luận án tiến sĩ nghiên cứu chế tạo và đặc trưng tính chất của tổ hợp carrageenancollagen từ vảy cá mang dược chất allopurinol

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>HàC VIÞN KHOA HàC VÀ CƠNG NGHị </b>

<b>Vi QUịC MắNH </b>

<b>C) MANG DỵC CHT ALLOPURINOL </b>

<i><b>Chuyờn ngành</b></i><b>: Hố Hāu c¢ </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

Tơi xin cam oan những nội dung trong luận án này do tôi thực hiện d°ới sự h°ớng dẫn cāa GS. TS. Thái Hoàng và PGS. TS. Vũ Quốc Trung. Một số nhiệm vÿ nghiên cău là thành quÁ tập thể và ã °ợc các ồng sự cho phép sử dÿng.

Các số liệu, kết quÁ trình bày trong luận án là trung thực và ch°a từng °ợc công bố trong các cơng trình khác.

<b>Tác giÁ lu¿n án </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<i>trưng tính chất của tổ hợp carrageenan/collagen (từ vÁy cá) mang dược chất allopurinol" đã hồn thành t¿i Phịng Hố lý vật liệu phi kim lo¿i – Viện Kỹ thuật nhiệt đới – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. </i>

<i>Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến GS. TS. Thái Hoàng và PGS. TS. Vũ Quốc Trung, những ngưßi Thầy đã tần tình hướng dẫn và chỉ bÁo tơi trong suốt q trình xây dựng và hồn thiện luận án. </i>

<i>Tôi xin chân thành cÁm ơn anh, chị, em trong Phịng Hố lý vật liệu phi kim lo¿i và Viện Kỹ thuật nhiệt đới – nơi tôi thực hiện đề tài, đã t¿o mọi điều kiện tuận lợi để tơi hồn thành luận án này. </i>

<i>Tơi xin trân trọng cÁm ơn Ban Giám đốc, thầy giáo, cô giáo cùng tồn thể cán bộ phịng Đào t¿o Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tơi trong q trình học tập và hồn thành luận án. </i>

<i>Tôi xin chân thành cÁm ơn Ban giám hiệu Trưßng Đ¿i học Thành Đơ, Ban lãnh đ¿o cùng tồn thể các đồng nghiệp Khoa Dược đã t¿o mọi điều kiện, hỗ trợ, giúp đỡ tốt nhất cho tôi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án. </i>

<i>Tôi xin chân thành cÁm ơn đề tài Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (Nafosted) – mã số: 104.02-2017.326 giai đo¿n 2018–2021 đã hỗ trợ kinh phí để tơi hồn thành luận án này. </i>

<i>Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, b¿n bè, đồng nghiệp đã t¿o điều kiện giúp đỡ, chia sẻ và động viên tôi trong quá trình hồn thành luận án. </i>

<i>Hà Nội, tháng 01 nm 2024 </i>

<b>Vi QUịC MắNH </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>Mä ĐÄU ... 1 </b>

<b>CH¯¡NG 1. TÞNG QUAN ... 4 </b>

<b>1.1. Tßng quan về collagen ... 4 </b>

1.1.1. Cấu t¿o và cấu trúc phân tử collagen ... 4

1.1.2. Phân lo¿i collagen ... 6

1.1.3. Tính chất cāa collagen ... 10

1.1.4. Tình hình nghiên cău sÁn xuất collagen từ cá ... 12

<b>1.2. Tßng quan về carrageenan ... 18 </b>

1.2.1. Cấu t¿o và cấu trúc phân tử carrageenan ... 18

1.2.2. Tình hình nghiên cău sÁn xuất carrageenan ... 24

1.2.3. Ăng dÿng cāa carrageenan ... 27

<b>1.3. Tßng quan về polyme thiên nhiên mang d°ÿc chÃt ... 29 </b>

<b>2.2. Trích ly collagen tā vÁy cá (há cá chép – Cyprinidae) ... 43 </b>

2.2.1. Xử lý s¡ bộ nguyên liệu ầu vào (B°ớc 1) ... 43

2.2.2. Xử lý protein và chất béo bằng dung dịch kiềm (B°ớc 2) ... 44

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

2.5.9. Ph°¡ng pháp sắc ký nano a chiều và khối phổ (nanoLC-MS/MS) ... 52

<b>2.6. GiÁi phóng allopurinol tā màng và h¿t tß hÿp Car/C/ALP trong các mơi tr°ãng pH khác nhau ... 53 </b>

2.6.1. Xây dựng °ßng chuẩn cāa allopurinol trong các dung dịch pH khác nhau .... 53

2.6.2. Xác ịnh hàm l°ợng allopurinol °ợc mang bái tổ hợp Car/C ... 55

2.6.3. Xác ịnh khối l°ợng thuốc allopurinol giÁi phóng từ vật liệu tổ hợp Car/C/ALP ... 55

<b>2.7. Thÿ nghißm in vivo sÿ dāng h¿t tß hÿp carrageenan/collagen/allopurinol trên c th òng vt (chuòt bình th°ãng và cht đ°ÿc tiêm phúc m¿c potassium oxalate) ... 56</b>

2.7.1. Xác ịnh ộc tính cấp cāa h¿t tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol trên chuột °ợc thử nghiệm ... 56

2.7.2. Xác ịnh ộc tính bán tr°ßng diễn cāa h¿t tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol trên chuột °ợc thử nghiệm ... 57

2.7.3. KhÁo sát tác dÿng cāa h¿t tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol ến sự giÁm nồng ộ urat/acid uric trong máu cāa các lo¿i chuột °ợc thử nghiệm ... 58

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

3.1.1. Ành h°áng cāa dung dịch kiềm ến xử lý vÁy cá thu collagen ... 61

3.1.2. Ành h°áng cāa hỗn hợp acid ến xử lý vÁy các thu collagen ... 62

3.1.3. Xác ịnh ộ tinh khiết và hàm l°ợng các acid amin trong collagen thu °ợc từ hỗn hợp vÁy cá ... 63

3.1.4. Đặc tr°ng, tính chất và hình thái cấu trúc cāa collagen thu °ợc từ hỗn hợp vÁy cá họ cá chép ... 66

<b>3.2. Màng tß hÿp carragennan/collagen/allopurinol ... 72 </b>

3.2.1. Hiệu suất mang allopurinol cāa các màng tổ hợp carrageenan/collagen ... 72

3.2.2. Phổ FTIR cāa màng tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol ... 73

3.3.1. Phổ FTIR cāa h¿t tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol (ACC) ... 90

3.3.2. Phân bố kích th°ớc h¿t cāa h¿t tổ hợp ACC ... 92

3.3.3. Ành SEM cāa h¿t tổ hợp nano ACC... 93

3.3.4. Đặc tr°ng nhiệt cāa h¿t tổ hợp nano ACC ... 94

3.3.5. Hiệu suất mang allopurinol cāa các h¿t tổ hợp nano ACC... 96

3.3.6. Nghiên cău giÁi phóng allopurinol từ h¿t tổ hợp nano Car/C/ALP trong dung dịch ệm pH 2 và pH 7,4 ... 97

<b>3.4. Thÿ nghißm in vivo sÿ dāng h¿t tß hÿp nano carrageenan/collagen/allopurinol trờn c th òng v¿t (cht bình th°ãng và cht đ°ÿc tiêm phúc m¿c potassium oxalat) ... 102 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

3.4.2. Xác ịnh ộc tính bán tr°ßng diễn cāa h¿t tổ hợp nano

carrageenan/collagen/allopurinol trên chuột °ợc thử nghiệm ... 105

3.4.3. KhÁo sát tác dÿng cāa h¿t tổ hợp nano carrageenan/collagen/allopurinol ến sự giÁm nồng ộ urat/acid uric trong máu cāa các nhóm chuột °ợc thử nghiệm ... 109

<b>K¾T LU¾N ... 115 </b>

<b>NHĀNG ĐĨNG GĨP MàI CĂA LU¾N ÁN ... 117 </b>

<b>DANH MĀC CƠNG TRÌNH CĂA TÁC GIÀ ... 118 PHĀ LĀC ... 1.PL </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

A-CNPs: Nano siêu thuận từ chitosan mang allopurinol

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

BÁng 1.1. Cấu trúc các lo¿i collagen [20] ... 7

NaOH 0,5 M ... 61

1) thu °ợc từ vÁy cá họ cá Chép t¿i Việt Nam ... 65

các màng tổ hợp CCA (hàm l°ợng thuốc khác nhau) trong các dung BÁng 3.15. Các ặc tr°ng nhiệt cāa ALP, carrageenan, collagen và h¿t tổ

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

dịch ệm pH 2 và pH 7,4 ... 101

BÁng 3.21. Cân nặng cāa các nhóm chuột tr°ớc và sau uống h¿t tổ hợp nano ACC19-10 sau 14 và 28 ngày (gam) ... 106 BÁng 3.22. Chỉ số huyết học cāa các nhóm chuột tr°ớc và sau uống h¿t tổ

