tử. Các gốc tự do ROS là
một trong các “gốc hình thái hoạt động” quan trọng nhất trong cơ thể sống [41]. ROS có
thể được tạo thành từ nguồn gốc ngoại sinh hoặc nội sinh. Nguồn gốc ngoại sinh như tia
UV, tia X, tia γ hoặc do các chất ô nhiễm trong khí quyển. Nguồn gốc nội sinh như: là
sản phẩm phụ của chuỗi truyền điện tử trong ty thể; hay được sản xuất bởi bạch cầu trung
tính, đại thực bào trong viêm; hoặc là sản phẩm của các phản ứng được xúc tác bởi kim
loại hay các enzymeví dụ NADPH oxidases (NOXs), xanthine oxidase (XO) [42].

1.2. Peroxit hóa lipid

Một trong các tác động phá hủy của ROS lên các đại phân tử sinh học đặc biệt
phải chú ý đến là sự peroxit hóa lipid (Lipid peroxidation – LPO). Sự peroxit hóa
lipid màng gây thay đổi các đặc tính sinh học của màng, làm bất hoạt các thụ thể
liên kết màng hay các enzyme dẫn đến làm giảm chức năng của các tế bào bình
thường và tăng tính thấm của màng. Hơn nữa, sự peroxit hóa lipid cịn có thể gây ra
và “khuếch đại” các tổn thương tế bào do tạo ra các sản phẩm oxi hóa thứ cấp [43].
Khác với các gốc tự do có thời gian tồn tại ngắn, các sản phẩm thứ cấp của q
trình peroxit hóa lipid có thời gian bán hủy dài hơn và có khả năng khuếch tán qua
màng tế bào, tấn cơng tới các đích ở xa nơi chúng được hình thành. Các sản phẩm
thứ cấp của quá trình peroxit hóa lipid là các aldehyde như malonaldehyde (MDA),
hexanal, 4-hydroxynonenal (HNE) hay acrolein đã được chứng minh có thể phản
ứng với các đại phân tử sinh học như ADN, Protein và Phospholipid [17, 23].

lOMoARcPSD|11346942

. Hiện nay, peroxit hóa lipid được xem là ngun nhân chính liên quan đến
việc oxy hóa, phá vỡ cấu trúc màng và tạo ra các chất độc có thể làm tổn hại
hay gây chết tế bào. Peroxit hóa lipid là một q trình phức tạp xảy ra ở cả thực
vật và động vật. Nó liên quan đến sự hình thành và phát tán các gốc lipid dư thừa
điện tử, sự sắp xếp lại các liên kết đơi trong chất béo khơng bão hịa (PUFA) dẫn
đến phá hủy màng lipid, cũng như sản xuất một loạt các sản phẩm phụ gây độc,
trong có các gốc rượu, xeton, andehyde và ete [13].

Sự peroxit hóa các lipid chứa gốc acid béo có thể dẫn đến một chuỗi các “phản
ứng dây chuyền phân nhánh” tạo ra thêm gốc tự do mới. Sở dĩ như vậy bởi vì từ
một gốc tự do kích thích ban đầu (R°) có thể dẫn đến sự hình thành của rất nhiều
các gốc tự do bên cạnh lipid hydroperoxyde (LOOH) như là: LO°, °OH và LOO° [18].
Các gốc LOO° & LO° được gọi là các “sản phẩm sơ cấp” của q trình peroxit hóa
lipid, chúng có thể phân hủy theo nhiều cơ chế khác nhau tạo ra vô số các sản
phẩm thứ cấp ổn định hơn và gây độc cho tế bào. Sự peroxit hóa của các PUFAs là
rất phức tạp vì có rất nhiều các loại axit béo có mặt trong cơ thể của động vật có
vú. Ngồi ra sự phức tạp này cịn do vị trí của các gốc peroxyl. Esterbauer ước
tình rằng có khoảng 120-150 sản phẩm có thể tạo ra từ q trình peroxit hóa lipid,
chẳng hạn như các gốc lipid alkoxyl (LO°) tiếp theo có thể phân cắt beta tạo ra các
sản phẩm ngắn hơn (từ C2 đến C12 với một dải các nhóm chức khác nhau) hoặc bị
biến đổi phần carboxylic của nó (phân cắt tạo HNE); các gốc lipid peroxyl (LOO°)
có thể tạo sản phẩm trung gian bicyclic endoperoxide rồi từ đó tạo ra MDA [23,
42].

