ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (FALLOPIA MULTIFLORA)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.12 MB, 51 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ - HÓA - SINH

------

TRẦN THỊ KIM QUỲNH

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG

INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Quảng Nam, tháng 05 năm 2018

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ - HÓA - SINH

------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Tên đề tài: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ

TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora)

Sinh viên thực hiện

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác.

Tác giả

Trần Thị Kim Quỳnh

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức lý thuyết cũng như thực hành thí nghiệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Th.S Hồ Thị Kim Cúc, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị làm việc tại Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam – nơi tôi thực hiện đề tài đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, động viên tôi trong suốt quá trình làm khóa luận.

Cuối cùng tơi gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, ln động viên và khích lệ tơi để tôi đạt được kết quả tốt nhất.

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Tác giả

Trần Thị Kim Quỳnh

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

2,4-D 2,4 – Diclorophenoxy Acetic Acid

CT Công thức

MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog (1962)

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Các công thức môi trường khảo sát sự ảnh hưởng của Javen đối với mẫu khử

20

2.2 Công thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp

21

2.3 Công thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

21

2.4 Công thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ

22

3.1 Kết quả sử dụng Javen để khử trùng mẫu cấy 25 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả

năng tái sinh chồi trực tiếp

27

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

29

3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ

32

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp

28

3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

30

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ 32

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC HÌNH ẢNH

3.4 Kết quả khảo sát nồng độ BA và NAA trong môi trường nhân nhanh chồi

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

MỤC LỤC

I. MỞ ĐẦU ... 1

1.1 Lý do chọn đề tài ... 1

1.2. Mục tiêu của đề tài ... 2

1.3. Đối tượng nghiên cứu... 2

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu... 2

1.3.2. Địa điểm nghiên cứu ... 2

1.3.3. Thời gian nghiên cứu ... 2

II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ... 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

1.1. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ... 3

1.1.1. Khái niệm ... 3

1.1.2. Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật ... 3

1.1.3. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô ... 3

1.1.4. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng ... 4

1.1.4.1. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng trên thế giới ... 4

1.1.4.2 . Sơ lược lịch sử phát triển nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Việt Nam ... 6

1.1.5. Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro cây dược liệu ... 8

1.2. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ ... 10

1.2.1. Tên khoa học ... 10

1.2.2. Nguồn gốc và phân bố... 10

1.2.3. Phân loại ... 10

1.2.4. Đặc điểm hình thái ... 11

1.2.5. Đặc điểm sinh thái ... 12

1.2.6. Thành phần hóa học trong cây Hà thủ ơ đỏ ... 12

1.2.7. Giá trị dược liệu của cây Hà thủ ơ đỏ ... 13

1.2.8. Tình hình nghiên cứu về kĩ thuật nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ. ... 14

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 16

2.1. Vật liệu nghiên cứu ... 16

2.1.1. Nguyên liệu khởi đầu ... 16

2.1.3. Hóa chất ... 16

2.1.4. Điều kiện nuôi cấy ... 16

2.1.5. Môi trường nuôi cấy ... 17

2.2. Quy trình nhân giống ... 19

2.3. Phương pháp nghiên cứu ... 20

2.3.1. Phương pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy ... 20

2.3.1.1. Phương pháp chọn mẫu cấy ... 20

2.3.1.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ Javen đối với mẫu khử ... 20

2.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 24

3.1 Khảo sát nồng độ javen trong khử trùng mẫu cấy ... 24

3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của BA trong môi trường tái sinh chồi trực tiếp ... 25

3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA trong môi trường nhân nhanh chồi ... 27

3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IBA trong môi trường ra rễ ... 30

III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ... 33

3.1 Kết luận ... 33

3.2 Kiến nghị ... 33

IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 34

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

I. MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những ngành khoa học cơng nghệ có triển vọng nhất hiện nay. Nuôi cấy mô tế bào thực vật tổng hợp những kĩ thuật được sử dụng để duy trì và ni cấy các tế bào, mơ hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng, môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần xác định. Các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo ra lợi thế nhất định so với phương pháp truyền thống như: tạo ra số lượng lớn cây giống từ bất kì bộ phận nào của cây, hạn chế tối đa khả năng phát tán sâu bệnh, bảo tồn các nguồn gen thực vật quý hiếm.[3]

