NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA
CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

TS.BS. Hoàng Anh Vũ
Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

1

Nội dung:
1.Các kỹ thuật khảo sát nhiễm sắc thể
2.Các kỹ thuật khảo sát nucleic acid
3.Các kỹ thuật khảo sát protein

Mục tiêu:
1.Nhận diện được kỹ thuật tương ứng mức độ phân tử
2.Nêu được cơ chế phân tử và cách phát hiện bất thường
3.Liệt kê ứng dụng của PCR và giải trình tự DNA

2

Cơ thể người
Cơ quan/hệ thống

Mô

Tế bào
Các phân tử sinh học
(nucleic acid, protein)

3

Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể đồ
FISH
Deoxyribonucleic acid (DNA)
(+ Histone) Southern blot (DNA)
Northern blot (RNA)
Ribonucleic acid (RNA) PCR
DNA sequencing

Protein Hóa mơ miễn dịch

Western blot 4

Nhiễm sắc thể đồ (karyotype)

 Bản đồ của bộ nhiễm sắc thể của một cá thể
 Nam bình thường: 46,XY
 Nữ bình thường: 46,XX

5

Nhiễm sắc thể đồ: Quy trình kỹ thuật

Cấy tế bào Cytokines (tủy: 1 – 2 ngày,
máu: 2 -3, ối: 5 -7)

Thu hoạch

Thu hoạch tế bào 0.075 M KCl Cố định
(Acid acetic: methanol)

Chuẩn bị slide

Nhuộm băng • G-banding
Phân tích • Q-banding
• (R, C, T, NOR)

20- 30 metaphase 6

Bất thường số lượng:
Hội chứng Down (Trisomy 21)

7

Bất thường cấu trúc:
Bệnh bạch cầu mạn dòng tủy

8

Hạn chế của nhiễm sắc thể đồ

 Chỉ khảo sát được khi nuôi cấy bệnh phẩm
thành công
 Không phát hiện được những bất thường nhỏ
 Tốn nhiều thời gian và nhân lực

9

FISH (fluorescence in situ hybridization)

 Lai tại chỗ gắn huỳnh quang: một kiểu lai phân

tử thực hiện ngay trong tế bào mà không cần tách
chiết nucleic acid ra khỏi tế bào
 Cung cấp thơng tin chính xác về vị trí và phân
bố của đoạn DNA quan tâm trên NST nhờ một mẫu
dò (probe) chuyên biệt

10

FISH: Nguyên tắc

 Probe: Chuỗi DNA đã được đánh
dấu
 Denature: Chuỗi đôi DNA tách rời
thành chuỗi đơn
 Hybridize: Các chuỗi đơn DNA
đặc hiệu sẽ bắt cặp được với nhau ở
điều kiện thích hợp

Phát hiện được các chuỗi đặc hiệu
nhờ các probe

11

Hình ảnh tăng biểu hiện của gen HER2/neu
trong ung thư vú

HER2/neu Bình thường: Ung thư vú:
2 tín hiệu màu đỏ nhiều tín hiệu đỏ

NST 17 Herceptin

12

Hình ảnh chuyển vị NST(Philadelphia)
trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy

nl(9) nl(9) nl(9)
nl(22) nl(22) der(9)

Ph(-) nl(22)
Ph
Nhạy Imatinib
Kháng Imatinib Ph(+)

13

14

Southern blot: Nguyên tắc

15

Southern blot: Quy trình kỹ thuật

16

Southern blot: Ứng dụng

• Phát hiện những thay đổi về cấu trúc của DNA
(mất đoạn, thêm đoạn)

• Có thể phát hiện đột biến điểm nếu đột biến làm
thay đổi điểm cắt của restriction enzyme

17

Mất đoạn gen CYP 21 và C4B trong bệnh
thiếu 21-hydroxylase

Probe: C4 Probe: CYP21
(Collier S, EMBO 1989:1393- 1402) 18

Đột biến tế bào hình liềm

19

Southern blot: Hạn chế của kỹ thuật

• Cần lượng DNA lớn (microgram)
• Kỹ thuật phức tạp, tốn nhiều thời gian

20