Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus sp đối kháng với vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp.
ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus
TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 62620301

NĂM 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp.
ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus
TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 62620301

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. VŨ NGỌC ÚT

TS. PHẠM ANH TUẤN

NĂM 2020


i


TÓM TẮT
Được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2009, bệnh Hoại tử gan
tụy cấp ở tôm (AHPND) đã lan rộng ra nhiều quốc gia nuôi tôm trên thế giới,
trong đó có Việt Nam và trở thành mối nguy hại hàng đầu đối với nuôi tôm
công nghiệp tại các quốc gia này. Tác nhân gây AHPND là một số chủng
Vibrio parahaemolyticus mang plasmid mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB
gây hoại tử gan tụy cấp. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm phân lập, ứng
dụng các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có tính đối kháng mạnh với V.
parahaemolyticus để phòng chống AHPND trong nuôi tôm công nghiệp. Để
đạt được mục tiêu nghiên cứu kể trên, từ các ao tôm công nghiệp không mắc
bệnh và nghi mắc AHPND tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau, 149
chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp. và 51 chủng vi khuẩn Vibrio sp. đã được
phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm, bùn và nước. Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR
phát hiện các gen toxR, tdh, trh, pirA và pirB và các quan sát mô bệnh học khi
cảm nhiễm trên tôm, 12 chủng V. parahaemolyticus đã được xác định, trong
đó chủng BĐB1.4v, dương tính với cả hai gen pirA và pirB, chính là tác nhân
gây AHPND. Bên cạnh đó, phương pháp phân loại MLST (Multilocus
Sequence Typing) đã được sử dụng để phân loại một tập hợp gồm 26 chủng
Bacillus sp. Kết quả phân tích cho thấy có bốn loài Bacillus chính là B. subtilis
(11 chủng), B. velezensis (8 chủng), B. siamensis (5 chủng) và B. licheniformis
(2 chủng). Tiếp đó, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được sử dụng để
phân lập hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có hoạt tính

đối kháng cao với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng BĐB1.4v gây
AHPND. Ngoài khả năng tiết enzyme protease, amylase và cellulase mạnh,
hai chủng này còn có thể thích ứng với các điều kiện rất rộng về nhiệt độ, pH
và độ mặn. Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng Bacillus này đối với chủng
V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND là 106 cfu/mL. Khi thử nghiệm
trên mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 lít, chủng B. subtilis
BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 giúp phòng chống hiệu quả AHPND với tỷ
lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm V. parahaemolyticus BĐB1.4v lần lượt
là 85,56% và 76,67%. Ở quy mô 1000 lít trong khoảng thời gian theo dõi đến
35 ngày sau cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh, chủng B. subtilis BRB2.1
không những cho phép bảo vệ tôm khỏi AHPND mà còn cải thiện tỷ lệ sống
và hiệu quả sử dụng thức ăn so với mẫu đối chứng không cảm nhiễm. Khả
năng đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 rất có thể liên quan đến sự có
mặt của gen mã hóa subtilosin A, vốn là một loại bacteriocin phổ rộng. Do
tính an toàn của B. subtilis đã được công nhận nên chủng B. subtilis BRB2.1
có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng
chống AHPND trong nuôi tôm nước lợ.
ii


ABSTRACT
Since its emergence in China in 2009, acute hepatopancreatic necrosis
disease (AHPND) has been causing massive losses in aquaculture. To date, the
disease has been recognized as the biggest threat to the shrimp farming
industry in many countries (including Vietnam). The causative agent of
AHPND has been identified as Vibrio parahaemolyticus strains that harbor a
large plasmid encoding binary toxins PirA/PirB. The aim of this study was to
isolate and apply Bacillus isolates that are strongly antagonistic against V.
parahaemolyticus to prevent AHPND in cultured shrimps. To this end, we
have isolated 149 presumptive Bacillus sp. isolates and 51 Vibrio sp. isolates