Các “sản phẩm thứ cấp” của q trình peroxit hóa lipid có thể là aldehyde,
alkane, isoprostane, alkene, ketone, alcohol và furane dưới các điều kiện phản ứng
khác nhau. Các sản phẩm aldehyde đặc biệt được chú ý bởi chúng là các sản phẩm
hoạt động và có độc tính với tế bào. Trong các aldehyde thì MDA được xem như chỉ
thị sinh học của sự peroxit hóa các axit béo omega-3, omega-6 và được sử dụng

nhiều nhất để đánh giá mức độ peroxit hóa lipid [18, 23].

1.3. Malondialdehyde

1.3.1. Đặc điểm, tính chất của MDA

Malondialdehyde (MDA) là một trong những sản phẩm cuối của q trình peroxit hóa
lipid đang được quan tâm hàng đầu hiện nay. MDA là chỉ thị của mức độ tổn thương

lOMoARcPSD|11346942

oxy hóa ở các tế bào và mơ. MDA cũng được sử dụng như một chỉ thị của tổn
thương màng tế bào . MDA có thể được tìm thấy trong hầu hết các mẫu sinh học bao
gồm huyết tương, huyết thanh, mô và nước tiểu.

MDA có bản chất hóa học một hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử thấp (M=72,04
g/mol), có cơng thức cấu tạo là C3H4O2, với hai nhóm aldehyde ở vị trí C1 và C3 và có
tính axit yếu, pKa=4,46.

MDA là một chất dễ bay hơi, ổn định dưới điều kiện trung tính. Trong dung dịch và
pha khí, MDA bị enol hóa hồn tồn và nhanh chóng giữa các dạng liên kết Hidro nội
phân tử khơng đối xứng (Hình 1.b và d) với một hàng rào thấp để biến đổi lẫn nhau
thông qua cấu trúc cộng hưởng liên kết Hidro đối xứng (Hình 1.c).

H椃nh 1. Các dạng cấu hình của MDA [27]
Trong các dung mơi hữu cơ, MDA tồn tại ở dạng cấu hình cis (Hình 1.b và d). Tuy
nhiên trong nước, MDA tồn tại ở dạng cấu hình trans, dưới dạng bazo liên hợp (Hình 1.a
và e). MDA hấp thụ bước sóng ở vùng tử ngoại với dung mơi là nước có tính axit, chúng
hấp thụ cực đại ở bước sóng 245 nm với hằng số hấp thụ điện tử ε = 13.103(cm-1 .M-1)
(Hình 2)[27].

MDA được xem là sản phẩm có khả năng đột biến cao [3]. MDA có độ ổn định hóa
học cao và khả năng thấm qua màng tốt hơn các gốc tự do chứa oxy (ROS) khác, đồng
thời MDA cũng không độc như 4-HNE và methyl glyoxal (MG) [20]. Một số nghiên cứu

lOMoARcPSD|11346942

cũng đã ghi nhận MDA có thể hoạt động như một phân tử tín hiệu và điều hịa biểu hiện
gen:

(i) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra MDA hoạt động như một phân tử tín hiệu và điều
hòa hoạt động tiết insulin khi có kích thích của glucose (GSIS) thông qua con
đường Wnt, đây là tập hợp các con đường dẫn truyền tín hiệu tế bào khởi đầu
bằng loại protein Wnt và sẽ kết thúc khi protein Wnt này được tiếp nhận bởi
thụ thể bề mặt tế bào. Ở nồng độ cao (5-10µM), MDA làm thay đổi tỉ lệ
ATP/ADP và lượng Ca2+ nội bào, và ảnh hưởng tới biểu hiện gen, gây ra các
thay đổi trong hoạt động của GSIS [43].