Thảo dược là nguồn thực vật quý giá để sản xuất và chế biến các loại thuốc hữu ích phục vụ việc chữa bệnh và phục hồi sức khỏe cho con người. Vì vậy, nhu cầu trồng trọt các giống dược liệu quý hiếm ngày càng tăng lên. Xuất phát từ nhu cầu đó việc ứng dụng cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật cung cấp các giống dược liệu cho nông dân đang trở thành xu hướng phát triển ở nhiều tỉnh thành trong cả nước.[4]

Hà Thủ Ơ đỏ có vị chát, ngọt, đắng, tính hơi ấm. Theo Đơng y, Hà Thủ Ơ đỏ có tác dụng làm đen tóc, bổ máu, an thần, dưỡng can, ích thận, nhuận tràng và kéo dài tuổi thọ. Y học hiện đại xác nhận rằng hà thủ ơ đỏ có tác dụng hạ huyết áp, chống xơ cứng động mạch, làm giảm lượng đường trong máu, tăng cường miễn dịch, máu, làm giãn mạch máu, tốt cho tim mạch, thúc đẩy chức năng tuyến thượng thận, và thúc đẩy nhu động đường tiêu hóa, bảo vệ tim và mạch máu não, bảo vệ gan, tăng trưởng tóc, chống lão hóa, và kháng khuẩn. Trong cây Hà thủ ô đỏ có một số hợp chất quan trọng như: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin… [4]

Trước đây, nguồn Hà thủ ô đỏ tự nhiên ở nước ta khá dồi dào nhưng do bị khai thác quá mức và nạn phá rừng đã làm cho số lượng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút đáng kể, không cung cấp đủ cho việc sản xuất và chế biến các loại thuốc để chữa bệnh cho con người. Do đó, việc nhân nhanh Hà thủ ơ đỏ với số lượng lớn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào là việc làm hết sức cần thiết.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Xuất phát từ lí do trên, tơi thực hiện đề tài: “ Ứng dụng công nghệ nuôi

cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia

multiflora)”.

1.2. Mục tiêu của đề tài

- Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ Javen trong khử trùng mẫu Hà thủ ô đỏ.

- Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến tái sinh chồi trực tiếp Hà thủ ô đỏ. - Khảo sát tìm ra mơi trường có nồng độ BA và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Hà thủ ơ đỏ.

- Khảo sát tìm ra mơi trường có nồng độ IBA thích hợp cho nuôi cấy tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ.

1.3. Đối tượng nghiên cứu

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu

Cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam.

1.3.2. Địa điểm nghiên cứu

Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam.

1.3.3. Thời gian nghiên cứu

Đề tài được nghiên cứu thừ tháng 11/2017 – 3/2018.

1.4. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thực nghiệm

- Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu tài liệu, sách, báo, internet… - Phương pháp thống kê và xử lí số liệu.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1. Khái niệm

Kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là

thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hịa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vơ trùng.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai ngun tắc: Dựa vào tính tồn năng của tế bào.

Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa.[8]

1.1.2. Vai trị của nhân giống in vitro ở thực vật

Nhân giống in vitro ở thực vật có ý nghĩa và vai trò to lớn đối với việc

nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời góp phần trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống.

Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn về việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống, thực tế đã cho phép nuôi cấy các mô phân sinh, mơ sẹo của cây có thể kích thích tái sinh thành cây hồn chỉnh. Từ đó, phương pháp nhân giống nuôi cấy mô được sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý, có giá

trị kinh tế cao. Nhân giống in vitro ở thực vật giúp sản xuất số lượng lớn các cây

giống cần thiết phục vụ cho nhu cầu hàng ngày của con người cũng như trong

nông nghiệp, y học. Việc nhân giống in vitro ở thực vật đã mở ra một thời kỳ mới

cho ngành nông nghiệp của thế giới, một hướng đi hoàn toàn mới mẻ và hiện đại.[3]

1.1.3. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như:

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

4 Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuôi cấy tế bào trần).

Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong cơng nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp.

Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngồi đồng ruộng (ni cấy tế bào đơn).

Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn). Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại. Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.

Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử. Nuôi cấy quang tự dưỡng.[16]

1.1.4. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng

1.1.4.1. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống

cây trồng trên thế giới

Cuối thế kỉ 19, nhà khoa học người Đức Haberlandt (1982) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kì cơ thể sinh vật nào đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền của cả sinh vật đó. Vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hồn chỉnh.[3]

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White người Mỹ nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với một mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose, và nước chiết nấm men. Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinicaxit. Từ đó việc ni cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau.[6]

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

5 Năm 1941, Overbeck ở Mỹ chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Datura). Sau đó năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt, trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành cơng. [3]

Trong thời gian từ 1954 - 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách đưa lắc trên máy lắc. Nickell (1956) nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu.[12]

Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo tế bào cà rốt khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phơi bình thường ở cà rốt, lúc này tính tồn năng của tế bào càng được khẳng định.[17]

Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính tồn năng của tế bào đã được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phơi. Ngày nay, bằng kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả…Việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới.

Vào đầu những năm 1960, Morel là người đầu tiên áp dụng thành công kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống lan trong ống nghiệm. Morel và Martin (1952) đã tạo được cây Thược dược sạch virut bằng cách dùng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy. Năm 1960, Cooking ở đại học Nottingham (Anh) cơng bố có thể dùng men cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thưc vật, kết quả thu được các tế bào trịn, khơng có vỏ bọc gọi là protoplast. Từ năm 1980 - 1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật được công bố. Nhờ có plasmid, phân tử AND vịng thường có trong tế bào vi khuẩn được

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

6 lắp ghép cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gen xác định đã thực hiện thành cơng hàng loạt cơng trình chuyển gen ngoại lai vào thực vật.[7]

Việc ứng dụng nuôi cấy mô ở thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách của cây nho và cây khoai tây đem nuôi cấy và cấy truyền nhiều lần trong ống nghiệm. Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mơ lớn khơng cịn hạn chế ở cây cảnh mà đã được thực hiện ở quy mô thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả, cây cảnh…Và có những đóng góp to lớn cho nơng nghiệp thế giới.[14]

Hiện nay, rất nhiều loài hoa như: hoa Lan, Cúc, Đồng tiền…và các loài cây cảnh có giá trị khác cũng được nhân giống theo phương pháp ni cấy mơ. Hiện có khoảng 30 chi phong lan được nhân giống phổ biến theo con đường nuôi cấy mô. Ở Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan…việc nhân giống theo con đường này đã trở nên rất phổ biến trên các đối tượng là hoa nhằm mục đích thương mại, điển hình như:

Hà Lan là quốc gia có lĩnh vực ni cấy mơ tế bào thực vật rất phát triển, nước này đã ứng dụng lĩnh vực này vào việc nhân và lai tạo giống cây trồng mới đặc biệt là các loài hoa với đa dạng về chủng loại và màu sắc.

Thái Lan đã sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân tạo các loại giống hoa Phong Lan rất thành công.[12]

1.1.4.2 . Sơ lược lịch sử phát triển nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Việt Nam

Việc nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam chỉ mới bắt đầu từ năm 1975. Ý thức được triển vọng to lớn của ngành công nghệ sinh học trong chọn giống và nhân giống cây trồng bắt đầu ứng dụng công nghệ này.

Trong những năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam cũng đã đạt được những thành tựu nhất định, có rất nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phịng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bước đầu đã nhân giống thành

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

7 cơng một số lồi hoa như: Cúc, Đồng tiền, Lan, Hồng…có hệ số nhân giống cao và cây con có chất lượng tốt.

Năm 2008 ở nước ta cơng nghệ ni cấy mơ đã có những bước đột phá mới. Một số địa phương nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô để thương mại, ngồi ra cịn khơi phục nhiều lồi thực vật có nguy cơ tuyệt chủng như các loài lan rừng quý hiếm (Lan Hài Hồng) tại phân viên sinh học Đà Lạt.