from shrimp digestive tract, sediment and water samples from commercial
shrimp ponds in Bac Lieu, Soc Trang and Ca Mau provinces. By detecting
toxin genes (toxR, tdh, trh, pirA và pirB) with PCR and performing
histological observation, we have identified 12 V. parahaemolyticus isolates,
among which, BĐB1.4v strain, positive for both pirA and pirB, was shown to
be the direct cause of AHPND. Furthermore, Multi-locus Sequence Typing
(MLST) was used to describe the genetic diversity of a collection of 26
Bacillus isolates. The results showed 4 major clusters, corresponding to 4
Bacillus species, namely B. subtilis (11 isolates), B. velezensis (8 isolates), B.
siamensis (5 isolates) và B. licheniformis (2 isolates). Additionally, agar
diffusion method was used to reveal the strong antagonistic activity of B.
subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 to V. parahaemolyticus (including
strain BĐB1.4v causing AHPND). These two Bacillus isolates could not only
secrete high level of protease, amylase, and cellulase, but also adapt to a vast
range of temperature, pH and salinity. Results showed that when inoculated at
106 cfu/mL or higher, these two isolates could inhibit the growth of V.
parahaemolyticus BĐB1.4v. When tested on Litopenaeus vannamei cultured
in tanks of 100L, B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 strains were
proved to be effective against AHPND (shrimps’ survival rates were 85,56%
and 76,67% when being cultured with the two isolates). In larger model
(1000L), B. subtilis BRB2.1 strain not only protected shrimps from AHPND
but also improved their food conversion rate. The antagonistic activity to V.
parahaemolyticus of this strain may be explained by the presence of the gene
encoding for subtilosin A, which is a wide-spectrum bacteriocin. Since B.
subtilis is considered as GRAS, B. subtilis BRB2.1 could be used directly to
produce probiotics that prevent AHPND in shrimp farming.

iii

iv


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ......................................................................................................................... i
TÓM TẮT.............................................................................................................................. ii
ABSTRACT ......................................................................................................................... iii
CAM KẾT KẾT QUẢ ......................................................... Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC ............................................................................................................................. v
DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... x
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... xiii
Chương 1: GIỚI THIỆU..................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 2
1.2.2 Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................ 2
1.4 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................................... 3
1.5 Tính mới của luận án: ...................................................................................................... 3
1.6 Thời gian thực hiện .......................................................................................................... 3
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4
2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) ......... 4

2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới .................................................. 4
2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam ................................................... 5
2.2 Tình hình dịch AHPND ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam ............................. 6
2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi ......................................................................... 7

2.4 Chẩn đoán AHPND và các biện pháp phòng, trị bệnh trên tôm nuôi .................. 8

2.4.1 Chẩn đoán AHPND ................................................................................... 8
2.4.2 Phòng chống AHPND ở tôm nuôi............................................................. 9
2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ........................................................................... 12

2.5.1 Đặc tính chủng V. parahaemolyticus ...................................................... 12
2.5.2 Các độc tố của V. parahaemolyticus ....................................................... 14
2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V.
parahaemolyticus ............................................................................................. 18
2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................... 18
2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH ............................................................................ 18
2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn ..................................................................... 18
2.6 Khái quát chung về Bacillus subtilis. ......................................................................... 19

2.6.1 Sơ lược về B. subtilis............................................................................... 19
2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của B. subtilis . 20
2.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống ................................. 22
2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử................................... 22
2.6.5 Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp và nuôi trồng thủy sản ....... 26
2.7 Bacteriocin ..................................................................................................................... 29

2.7.1 Khái niệm ................................................................................................ 29
2.7.2 Phân loại Bacteriocin .............................................................................. 31
2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus trong thủy sản ............................. 31
v


2.7.4 Subtilosin A............................................................................................. 33
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 35

3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu........................................................ 35
3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 35

