Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má centella asiatica (l ) urban, họ hoa tán (apiaceae)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (235.47 KB, 15 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY

RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN

(APIACEAE)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2017

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HĨA HĨA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY

RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TSKH. Trần Văn Sung và TS. Trần Văn Lộc. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án

Võ Thị Quỳnh Như

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cơ, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và người thân.

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến GS. TSKH. Trần Văn Sung và TS. Trần Văn Lộc – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận án.

Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình thực nghiệm và hồn thành bản luận án.

Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã giảng dạy, hướng dẫn tơi hồn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo.

Tơi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường THPT Gio Linh cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tơi hồn thành tốt luận án.

Luận án được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản của Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 104.01-2012.33 do TS. Trần Văn Lộc làm chủ nhiệm.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày tháng năm 2017

Võ Thị Quỳnh Như

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 2

1.1. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má và hoạt tính sinh học của chúng ... 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân gian 2

1.2. Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban ... 9

1.3. Hoạt tính sinh học của cây rau má ... 15

1.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn ... 15

1.3.2. Hoạt tính giảm đau và kháng viêm ... 15

1.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa ... 16

1.3.4. Tác dụng bảo vệ thần kinh ... 16

1.4.5. Hoạt tính chống xơ vữa động mạch ... 16

1.4. Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất ... 17

1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thư ... 17

1.4.2. Hoạt tính làm lành vết thương ... 19

1.4.3. Hoạt tính chống trầm cảm ... 20

1.4.4. Hoạt tính bảo vệ gan ... 20

1.4.5. Các hoạt tính khác ... 20

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

1.5. Một số chuyển hóa của asiatic acid ... 21

1.5.1. Một số chuyển hóa hóa học của asiatic acid... 21

1.5.2. Chuyển hóa bằng phương pháp sinh học ... 29

1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước ... 30

Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 34

2.1. Các phương pháp chiết xuất và phân lập chất ... 34

2.2. Các phương pháp phổ ... 34

2.3. Các phương pháp tổng hợp hữu cơ ... 34

2.4. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro ... 35

2.5. Phương pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm ... 35

2.6. Nghiên cứu, dự đốn hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp được trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử) ... 35

Chương 3. THỰC NGHIỆM ... 37

3.1. Nguyên liệu ... 37

3.1.1. Mẫu cây rau má ... 37

3.1.2. Dung mơi, hóa chất ... 37

3.2. Phân lập chất ... 37

3.2.1. Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí Minh ... 37

3.2.1.1. Phân lập các chất ... 37

3.2.1.2. Các số liệu phổ của các chất phân lập được ... 38

3.2.2. Nghiên cứu định lượng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ ... 40

3.2.2.1. Xác định hàm lượng asiatic acid bằng phương pháp HPLC ... 40

3.2.2.2. Xác định hàm lượng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột 42 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu hồi asiatic acid và madecassic acid ... 42

3.2.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ... 42

3.2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cồn ... 43

3.2.3.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết ... 44

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

iii

3.2.4. Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella asiatica

(L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất ... 44

3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid ... 47

3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid ... 47

3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid ... 63

3.4. Thăm dị hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp được ... 72

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro ... 72

3.4.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) ... 73

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 75

4.2. Điều kiện chiết xuất cho hiệu suất cao nhất từ mẫu rau má... 80

4.3. Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid ... 80

4.3.1. Chuyển hóa của asiatic acid ... 80

4.3.1.1. Chuyển hóa nhóm COOH (C-28) ... 80

4.3.1.2. Chuyển hóa vịng A của asiatic acid ... 98

4.3.2. Các dẫn xuất của madecassic acid ... 103

4.4. Thử hoạt tính sinh học ... 113

4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro ... 113

4.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn xuất của asiatic acid . 113 4.4.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn xuất của madecassic acid ... 115

4.5.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) ... 118

4.6. Nghiên cứu, dự đốn hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp trên mơ hình tế bào (docking phân tử) ... 119

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 121

5.1. Kết luận ... 121

5.2. Kiến nghị ... 122

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ... 123

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ ... 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 125

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Các phương pháp sắc ký

HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao qua nhiều liên kết

HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry

Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử HSQC Heteronuclear Single Quantum

tính bằng phần triệu

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Các dòng tế bào

HeLa Human cervical adenocarcinoma Ung thƣ cổ tử cung

carcinoma

Ung thƣ gan

MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thƣ vú MDA-MB-231 Metastatic human breast cancer Ung thƣ vú

12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate

Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên

bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. 1. Cây rau má Centella asiatica (L.) Urban ... 3

Hình 1. 2. Các monoterpenoid thu được từ tinh dầu cây rau má ... 5

Hình 1. 3. Các sesquiterpenoid thu được từ tinh dầu cây rau má ... 5

Hình 1. 4. Các triterpene và triterpene saponin khung ursane được phân lập từ cây rau má ... 6

Hình 1. 5. Các triterpene và triterpene glucoside khung oleanane được phân lập từ cây rau má ... 7

Hình 1. 6. Cơng thức các hợp chất phenolic phân lập từ cây rau má ... 8

Hình 1. 7. Các thành phần hóa học khác được phân lập từ cây rau má ... 9

Hình 1. 8. Các triterpene và triterpene glycoside được Yoshida M phân lập từ cây rau má trồng tại Nhật Bản và hoạt tính kháng tế bào ung thư của chúng ... 12