(ii) Ở các tế bào sao ở gan, MDA kích thích biểu hiện gen collagen thơng qua
tăng cường hoạt động của gen Sp1 (specificity protein-1), khiến lượng protein
Sp3 và Sp1 tăng cao [22]. Cả Sp1 và Sp3 có thể tương tác với các protein
trong hệ thống kiểm soát phiên mã của gene, các enzyme kiểm soát histone và
các phức hệ cấu trúc nhiễm sắc thể, các ảnh hưởng này minh chứng cho việc
Sp1 và Sp3 là các yếu tố phiên mã quan trọng, tham gia tái cấu trúc lại nhiễm
sắc thể và điều hòa biểu hiện gen [28].

Vì MDA là một aldehyde ưa điện tử, độ hoạt động của MDA phụ thuộc nhiều vào
pH. Ở pH sinh lí, MDA tồn tại ở dạng ion enolate và có hoạt độ thấp. Khi pH giảm,
MDA tồn tại ở dạng beta-hydroxyacrolein và hoạt độ của nó tăng lên. Hoạt độ của MDA
cao chủ yếu dựa vào tính điện, dẫn đến MDA có xu hướng phản ứng mạnh mẽ với các
nucleophile [3]. MDA có thể hoạt động như một nucleophile hoặc electrophile và tạo

thành các sản phẩm đa sắc [11, 31].

Aldehyde nói chung có khả năng phản ứng hình thành các sản phẩm cộng và phức
hợp trong hệ thống sinh học và MDA cũng không ngoại lệ, mặc dù, ở pH sinh lý MDA
có độ hoạt động thấp. Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh MDA đóng vai trò quan trọng
trong nhiều phản ứng sinh học. Các thống kê gần đây cho thấy có tới 33 protein bị biến
đổi bởi MDA, trong đó có cả các enzyme, protein vận chuyển, protein khung xương tế
bào, các protein của ty thể và protein chống oxy hóa [20]. Những thay đổi DNA do MDA
gây ra có thể là nguyên nhân đáng kể cho bệnh ung thư và các bệnh lý liên quan đến di
truyền khác [3].

lOMoARcPSD|11346942

1.3.2. Nguồn gốc phát sinh MDA
1.3.2.1. Nguồn gốc nội sinh

MDA là sản phẩm cuối của q trình peroxit hóa arachidonic và các phân tử PUFA
lớn [20] thơng qua các con đường có enzyme hoặc khơng có enzyme (Hình 2).

H椃nh 2. Quá trình hình thành và chuyển hóa MDA
(Chú thích: MDA được tạo ra theo con đường có enzyme (màu xanh nước biển), MDA
được tạo ra theo con đường khơng có enzyme (màu cam. Các enzyme chính liên quan đến
sự hình thành MDA: cyclooxygenase (1), prostacyclin hydroperoxidase (2),
thromboxanesynthase (3)).

i) Sản xuất MDA theo con đường có enzyme
Trong điều kiện in vivo, MDA có thể được sinh ra theo con đường có enzyme
trong quá trình tổng hợp thromboxane A2 (TXA2) [25, 36, 39]. TXA2 là một
chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học của axit arachidonic (AA) được hình
thành từ prostaglandin endoperoxide hoặc prostaglandin H2 (PGH2) dưới sự