BÁng 3.23. Các chỉ số sinh hóa cāa chuột tr°ớc và sau uống h¿t tổ hợp nano ACC19-10 sau 14 và 28 ngày ... 107 BÁng 3.24. Trọng l°ợng gan, thận và lách cāa chuột sau uống h¿t tổ hợp

nano ACC19-10 sau 28 ngày ... 108

ALP và nano-ALP ... 111

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<i><b>Trang </b></i>

Hình 1.1. Cấu trúc cāa collagen ... 4

Hình 1.2. Sự tham gia cāa hydroxyproline vào liên kết hydro giữa các chuỗi polypeptide ... 5

Hình 1.3. Cấu trúc xoắn ba cāa collagen ... 5

Hình 1.4. Một số d¿ng sinh học cāa chuỗi xoắn 3 collagen ... 6

Hình 1.5. Sự sắp xếp cāa collagen d¿ng sợi ... 7

Hình 1.6. Sự sắp xếp cāa một số lo¿i collagen khơng t¿o cấu trúc sợi ... 9

Hình 1.7. Cấu trwc phân tử và sự chuyển hóa trong mơi tr°ßng kiềm cāa các lo¿i carrageenan khác nhau ... 20

Hình 1.8. Cấu trúc cāa ½-Car ... 21

Hình 1.9. Cấu trúc cāa ¼-carrageenan Car ... 21

Hình 1.10. Cấu trúc cāa ¾-carrageenan Car ... 21

Hình 1.11. Gel carrageenan với Ca<small>2+</small>... 23

Hình 1.12. Đồ thị hàm l°ợng Cur giÁi phóng từ hệ ½-Car-Cur trong dung dịch pH 5,0 và pH 7,4 ... 30

Hình 1.13. (a) L°ợng GH giÁi phóng từ C/PVA (20/80) á nồng ộ khác nhau, ... 33

Hình 1.14. Đồ thị giÁi phóng thuốc Dox từ màng tổ hợp CoL/Ch/DBC mang thuốc Dox hàm l°ợng CoL/Ch khác nhau trong các dung dịch ệm pH 7,4 (a), 6,5 (b) và 5,8 (c) ... 36

Hình 2.1. Collagen kết tāa (trái), collagen sau khi ơng khơ (phÁi) ... 45

Hình 3.1. Phổ EDX cāa collagen thô (A); collagen thẩm tích sau 24 giß (B) và collagen thẩm tích sau 48 giß (C)BÁng 3.4. Tỉ lệ khối l°ợng (%) các nguyên tố trong collagen tr°ớc và sau khi thẩm tích ... 63

Hình 3.2. Phổ FTIR cāa collagen sau thẩm tích 48 giß ... 67

Hình 3.3. Ành SEM cāa collagen thơ á ộ phóng ¿i 100.000 lần ... 68

Hình 3.4. Ành SEM á các ộ phóng ¿i 1.000 và 10.000 lần cāa collagen tinh sau khi thẩm tích 48 giß ... 68

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

Hình 3.7. Kết quÁ iện di SDS-Page cāa collagen ... 70

Hình 3.8. Đồ thị phÁn ánh sự phÿ thuộc cāa phần ộ nhớt cāa collagen vào nhiệt ộ ... 72

Hình 3.9. Phổ FTIR cāa ALP, Car và C ... 74

Hình 3.10. Phổ FTIR cāa màng tổ hợp CCA ... 75

Hình 3.11. Phổ FTIR cāa màng tổ hợp CCA á các tỉ lệ Car/C và ALP khác nhau ... 77

Hình 3.12. Một số giÁ thuyết t°¡ng tác trong màng tổ hợp Car/C/ALP ... 78

Hình 3.13. GiÁn ồ XRD cāa ALP ... 79

Hình 3.14. GiÁn ồ XRD cāa màng tổ hợp Car/C/ALP á tỉ lệ Car/C = 95/5, 1% KCl ... 79

Hình 3.15. Ành SEM cāa các màng tổ hợp Car/C/ALP, chất t¿o gel KCl 1 %: ALP (a), CCA991-5 (b), CCA955-5 (c), CCA9010-5 (d), CCA955-3 (e) và CCA955-10 (f) ... 80

Hình 3.16. GiÁn ồ DSC cāa màng tổ hợp Car/C/ALP (5 %)... 81

Hình 3.17. Đồ thị giÁi phóng ALP từ màng tổ hợp CCA trong các dung dịch ệm pH 2 và pH 7,4 ... 84

Hình 3.18. Đồ thị giÁi phóng ALP từ mẫu màng CoA-5, CaA-5 và màng tổ hợp CCA khi hàm l°ợng ALP thay ổi trong dung dịch ệm pH 7,4 .. 86

Hình 3.19. Đồ thị giÁi phóng ALP tinh khiết và từ màng CCA với hàm l°ợng ALP thay ổi trong dung dịch ệm pH 2 và pH 7,4 ... 87

Hình 3.20. Phổ FTIR cāa Car, C, ALP và các h¿t tổ hợp ACC á các t礃ऀ lệ Car/C khác nhau ... 91

Hình 3.21. Phổ IR cāa các h¿t tổ hợp ACC19-5, ACC19-10 và ACC19-15 ... 92

Hình 3.22. GiÁn ồ phân bố kích th°ớc h¿t cāa các h¿t tổ hợp nano ACC28-10, ACC55-ACC28-10, ACC64-10 ... 93

Hình 3.23. Ành SEM cāa ALP các h¿t tổ hợp nano ACC với t礃ऀ lệ Car/C khác nhau .... 94

Hình 3.24. Ành SEM cāa các h¿t tổ hợp ACC với hàm l°ợng ALP khác nhau ... 94

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

Hình 3.26. Đồ thị giÁi phóng ALP các h¿t tổ hợp nano ACC và ALP tinh khiết

l°ợng ALP khác nhau) trong dung dịch ệm pH 7,4 ... 100

Hình 3.31. Hình Ánh ¿i thể cāa gan, lách và thận cāa chuột sau 72 giß uống

S¡ ồ 2.1. Quy trình trích ly và tinh chế collagen từ hỗn hợp vÁy cá (họ cá

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>Mä ĐÄU </b>

Polyme thiên nhiên, nhân t¿o hoặc tổng hợp có sử dÿng trong y học °ợc gọi là vật liệu polyme y sinh. Chúng °ợc sử dÿng với các mÿc ích khác nhau nh°: iều trị bệnh, thay thế các c¡ quan bị tổn th°¡ng giwp phÿc hồi chăc nng hoặc tng c°ßng một chăc nng nào ó trong c¡ thể [1].

Các polyme y sinh dùng làm vật kiệu thay thế cần có các tính chất sau [1, 2]: T°¡ng hợp sinh học và khơng ộc h¿i; có thể khử trùng; dễ chế t¿o. Lo¿i vật liệu th°ßng sử dÿng làm các bộ phận thay thế trong c¡ thể là sợi carbon, polyglycolide,

Với polyme y sinh làm vật liệu mang, dẫn thuốc trong d°ợc phẩm, ng°ßi ta chia làm 2 lo¿i: dùng làm tá d°ợc mang thuốc và dùng làm truyền dẫn iều trị t¿i ích [3, 4]. Trong ó, các polyme y sinh á d¿ng h¿t nano nh¿y với nhiệt ộ và pH ể mang và giÁi phóng thuốc một cách tự nhiên từ các phần tử cāa thuốc vào c¡ thể con ng°ßi theo những ch°¡ng trình °ợc thiết lập sẵn. Nh° vậy, nồng ộ thuốc

hiện t°ợng giÁi phóng cÿc bộ và có thể kéo dài thßi gian iều trị cho một lần sử dÿng thuốc.

Trong các hệ polyme y sinh, hệ polyme hydrogel có nhiều °u iểm nh°: khÁ nng t°¡ng thích sinh học tốt, t°¡ng tác tốt với d°ợc phẩm, dễ kiểm sốt giÁi phóng

cău ể ăng dÿng vào bào chế các d¿ng thuốc mới trong iều trị bệnh. Trong số các polyme phổ biến dùng ể chế t¿o d¿ng hydrogel, carrageenan (Car) và collagen (C) là hai ăng viên tiềm nng °ợc sử dÿng ể mang các d°ợc chất. Carrageenan °ợc chiết xuất từ rong ỏ, có thể phân hu礃ऀ sinh học và an tồn với c¡ thể ng°ßi. Các sÁn phẩm cāa Car với kích th°ớc nano ặc biệt là hệ nano tổ hợp có nhiều tính chất và °ợc ăng dÿng nhiều trong công nghiệp d°ợc phẩm [5, 6] (làm tá d°ợc sÁn xuất các lo¿i thuốc iều trị nh°: thuốc chống ông máu, ngừa ung th°, … [7, 8]). Collagen có tác dÿng bÁo vệ thuốc kháng các yếu tố gây biến ổi d°ợc chất nh°: ánh sáng, oxy... Tuy nhiên, nguồn collagen hiện nay °ợc sÁn xuất chā yếu từ da ộng vật. Trong ó ộng vật có thể bị nhiễm một số bệnh nh°: bệnh bò iên, bệnh não xốp á bị, lá mồm long móng, … khiến cho chất l°ợng collagen thu °ợc không Ám bÁo.