Đà Lạt là địa phương có lĩnh vực ni cấy mơ tế bào phát triển rất mạnh. Việc lai tạo giống thông qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào được phổ biến khá rộng rãi. Tại đây các cơ sở nuôi cấy mô của nhà nước và tư nhân đều phát triển mạnh và nuôi cấy rất nhiều giống cây khác nhau, trong đó chủ yếu là các loại hoa, hầu như nông dân trồng hoa ở Lâm Đồng đều sử dụng cây con giống từ cây nuôi cấy mô và đã trồng hoa với các kĩ thuật mới nên đem lại lợi nhuận kinh tế rất cao.[10]

Tại những tỉnh thành khác của cả nước cũng đã tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm các giống cây bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào và bước đầu thu được một số kết quả đáng kể, cụ thể như:

Phịng ni cấy mô của trung tâm giống và kĩ thuật cây trồng tỉnh Phú Yên hằng năm có thể tạo ra hơn 100.000 cây chuối cấy mô theo yêu cầu của khách hàng.

Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học và Công nghệ Lạng Sơn hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống bạch đàn nuôi cấy mô.

Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ khoa học công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành công việc nhân giống cây Lô Hội bằng phương pháp nuôi cấy mô đây là một loại dược liệu quý của địa phương.

Viện sinh học Nông nghiệp của trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội là một trong 50 cơ sở chuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật, bước đầu cơ sở này đạt được những kết quả tốt như ni cấy các lồi Phong Lan, Dứa Cayen, khoai tây sạch bệnh, đặc biệt là các lồi hoa có giá trị (Lan, Đồng tiền, Cúc…). Hầu hết các phịng ni cấy mơ đều có ưu thế là có sản phẩm đầu ra liên tục và ổn định.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

8 Hiện nay công nghệ sinh học tế bào ở Hà Nội đang có bước phát triển nhảy vọt để phục vụ cho nền nông nghiệp.

Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ tỉnh Bình Định ln đẩy mạnh việc triển khai ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học về nuôi cấy mô thực vật để nhân giống phục vụ công tác giống cây trồng tại địa phương. Trung tâm đã nghiên cứu và hồn thiện được nhiều quy trình vi nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô các giống cây ăn quả, cây công nghiệp, cây hoa cảnh có giá trị kinh tế cao, phù hợp với điều kiện lập địa ở Bình Định và các tỉnh vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên như: chuối, đu đủ, dứa, mía, bạch đàn, keo lai…và một số loại Phong Lan (Dendrobium, hồ điệp ngọc điểm), lay ơn, hoa cúc, hoa huệ, đồng tiền…

So với các nước phát triển trên thế giới, cơng nghệ sinh học của Việt Nam cịn một khoảng cách khá xa. Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật được áp dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lí luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam đã thốt khỏi giai đoạn phơi thai của nó, đang phát triển có những đóng góp tích cực vào lí luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn phát triển ngành Nông – Lâm nghiệp của nước nhà. [9]

1.1.5. Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro cây dược liệu

* Một số nghiên cứu trên thế giới:

Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành cơng lồi lan Kim Tuyến

( Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là:

1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Mơi trường được sử dụng để nhân chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA [1]. Năm 2002, Tsay và cs đã cắt các mắt đốt thân lấy từ

cây Anoectochilus formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng

dung tích 500 ml + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 2% than hoạt tính [11]. * Một số nghiên cứu trong nước:

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

9 Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đưa ra quy trình nhân giống in vitro

thành cơng cho lồi lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban

đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu ban đầu là H3 ( Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1 mg/l BAP (hoặc 1-2 mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính [1]. Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành đã thành công quy trình nhân giống lồi lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô [4].

Năm 2010, Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư đã nghiên cứu nhân giống

in vitro cây Ba Kích ( Morinda Officinalis How) với mơi trường tái sinh chồi in

vitro là MS có bổ sung 0,25 mg/L KIN. Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: MS bổ sung 3,5 mg/L BA và 0,2 mg/L IBA (với 15,00 chồi/ mẫu cấy). Chồi được tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2 - 0,25 mg/L IBA. Cây in vitro đưa ra nhà lưới đạt 97,9% cây sống sót và sinh trưởng tốt sau 30 ngày tuổi trồng trên cơ chất đất cát pha [1].

