Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ lactobacillus fermentum

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (947.71 KB, 15 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tơi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác.

Nghiên cứu sinh

Trần Thị Ái Luyến

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU/mL colony-forming unit/Ml số lượng tế bào/mL COSY Correlated Spectroscopy

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa Kỳ

HePS heteropolysaccharide Polysaccharide phức tạp HMBC Heteronuclear multiple - Bond

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

GlcA glucuronic acid

GRAS Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear Overhauser Effect

WPC whey protein concentration

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

1.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum ... 5

1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic ... 6

1.3.1. Khái niệm ... 6

1.3.2. Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa ... 6

1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng ... 14

1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB ... 20

1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS ... 20

1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS ... 23

1.4.3. Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc ..

... 24

1.4.4. Về tính chất cơng nghệ và các tác dụng về sức khỏe ... 34

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 37

3.1. Đối tượng nghiên cứu ... 37

3.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ... 37

2.2.1. Hóa chất ... 37

2.2.2. Thiết bị và dụng cụ ... 37

3.3. Phương pháp nghiên cứu ... 38

2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD)... 38

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] ... 38

2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS ... 39

2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum ... 40

2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37] ... 43

2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] ... 44

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công

nghệ thực phẩm ... 45

2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS ... 47

2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ... 50

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ... 52

3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum ... 52

3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao . ... 52

3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng Lb. fermentum tuyển chọn ... 54

3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện ni cấy đến q trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 ... 66

3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men ... 82

3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước ... 89

3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu ... 91

3.2.3. Khả năng chống oxy hóa ... 95

3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 ... 99

3.3.1. Khối lượng phân tử ... 99

3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 ... 103

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các

lồi Lactobacillus đã được cơng bố ... 22

Bảng 1.2. Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng ... 27

Bảng 1.3. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố ... 29

Bảng 1.4. Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được cơng bố ... 35

Bảng 2.1. Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS ... 50

Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong luận án ... 81

Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch ni cấy thích hợp của các chủng Lb. fermentum trong luận án ... 89

Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum ... 90

Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb. fermentum ... 92

Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum ... 93

Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb.

Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3... 110

Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO ... 118

Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC ... 119

Bảng 3.12. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã công bố và của EPS-MC3 của luận án ... 123

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose

(b) của fructose ... 3

Hình 1.2. Hình dạng khuẩn lạc Lb. fermentum ... 5

Hình 1.3. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS ... 7

Hình 1.4. Mơ hình về q trình sinh tổng hợp glucan và fructan ... 7

Hình 1.5. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB ... 9

Hình 1.6. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS ... 10

Hình 1.7. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB ... 11

Hình 1.8. Cấu tạo của glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP-glactose ... 12

Hình 1.9. Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB ... 14

Hình 1.10. Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB .... 15

Hình 2.1. Sơ đồ ni cấy thu nhận sinh khối ... 38

Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận và tách EPS ... 39

Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS ... 40

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong cơng nghệ thực phẩm ... 45

Hình 2.5. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside ... 48

Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS ... 49

Hình 3-1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic ... 53

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum ... 55

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum ... 61

Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ni cấy ban đầu lên q trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ... 66

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ... 69

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ ni cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum ... 72

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các

chủng Lb. fermentum ... 77

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 ... 83

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 ... 83

Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 ... 83

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 ... 84

Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS ... 87

Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS ... 88

Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel ... 100

Hình 3.15. Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR ... 111

Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 ... 112

Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 ... 113

Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 ... 116

Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 ... 117

Hình 3020. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 ... 118

Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 ... 119

Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần ... 120

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngồi mơi trường [115]. Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, ... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] …

Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng cịn khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác.

Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],….

Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng khơng nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong cơng nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thơng tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS

sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus

fermentum nói riêng, chúng tơi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”.

Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được:

1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất;

2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm;

3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu.

Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về polysaccharide

1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide

Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật),... [29].

Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside. Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên chúng. Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan. Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là heteropolysaccharide hoặc heteroglycan.

Các monosaccharide có cấu trúc dị vịng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy, hydro, carbon. Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở. Các PS thường được tạo nên bởi các đơn vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên thường có cấu trúc vịng 6 cạnh (pyranose). Các monosaccharide này có cấu trúc dạng α và β. Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất. β-D-glucopyranose có

thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a). Ngồi ra, vịng 5 cạnh

(furanose) cũng được coi là thành phần có vai trị quan trọng về mặt sinh học (Hình 1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật.

Hình 1.1. Cấu trúc dạng vịng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trị quan trọng trong y học và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật. Các PS này có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc khơng gây bệnh. Trong đó, các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật khơng gây bệnh đã được khai thác vì chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong cơng nghiệp và trong cơng nghệ sinh học với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học,... Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan thương mại từ nấm men bia [67].

1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide

Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,…

Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia

được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trị giúp hồn thiện cấu trúc thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt, từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67].

Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến. Chúng đang

đóng góp vai trị quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114].

Trong công nghệ sinh học và phịng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film,

tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong cơng tác nghiên cứu tại phịng thí nghiệm. Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử dụng các PS hịa tan, khơng hịa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất

</div>

Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ lactobacillus fermentum

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về