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

Gần ây, collagen °ợc trích ly từ vÁy cá °ợc quan tâm nghiên cău nh° một lo¿i vật liệu sinh học mới thay thế collagen từ ộng vật vì nguồn collagen từ vÁy cá an tồn, giúp xử lý chất phế thÁi cāa ngành thāy sÁn, ồng thßi mang l¿i hiệu quÁ kinh tế cho ngành thāy sÁn. Cho ến thßi iểm này, ch°a có ề tài nào nghiên cău xử lý

thu collagen một cách có hệ thống cũng nh° sử dÿng tổ hợp carrageenan và collagen từ vÁy cá làm vật liệu mang, dẫn thuốc.

Acid uric là sÁn phẩm chuyển hóa cāa purine trên ng°ßi [9]. KhoÁng 2/3 l°ợng acid uric °ợc sinh ra từ chuyển hóa nội sinh và các lo¿i thăc n giàu purine nh° thịt, hÁi sÁn… [10]. Phần lớn acid uric °ợc ào thÁi qua °ßng tiết niệu và một phần qua mật. Sự mất cần bằng trong chuyển hóa acid uric và rối lo¿n ào thÁi qua thận sẽ dẫn ến tng acid uric máu [11]. Allopurinol (ALP) là một chất ăc chế enzyme xanthine oxidase (enzym oxy hóa xanthine thành acid uric), do ó có tác dÿng làm giÁm m¿nh nồng ộ acid uric trong máu °ợc sử dÿng làm thuốc iều trị

<i><b>cāu chế t¿o và đặc trưng tính chất cÿa tổ hợp carrageenan/collagen (từ vÁy cá) mang dược chất allopurinol= nhằm thu °ợc collagen từ quá trình xử lý, chiết tách </b></i>

vÁy cá n°ớc ngọt á Việt Nam (cá chép, cá trôi, các trắm, cá rơ phi), ồng thßi sử dÿng collagen từ vÁy cá thu °ợc kết hợp với carrageenan ể chế t¿o vật liệu mang d°ợc chất mơ hình là ALP ể hỗ trợ iều trị bệnh gút, nhằm kiểm soát sự hấp thu và thÁi trừ cāa thuốc ALP, qua ó kéo dài thßi gian tác dÿng cāa thuốc.

<b>-</b><i> Xây dựng °ợc q trình trích ly collagen từ vÁy cá n°ớc ngọt Việt Nam </i>

<i>(cá chép - Cyprinus carpio, cá trôi - Labeo rohita, cá trắm cỏ - Ctenopharyngodon </i>

<i>idella, cá rô phi - Oreochromis niloticus). </i>

<b>-</b><i> Chế t¿o °ợc tổ hợp polyme thiên nhiên carrageenan/collagen (từ vÁy cá) </i>

chăa ALP d¿ng màng và d¿ng h¿t bằng ph°¡ng pháp dung dịch và ph°¡ng pháp gel – ion hóa.

<b>-</b><i> Đánh giá °ợc khÁ nng làm giÁm acid uric trong máu từ việc sử dÿng tổ </i>

hợp polyme thiên nhiên carrageenan/collagen (từ vÁy cá) chăa ALP.

- Nghiên cău iều kiện trích ly collagen từ vÁy cá n°ớc ngọt Việt Nam (cá

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<i>chép - Cyprinus carpio, cá trôi - Labeo rohita, cá trắm cỏ - Ctenopharyngodon </i>

<i>idella, cá rô phi - Oreochromis niloticus). </i>

- Nghiên cău iều kiện chế t¿o và tỉ lệ thành phần giữa các polyme carrageenan và collagen (từ vÁy cá) mang ALP ể thu °ợc tổ hợp polyme mang d°ợc chất á d¿ng màng và d¿ng h¿t bằng ph°¡ng pháp dung dịch và ph°¡ng pháp gel – ion hóa.

- Nghiên cău sự giÁi phóng d°ợc chất ALP từ tổ hợp polyme Car/C/ALP. - Nghiên cău thử nghiệm in vivo trên chuột sử dÿng tổ hợp polyme thiên nhiên Car/C (từ vÁy cá) chăa ALP ến khÁ nng giÁm acid uric trong máu.

Luận án bao gồm: Phần má ầu, ba ch°¡ng nội dung chính cāa luận án, kết luận, các óng góp mới cāa luận án, danh mÿc các công bố liên quan ến luận án, danh mÿc tài liệu tham khÁo và phÿ lÿc.

<i><b>PhÅn Må đÅu: Nêu tính cấp thiết cāa luận án, khái quát chung về nội dung </b></i>

và mÿc ích nghiên cu ca lun ỏn.

<i><b>ChÂng 1. Tòng quan: Giới thiệu về các ối t°ợng nghiên cău, ph°¡ng </b></i>

pháp nghiên cău cũng nh° các nghiên cău trong và ngoài n°ớc liên quan ến các

<i><b>ối t°ợng và ph°¡ng pháp nghiờn cu. </b></i>

<i><b>ChÂng 2. Thc nghiòm: Trỡnh by v vt liệu và các ph°¡ng pháp chế t¿o, nghiên cău. </b></i>

<i><b>Ch°¢ng 3. K¿t quÁ và thÁo lu¿n: Đánh giá về những kết quÁ nghiên cău ã </b></i>

<i>¿t °ợc cāa luận án. </i>

<b>Các đóng góp mái </b>

<b>Danh māc các cơng bß liên quan đ¿n lu¿n án </b>

<i><b>Tài lißu tham khÁo: Liệt kê các tài liệu tham khÁo ã sử dÿng ể nghiên cău và thực hiện luận án. </b></i>

<b>Phā lāc: Trình bày các bÁng biểu số liệu o ¿c liên quan tới kết quÁ cāa luận án. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<b>CH¯¡NG 1. TÞNG QUAN </b>

<i><b>1.1.1. Cấu t¿o và cấu trúc phân tử collagen </b></i>

Đ¡n vị cấu trwc c¡ bÁn cāa collagen là tropocollagen có chiều dài khoÁng 300 nm, °ßng kính khng 1,5 nm, gồm ba chuỗi polypeptide xoắn l¿i với nhau (Hình 1.1). Các chuỗi trong collagen °ợc ổn ịnh bái liên kết hydro giữa các nhóm –CO– và –NH– kế liền nhau trên m¿ch polypeptide [12].

<i><b>Hình 1.1.</b></i> Cấu trwc cāa collagen

Mỗi chuỗi polypeptide chăa khoÁng 1050 amino acid, trong ó chā yếu là

polypeptide cāa collagen, các amino acid có sự lặp l¿i cāa bộ ba amino acid Gly-X-Y, (X th°ßng là prolin, Y th°ßng là hydroxyprolin hoặc hydroxylysin). Với những collagen khơng có cấu trwc sợi, sự lặp l¿i cāa bộ ba Gly-X-Y có thể bị gián o¿n á những vị trí xác ịnh trong những o¿n xoắn ba [13].

Hàm l°ợng các amino acid trong collagen có nguồn gốc từ cá thấp h¡n collagen có nguồn gốc từ ộng vật. Amino acid trong collagen cāa cá á mơi tr°ßng ấm cao h¡n mơi tr°ßng l¿nh. Các amino acid này giwp ổn ịnh cấu trwc xoắn cāa

nhóm carbonyl cāa chuỗi peptid kế bên và một phân tử n°ớc làm cầu nối trung gian (Hình 1.2).

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<i><b>Hình 1.2.</b></i> Sự tham gia cāa hydroxyproline vào liên kết hydro giữa các chuỗi polypeptide

Persikov ã nghiên cău sự ổn ịnh cāa phân tử collagen dựa trên trình tự Gly-X-Hyp và Gly-Pro-Y, từ ó xác ịnh °ợc các amino acid trên các vị trí X và Y, á vị trí cāa X th°ßng gặp các amino acid: Pro, Glu, Ala, Lys, Arg, Gln, và Asp; á vị trí Y th°ßng gặp các amino acid là: Hyp, Arg, Met, Ile, Gln, và Ala; các amino acid th¡m và Gly ít ổn ịnh á cÁ hai vị trí X và Y [14].