Downloaded by Quang Tr?n ()

lOMoARcPSD|11346942

xúc tác của thromboxane A2 synthase [5, 19], trong đó PGH2 được hình
thành từ AA khi có xúc tác của cyclooxygenase [5, 7].
ii) Sản xuất MDA theo con đường khơng có enzyme
Lipid hydroperoxide được hình thành trong q trình peroxit hóa lipid. Gốc
peroxyl của hydroperoxide có một liên kết đơi có thể kết hợp với một gốc
nữa, tại vị trí liên kết đơi để tạo ra một gốc tự do mới. Các gốc tự do trung
gian được hình thành sau khi đóng vịng, có thể tiếp tục đóng vịng nữa để tạo
thành endoperoxide bi-cycle, có cấu trúc tương tự như prostaglandin, và tạo ra
MDA. Ở con đường khơng có enzyme, q trình hình thành MDA sẽ phụ
thuộc gốc tự do oxy gen. AA là tiền chất quan trọng của endoperoxide
bicycle, từ chất này, theo nhiều phản ứng khơng có enzyme nữa sẽ tạo ra
MDA (Hình 2) [20]. Tuy nhiên, eicosanoid cũng được tạo ra theo con đường
này và có thể là tiền chất của endoperoxide bicycle và MDA [21, 44]. Các
nghiên cứu gần đây cũng ghi nhận, trong một số điều kiện cụ thể, MDA cũng
được hình thành theo con đường khơng có enzyme [32].
1.3.2.2. Nguồn gốc ngoại sinh
Ảnh hưởng của bức xạ ion hóa hoặc khơng ion hóa, ơ nhiễm khơng khí và khí độc tự
nhiên như ozone, hóa chất và các chất độc hại như các chất khử trùng hóa học, sẽ trực
tiếp hoặc gián tiếp gây ra stress oxy hóa. Chế độ ăn không đủ chất dinh dưỡng cũng gián
tiếp dẫn đến stress oxy hóa bằng cách làm suy yếu cơ chế bảo vệ tế bào. Các đại phân tử
tế bào, đặc biệt là lipid, protein và DNA là mục tiêu tự nhiên của q trình oxy hóa. Chất
oxy hóa có khả năng bắt đầu q trình oxy hóa lipid bằng cách lấy một proton allylic từ
một PUFA. Quá trình này qua nhiều giai đoạn dẫn đến sự hình thành lipid hydroperoxide
từ đó dẫn đến tạo ra MDA [29].
1.3.2.3. Phương pháp hóa học tổng hợp MDA

Có thể tạo ra MDA theo phương pháp hóa học bằng cách thủy phân 1,1,3,3-
tetraethoxypropane (TEP) hoặc 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP) trong môi trường
axit.

Downloaded by Quang Tr?n ()

lOMoARcPSD|11346942

H椃nh 3. Phản ứng hình thành MDA từ TMP

H椃nh 4. Phản ứng hình thành MDA từ TEP
Do MDA không ổn định và không thể lưu trữ ở dạng tinh khiết nên dung dịch của
MDA thường được sử dụng ngay khi làm phản ứng thủy phân axit TEP hay TMP. Đã có
nhiều báo cáo công bố cho rằng sự thủy phân các hợp chất này đi kèm với việc tạo ra các
sản phẩm phụ được cho là polyme của MDA. Do đó, để tránh được sự hình thành của các
polyme này, người ta đã sử dụng dung dịch TEP hay TMP rất loãng để thực hiện phản
ứng thủy phân [4].
1.4. Các phương pháp định lượng MDA
MDA được xem như một chỉ số chính để đánh giá mức độ peroxit hóa lipid. Để định
lượng MDA có thể sử dụng các phương pháp định lượng trực tiếp hoặc định lượng gián
tiếp thông qua các dẫn xuất của MDA với các chất khác.
1.4.1. Định lượng trực tiếp
Các phương pháp phân tích định lượng MDA trực tiếp đều dựa trên nguyên lí kết hợp
HPLC với đo quang phổ tử ngoại, ngồi ra có thể sử dụng thêm các phương pháp làm
sạch mẫu trước khi chạy sắc ký như: lọc gel, siêu lọc và chưng cất.