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu .............................................................................. 36
3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp. và xác định V. parahaemolyticus từ ao
nuôi tôm ........................................................................................................... 37
3.2.3 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở các chủng Vibrio sp. phân lập được
.......................................................................................................................... 37
3.2.3.1 pirA.................................................................................................... 39
3.2.3.2 pirB.................................................................................................... 39
3.2.3.3 toxR ................................................................................................... 39
3.2.3.4 tdh...................................................................................................... 40
3.2.3.5 trh ...................................................................................................... 40
3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ,
pH, độ mặn) đến sự phát triển của V. parahaemolyticus .................................. 40
3.2.5 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm
công nghiệp ...................................................................................................... 41
3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu........................................................................ 41
3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm ................................ 41
3.2.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp....................... 42
3.2.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối
kháng V. parahaemolyticus ........................................................................... 42
3.2.6.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính
protease cao ................................................................................................... 42
3.2.6.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính
amylase cao ................................................................................................... 42
3.2.6.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính
cellulase cao .................................................................................................. 43
3.2.7. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus ............ 43
3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng

Bacillus BRB2.1 ............................................................................................... 43
3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1
....................................................................................................................... 43
3.2.8.2. PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 ....... 44
3.2.8.3 Tách dòng và giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1 ..... 44
3.2.8.4 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide và trình tự axít amin của
subtilosin A ................................................................................................... 44
3.2.9 Phương pháp đánh giá đa đạng di truyền của Bacillus sp. phân lập được
.......................................................................................................................... 45
3.2.9.1 Đánh giá đa dạng di truyền nhóm Bacillus dựa trên trình tự 16S
rDNA ............................................................................................................. 45
3.2.9.2 Đánh giá đa đạng di truyền của nhóm Bacillus dựa trên phân tích
MLST ............................................................................................................ 46
3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát
triển của Bacillus sp. ........................................................................................ 47
vi


3.2.11 Kiểm tra khả năng gây AHPND của các chủng V. parahaemolyticus
BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v trên TTCT ...................... 48
3.2.12 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm
.......................................................................................................................... 49
3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio sp.
ở quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................. 50
3.2.13.1 Lựa chọn các chủng Bacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn V.
parahaemolyticus và hoạt tính enzyme ngoại bào cao ................................. 50
3.2.13.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của các
chủng vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thống bể nuôi tôm 100 lít .................. 51
3.2.14 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi
khuẩn Bacillus trong hệ thống bể nuôi tôm 1000 lít ........................................ 52

3.2.14.1 Bố trí thí nghiêm: ............................................................................ 52
3.2.14.2 Phương thức thực hiện: ................................................................... 52
3.2.14.3 Cho ăn và quản lý ........................................................................... 52
3.2.14.4 Các chỉ tiêu theo dõi ....................................................................... 53
3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 53
Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................. 54
4.1 Phân lập các chủng thuộc chi Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp.................. 54
4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. phân lập được bằng
PCR....................................................................................................................................... 55

4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V. parahaemolyticus............................ 55
4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh ........................................................................ 58
4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh......................................................................... 59
4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA ...................................................................... 60
4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB ...................................................................... 60
4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển của V.
parahaemolyticus ................................................................................................................. 62

4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 62
4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 63
4.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 64
4.4 Phân lập các chủng thuộc chi Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp .............. 65
4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh học ứng dụng trong
nuôi tôm công nghiệp ......................................................................................................... 67

4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V.
parahaemolyticus ............................................................................................. 67

4.5.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh protease cao. 68
4.5.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh amylase cao . 69
4.5.4 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh cellulase cao 70
4.6 Xác định sự có mặt của các gen mã hóa bacteriocin ở chủng BRB2.1 ................ 72

4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1 ......... 72
4.6.2 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng
BRB2.1............................................................................................................. 75

vii


4.6.2.1 Xây dựng cây phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng
BRB2.1 .......................................................................................................... 75
4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A ............................................. 76
4.6.3 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự nucleotide gen sboA của
chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu ...................................................... 77
4.6.3.1. Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA ......................... 77
4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA ................................................ 77
4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trên trình tự gen
mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST .......................................................................... 78

4.7.1. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương
pháp giải trình tự 16S rDNA ............................................................................ 78
4.7.2. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng
MLST ............................................................................................................... 79
4.8 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của chủng B. subtilis
BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 ...................................................................................... 85