Độ ổn ịnh nhiệt cāa collagen °ợc tng lên nhß hydroxyprolin. Sakikabara

nhiệt này là do nhóm hydroxyl cāa Hyp h°ớng ra phía bề mặt ngồi cấu trwc xoắn ốc, không tham gia vào liên kết hydro bên trong cấu trwc nên nhóm này sẽ tham gia hình thành liên kết hydro nhß cầu nối trung gian là phân tử n°ớc [15]. Lúc này,

những cầu n°ớc liên tÿc nhau [16]. Do ó, sự lặp l¿i cāa bộ ba amino acid Gly-X-Y trong mỗi chuỗi polypeptide cho phép hình thành cấu trwc xoắn ba với amino acid glycine cuộn vào bên trong lõi xoắn ốc còn các amino acid X và Y lộ ra phía bề mặt ngồi (Hình 1.3) [12].

<i><b>Hình 1.3</b></i><b>. </b>Cấu trwc xoắn ba cāa collagen

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

Trong thành phần cấu t¿o cāa collagen, số l°ợng các amino acid có tính acid gần bằng số l°ợng các amino acid có tính base. Vì vậy, collagen vẫn giữ °ợc tr¿ng thái cân bằng về iện trong những iều kiện sinh lý khác nhau [17]. Các ph°¡ng pháp th°ßng °ợc dùng ể tách các phân tử collagen từ các bó sợi là dùng các enzyme (nh° pepsin) ể phân cắt các chuỗi polypeptide ra khỏi phân tử collagen (lo¿i bỏ °ợc các liên kết ngang ngo¿i phân tử), do ó dễ dàng thu hồi collagen [17].

Trong ộng vật, các phân tử collagen sẽ kết tÿ với nhau t¿o thành vi sợi (microfibril). Các vi sợi là ¡n vị cấu trwc ể hình thành các sợi, bó sợi lớn h¡n và các m¿ng l°ới có trong mơ, x°¡ng và các màng c¡ bÁn (Hình 1.4) [18].

<i><b>Hình 1.4</b></i><b>. </b>Một số d¿ng sinh học cāa chuỗi xoắn 3 collagen

<i><b>1.1.2. Phân lo¿i collagen </b></i>

Trong c¡ thể ng°ßi, tồn t¿i 28 lo¿i collagen °ợc °ợc liệt kê trong BÁng

d¿ng màng, chuỗi h¿t, chuỗi ngắn, d¿ng chuyển màng và một số lo¿i khác.

<i>1.1.2.1. Collagen d¿ng sợi </i>

Là d¿ng phổ biến với hàm l°ợng h¡n 90% l°ợng collagen trong c¡ thể. Collagen d¿ng sợi có chiều dài chu kỳ khoÁng 64-67 nm, °ợc lặp i lặp l¿i. Mỗi sợi

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

collagen t¿o bái các ¿i phân tử tropocollagen với kích th°ớc: dài 300 nm, rộng 15 nm và °ợc sắp xếp so le nhau. Hai phân tử liên tiếp cách nhau 40 nm (Hình 1.5) [19].

<i><b>Hình 1.5.</b></i> Sự sắp xếp cāa collagen d¿ng sợi

m¿c, phổi, m¿ch máu); collagen lo¿i II (thành phần quan trọng cāa sÿn); collagen lo¿i III (có tính chất àn hồi do vậy có nhiều trong mô liên kết nh° : nh° phổi, da, m¿ch máu); collagen lo¿i V °ợc liên kết với lo¿i I (có trong giác m¿c); collagen lo¿i XI °ợc liên kết với lo¿i II (có trong cấu t¿o cāa sÿn) (BÁng 1.1). Collagen d¿ng sợi có mỗi chuỗi ³, có vùng xoắn ốc dài và lặp l¿i liên tÿc cāa bộ ba

<i><b>BÁng 1.1. Cấu trúc các lo¿i collagen [20] </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

Collagen lo¿i IV là d¿ng phổ biến nhất, là thành phần màng phân cách giữa các c¡ quan, màng trong, h¿ bì, mơ c¡ và tế bào thần kinh và mơ c¡. Collagen IV dài h¡n

ầu 7S và NC1 khác với d¿ng sợi là khơng có hai ầu teleopeptide N và C. Phân tử collagen IV kết tÿ l¿i với nhau nhß vào sự hình thành liên kết t¿i hai vùng 7S và NC1, sự t°¡ng tác t¿i các vùng xoắn ốc và t°¡ng tác giữa các thành phần khác cāa màng ể hình thành lên cấu trwc m¿ng l°ới (Hình 1.6A).

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<i><b>Hình 1.6.</b></i> Sự sắp xếp cāa một số lo¿i collagen không t¿o cấu trwc sợi

Trong số collagen cāa ộng vật thì vùng xoắn ốc cāa collagen VII là dài nhất (chiều dài 420 nm) vàbị gián o¿n t¿i các iểm á hai ầu vùng NC1 và NC2. Collagen này có á ranh giớ nối giữa lớp trung và biểu bì, với chăc nng sợi neo giữ các cấu trwc (Hình 1.6B). Collagen lo¿i XVIII và XV có nhiều o¿n kết tÿ l¿i với nhau, gọi là lo¿i hỗn hợp. Hai lo¿i này t¿o liên kết với các màng và liên kết cộng hoá trị với các chuỗi glycosaminoglycan gọi là các proteoglycan.

<i>1.1.2.3. Collagen chuỗi h¿t </i>

Collagen chuỗi h¿t là lo¿i phổ biến óng vai trị duy trì hình d¿ng và tr¿ng thái các mơ. Các phân tử chuỗi h¿t có các vùng xoắn ốc ngắn (bằng 1/3 so với d¿ng sợi). Phân tử collagen VI liên kết với nhau tao chuỗi h¿t, có chiều dài chu kỳ 110 nm (Hình 1.6 C).

<i>1.1.2.4. Collagen chuỗi ngắn </i>

xoắn ba có chiều dài bằng 1/2 d¿ng sợi và có nhiều vùng gián o¿n. Hai lo¿i này tham gia hình thành giác m¿c (collagen VIII) và sÿn (collagen X) (Hình 1.6 D).

<i>1.1.2.5. FACIT collagen </i>

Là lo¿i collagen ầu tiên °ợc tìm thấy. Lo¿i này có collagen IX, là thành phần chính cāa sợi collagen trong sÿn. Collagen IX là heterotrime d¿ng ³1(IX)³2(IX)³3(IX) gồm: phân tử glycosaminoglycan liên kết với chuỗi ³2(IX) nên

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

gọi là proteoglycan. Trên bề mặt các collagen II và XI liên kết với collagen IX có trong sÿn bằng với các dẫn xuất cāa lysin bằng liên kết cộng hoá trị.

bố trong các mô khác nhau, nh° collagen XXII có á màng biên giữa các mô;

<i><b>1.1.3. Tính chất cÿa collagen </b></i>

<i>1.1.3.1. Sự hút ẩm của collagen </i>

kết giÁm. Khi hwt n°ớc, collagen bị ion hóa do t°¡ng tác giữa các nhóm phân cực

hydro cāa chuỗi polypeptide trong collagen làm yếu liên kết. Collagen liên kết với

thể tích phân tử collagen tng lên [19].

Tỉ lệ giãn ná cāa collagen có giới h¿n (7 % cho sợi °ớt và 5 % cho sợi khô).

bằng 1/3 - 1/4 chiều dài ban ầu. Tiếp tÿc un nóng, collagen bị thāy phân thành

Trong q trình lão hóa, collagen bị thối hóa sẽ gây ra nếp nhn trên da [21].

Đun sôi dung dịch collagen t¿o thành gelatin, khi ó vịng xoắn ba má xoắn

gelatin. T礃ऀ lệ giữa gelatin/gelaton/galatose phÿ thuộc vào thßi gian un và nhiệt ộ un. Enzym trysin và pepsin có tác dÿng thāy phân chậm collagen và thāy phân nhanh gelatin. Collagen bị kết tāa t¿o sợi dày khi bổ sung alchol, acetone hoặc muối

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

<i>1.1.3.2. Sự tương tác của collagen với acid và kiềm </i>

Collagen là chất l°ỡng tính, nó có thể tác dÿng với acid và kiềm do trên m¿ch cāa phân tử collagen tồn t¿i các gốc carboxyl và amino [21]. Trong mơi

có thể thu礃ऀ phân liên kết peptide trong collagen t¿o thành chuỗi peptide ngắn h¡n và các acid amin tự do.

<i>1.1.3.3. Một số tính chất khác của collagen [22] </i>

Tuỳ thuộc nguồn gốc, mỗi lo¿i collagen sẽ có những ặc iểm khác nhau và chwng °ợc mơ tÁ bái nhiều tính chất ặc tr°ng cho nguồn gốc trích ly nh°:

+ Nhiệt ộ biến tính collagen: là nhiệt ộ t¿i ó cấu trwc xoắn ba cāa collagen bắt ầu bị biến ổi thành những cuộn xoắn ngẫu nhiên. Do ó, biết °ợc tính chất này sẽ giwp việc ăng dÿng collagen °ợc hiệu quÁ và thích hợp.

+ Thành phần amino acid cāa collagen: là tính chất rất quan trọng, giwp ánh giá °ợc mặt dinh d°ỡng cāa collagen, là nền tÁng ể dự ốn các tính chất hố học, lý học và sinh học... cāa collagen.