 Ưu điểm của phương pháp

Downloaded by Quang Tr?n ()

lOMoARcPSD|11346942

Phương pháp định lượng trực tiếp cho độ đặc hiệu cao.
 Nhược điểm của phương pháp

Phương pháp đòi hỏi các thiết bị HPLC với detector có độ nhạy cao, thời gian chạy
sắc ký để thôi MDA cùng các thành phần khác của mẫu lớn, tùy thuộc vào mỗi loại mẫu,
thời gian có thể rất khác nhau. Thêm vào đó, MDA cũng có thể liên kết với các thành
phần của mẫu, khi đó cần phải thủy phân các liên kết này trước khi chạy HPLC đồng thời
phải phân tích xem lượng MDA liên kết là bao nhiêu để có thể định lượng đúng giữa
MDA tổng số và MDA tự do [46].

1.4.2. Định lượng gián tiếp thông qua dẫn xuất
Các phương pháp định lượng MDA gián tiếp thông qua dẫn xuất cho phép định lượng

gián tiếp MDA bằng cách định lượng các dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang các dẫn
xuất màu, các dẫn xuất hấp thụ tia tử ngoại hay các sản phẩm khí.

a. Ưu điểm
Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, năng suất lớn, có thể xử lí đồng thời
được nhiều mẫu với tốc độ nhanh chóng, có thể định lượng bằng phương pháp quang
phổ.
b. Nhược điểm
Các phản ứng tạo dẫn xuất của MDA đòi hỏi phải thực hiện trong các điều kiện
“khắc nghiệt” (môi trường axit, nhiệt độ cao, có các dung mơi hữu cơ), điều này
khiến cho mẫu có thể tiếp tục bị oxy hóa hay phân hủy tạo ra các dẫn xuất phụ hoặc các
sản phẩm không mong muốn gây nhiễu đến việc định lượng. So với phương pháp định
lượng trực tiếp, các phương pháp định lượng thơng qua dẫn xuất có thể dẫn đến các đánh
giá sai lệch về chỉ số peroxit hóa lipid nhiều hơn.
Để giảm thiểu các ảnh hưởng của các dẫn xuất phụ đến kết quả, HPLC thường được

kết hợp để phân tách các hỗn hợp dẫn xuất. Ngoài ra, việc tiến hành phản ứng trong điều
kiện kị khí kết hợp với bổ sung các chất chống oxy hóa để giảm thiểu q trình tự oxy
hóa hay phân hủy của mẫu trong quá trình tạo dẫn xuất. Tuy nhiên có rất ít các nghiên
cứu trực tiếp chứng minh sự hiệu quả của biện pháp phòng ngừa trên [27].
1.5. Phản ứng TBARS
Năm 1944, Kohn và Liversedge đã quan sát thấy rằng các mô động vật được ủ trong
điều kiện hiếu khí tạo ra phản ứng có màu sắc với 2-thiobarbituric (TBA) [8]. Bernheim
và cộng sự nhận thấy màu đỏ hồng này là kết quả của một phức hợp được hình thành từ

Downloaded by Quang Tr?n ()

lOMoARcPSD|11346942

các sản phẩm oxy hóa của axit béo khơng bão hịa và TBA. Phản ứng TBARS sau đó đã
được phát triển trở thành một test nghiệm thực nghiệm về tự oxy hóa lipid và đã được sử
dụng rộng rãi với các vật liệu sinh học như mô và thực phẩm [6].

Phản ứng TBARS xảy ra dựa trên sở phản ứng của phân tử MDA và hai phân tử
MDA (nhóm monoenolic của MDA tấn cơng vào nhóm methylene của hai phân tử
TBA) tạo ra một dẫn xuất màu TBARS (H椃nh 5).

TBARS có cực đại của phổ hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến (530-535nm) và
đỉnh hấp thụ thứ hai ở vùng bước sóng tử ngoại (245-305 nm) [26, 27].