Năm 2014, Lê Tiến Vinh và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Đan

Sâm (Salvia Miltiorrhiza Bunge) từ hạt với tỉ lệ nảy mầm sau 2 tuần nuôi cấy là

40,43% trên môi trường cơ bản MS + 1,0 mg/L GA3. Đoạn thân từ cây đan sâm nảy mầm được sử dụng làm vật liệu nhân nhanh, môi trường nhân chồi tốt nhất là MS + 0,5mg/L BA với hệ số nhân chồi đạt cao nhất(5,05 chồi/mẫu cấy). Mơi trường ra rễ thích hợp nhất là mơi trường MS có bổ sung 0,75 mg/L IAA, cho tỉ lệ ra rễ đạt 100%, cây in vitro trên môi trường ra rễ 30 ngày là thích hợp để chuyển cây ra ngồi vườn ươm thích nghi. Trên giá thể chứa 50% xơ dừa và 50% cát tỉ lệ cây sống đạt 100%, cây sinh trưởng và phát triển tốt [18].

Bùi Văn Thắng và cs đã nghiên cứu thành cơng quy trình nhân giống cây

Đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. F. Et Thomson) bằng kỹ thuật

nuôi cấy mô, cảm ứng tạo cụm chồi trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L kinetin + 0,2 mg/L NAA cho hệ số nhân chồi 16,55 lần/chu kỳ nhân (3 tuần), tỉ lệ chồi hữu hiệu là 91,09%. Chồi ra rễ khi nuôi trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/L IBA, 20 g/L sucrose và 7 g/L agar với tỉ lệ chồi ra rễ là 100%, số rễ 6,17

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

10 rễ/cây, chiều cao trung bình 1,07 cm. Cây Đảng sâm con in vitro hoàn chỉnh sinh trưởng và phát triển tốt sau 4 tuần trồng trên giá thể 100% cát vàng cho tỉ lệ sống 98,89% [11].

Phan Thị Thảo Nhi (2016) đã nghiên cứu thành cơng quy trình nhân giống cây đinh lăng ni cấy mô bằng con đường trực tiếp từ phôi soma, môi trường nhân nhanh chồi là MS bổ sung 3 mg/L BAP.

1.2. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ

1.2.1. Tên khoa học

- Bộ (ordo): Cẩm chướng (Caryophyllales)

- Họ (familia): Rau răm (Polygonaceae)

- Chi (genus): Fallopia

- Loài ( species): F. multiflora[21]

1.2.2. Nguồn gốc và phân bố

Hà thủ ơ đỏ được tìm thấy ở Trung Quốc vào năm 713. Trên thế giới, Hà thủ ô đỏ có nhiều ở Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây Hà thủ ô đỏ phân bố chủ yếu ở vùng núi phía Bắc như: Hà Giang, Lào Cai, Thanh Hóa, Nghệ An… Hiện nay, Hà Thủ Ơ Đỏ được trồng ở nhiều vùng ở phía Bắc và cả ở phía Nam, cây mọc tốt ở Lâm Đồng, Đắk Lắk, Phú Yên, Bình Định.[1]

1.2.3. Phân loại

Hà thủ ô chia làm 2 loại là hà thủ ô đỏ và Hà thủ ô trắng.

Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas): là cây thảo thuộc dạng cây leo,

dài đến 2m hoặc hơn, thân màu nâu đỏ có nhiều lơng, càng non càng nhiều lông. Lá mọc đối, mép nguyên, gân lá hình lơng chim, có nhiều lơng. Lá mọc đối, mép ngun lá hình lơng chim, có nhiều lơng. Tồn cây có nhựa mủ trắng hay cịn gọi là hà thủ ô nhựa trắng. Hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tím, mọc thành xim ngắn. Quả hình thoi. Cây thường mọc hoang ở vùng đồi núi.