+ Khối l°ợng phân tử collagen: là thông số gián tiếp giwp nhận biết măc ộ nguyên vẹn cāa m¿ch phân tử collagen thu °ợc (mỗi phân tử collagen có khối l°ợng khoÁng 300 kDa).

+ Phổ hồng ngo¿i (IR): mỗi amide có ộ hấp thÿ á b°ớc sóng riêng biệt, do vậy phổ IR giwp phát hiện và xác ịnh mẫu phân tích có tồn t¿i cấu trwc xoắn hay khơng.

hóa yếu nh°ng tốt h¡n sữa gầy.

+ Sự biến tính: d°ới tác dÿng hóa học cāa acid, base, muối, ancol…. cấu trwc

nguyên liên kết peptide (cấu trwc bậc một cāa protein). Do vậy, tính chẩt cāa protein bị thay ổi, gọi là là hiện t°ợng biến tính protein. Sau biến tính, protein th°ßng giÁm ộ hịa tan, mất ho¿t tính sinh học, nh¿y cÁm với enzyme protease, ộ nhớt nội t¿i tng lên và không kết tinh [23].

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<i><b>1.1.4. Tình hình nghiên cāu sÁn xuất collagen từ cá </b></i>

<i>1.1.4.1. Trên thế giới </i>

Theo Caruso và cộng sự [24], °ớc tính rằng h¡n 50% bộ phận cāa cá, bao gồm vây, ầu, da và nội t¿ng, bị lo¿i bỏ d°ới d¿ng <chất thÁi=, v°ợt quá 20 triệu tấn sÁn phẩm phÿ mỗi nm. Do ó, việc khai thác các sÁn phẩm phÿ từ cá biển nh° một nguồn cung cấp collagen mới ngày càng thu hwt °ợc sự chw ý [25, 26] do collagen thu °ợc từ cấc phÿ phẩm này dễ chiết xuất, hàm l°ợng cao, dễ hấp thÿ, t°¡ng thích sinh học, Khơng lây nhiễm một số mầm bệnh nh° collagen từ ộng vật. Do vậy, nhiều nghiên cău ã tập trung vào việc trích ly và ánh giá các ặc tính cāa

<i>collagen từ da cāa các loài cá khác nhau, chẳng h¿n nh° vÁy và vây cāa Catla catla và Cirrhinus mrigala [27], cá nhám mèo ốm nhỏ (Scyliorhinus canicula) [28], cá </i>

da tr¡n (Silurus triostegus) [29].

Nghiên cău cāa Huang và cộng sự [30] cho thấy áp suất cao °ợc sử dÿng trong q trình tách collagen từ vÁy cá rơ phi cho sÁn l°ợng collagen từ 7,5 ến 12,3%, cao gấp 2–3 lần so với sÁn l°ợng cāa quy trình chiết xuất sử dÿng acetic acid thơng th°ßng.

Sử dÿng acid khi chiết tách collagen cũng °ợc nghiên cău. Acetic acid là một trong những acid phổ biến nhất °ợc dùng trong chiết xuất collagen từ cá, nồng ộ cāa dung dịch th°ßng dùng từ 0,5 ến 1M. Tan và cộng sự [31] ã nghiên cău Ánh h°áng cāa các lo¿i acid khác nhau (acetic acid, acid clohydric, acid citric và acid lactic, W:V = 1:50), t礃ऀ lệ chất lỏng/chất rắn và ộ pH khác nhau (1,8; 2,1; 2,4 ; 2,7 và 3,0 ) ến quá trình chiết xuất collagen từ da cá da tr¡n bằng các ph°¡ng pháp khác nhau (ph°¡ng pháp chiết xuất bằng acid, ồng nhất hóa và hỗ trợ pepsin). Ph°¡ng pháp pepsin và hỗ trợ ồng nhất hóa thể hiện khÁ nng thu hồi protein cao nhất (64,19% á pH 2,4 bằng HCl). Về ph°¡ng pháp chiết xuất acid, t礃ऀ lệ thu hồi protein tách từ da bằng HCl á pH 2,4 là 42,36% (cao nhất), tiếp theo là chiết xuất bằng acetic acid pH 2,7 (39,45%).

Tác dÿng cāa acetic acid nồng ộ khoÁng 0,2–1,0 M ối với quá trình chiết xuất collagen từ da cá °ợc Arumugam và cộng sự nghiên cău [32]. Kết quÁ thu °ợc sÁn l°ợng collagen tng dần khi tng nồng ộ acetic acid, l°ợng collagen tối

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

a thu °ợc là 15,968 mg/g á 0,6M acetic acid. Tuy nhiên, v°ợt quá 0,6 M, sÁn l°ợng collagen giÁm do l°ợng acid d° có tác dÿng thāy phân collagen.

Yang và cộng sự nghiên cău tách chiết collagen từ da cá có sử dÿng acetic acid. Hàm l°ợng collagen thu °ợc phÿ thuộc nồng ộ acetic acid sử dÿng, nồng ộ cāa collagen tng từ 0,518 lên 1,581 mg/mL khi thay ổi nồng ộ acetic acid từ 0,1 ến 2,0 M [33].

Masahiro Ogawa và cộng sự (2004) ã nghiên cău các tính chất hố sinh cāa

<i>collagen tách chiết từ x°¡ng và vÁy cāa cá trống en (Pogonia cromis) cận nhiệt ới và cá sheepshead seabream (Archosargus probatocephalus). Collagen °ợc </i>

trích ly bằng cách sử dÿng acetic acid và sử dÿng enzyme pepsin kết hợp với acetic

Nm 2006, L.S. Senaratne và các cộng sự ã nghiên cău tách chiết và xác

<i>ịnh các tính chất ặc tr°ng cāa collagen từ da cá l°ng nâu toadfish (Lagocephalus </i>

<i>glover</i>). Các tác giÁ °a ra quy trình tách: Đầu tiên khử protein phi collagen bằng cách ngâm da cá trong dung dịch NaOH 0,1N trong 3 ngày. Sau ó lo¿i chất béo bằng ancol butylic 10% trong 24 giß. Da cá sau khi lo¿i bỏ chất béo tiếp tÿc °ợc ngâm trong acetic acid 0,5M trong 3 ngày và °ợc xử lý bằng enzyme pepsin trong 48 giß ể tách collagen. Thêm NaCl vào dung dịch thu °ợc ể kết tāa collagen. Ph°¡ng pháp này cho hiệu suất tách chiết là 54,3% theo khối l°ợng khô, cấu trwc phân tử cāa collagen gồm ba chuỗi ³1, ³2, ³3, nhiệt ộ biến tính cāa collagen là 28

Lin Wang và các cộng sự (2008) cũng nghiên cău tách chiết và xác ịnh các

<i>tính chất ặc tr°ng cāa collagen từ da, vÁy và x°¡ng cāa cá ỏ (Sebastes mentella). </i>

Quá trình tách chiết °ợc thực hiện qua các b°ớc khử protein phi collagen bằng NaOH 1M; khử khoáng bằng ethylenediaminotetraacetic (EDTA) 0,5M và khử chất béo bằng hexan. Các quá trình khử ều °ợc thực hiện trong 24 giß. Sau ó các phần ều °ợc ngâm trong acetic acid 0,5M (trong 48 giß) ể chiết collagen và kết tāa collagen bằng NaCl. Hiệu suất thu hồi và nhiệt ộ biến tính collagen từ da, vÁy

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

ph°¡ng pháp ùn – thāy phân – chiết (EHE) ể tách collagen từ vÁy cá rô phi. Ph°¡ng pháp EHE °ợc ăng dÿng nhiều trong công nghiệp thực phẩm với nhiều °u iểm nh° dễ vận hành, sÁn xuất liên tÿc, nng suất cao và ít chất thÁi. Quá trình ùn °ợc sử dÿng ể làm ăt các liên kết giữa collagen và hydroxyapatide trong vÁy cá và giwp cho sự trích ly collagen từ vÁy cá bằng cách tách với n°ớc °ợc dễ dàng h¡n. H¡n nữa, quá trình ùn cũng giwp làm giÁm bớt mùi khó chịu cāa vÁy cá ể thu °ợc collagen có mùi dễ chịu h¡n. Collagen thu °ợc là collagen lo¿i I, có ộ tinh s¿ch cao. Hiệu suất cāa ph°¡ng pháp EHE cao h¡n 2-3 lần so với ph°¡ng pháp chiết/ép. Tất cÁ các chiết xuất thu °ợc, ặc biệt là collagen lo¿i I có các tính chất hóa lý tốt và là ăng viên tiềm nng trong sÁn xuất các sÁn phẩm th°¡ng m¿i [37].

