Nhóm 11 thứ 3 ca1 thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh học

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

GVHD: HUỲNH VĂN BIẾT

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ƠN TRÊN LÚA,

MAGNAPORTHE ORYZAE

Trường Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa Khoa Học Sinh Học

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Khó khăn trong việc nhận diện nấm

<i>Magnaporthe oryzae và các loại </i>

nấm khác???

1. Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Sử dụng phương pháp PCR để chỉ ra được tính chuyên biệt của Pot2 transposon trong việc phát hiện nấm đạo ôn và lá/cổ bông nhiễm đạo ôn trên lúa nhưng không phát hiện trên các mẫu nấm bệnh khác

1.2 Mục tiêu

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

-Mẫu nấm sẽ được nuôi cấy trong 100 ml môi trường CM lỏng (0,3%

casamino acids, 0,3% yeast extract, 0,5% sucrose) ở 26<small>0</small>C cho việc chiết xuất

-Genomic DNA của mẫu lá

2. Vật liệu và phương pháp ngiên cứu

2.1 Hóa chất

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

2.2 Vật liệu

-Primers

-Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 72 <small>o</small>C . -Gel Loading Dye

-Thang chuẩn DNA

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chủng nấm và môi trường nuôi cấy

-Mẫu được lấy tại Đồng Nai và Tiền Giang. -Sử dụng môi trường PDA nuôi cấy trong nhiều tháng. Mẫu nấm được CM lỏng (0,3% casamino acids, 0,3%

yeastextract,0,5% sucrose) ở 26ºC cho việc chiết xuất DNA tổng số.

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

Mẫu nấm phân lập được nuôi trong môi trường oat meal agar (OMA). Các sợi nấm sẽ được loại bỏ bằng cách chà sát trên bề mặt môi trường nuôi cấy dưới đèn UV chuyên biệt. Bào tử sẽ đươc thu bằng cách thêm nước cất vào môi trường nuôi cấy, chà sát trên bề mặt bằng thanh bơng gịn tiệt trùng và được lọc bằng giấy kimwipe. Việc đếm và quan sát bào tử sẽ được thực hiện trên buồng đếm tế bào chuyên biệt dưới kính hiển vi.

* Chú ý: Trong quá trình thực hiện các mẫu nấm ln giữ ở nhiệt độ 25ºC

2.3.2 Kích hoạt sự hình thành bào tử nấm

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

Trình tự đoạn mồi trong nghiên cứu này (Pot2-F: 5’ CGTCACACGTTCTTCAACC 3’ và Pot2-R: 5’ CGTTTCACGCTTCTCCG 3’) được sử dụng để khuếch đại một vùng có chiều dài 687 bp của Pot2 transposon. Phản ứng PCR được thực hiện trong 50wl hỗn hợp phảnứng/mẫu với DNA Taq polymerase và genomic DNA từ các mẫu nấm và lá, cổ bông nhiễm đạo ôn thông qua máy khuếch đại DNA (Model Nexus Cycler,

Eppendorf). Thành phần phản ứng PCR như sau (25 wl Toptaq Master Mix; 0,2 wM cho mỗi đoạn mồi, < 1 wg mẫu DNA và điều chỉnh bằng nước cất đã khử trùng sạch RNase/ DNase lên đến 50 wl).

2.3.3 Khuếch đại PCR phát hiện nấm đạo ôn

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

3. Kết quả

Hình 3. Tính chun biệt của cặp mồi Pot2 tranposon trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ơn và trong chẩn đốn bệnh đạo ơn trên đồng ruộng

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

Hình 4. Kết quả BLAST trình tự DNA sản phẩm PCR bằng cặp mồi Pot2 transposon của mẫu nấm đạo ôn phân lập từ lá lúa và lá lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn trên cơ sở dữl iệu DNA của NCBI.

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<small>CREDITS: This presentation template was created by Slidesgo, including icons by Flaticon, infographics & images by Freepik</small>

</div>