H椃nh 5. Phản ứng tạo dẫn xuất màu TBARS của hai phân tử TBA với MDA [27]
Ưu điểm của phương pháp phân tích TBARS là chất phản ứng chính MDA, TBA là
chất hịa tan trong nước, sản phẩm TBARS được hình thành hoặc giải phóng khi đung
nóng mẫu trong mơi trường axit và cường độ màu của phức hợp hình thành trong phản
ứng là rất lớn nên phương pháp này có độ nhạy cao trong việc phát hiện và định lượng

Downloaded by Quang Tr?n ()

lOMoARcPSD|11346942

peroxit hóa lipid [40]. Tuy nhiên, phương pháp này cịn có một số nhược điểm như khơng
đặc hiệu, kết quả đo có thể bị nhiễu bởi 4 lí do chính:

(i) Các aldehyde khác ngồi MDA có thể tham gia phản ứng với TBA tạo dẫn
xuất phụ có phổ hấp thụ gần giống với dải phổ hấp thụ ánh sáng của TBARS
từ MDA.

(ii) Quá trình phân hủy của các lipid peroxide có thể tiếp tục xảy ra trong quá
trình thực hiện phản ứng TBARS làm sai lệch kết quả MDA thực tế lúc ban
đầu có trong mẫu.

(iii) Các ion kim loại chuyển tiếp có ảnh hưởng đến q trình peroxit hóa lipid gây
ra bởi gốc tự do, sự có mặt của các ion kim loại gây ảnh hưởng nhiều đến độ
tin cậy của kết quả.

(iv) Khi tiến hành phản ứng TBARS đối với các mẫu ở người và động vật, MDA
trong mẫu có thể hình thành từ các nguồn khác (như glycoprotein, sắc tố mật)
mà không phải do q trình peroxit hóa lipid, dẫn đến kết quả khơng chính
xác [17, 24].

Để khắc phục các nhược điểm của phản ứng TBARS, ngày nay các nghiên cứu
thường kết hợp phản ứng TBARS với HPLC để phân tách sản phẩm TBARS từ hỗn hợp
các dẫn xuất nhằm tăng độ đặc hiệu [17]. Bên cạnh đó, việc bảo quản mẫu trong nitơ lỏng
và thêm vào các chất chống oxi hóa cũng được chú ý trong nhiều nghiên cứu. Ngồi ra,
có các tác giả cho rằng, độ hấp thụ ở bước sóng 532 - 535 nm của các dẫn xuất phụ khác
so với dẫn xuất của MDA nhỏ hơn khoảng 1000 lần [26]. Vì vậy chúng tơi chọn bước

sóng 535 nm để đo độ hấp thụ của sản phẩm phản ứng TBARS.

Ngày nay có bốn quy trình Phản ứng TBA chính, bao gồm:
 Phản ứng TBARS với mẫu nguyên vẹn
 Phản ứng TBARS với dịch chiết nước hoặc axit của mẫu
 Phản ứng TBARS với dịch sản phẩm trưng cất của mẫu
 Phản ứng TBARS với lipid chiết từ mẫu
Trong bốn quy trình phản ứng TBARS này thì quy trình Phản ứng TBA với
mẫu nguyên vẹn là dễ thực hiện nhất. Trong quy trình này, mẫu nguyên vẹn
được nghiền đồng thể và cho phản ứng với dung dịch TBA dưới điều kiện pH

Downloaded by Quang Tr?n ()

lOMoARcPSD|11346942

thấp (pH từ 2-3), nhiệt độ cao (95-100ºC), dẫn xuất màu tạo thành sau dó được
chiết bằng n-butanol và đo độ hấp thụ bước song cực đại ở 530-535 nm. Từ kết
quả độ hấp thụ, thông qua hằng số hấp thụ phân tử tính được lượng MDA trong
mẫu, lượng MDA trong mẫu thường được tính theo lượng mg MDA/ kg mẫu.
Bảng 1 liệt kê các giá trị hằng số hấp thụ phân tử của các tác giả khác nhau
[26, 34].