P. K. Bhagwat và cộng sự ã nghiên cău ặc tr°ng cāa collagen °ợc trích ly từ vÁy cá chép theo 2 b°ớc [23]. Đầu tiên, vÁy cá sau khi s¡ chế °ợc tách khoáng bằng hỗn hợp dung dịch chăa NaCl 1M, Tris HCl 0,05M, EDTA 20 mM trong 48 giß. Sau ó, ngâm vÁy cá trong dung dịch EDTA 0,5M trong 48 giß và °ợc rửa l¿i với n°ớc s¿ch, thu °ợc vÁy cá ã tách khoáng. VÁy cá sau khi tách khoáng °ợc

cá. Thêm NaCl (tới nồng ộ 0,9M) vào dịch lọc và khuấy liên tÿc trong 24 giß. Sau ó, ly tâm hỗn hợp trong 20 phwt á tốc ộ 8000 vòng/phwt thu °ợc kết tāa. Quá trình trên °ợc lặp l¿i hai lần ể thu °ợc collagen có ộ tinh khiết cao h¡n. Collagen sau ó °ợc thẩm tích trong 24 giß tr°ớc khi tiến hành ơng khơ.

Nm 2022, Rasmi Zakiah Oktarlina và cộng sự ã nghiên cău quy trình trích ly micro-collagen từ vÁy cá chép (Cyprinus carpio). Kết quÁ thu °ợc cho thấy hiệu suất trích ly collagen từ vÁy cá chép là 8,62%, collagen thu °ợc có màu trắng vàng, cấu trwc d¿ng sợi với các liên kết amide A, B, I, II và III. Kích th°ớc cāa micro-collagen trong khoÁng 668 – 1581nm với kích th°ớc chā yếu là 1146 nm [38].

Cũng trong nm 2022, Robert Gál và cộng sự ã nghiên cău quá trình tách collagen từ x°¡ng cāa cá chép sau ó chế t¿o gelatin. Thí nghiệm nghiên cău hai yếu tố cāa quy trình là nồng ộ HCl (t°¡ng ăng 0,5 ; 1,0 và 2,0 % khối l°ợng nguyên liệu) trong quá trình khử khoáng cāa nguyên liệu ban ầu và hàm l°ợng

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

collagen. Tùy thuộc vào các iều kiện, gelatin thu °ợc bằng cách chiết xuất nhiều giai o¿n từ nguyên liệu ban ầu với tổng hiệu suất là 18,7–55,7%. Gelatin thu °ợc có ộ nhớt trung bình thấp (1,1– 4,9 mPa.s) và thích hợp cho một số ăng dÿng trong thực phẩm, d°ợc phẩm và mỹ phẩm [39].

<i>1.1.4.2. à Việt Nam </i>

Trên thế giới, việc trích ly collagen từ da cá ã °ợc nghiên cău từ nm 1990, nh°ng á Việt Nam, ến nay ch°a có cơng trình nghiên cău trích ly collagen °ợc °a vào ăng dÿng. Các nghiên cău gần ây mới chỉ dừng l¿i á quy mơ phịng

<i>thí nghiệm nh°: nghiên cău tách chiết gelatin từ da cá tra (Pangasianodon </i>

<i>hypophthalmus</i>) cāa các tác giÁ Nguyễn Đỗ Quỳnh, Nguyễn Lê Anh Đào, Tr°ßng Đ¿i học Cần Th¡ [40]. Kết quÁ thu °ợc cho thấy da cá °ợc khử 19%N phi protein

cāa gelatin thu °ợc (157,40 g) cao gấp 1,5 lần so với ộ bền gel cāa gelatin từ da cá Trung Quốc (107,2 g). Độ nhớt gelatin từ da cá tra (3,34 cP) cao h¡n ộ nhớt cāa gelatin từ Trung Quốc (1,88 cP).

Trần Thị Huyền và cộng sự, bằng ph°¡ng pháp hóa học ã tách chiết collagen từ da cá tra. Để tng hiệu q cho q trình trích ly collagen, da cá tra °ợc ngâm trong dung dịch NaOH 0,2M (t礃ऀ lệ khối l°ợng/thể tích = 1/10) trong 20 giß, thay dung dịch xử lý 2 giß một lần. Sau ó, xử lý bằng dung dịch acid citric 0,003M (t礃ऀ lệ khối l°ợng/thể tích = 1/8) trong 30 phút. Tiếp tÿc ngâm trong dung dịch acetic acetic acid 0,5M (t礃ऀ lệ khối l°ợng/thể tích = 1/10) trong 34 giß ể trích ly collagen. Dịch chiết °ợc kết tāa bằng dung dịch NaCl 2,5M thu °ợc collagen.

(tính theo % khối l°ợng khơ), hwt n°ớc cāa collagen tng 415%, collagen có nhiệt

kDa, 156 kDa, 217 kDa và 185 kDa [41].

Võ Quốc Vn và Hà Thanh Toàn (2008) ã sử dÿng ph°¡ng pháp hoá học ể

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

chiết tách gelatin từ da cá Tra. Quá trình chiết tách °ợc thực hiện á 50<small>o</small>C trong 3 giß trong dung dịch acetic acid 0,05M. Gelatin thu °ợc có khối l°ợng phân tử nằm trong khoÁng từ 95-138 kDa, chăa 14 lo¿i amino acid, trong ó proline chiếm t礃ऀ lệ cao nhất (13,73%) [42].

Tác giÁ Trần Thanh Nhãn ã sử dÿng enzyme alcalase với nồng ộ 0,05 % ể

Nm 2021, Tr°¡ng Thị Mộng Thu và cộng sự ã nghiên cău iều kiện tiền xử

<i>lý và chiết tách collagen từ da cá lóc (Channa striata) bằng pepsin. Kết quÁ thu °ợc </i>

cho thấy, da cá lóc °ợc xử lý lo¿i lipid bằng cách ngâm trong dung dịch butyl alcohol 10% trong 72 giß. Sau ó, chiết tách collagen °ợc thực hiện với pepsin 0,45% trong 24 giß. Collagen thu °ợc là collagen lo¿i I, có 20 lo¿i acid amin, hịa tan tốt trong khoÁng pH 1 – 4 và dung dịch NaCl từ 0,2 – 0,6M [44].

<i><b>1.1.5. Āng dụng cÿa collagen </b></i>

<i>1.1.5.1. Trong công nghệ thực phẩm </i>

Trong công nghiệp thực phẩm, collagen °ợc dùng ể làm màng bọc kẹo, vỏ bao xwc xích, thực phẩm chăc nng... Collagen °ợc sử dÿng làm bền hệ nhũ t°¡ng cāa xwc xích và gim bơng sẽ làm tng khÁ nng giữ ẩm. Do ó, làm giÁm °ợc hao hÿt khối l°ợng trong suốt quá trình chế biến. Nhß vào cấu trwc có thă bậc cāa collagen ã t¿o cho lớp vỏ ộ bền và ộ ổn ịnh trong suốt quá trình chế biến, tuy nhiên vẫn giữ °ợc ộ mềm cần thiết cho sÁn phẩm hồn thiện. Vỏ bao bằng collagen có nhiều °u iểm h¡n so với màng bao bằng ruột ộng vật nh°: dễ vệ sinh h¡n, dễ dàng bÁo quÁn, chất l°ợng ổn ịnh, dễ dàng t¿o màu sắc... Polyphenol và tanin trong r°ợu bị kết tāa cùng collagen nên °ợc sử dÿng trong nghành công nghiệp ồ uống nh° r°ợu vang giúp lo¿i bỏ các thành phần ộc h¿i [45].

<i>1.1.5.2. Trong y dược </i>

Trong y - d°ợc, do khẳ nng phân hāy, t¿o màng và t¿o gel, collagen °ợc sử dÿng rộng dãi. Collagen còn °ợc sử dÿng nhiều y d°ợc do không gây dị ăng và °ợc hấp thj triệt ể trong c¡ thể; ngồi ra tính t°¡ng thích sinh học cũng nh° khÁ nng cầm máu cāa collagen nên nó có thể °ợc chế t¿o thành những d¿ng bào chế khác nhau. Dựa vào các tính chất trên cāa collagen có thể °ợc ăng dÿng trong các

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

lĩnh vực sau: sÁn xuất thuốc, sÁn xuất vật liệu cầm máu và làm lành vết th°¡ng, máu nhân t¿o, sÁn xuất mơi tr°ßng ni cấy tế bào và mơ.