4.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1

và B. siamensis BĐK2.3................................................................................... 85
4.8.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B.
siamensis BĐK2.3............................................................................................ 86
4.8.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và
B. siamensis BĐK2.3 ....................................................................................... 86
4.9 Kiểm tra khả năng gây AHPND của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên
TTCT .................................................................................................................................... 87
4.10 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm ......... 89
4.11 Thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với V. parahaemolyticus BĐB1.4v
ở quy mô phòng thí nghiệm .............................................................................................. 91

4.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 và B.
siamensis BĐK2.3 đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND
trong môi trường nước nuôi tôm ...................................................................... 91
4.11.2 Thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis
BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 Lít............................. 93
4.12 Thử nghiệm khả năng bảo vệ tôm khỏi sự nhiễm V. parahaemolyticus gây bệnh
AHPND ở quy mô nuôi 1000 lít ....................................................................................... 95

4.12.1. Sự biến động của các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thử nghiệm 95
4.12.2 Sự biến động của chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio trong quá
trình thử nghiệm ............................................................................................... 97
4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm trong quá trình thử nghiệm ............ 99
Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT ............................................................................. 101
5.1 Kết luận .........................................................................................................................101
5.2 Đề xuất ..........................................................................................................................101
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 103
PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ....................................................................... 128
PHỤ LỤC B: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.................................................. 149
PHỤ LỤC C: CÁC BẢNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC KHI PHÂN

LẬP ..................................................................................................................................... 150
PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS
BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA ................................................................. 161
viii


PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ ......................................................................... 164
PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM....................................................... 171

ix


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các gen được sử dụng để phân loại các loài thuộc nhóm B. cereus bằng kỹ
thuật MLST ................................................................................................................ 25
Bảng 2.2 Các bacteriocin từ Bacillus sp. được công bố trong khoảng thời gian 20002019 ............................................................................................................................ 32
Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau .............................. 35
Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong dựng cây phả hệ gen subtilosin A ....... 45
Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng cho phân tích MLST ................................................ 46
Bảng 4.1: Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio ................................ 54
Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả PCR khuếch đại gen toxR và hình thái khuẩn lạc trên môi
trường Chromagar Vibrio ........................................................................................... 57
Bảng 4.3 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các mức nhiệt độ
khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ......................................................................... 62
Bảng 4.4 Mật độ (Log cfu/mL) của vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong
các nghiệm thức pH khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ........................................ 63
Bảng 4.5 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các độ mặn khác
nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy .................................................................................. 65
Bảng 4.6 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus .............................. 65

Bảng 4.7 Kết quả phân tích MLST 7 gen “house-keeping”....................................... 81
Bảng 4.8 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ
nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau ............................................................................. 85
Bảng 4.9 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ
nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau ........................................................................... 86
Bảng 4.10 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ
nuôi cấy ở các độ mặn khác nhau .............................................................................. 87
Bảng 4.11 Ảnh hưởng của 5 chủng V. parahaemolyticus đến tỉ lệ tôm chết sau 36 giờ
gây nhiễm trong hệ thống nuôi 100 lít ....................................................................... 88
Bảng 4.12 Ảnh hưởng của mật độ cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v
đến tỉ lệ tôm chết sau 24 giờ ...................................................................................... 90
Bảng 4.13 Ảnh hưởng của liều cấp giống của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B.
siamensis BĐK2.3 đến mật độ V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong môi trường nước
nuôi tôm ..................................................................................................................... 93
Bảng 4.14 Kết quả thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis
BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 lít sau 36 giờ gây nhiễm .... 94
Bảng 4.15: Các chỉ tiêu môi trường trong các nghiệm thức ...................................... 96
Bảng 4.16: Mật độ vi sinh vật tổng số của các nghiệm thức trong quá trình thử
nghiệm (cfu/mL) ........................................................................................................ 98
Bảng 4.17: Mật độ vi khuẩn Vibrio của các nghiệm thức trong quá trình thử nghiệm
(cfu/mL) ..................................................................................................................... 98
Bảng 4.18: Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) sau
thí nghiệm ................................................................................................................ 100
Bảng C.1: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong mẫu
nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường NA .......................................... 150
Bảng C.2: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong mẫu
nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường TCBS ...................................... 151
Bảng C.3: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi
trường NA (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu).................................................................... 151

