luận án tiến sĩ ngành nuôi trồng thủy sản nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus sp đối kháng với vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (975.61 KB, 15 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus

TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus

TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

TÓM TẮT

Được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2009, bệnh Hoại tử gan tụy cấp ở tôm (AHPND) đã lan rộng ra nhiều quốc gia nuôi tôm trên thế giới, trong đó có Việt Nam và trở thành mối nguy hại hàng đầu đối với nuôi tôm công nghiệp tại các quốc gia này. Tác nhân gây AHPND là một số chủng

Vibrio parahaemolyticus mang plasmid mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB

gây hoại tử gan tụy cấp. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm phân lập, ứng

dụng các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có tính đối kháng mạnh với V.

parahaemolyticus để phòng chống AHPND trong nuôi tôm công nghiệp. Để

đạt được mục tiêu nghiên cứu kể trên, từ các ao tôm công nghiệp không mắc bệnh và nghi mắc AHPND tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau, 149

chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp. và 51 chủng vi khuẩn Vibrio sp. đã được

phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm, bùn và nước. Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR

phát hiện các gen toxR, tdh, trh, pirA và pirB và các quan sát mô bệnh học khi cảm nhiễm trên tôm, 12 chủng V. parahaemolyticus đã được xác định, trong đó chủng BĐB1.4v, dương tính với cả hai gen pirA và pirB, chính là tác nhân

gây AHPND. Bên cạnh đó, phương pháp phân loại MLST (Multilocus Sequence Typing) đã được sử dụng để phân loại một tập hợp gồm 26 chủng

Bacillus sp. Kết quả phân tích cho thấy có bốn loài Bacillus chính là B. subtilis

(11 chủng), B. velezensis (8 chủng), B. siamensis (5 chủng) và B. licheniformis

(2 chủng). Tiếp đó, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được sử dụng để

phân lập hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có hoạt tính đối kháng cao với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng BĐB1.4v gây

AHPND. Ngoài khả năng tiết enzyme protease, amylase và cellulase mạnh, hai chủng này còn có thể thích ứng với các điều kiện rất rộng về nhiệt độ, pH

và độ mặn. Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng Bacillus này đối với chủng

trên mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 lít, chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 giúp phòng chống hiệu quả AHPND với tỷ lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm V. parahaemolyticus BĐB1.4v lần lượt

là 85,56% và 76,67%. Ở quy mô 1000 lít trong khoảng thời gian theo dõi đến

35 ngày sau cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh, chủng B. subtilis BRB2.1

không những cho phép bảo vệ tôm khỏi AHPND mà còn cải thiện tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn so với mẫu đối chứng không cảm nhiễm. Khả

năng đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 rất có thể liên quan đến sự có

mặt của gen mã hóa subtilosin A, vốn là một loại bacteriocin phổ rộng. Do

tính an toàn của B. subtilis đã được công nhận nên chủng B. subtilis BRB2.1

có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng chống AHPND trong nuôi tôm nước lợ.

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

ABSTRACT

Since its emergence in China in 2009, acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) has been causing massive losses in aquaculture. To date, the disease has been recognized as the biggest threat to the shrimp farming industry in many countries (including Vietnam). The causative agent of

AHPND has been identified as Vibrio parahaemolyticus strains that harbor a large plasmid encoding binary toxins PirA/PirB. The aim of this study was to isolate and apply Bacillus isolates that are strongly antagonistic against V.

parahaemolyticus to prevent AHPND in cultured shrimps. To this end, we

have isolated 149 presumptive Bacillus sp. isolates and 51 Vibrio sp. isolates

from shrimp digestive tract, sediment and water samples from commercial shrimp ponds in Bac Lieu, Soc Trang and Ca Mau provinces. By detecting

toxin genes (toxR, tdh, trh, pirA và pirB) with PCR and performing histological observation, we have identified 12 V. parahaemolyticus isolates, among which, BĐB1.4v strain, positive for both pirA and pirB, was shown to

be the direct cause of AHPND. Furthermore, Multi-locus Sequence Typing (MLST) was used to describe the genetic diversity of a collection of 26

