Thiết bị và kĩ thuật nhóm 4 thứ 4 ca 2

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.16 MB, 25 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<small>TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC </small>

<b>Phát hiện đột biến gen KRAS trong ung thư đại </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

Mai Nguyễn Thục DiễmNguyễn Thị Thu Ngân

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>Phương pháp nghiên cứuKết quả và thảo luận</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>Giới thiệu chung</b>

I

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>Giới thiệu sơ về gen KRAS 1</b>

khiến cho việc truyền thông tin bị gián đoạn làm cho các tế

dẫn đến hình thành các khối u trong cơ thể.

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<small></small> <b>Có chức năng cung cấp hướng dẫn để tạo ra protein K-RAS tham gia </b>

vào quá trình đường truyền tín hiệu chuyển tiếp các tín hiệu từ bên ngoài tế bào đến nhân tế bào. <small></small> Tín hiệu được chuyển tiếp sẽ

<b>hướng dẫn tế bào phát triển, phân </b>

biệt hóa của nó.

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>Giới thiệu phương pháp COLD-PCR.2</b>

 <b> PCR đồng khuếch đại ở nhiệt độ biến tính thấp hơn </b>

(COLD-PCR) là một cải tiến mới của phương pháp PCR thông thường

 Nhằm khuếch đại có chọn lọc các alen thiểu số từ hỗn

<b>hợp các trình tự kiểu tự nhiên (wildtype) và kiểu đột </b>

<b>biến (mutant) bất kể loại đột biến hoặc vị trí đột biến. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>Giới thiệu phương pháp </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>AIIVÀ ĐẶT VẤN <sup>TỔNG QUAN </sup>ĐỀ</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>Tổng quan</b>



Theo Trung tâm y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai, ung thư đại trực tràng là một trong

<b>những loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất. Tỷ </b>

lệ mắc chuẩn theo tuổi là 10,1/100.000 dân

 Phương pháp điều trị bao gồm phẫu thuật, xạ trị, hóa trị và trong đó có các kháng thể đơn dòng kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR).

<b>1</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>2. Đặt vấn đề</b>

Rối loạn các thụ thể tyrosine kinase, trong đó có thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô

(EGFR: epidermal growth factor receptor)

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<small></small> Hoạt tính tyrosine kinase của EGFR đóng

<b>vai trị quan trọng trong điều khiển sự tăng </b>

sinh và sống còn của tế bào.

<small></small> <b>Protein EGFR thường biểu hiện quá mức </b>

trên bề mặt tế bào.

<small></small> Ức chế hoạt tính tyrosine kinase của EGFR

<b>là một chiến lược điều trị thích hợp.</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<small></small> Khi đột biến xảy ra sẽ suất đột biến tại condon

ở bệnh nhân bằng kỹ thuật COLD-PCR kết hợp giải trình tự DNA phép khuếch đại ưu thế dòng alen mang gen đột biến ngay cả khi chỉ có

biến trong mẫu khảo sát.

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>3 Đối tượng nghiên cứu</b>

Tiến hành khảo sát đột biến gen KRAS cho những bệnh nhân UTDTT, bệnh nhân được chuẩn đoán xác định UTDTT bằng tiêu chuẩn giải phẫu bệnh tại bộ môn giải phẫu bệnh – đại học Y dược

Thành phố Hồ Chí Minh.

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>Phương pháp. </b>

<b><small>Tách chiết genomic DNA</small></b>

<small>Bệnh phẩm: mô vùi nến, hoặc vùng mô ung thư (bệnh phẩm phẫu thuật) </small>

<small>Đánh dấu vùng mô ung thư và vùng mô lành xung quanh, rồi được cạo vào tube 1,5μL bằng lưỡi dao chuyên biệt (2-4 tiêu bản).L bằng lưỡi dao chuyên biệt (2-4 tiêu bản).</small>

<small>DNA genomic được lý trích bằng bộ kit ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System.</small>

<b>1</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b><small>Khuếch đại exon 2 của gen KRAS bằng kỹ thuật COLD-PCR</small></b>

<small>Cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen KRAS:</small>

<b><small>+ Primer R 5’ CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC 3’</small></b>

<small>Mỗi tube PCR có tổng thể tích 50μL bằng lưỡi dao chuyên biệt (2-4 tiêu bản).L, các thành phần gồm PCR buffer, primer F, primer R, Taq Polymerase, 50-100ng genomic DNA. </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<b>Giai đoạn thực hiện theo chu kì luân nhiệt:</b>

<small></small> Giai đoạn biến tính ban đầu 98<small>o</small>C – 3phút, theo sau 10 chu kỳ gồm, biến tính ở 98<small>o</small>C trong 10 giây, gắn mồi ở 60<small>o</small>C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 72<small>o</small>C trong 40 giây.

<small></small> Tiếp theo, phản ứng tổng hợp chuỗi DNA được thực hiện với 40 chu kỳ gồm 5 bước:

+ Biến tính ở 98<small>o</small>C trong 10 giây

+ Tái bắt cặp các sản phẩm PCR ở 70<small>o</small>C trong 2 phút

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<small>+Phân tách các sản phẩm PCR ở 80oC trong 10 giây+ Gắn mồi ở 60oC trong 15 giây</small>

<small>+ Tổng hợp chuỗi DNA ở 72oC trong 40 giây.</small>

<small>Phản ứng kết thúc ở giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 72oC trong 5 phút. Tinh sạch sản phẩm PCR.</small>

<small>Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1.5% có thuốc nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Prỉngraph.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<b>Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA.</b>

Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng Cycle sequencing, theo 2 chiều xi và ngược. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, biến tính ở 95oC trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer. Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape.

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">