Hình 1. 9. Các triterpene và triterpene glycoside được Rumalla phân lập từ cây rau má trồng tại Mỹ ... 13

Hình 1. 10. Các triterpene và triterpene glycoside được Weng phân lập từ cây rau má trồng tai Trung Quốc ... 13

Hình 1. 11. Một số sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có chứa rau má ... 17

Hình 1. 12. Một số sản phẩm từ cây rau má Việt Nam ... 30

Hình 3. 1. Đường chuẩn asiatic acid ... 41

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG

Bảng 3. 1. Giá trị HPLC của asiatic acid ... 41

Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết. ... 43

Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hiệu quả chiết asiatic acid và madecassic acid ... 43

Bảng 3. 4. Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô ... 44

Bảng 4. 1. Tổng hàm lượng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phương pháp HPLC ... 79

Bảng 4. 2. Tổng hàm lượng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phương pháp CC ... 79

Bảng 4. 3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất tổng hợp của asiatic acid ... 114

Bảng 4. 4. Hoạt tính gây độc tế bào của dẫn xuất madecassic acid ... 117

Bảng 4. 5. Sự thay đổi các chỉ số AST ( UI/ L) và ALT (UI/L) ở các lơ thí nghiệm... 118

Bảng 4. 6. Khối lượng gan chuột (g/10g cơ thể) ở các lơ thí nghiệm ... 118

Bảng 4. 7. Hàm lượng MDA trong gan chuột thí nghiệm ... 119

Bảng 4. 8. Kết quả dự đốn hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo phương pháp docking phân tử của asiatic acid ... 119

Bảng 4. 9. Kết quả dự đốn hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo phương pháp docking phân tử của madecassic acid ... 120

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1. 1. Chuyển hóa các dẫn xuất của AA tại vị trí C-2 ... 22

Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp dẫn xuất C2- oxo của asiatic acid ... 22

Sơ đồ 1. 3. Chuyển hóa ở C2 (khử oxy) của asiatic acid ... 23

Sơ đồ 1. 4. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23, C-11 và C-28 của asiatic acid ... 23

Sơ đồ 1. 5. Tổng hợp dẫn xuất 3-oxo-23-andehyde và các dẫn xuất ... 24

Sơ đồ 1. 6. Tổng hợp dẫn xuất C2-benzyloxy, C3,23-diacetoxy của acid methyl ester. ... 24

Sơ đồ 1. 7. Tổng hợp C11-keto asiatic acid. ... 25

Sơ đồ 1. 8. Tổng hợp C28-hydroxymethyl asiatic acid. ... 26

Sơ đồ 1. 9. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23 của asiatic acid ... 26

Sơ đồ 1. 10. Chuyển hóa ở vị trí C2,3,28 của asiatic acid ... 27

Sơ đồ 1. 11. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amino axit từ asiatic acid ... 28

Sơ đồ 1. 12. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amide từ asiatic acid ... 29

Sơ đồ 1. 13. Tổng hợp một số dẫn xuất của AA bằng con đường sinh học ... 30

Sơ đồ 3. 1. Sơ đồ phân lập các chất từ cây rau má [C. asiatica (L.) Urban] thu hái tại Thành phố Hồ Chí Minh ... 38

Sơ đồ 4. 1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (1) ... 81

Sơ đồ 4. 2. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (2) ... 98

Sơ đồ 4. 3. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid ... 103

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

MỞ ĐẦU

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học lý thú đã và đang được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y dược, nông nghiệp và đời sống. Có nhiều loại thuốc hồn toàn phải dựa vào thiên nhiên để chữa các bệnh thông thường cũng như các bệnh hiểm nghèo. Một trong những hướng nghiên cứu quan trọng hiện nay được các nhà khoa học nước ta và trên thế giới rất quan tâm là: Từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu người ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học của chúng để tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính và tính chất ưu việt hơn những hợp chất ban đầu. Cách tiếp cận này có tính kinh tế tốt hơn, phù hợp hơn với cơ thể sống và thân thiện môi trường hơn.

Trong số các hợp chất thiên nhiên, các triterpene có khung ursane như nhóm ursolic acid và các dẫn xuất của ursolic acid có nhiều hoạt tính sinh học lý thú nên ngày càng được quan tâm nghiên cứu về mặt hoá học và dược lý học. Trong đó hoạt tính gây độc với tế bào khối u phổi dòng A-549, cũng như với tế bào bạch cầu lympho P-388 và L-1210, hoạt tính gây độc với tế bào khối u KB và khả năng ức chế phát triển khối u trên da chuột đã được khẳng định [1].

Trong quá trình tìm hiểu về các cây thuốc cổ truyền Việt Nam, chúng tôi

thấy cây rau má, có tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban thuộc họ Hoa tán

(Apiaceae), có chứa nhiều hợp chất triterpene thuộc khung ursane như: asiatic acid, asiaticoside, madecassic acid, madecassoside… với hàm lượng khá cao có hoạt tính độc với tế bào ung thư [2]. Để tận dụng nguồn nguyên liệu này và góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các chất mới có hoạt tính cao, chúng tơi đặt mục đích sử dụng các triterpene tách được từ cây rau má để chuyển hóa chúng tạo thành các dãy dẫn xuất mới và thăm dị hoạt tính kháng ung thư của các chất thu được.

Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dị hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây

rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)”. Đề tài được thực

hiện với ba mục tiêu:

1. Nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây

rau má Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam.

2. Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập được từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng.

3. Thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp được để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tương quan cấu trúc – hoạt tính của chúng.

</div>