Hà thủ ơ đỏ (Fallopia multiflora): cịn có tên là dạ giao đằng, dạ hợp, địa

tinh, khua lình (dân tộc Thái), mằn năng ón. Trong y học điều trị bệnh, Hà thủ ô đỏ được dùng nhiều và thông dụng hơn hẳn so với hà thủ ô trắng bởi hàm lượng

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

11 hoạt chất điều trị bệnh có trong Hà thủ ơ đỏ là cao hơn, giúp cho khả năng điều trị bệnh của Hà thủ ô đỏ tốt hơn hẳn. Hà thủ ơ trắng cũng có cơng dụng tốt, tuy nhiên so với Hà thủ ơ đỏ thì nó khơng được nổi trội bằng. Cả hai loại này đều là loại cây có thân leo dạng dây nhỏ, sống lâu năm và thường mọc đan xen lẫn vào những cây khác. Đặc tính của Hà thủ ơ đỏ thường có vị chát, ngọt, đắng, tính hơi ấm, mùi đặc trưng giúp phân biệt loại cây thuốc này.

Đặc điểm bên ngồi khó nhận biết bởi Hà thủ ô đỏ vàHhà thủ ô trắng rất giống nhau. Tên gọi phân biệt là ở màu sắc của ruột củ Hà thủ ô. Củ Hà thủ ô trắng có ruột màu trắng trong khi ruột của củ Hà thủ ô đỏ là màu đỏ.

Về cơng dụng thì chúng khác nhau rất nhiều, nếu Hà thủ ô đỏ được nhiều người sử dụng bởi cơng dụng của nó đối với người sử dụng tốt hơn nhiều so với Hà thủ ô trắng.[4]

1.2.4. Đặc điểm hình thái

Hình 1.2 Cây Hà Thủ ô đỏ Hình 1.3. Củ Hà thủ ô đỏ Hà thủ ơ đỏ có dạng dây leo, sống nhiều năm. Thân rễ phồng thành củ. Thân quấn, mọc xoắn vào nhau, mặt ngồi thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân. Lá mọc so le, có cuống dài. Phiến lá hình tim, dài 4 – 8cm, rộng 2,5 – 5cm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hai mặt đều nhẵn. Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân. Hoa tự chùm nhiều nhánh. Hoa nhỏ, đường kính 2mm, mọc cách xa nhau ở kẽ những lá bắc ngắn, mỏng. Bao hoa màu trắng, 8 nhụy (trong số đó có 3 nhụy hơi dài hơn). Bầu hoa có 3 cạnh, 3 vịi ngắn rời nhau. Đầu nhụy hình mào gà rủ xuống. Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa cịn lại, 3 bộ phận ngồi của bao hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng, nguyên.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

12 Đặc điểm hình thái rễ củ: hình trịn, dài, khơng đều. Mặt ngồi có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành. Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ và có vị chát [1].

1.2.5. Đặc điểm sinh thái

Hà thủ ơ đỏ là cây ưa khí hậu ẩm mát của vùng nhiệt đới và nhiệt đới núi cao, cây ưa sáng và có thể chịu bóng, nơi mọc thích hợp nhất là quần hệ rừng núi đá vôi với độ cao dưới 1700m.

Nhiệt độ : Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây Hà thủ ô đỏ. Hà thủ ô đỏ là cây mọc hoang ở những vùng có khí hậu mát mẻ quanh năm. Nhiệt độ thích hợp là 18 - 250C. Ở miền núi, có năm nhiệt độ xuống thấp về mùa đông, cây vẫn tồn tại. Ở những nơi có nhiệt độ quá cao trên 400C Hà thủ ô đỏ sinh trưởng và phát triển chậm.

Ánh sáng là yếu tố vô cùng quan trọng cho sự sinh trưởng của cây vì nó rất cần cho quá trình quang hợp. Ánh sáng quyết định q trình hơ hấp và chuyển hóa các chất dinh dưỡng giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt. Thiếu ánh sáng thì cây phát triển chậm, quang hợp kém.

Nước vừa là nguyên liệu vừa là dung mơi cho các phản ứng sinh lí sinh hóa trong cây diễn ra. Lượng mưa trung bình năm 1500 - 1800mm là thích hợp. Ở những vùng khơ hanh cần có biện pháp tưới tiêu hợp lí để đảm bảo cung cấp đầy đủ nước cho cây sinh trưởng và phát triển.