Bacillus isolates. The results showed 4 major clusters, corresponding to 4 Bacillus species, namely B. subtilis (11 isolates), B. velezensis (8 isolates), B. siamensis (5 isolates) và B. licheniformis (2 isolates). Additionally, agar

diffusion method was used to reveal the strong antagonistic activity of B.

subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 to V. parahaemolyticus (including

strain BĐB1.4v causing AHPND). These two Bacillus isolates could not only

secrete high level of protease, amylase, and cellulase, but also adapt to a vast range of temperature, pH and salinity. Results showed that when inoculated at 106 cfu/mL or higher, these two isolates could inhibit the growth of V.

parahaemolyticus BĐB1.4v. When tested on Litopenaeus vannamei cultured

in tanks of 100L, B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 strains were

proved to be effective against AHPND (shrimps’ survival rates were 85,56% and 76,67% when being cultured with the two isolates). In larger model

(1000L), B. subtilis BRB2.1 strain not only protected shrimps from AHPND but also improved their food conversion rate. The antagonistic activity to V.

parahaemolyticus of this strain may be explained by the presence of the gene

encoding for subtilosin A, which is a wide-spectrum bacteriocin. Since B.

subtilis is considered as GRAS, B. subtilis BRB2.1 could be used directly to

produce probiotics that prevent AHPND in shrimp farming.

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ... xiii

Chương 1: GIỚI THIỆU ... 1

1.1 Đặt vấn đề ... 1

1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ... 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát ... 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể ... 2

1.3 Nội dung nghiên cứu ... 2

1.4 Ý nghĩa nghiên cứu ... 3

1.5 Tính mới của luận án: ... 3

1.6 Thời gian thực hiện ... 3

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4

2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) ... 4

2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới ... 4

2.1.2 Tình hình ni tơm nước lợ ở Việt Nam ... 5

2.2 Tình hình dịch AHPND ở tơm ni trên thế giới và Việt Nam ... 6

2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm ni ... 7

2.4 Chẩn đốn AHPND và các biện pháp phịng, trị bệnh trên tơm ni ... 8

2.4.1 Chẩn đoán AHPND ... 8

2.4.2 Phịng chớng AHPND ở tơm ni ... 9

2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ... 12

2.5.1 Đặc tính chủng V. parahaemolyticus ... 12

2.5.2 Các độc tố của V. parahaemolyticus ... 14

2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V. parahaemolyticus ... 18

2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ... 18

2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH ... 18

2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn ... 18

2.6 Khái quát chung về Bacillus subtilis. ... 19

2.6.1 Sơ lược về B. subtilis ... 19

2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của B. subtilis . 202.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống ... 22

2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử ... 22

2.6.5 Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp và nuôi trồng thủy sản ... 26

2.7 Bacteriocin ... 29

2.7.1 Khái niệm ... 29

2.7.2 Phân loại Bacteriocin ... 31

2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus trong thủy sản ... 31

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

2.7.4 Subtilosin A ... 33

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 35

3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu ... 35

3.2 Phương pháp nghiên cứu ... 35

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu ... 36

3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp. và xác định V. parahaemolyticus từ ao

3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của V. parahaemolyticus ... 40

3.2.5 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp ... 41

3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu... 41

3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm ... 41

3.2.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp... 42

3.2.6.1 Phương pháp tủn chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp. có hoạt tính đối

3.2.7. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus ... 43

3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1 ... 43

3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 ... 43

3.2.8.2. PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 ... 44

3.2.8.3 Tách dịng và giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1 ... 44

3.2.8.4 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide và trình tự axít amin của

3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus sp. ... 47

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

3.2.11 Kiểm tra khả năng gây AHPND của các chủng V. parahaemolyticus

BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v trên TTCT ... 48

3.2.12 Nghiên cứu đợc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tơm ... 49

3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio sp. ở quy mô phòng thí nghiệm ... 50

3.2.13.1 Lựa chọn các chủng Bacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus và hoạt tính enzyme ngoại bào cao ... 50

3.2.13.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thống bể nuôi tôm 100 lít ... 51

3.2.14 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus trong hệ thớng bể ni tơm 1000 lít ... 52

3.2.14.1 Bớ trí thí nghiêm: ... 52

3.2.14.2 Phương thức thực hiện: ... 52

3.2.14.3 Cho ăn và quản lý ... 52

3.2.14.4 Các chỉ tiêu theo dõi ... 53

3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu ... 53

Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ... 54

4.1 Phân lập các chủng thuộc chi Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp... 54

4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. phân lập được bằng PCR ... 55

4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V. parahaemolyticus ... 55

4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh ... 58

4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh ... 59

4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA ... 60

4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB ... 60

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển của V.