Có nhiều polyme tự nhiên và nhân t¿o °ợc ăng dÿng nh° là các lo¿i vật liệu sinh học, nh°ng các tính chất cāa collagen khác với các tính chất cāa polyme tổng hợp chā yếu á cách thăc nó t°¡ng tác với c¡ thể. Collagen có tính chất ho¿t ộng bề mặt, có khÁ nng phân hu礃ऀ tốt, có tính kháng ngun yếu và có khÁ nng t°¡ng thích sinh học cao h¡n so với các polyme khác nh° albumin và gelatin [46, 47]. Những ăng dÿng chính cāa collagen trong lĩnh vực y d°ợc làm hệ thống vận chuyển thuốc bao gồm:

+ Màng mỏng collagen: màng collagen có tác dÿng làm màng vận chuyển thuốc, các thành phần thuốc °ợc °a vào các màng nhß liên kết hydro và liên kết cộng hoá trị. Các màng collagen °ợc dùng trong iều trị nhiễm trùng mô, nhiễm trùng giác m¿c…

+ L°ới collagen sử dÿng trong nhãn khoa: l°ới collagen có tác dÿng bÁo vệ biểu mô giác m¿c khỏi ho¿t ộng chớp mắt cāa mí mắt, ồng thßi nó thwc ẩy q trình chữa lành biểu mô sau khi cấy ghép giác m¿c. D°ợc phẩm °ợc vận chuyển phÿ thuộc vào khÁ nng n¿p và giÁi phóng d°ợc phẩm cāa l°ới collagen. L°ới collagen khi °ợc °a vào trong mắt sẽ t¿o ra một lớp dung dịch collagen có khÁ nng t°¡ng thích sinh học và nó có tác dÿng bơi tr¡n bề mặt trong cāa mắt, làm giÁm sự cọ xát cāa mí mắt với giác m¿c, và thwc ấy quá trình lành biểu mơ.

+ Bng, g¿c collagen: Bng g¿c collagen có nhiều °u iểm nh°: (1) Có khÁ nng thấm hwt một l°ợng lớn dịch tiết cāa mơ, bám dính tốt vào vết th°¡ng °ớt do ó bÁo vệ vết th°¡ng khỏi sự lây nhiễm vi sinh vật. (2) G¿c collagen có khÁ nng kết hợp với các thành phần thwc ẩy phát triển tế bào và kết hợp với các hợp chất kháng khuẩn, làm cho quá trình chữa lành vết th°¡ng diễn ra nhanh chóng h¡n. (3) H¡n nữa ể ¿t °ợc hiệu quÁ phÿc hồi nhanh h¡n, g¿c collagen °ợc kết hợp với một số thành phần khác nh°: elastin, fibronectin và glycosaminoglycan…

+ Trong kỹ thuật cây ghép da, collagen °ợc sử dÿng là chất vận chuyển các tế bào da °ợc nuôi cấy hoặc là chất vận chuyển các thành phần thuốc cho quá trình

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

thay thế da và iều trị vết bỏng. Trong kỹ thuật ni cấy da thay thế, màng collagen có tác dÿng thwc ẩy sự phát triển cāa biểu mô.

<i>1.1.5.3. Trong mỹ phẩm </i>

Trong cấu trúc cāa da có ến 70% thành phần là collagen, °ợc phân bố nhiều á lớp h¿ bì. Collagen óng vai trị trong việc t¿o hệ thống nâng ỡ, tng c°ßng các ặc tính c¡ học cāa da nh° ộ àn hồi, săc cng, ộ mịn cāa da và ộ ẩm cāa da... Khi số l°ợng, chất l°ợng và hàm l°ợng collagen bị suy giÁm dẫn ến giÁm ộ àn hồi, ộ cng mịn cāa da và khÁ nng giữ ẩm cāa da… Ngoài 30 tuổi, tốc ộ tổng hợp collagen giÁm và tng q trình lão hóa, phân hāy cāa collagen. Hàng nm, trung bình l°ợng collagen trong c¡ thể bị tổn hao khoÁng 1,5 %. Hàm l°ợng collagen mất i làm thay ổi các °ßng nét trên khn mặt, làn da bị chÁy nhão, trùng xuống và xuất hiện các nếp nhn. Vì vậy, bổ sung collagen th°ßng xuyên giúp cÁi thiện cấu trúc cāa da, phÿc hồi tế bào tổn th°¡ng, tng khÁ nng giữ ẩm và kích thích tái t¿o làn da. Do ó, collagen là thành phần chính cāa các sÁn phẩm làm ẹp nh°: kem d°ỡng, mặt n¿ collagen, sữa tắm… Collagen °ợc sử dÿng làm thuốc tiêm cng da, và °ợc FDA (Cÿc quÁn lý Thực phẩm và D°ợc phẩm Hoa Kỳ) chăng nhận và cho phép tiêm vào các nếp nhng, vết sẹo trong iều trị thẩm mỹ. Thuốc tiêm chăa collagen °ợc tiêm vào lớp h¿ bì giúp iều chỉnh các nếp gấp, nếp nhn giúp khôi phÿc l¿i vẻ bề ngồi mềm m¿i, cng mịn và trẻ hóa làn da. Thuốc tiêm collagen có tác dÿng trong 1 – 2 nm do collagen cũng bị c¡ thể hấp thu [56].

<i><b>1.2.1. Cấu t¿o và cấu trúc phân tử carrageenan </b></i>

<i>1.2.1.1. Thành phần, cấu t¿o và cấu trúc phân tử carrageenan </i>

<i>từ rêu Irish moss (Loài rong ỏ Chondrus crispus) t¿i một ngơi làng trên bß biển </i>

cấu trwc hóa học cāa Car °ợc ẩy m¿nh. Hiện nay, sÁn xuất Car với quy mô công

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<i>nghiệp °ợc má rộng, mà nguồn rong ỏ thuộc ngành Rhodophyta sử dÿng phổ </i>

biến h¡n. Những lồi này gọi chung là Carrageenophyt. Từ nhiều cơng trình nghiên cău, ã có hàng chÿc lồi rong biển °ợc khai thác tự nhiên hay nuôi trồng ể sÁn xuất Car.

gắn vào Car á các vị trí với số l°ợng khác nhau. Vì vậy, Car không chỉ là một

cấu trwc riêng và °ợc ký hiệu riêng. Nh°: ẵ-, ắ-, -, ẳ-Car (Hỡnh 1.7) [48].

Car trong ni bào và thành tế bào rong biển, Car là một polysaccharit cao phân tử với hàm l°ợng este-sulfate từ 15% - 40%. Với các ¡n vị mắt xích c¡ bÁn

glycosid và ³-(1,3), các ¡n vị này ều có thể °ợc hoặc khơng °ợc sulfat hóa. Số l°ợng và vị trí nhóm este sulfat cũng nh° hàm l°ợng 3,6-AG là nguyên nhân gây kên sự khác nhau gia cỏc ẵ-, ắ-, -, ẳ-Car. ẵ-Car cú lng este sulfat từ 25% ến 30% và khoÁng 28% ến 35% l°ợng 3,6-AG. ¼-Car có l°ợng este sulfat từ 28% ến 30% và l°ợng 3,6-AG từ 25% ến 30%. ¾-Car có l°ợng este sulfat trong khng 32% ến 39% và khơng có 3,6-AG [48]. Hàm l°ợng este sulfat lớn làm nhiệt ộ hòa tan thấp và ộ bền gel thấp [49].

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

<i><b>Hknh 1.7. Cấu trwc phân tử và sự chuyển hóa trong mơi tr°ßng kiềm cāa các lo¿i </b></i>

carrageenan khác nhau

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

<i>1.2.1.2. Phân lo¿i carrageenan </i>

Dựa theo cấu trúc carrageenan °ợc chia thành các lo¿i [48]:

<b>¼-Car: Là một lo¿i polymer m¿ch ngắn có sự xen kẽ giữa </b>

D-galactose-4-sulphate và 3,6–AG. Cấu trwc phân tử ½-carrageenan là một vịng chuỗi xoắn kép bậc 3 (Hình 1.8).

<i><b>Hình 1.8.</b></i> Cấu trúc cāa ½-Car

<b>»-Car: Gống nh° ½-Car nh°ng gốc 3,6-AG l¿i á vị trí cacbon số 2. ¼-Car có </b>

cấu trúc vịng xoắn kép bậc 2. Gel ¼-Car có tính àn hồi tốt (Hình 1.9).

<i><b>Hình 1.9.</b></i> Cấu trúc cāa ¼-carrageenan Car

<i><b>Hình 1.10.</b></i> Cấu trúc cāa ¾-carrageenan Car

<i>1.2.1.3. Tính chất của carrageenan </i>

Các lo¿i carrageenan khác nhau có các tính chất khác nhau nh°: ộ tan; tính t¿o gel và t¿o ộ nhớt cāa dung dịch; khÁ nng liên kết với protein cũng nh° liên kết với các polysaccarid khác. Do vậy, á các tr¿ng thái khác nhau, carrageenan có những tính chất khác nhau ặc tr°ng cho từng d¿ng sÁn phẩm.

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

* <i>Độ tan </i>

cāa gel. Độ tan cāa Car phÿ thuộc vào số l°ợng, số lo¿i các ion trong cấu trúc và nồng ộ dung dịch Car.