Đất chọn đất cao ráo, thoát nước, tơi xốp, nhiều mùn, giàu chất dinh dưỡng. Độ pH = 5-6,5.

Phân bón Hà thủ ơ đỏ cần chất dinh dưỡng nhiều, do đó phải chú ý bón phân. Trước khi trồng cần bón lót. Ngồi ra, cần bổ sung thêm phân chuồng, phân xanh…[20]

1.2.6. Thành phần hóa học trong cây Hà thủ ô đỏ

Trong củ Hà thủ ơ đỏ có chứa các hợp chất : Tinh bột 45,2%, lipid 3,1%, chất vô cơ 4,5%, protid 1,1%, antraglucosid (emodin, chrysophanol, rhein, physcion) 1,7%; các chất tan trong nước, lecitin, rhaponticin, 2,3,5,4-

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

13 tetrahydroxytibene- 2-O-b-D-glucoside 26,4%, tanin (hà thủ ô đỏ chưa bào chế) 7,68%, dẫn xuất anthraquinon tự do (hà thủ ô đỏ chưa bào chế) 0,25%, dẫn xuất anthraquinon tồn phần (Hà thủ ơ đỏ chưa bào chế) 0,8058 %, tanin( sau khi đã bào chế) 3,82%, dẫn xuất anthraquinon tự do (Hà thủ ô đỏ đã bào chế) 0,1127%, dẫn xuất anthraquinon toàn phần (Hà thủ ô đỏ đã bào chế) 0,2496%.

Các hợp chất trên có tác dụng chữa bệnh rất phổ biến và đem lại hiệu quả tốt cho người sử dụng.[1]

1.2.7. Giá trị dược liệu của cây Hà thủ ô đỏ

* Tác dụng dược lý:

Hà thủ ơ có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mơ hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc cịn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol của ruột thỏ, theo tác giả, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol . Thuốc có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch. Có thể tác dụng giảm xơ cứng động mạch và do thuốc có thành phần Lecithin [5].

Thuốc làm chậm nhịp tim. Làm tăng nhẹ lưu lượng máu động mạch vành và bảo vệ được cơ tim thiếu máu.

Thuốc giữ được tuyến ức của chuột nhắt già không bị teo mà giữ được mức như lúc chuột còn non, tác dụng này có nghĩa chống lão hóa nhưng cơ chế còn cần nghiên cứu thêm.

Thuốc có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất oxymethylanthraquinone làm tăng nhu động ruột [13]. Hà thủ ô sống có tác dụng nhuận tràng mạnh hơn Hà thủ ô chín.

Tác dụng kháng khuẩn và virus: thuốc có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn lao ở người và trực khuẩn lỵ flexner. Thuốc có tác dụng ức chế virus cúm [19].

* Công dụng:

Bổ máu, trị thần kinh suy nhược, ngủ kém, sốt rét kinh niên, thiếu máu, đau lưng, mỏi gối, di mộng tinh, bạch đới, đại tiểu tiện ra máu, mẩn ngứa.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

14 Bổ huyết giữ tinh, hồ khí huyết, bổ can thận, mạnh gân xương, nhuận tràng.

Chống rụng tóc :

Từ lâu trong dân gian vẫn có câu: “Muốn cho xanh tóc đỏ da, rủ nhau lên núi tìm hà thủ ơ”. Câu nói này đã cho thấy cơng dụng tuyệt vời của hà thủ ơ đối với tóc. Hà thủ ơ giúp cho tóc hết rụng, trở nên khỏe đẹp, đen hơn.

An thần và cải thiện giấc ngủ: Hà thủ ơ đỏ giúp kích thích tiêu hóa, dùng hà

thủ ô sẽ cải thiện sức khỏe, ăn ngon miệng, không còn bị mất ngủ nữa. Hơn thế, hà thủ ơ cịn kích thích tiêu hóa, làm chậm quá trình lão hóa, giữ cho tóc ln đen, khơng bị bạc. Chính vì vậy, nhiều người cịn xem hà thủ ơ như một bí quyết để trẻ mãi khơng già.