4.4 Phân lập các chủng thuộc chi Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp ... 65

4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh học ứng dụng trong ni tơm cơng nghiệp ... 67

4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đới kháng V. parahaemolyticus ... 67

4.5.2 Tủn chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp. có hoạt tính sinh protease cao . 684.5.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh amylase cao . 694.5.4 Tủn chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp. có hoạt tính sinh cellulase cao 70 4.6 Xác định sự có mặt của các gen mã hóa bacteriocin ở chủng BRB2.1 ... 72

4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1 ... 72

4.6.2 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 ... 75

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

4.6.2.1 Xây dựng cây phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng

BRB2.1 ... 75

4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A ... 76

4.6.3 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu ... 77

4.6.3.1. Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA ... 77

4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA ... 77

4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST ... 78

4.7.1. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA ... 78

4.7.2. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng

4.10 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm ... 89

4.11 Thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở quy mơ phịng thí nghiệm ... 91

4.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND trong môi trường nước nuôi tôm ... 91

4.11.2 Thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 Lít... 93

4.12 Thử nghiệm khả năng bảo vệ tôm khỏi sự nhiễm V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở quy mơ ni 1000 lít ... 95

4.12.1. Sự biến đợng của các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thử nghiệm 95 4.12.2 Sự biến động của chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio trong quá trình thử nghiệm ... 97

4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm trong quá trình thử nghiệm ... 99

Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT ... 101

PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA ... 161

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ ... 164PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM ... 171

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau ... 35

Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong dựng cây phả hệ gen subtilosin A ... 45

Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng cho phân tích MLST ... 46

Bảng 4.1: Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio ... 54

Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả PCR khuếch đại gen toxR và hình thái khuẩn lạc trên môi trường Chromagar Vibrio ... 57

Bảng 4.3 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các mức nhiệt độ khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ... 62

Bảng 4.4 Mật độ (Log cfu/mL) của vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong các nghiệm thức pH khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ... 63

Bảng 4.5 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các độ mặn khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ... 65

Bảng 4.6 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus ... 65

Bảng 4.7 Kết quả phân tích MLST 7 gen “house-keeping” ... 81

Bảng 4.8 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau ... 85

Bảng 4.9 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau ... 86

Bảng 4.10 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các độ mặn khác nhau ... 87

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của 5 chủng V. parahaemolyticus đến tỉ lệ tôm chết sau 36 giờ gây nhiễm trong hệ thống nuôi 100 lít ... 88

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của mật độ cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v đến tỉ lệ tôm chết sau 24 giờ ... 90

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của liều cấp giống của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đến mật độ V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong môi trường nước nuôi tôm ... 93

Bảng 4.14 Kết quả thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 lít sau 36 giờ gây nhiễm .... 94

Bảng 4.15: Các chỉ tiêu môi trường trong các nghiệm thức ... 96

Bảng 4.16: Mật độ vi sinh vật tổng số của các nghiệm thức trong quá trình thử

Bảng C.1: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường NA ... 150

Bảng C.2: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường TCBS ... 151

Bảng C.3: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu) ... 151

</div>

luận án tiến sĩ ngành nuôi trồng thủy sản nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus sp đối kháng với vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

<b> LÊ THẾ XUÂN </b>

<i><b>NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus </b></i>

<b>TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP </b>

<b>BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ </b>

<b>LÊ THẾ XUÂN </b>

<i><b>NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus </b></i>

<b>TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP </b>

<b>TÓM TẮT </b>

<b>ABSTRACT </b>

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về