Trong n°ớc l¿nh, chỉ có ¾-Car và mui sodium ca ẵ- v ẳ-Car l b hũa tan. Mui potassium v calci ca ẵ- v ẳ-Car khụng tan, khÁ nng tr°¡ng ná cāa car phÿ thuộc vào theo nồng ộ và kiểu cation có mặt trong n°ớc. Trong n°ớc l¿nh khi có

này sau khi làm l¿nh ều hình thành gel. Độ chắc cāa gel và tính ồng nhất cāa

nh° chất t¿o gel và làm ặc dung dịch sữa l¿nh khi có mặt cāa gốc photphat

ẳ- v ắ-Car hũa tan trong dung dch muối NaCl 10% có sự gia nhiệt. ½-Car khơng hòa tan trong dung dịch này [50].

* <i>Độ nhớt </i>

Độ nhớt cāa dung dịch Car xác ịnh °ợc khi dung dịch Car không t¿o gel. Khi dung dịch Car thay ổi nhiệt ộ từ cao xuống thấp sẽ làm tng ộ nhớt ến khi xuất hiện gel. Độ nhớt tng khi bắt ầu hình thành gel. Vì vậy, quá trình o ộ nhớt cāa dung dịch Car °ợc tiến hành á nhiệt ộ cao (75,0ºC) ể tránh sự

Độ nhớt dung dịch Car phÿ thuộc vào nhiệt ộ, nồng ộ và sự xuất hiện cāa ion khác trong dung dịch, khối l°ợng và lo¿i Car [56]. Độ nhớt tng khi nồng ộ dung dịch Car tng hoặc khối l°ợng phân tử Car lớn. Độ nhớt dung dịch Car giÁm khi tng nhiệt ộ và ng°ợc l¿i [50].

Dung dịch Car có ộ nhớt thấp nên dễ dàng xử lý [51]. Do gel n°ớc ½-Car khơng á d¿ng thixotrovân phổ. Khi ½-Car °ợc sử dÿng trong sữa với nồng ộ nhỏ, chwng có ặc tính t°¡ng tự ¼-Car trong n°ớc. Vì vậy, gel yếu °ợc t¿o bái hỗn hợp

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

protein sữa và ½-Car dễ bị phá vỡ khi có lực tác ộng, khi ó chế ộ chÁy cāa gel trá thành giÁ dẻo. Khi lực tác ộng giÁm, gel tái hình thành và chế ộ chÁy l¿i trá về bÁn chất tự nhiên là thixotropic.

<i>* T¿o gel </i>

Khi làm l¿nh, dung dịch ½-, ¼-Car t¿o thành gel. Hiện t°ợng này phÿ thuộc vào cấu trúc xoắn ôi cāa Car. à nhiệt ộ lớn h¡n nhiệt ộ chÁy lỏng cāa gel, Car tồn t¿i á tr¿ng thái cuộn ngẫu nhiên trong dung dịch. Khi h¿ nhiệt ộ dung dịch, hình thành cấu trúc khơng gian 3 chiều, hình thành các iểm xoắn ôi t¿i iểm giao nhau cāa chuỗi polyme. Khi h¿ nhiệt ộ xuống d°ới nhiệt ộ nóng chÁy sẽ t¿o iều kiện cho các mắt xích cāa Car ính kết ể t¿o gel với cấu trúc 3 chiều. Sự xuất hiện cāa liên kết trong cấu trúc cũng nh° kiểu, số l°ợng và vị trí nhóm este sulfat sẽ Ánh h°áng ến tính t¿o gel cāa Car. C¡ chế gel hóa c¡ bÁn dựa trên dung dch ẵ- v ẳ-Car.

ti c tớnh ca ắ-Car (Hình 1.11) [52].

<i><b>Hình 1.11. </b></i>Gel carrageenan với Ca<small>2+</small>

Các cation tng c°ßng sự gel hóa cāa Car, giúp ổn ịnh cấu trúc xoắn cāa Car thơng qua việc chặn/khóa nhóm sulfat, ngồi ra các cation có thể tham gia liên kết phối trí giữa các phân tử [53].

phÿ thuốc vào nồng ộ KCl, khi tng nồng ộ KCl làm tng ộ căng cāa gel ½-Car.

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

½-Car tinh khiết hình thành gel yếu á nồng ộ từ 0,7 – 1,4%. Khi có mắt ồng thßi 2

Độ àn hồi cāa gel Car là do số l°ợng nhóm sulfat thấ [55], do nhóm sulfat khơng t¿o cấu trúc lập thể, do vậy q trình chuyển hóa cấu trúc cāa Car bị dừng l¿i

khÁ nng ông ặc. Độ chắc gel t礃ऀ lệ thuận với nồng ộ Car và ion trong dung dịch. Gel °ợc hình thành d¿ng gel nhiệt khơi phÿc và có ít sự biến ổi khichúng tham

có thể °ợc ánh giá thơng qua mơ un àn hồi. Mô un àn hồi tng khi tng nồng ộ Car [57, 58].

<i><b>1.2.2. Tình hình nghiên cāu sÁn xuất carrageenan </b></i>

<i>1.2.2.1. Trên thế giới </i>

Để thu °ợc Car, rong biển °ợc chiết xuất bằng cách sử dÿng n°ớc nóng

chất và sấy khơ, ngâm trong dung dịch kiềm (3–10%) un á nhiệt ộ cao (70–100

tiền chất cāa carrageenan. Sau khi chiết kiềm, hàm l°ợng sulfat sẽ giÁm [60]. Vì lý do này việc chiết xuất Car bằng kiềm gọi là khử l°u huỳnh.

Chiết xuất Car cũng có thể thực hiện bằng n°ớc nóng. So với chiết xuất kiềm, ph°¡ng pháp n°ớc nóng cho hiệu suất cao h¡n [61]. Nh°ợc iểm, ộ bền gel °ợc t¿o ra bái nhiệt ộ nóng n°ớc thấp h¡n so với sử dÿng dung dịch kiềm. Độ bền gel thấp h¡n do hàm l°ợng sunfat cao h¡n và hàm l°ợng 3,6-AG thấp h¡n so với trong chiết kiềm. Vì lý do này, chiết kiềm th°ßng °ợc sử dÿng trong quy mơ cơng nghiệp Car.

Andi Hasiah và các cộng sự ã chiết xuất Car từ Eucheuma spinosum bằng cách sử dÿng nhiệt iện trá. Kết quÁ cho thấy hiệu suất chiết thay ổi từ 29,6-62,4%

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

với ộ nhớt và ộ bền gel thay ổi lần l°ợt từ 259-290 cP và 42,54-70,41 g/cm<small>2</small>.

cP) ¿t °ợc á nhiệt ộ chiết xuất 95 °C, thßi gian chiết 240 phút, nồng ộ KOH 0,4M, t礃ऀ lệ dung dịch so với rong biển là 45/1 [61].

Tr°ớc ó, Webber và cộng sự cũng nghiên cău ể tối °u hóa q trình chiết tách Car từ rong bằng ph°¡ng pháp bề mặt áp ăng. Nghiên cău xác ịnh °ợc iều kiện chiết xuất tối °u là 74°C trong 4 giß, hiệu suất chiết tách carrageenan là

Car chiết xuất từ Kappaphycus alvarezii ã °ợc Anisuzzaman và cộng sự nghiên cău. Rong biển °ợc xử lý kiềm và sử dÿng kỹ thuật phun sấy ể thu °ợc bột Car. Quy trình chiết tối °u cho kỹ thuật sấy phun cho kết quÁ á nồng ộ KOH 6,70% và thßi gian chiết 74,70 phút. à iều kiện tối °u, ộ nhớt cāa gel là 111,80 cP và kích th°ớc h¿t cāa bột là 86,88 ¿m. Độ bền cāa gel °ợc tối °u hóa á măc

Trong số các nghiên cău về ph°¡ng pháp chiết xuất Car thì ph°¡ng pháp xử lý bằng enzyme cho nhiều hăa hẹn h¡n và thân thiện với mơi tr°ßng [64]. Mặc dù cơng nghệ này có tiềm nng °ợc sử dÿng á quy mơ cơng nghiệp nh°ng có rất ít thay ổi trong việc sử dÿng enzyme ể sÁn xuất Car từ rong biển. Enzyme cellulase là một trong những enzyme °ợc sử dÿng rộng rãi nhất ể chiết xuất carrageenan.

ph°¡ng pháp un sôi ¿t hiệu suất 37,5% [65]. Enzyme xenluloze °ợc thêm vào

trong 1 giß. Các huyền phù °ợc ly tâm tách lấy các chất nổi trên bề mặt và cho vào

cao vì cellulose là thành phần chính cāa thành tế bào rong biển. Endo-cellulase, exo-cellulase và ³ -glucosidase là ba lo¿i enzyme cellulose chính và q trình thāy phân hồn tồn các vi sợi cellulose trong thành tế bào có thể °ợc thực hiện bằng cách kết hợp ba lo¿i enzyme này [66].

Gần ây, nhằm giÁm thiểu việc sử dÿng hóa chất các nghiên cău về ph°¡ng pháp sử dÿng ít dung mơi h¡n, tốn ít nng l°ợng và thßi gian chiết xuất

</div>