B愃ऀng 1. Các giá trị hằng số hấp thụ phân tử [34]

Bước sóng (nm) Hằng số hấp thụ phân tử Theo tác giả
(litre/mol.cm)
530 1.48 x 105 Tarladgis et al. (1984)
530 1.54 x 105 Tarladgis et al. (1962)
535 1.45 x 105 Tomas & Funes (1987)
535 1.55 x 105 Buege & Aust (1978)

535 1.56 x 105 Kanner & Harel (1985);
Kim & LaBella (1987);
535 1.57 x 105 Vincent et al. (1988);
Kosugi et al. (1989)
535 1.59 x 105
Albro et al. (1986)
535 1.49 x 105 Przybylski & Hougen

535 1.56 x 105 (1989)
Bull & Marnett (1985)
538 1.90 x 105
Rhee et al. (1984)
Ke et al. (1984)

Downloaded by Quang Tr?n ()

lOMoARcPSD|11346942

1.6. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam

1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Phản ứng TBARS là một chủ đề nghiên cứu được rất nhiều quan tâm trên thế giới. Do

đây là một phản ứng được thực hiện nhằm định lượng MDA có trong mẫu, từ đó đánh giá
được mức độ stress oxy hóa.

Phản ứng TBARS lần đầu được đề xuất bở Kohn và Liversedge vào năm 1944, dựa
trên cơ sở phản ứng của phân tử MDA với hai phân tử TBA tạo ra dẫn xuất màu hấp thụ
cực đại ở vùng ánh sáng khả kiến (530-535 nm) và đỉnh hấp thụ thứ hai ở vùng bước
sóng tử ngoại (245-305 nm) [27].

Yu và Sinnhuber (1964) đã công bố rằng sự phân hủy của hydroperoxit hoặc các dẫn
xuất và tiền chất của MDA bằng TBA có thể làm tăng MDA tự do [45].

Nghiên cứu của Manoharan và cs [52] trên huyết tương và hồng cầu bệnh nhân ung
thư tế bào biểu mô miệng cho thấy mức TBARS màng hồng cầu tăng lên dần qua các giai
đoạn ung thư (giai đoạn khỏe mạnh, II, III, IV).Trong nghiên cứu về mức độ MDA và
chất chống oxi hóa được tìm thấy là có liên quan với các giai đoạn khối u của bệnh nhân
[30].

Turner và cs (1954) [40] và Baumgartner và cs (1975) [12] đã chứng minh Sucrose
tạo thành phức màu vàng khi phản ứng với TBA, gây nhiễu cho phản ứng TBARS do
đỉnh ở (450-460 nm) và có chân phổ hấp thụ chồng lên một phần đỉnh hấp thụ của
TBARS ở bước sóng vùng màu hồng (530-537 nm).

Đã có nhiều nghiên cứu công bố nhiều chất gây nhiễu đến phản ứng TBARS như
protein của Chio và Tappel (1969) [15], Buttkus và Bose (1972) [14], diệp lục của
Shamberger và cs (1977) [35] và forrmaldehyde của Almandos và cs (1988) [9].

1.6.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có các nghiên cứu sâu về cơ chế của phản ứng TBARS

cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng này. Nhưng có một số bài báo và nghiên
cứu có đề cập đến việc dung phản ứng TBARS nhằm bán định lượng q trình stress oxi
hố ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng như luận án TS của tác giả Phạm Mạnh Cường "
Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng Malondialdehyde ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng
trước và sau phẫu thuật triệt căn" [1], hay cơng trình khoa học "Mức độ peroxit hóa lipid
trên một số nhóm người có mắc độ vận động khác nhau" của Lê Thị Mai và cs (2016)
trên tạp chí Sinh lí học Việt Nam [2]. Và cũng đã có một số nghiên cứu đánh giá ảnh

Downloaded by Quang Tr?n ()

lOMoARcPSD|11346942

hưởng của điều kiện pH, nhiệt độ ủ mẫu, thời gian ủ mẫu đến phản ứng TBA. Tuy nhiên,
chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của một số nhân tố như MSU, Glucose, Sucrose
hay Hemoglobin đến phản ứng TBARS để kiểm tra liệu chúng có ảnh hưởng đến kết quả
nghiên cứu hay không.

Downloaded by Quang Tr?n ()