Kháng khuẩn vius : Một số nghiên cứu đã cho thấy, các chất trong củ hà thủ ô ức chế hoạt động của virus HIV trong một số tế bào nhiễm bệnh và không gây hại cho các tế bào thường.

Giảm đau gối, mỏi lưng, tăng cường sinh lực : Hà thủ ô là thuốc bổ các tuyến nội tiết, bổ thận nhờ đó giúp cải thiện sức khỏe, đề kháng bệnh tật khi thời tiết thay đổi. Tác dụng được nhiều người biết đến của hà thủ ơ cịn là tăng cường sinh lực, hỗ trợ điều trị hiếm muộn. Hà thủ ô làm tăng lượng hồng ở phụ nữ và lượng tinh trùng ở nam giới, chữa chứng rối loạn kinh nguyệt ở phụ nữ, nhờ đó dễ sinh con hơn.[1]

1.2.8. Tình hình nghiên cứu về kĩ thuật nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ.

* Tình hình ni trồng và sản xuất cây Hà thủ ô đỏ trên thế giới và Việt Nam:

Trên thế giới, chủ yếu ở Châu Á có điều kiện phù hợp với khả năng sinh trưởng của cây Hà thủ ô như ở Trung Quốc, Nhật Bản, Bắc Lào, Ấn Độ. Đã nhân giống và sản xuất cây giống Hà thủ ô đỏ [11].

Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu và trồng thử nghiệm cây thuốc để phục vụ cho nhu cầu của con người. Ở Bắc Giang đã triển khai nhân giống và trồng thử nghiệm cây Hà thủ ô đỏ tại 2 huyện Lục Nam và Sơn Đông. Đã trồng thử nghiệm thành công dự án 15000 cây giống. Bên cạnh đó hồn thiện được quy

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

15 trình sản xuất giống cây Hà thủ ô đỏ phù hợp với điều kiện ở địa phương. Ngoài ra, ở một số nơi nước ta cũng đang triển khai nhân giống và sản xuất cây giống như ở Lâm Đồng, Nghệ An, Lào Cai,...

* Những nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ:

Li-Chang-Lin và cs (2003) đã nghiên cứu vi nhân giống bằng kỹ thuật in vitro trên cây Hà thủ ô đỏ với hệ số nhân chồi 4,7chồi/mẫu cấy trên môi trường 2 mg/L BA và 0,2 mg/L NAA [22]. Năm 2004, Trần Thị Liên đã thực hiện đề tài

nghiên cứu quy trình nhân giống vơ tính lồi hà thủ ô đỏ bằng kỹ thuật in vitro.

Môi trường nhân nhanh chồi là 2.5 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA cho quá trình nhân chồi trong 6 tuần nuôi cấy ở điều kiện 250C ± 20C, cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày kết quả thu được hệ số nhân chồi 5 lần so với đối chứng. Năm 2008, Trương Thị Bích Phượng và cs đã nghiên cứu và nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ [13]. Năm 2011, Hoàng Thị Kim Hồng đã thực hiện đề tài nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và cụm chồi trong nuôi cấy in vitro với hệ số nhân chồi 8,54 chồi/mẫu cấy trên môi trường nhân chồi 4 mg/L BA và 0,1 mg/L NAA [15].

Năm 2012, Nguyễn Xuyến Thành Thắng và cs đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ. Môi trường MS có bổ sung 4 mg/l

BA và 1,5 mg/l KIN kích thích đoạn thân của chồi in vitro tái sinh chồi tốt nhất,

tỉ lệ tái sinh chồi là 88,88% với hệ số nhân chồi là 3,77 chồi/mẫu. Các đoạn thân này cũng có khả năng tạo cụm chồi trên mơi trường có bổ sung 4 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA. Chồi đơn tách từ cụm chồi phát triển tốt trên môi trường tạo rễ 0,5

mg/l NAA . Cây hà thủ ô đỏ con in vitro phát triển tốt trên giá thể 100% xơ dừa

ẩm trong điều kiện mơi trường nhà kính [18].

</div>