x


Bảng C.4: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi
trường TCBS (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu) ............................................................... 152
Bảng C.5: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) ........................................ 153
Bảng C.6: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) .................................... 154
Bảng C.7: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong
nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) ................................. 155
Bảng C.8: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong nước
sau 24h cấy trên môi trường TCBS .......................................................................... 156
Bảng C.9: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi
trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau)............................................................................. 156
Bảng C.10: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi
trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) ........................................................................ 157
Bảng C.11: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) .......................................... 157
Bảng C.12: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) ...................................... 158
Bảng C.13: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong
nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ............................. 158
Bảng C.14: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi
trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ......................................................................... 159
Bảng C.15: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm
sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ...................................... 160

DANH SÁCH HÌNH
Trang

Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pVA1 và vị trí các gen pirA và pirB ..................................... 8
Hình 2.2 Vị trí gen pirA và pirB trên plasmid pVA1 của V. parahaemolyticus .......... 8
Hình 2.3 Nhuộm mô gan tụy bằng haematoxylin và eosin (Phiwsaiya et al., 2017) ... 9
Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn V. parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử
( ..................... 13
Hình 2.5 Cấu trúc và các tác nhân độc lực của V. parahaemolyticus (Wang et al.,
2015) .......................................................................................................................... 13
Hình 2.6 Cấu trúc của độc tố Cry của B. thuringiensis (Lin et al., 2017).................. 16
Hình 2.7 Cấu trúc của các độc tố PirA và PirB của V. parahaemolyticus (Lin et al.,
2017) .......................................................................................................................... 16
Hình 2.8 Hình thái vi khuẩn B. subtilis 168 dưới kính hiển vi điện tử (Zweers et al.,
2008) .......................................................................................................................... 19
Hình 2.9 Cấu trúc của Subtilosin A (Abriouel et al., 2011)....................................... 33
Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu của luận án ..................................................................... 36
Hình 3.2 Quy trình phát hiện các gen độc tố của các chủng V. parahaemolyticus .... 38
Hình 3.3. Hình thái các loài Vibrio trên môi trường CHROMagar (CHROMagar,
Paris, France).............................................................................................................. 38
Hình 4.1: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio phân lập tại Bạc lieu và Cà Mau ...... 55
Hình 4.2 Kết quả PCR khuếch đại gen toxR từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ...... 57
Hình 4.3 Kết quả PCR khuếch đại gen tdh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ........ 59
Hình 4.4 Kết quả PCR khuếch đại gen trh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ......... 59
Hình 4.5 Kết quả PCR khuếch đại gen pirA từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ...... 60
Hình 4.6 Kết quả PCR khuếch đại gen pirB từ 31 chủng Vibrio phân lập được ....... 61
xi


Hình 4.7 Kết quả điện di lại sản phẩm PCR khuếch đại gen pirB từ các mẫu
BDB11.1v (19); CRK1.2v (27); BĐB1.4v (31) ......................................................... 61
Hình 4.8: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus phân lập tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và
Cà Mau ....................................................................................................................... 66

Hình 4.9 Vòng kháng khuẩn của 6 chủng BRB2.1, BĐK2.3, BNK 6.1, BRK4.4,
BNK7.1, BĐB11.1 trên đĩa thạch với vi khuẩn kiểm định là chủng V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ....................................................................................... 68
Hình 4.10 Vòng ức chế vi sinh vật kiểm định (D-d) của 6 chủng nghi là Bacillus có
hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn.
.................................................................................................................................... 68
Hình 4.11 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh protease của một số chủng nghi là
Bacillus sp. trên môi trường thạch SM. ..................................................................... 69
Hình 4.12 Khả năng sinh protease của tập hợp 30 chủng nghi là Bacillus ................ 69
Hình 4.13 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh amylase của một số chủng nghi là
Bacillus sp. trên môi trường Starch Agar. .................................................................. 70
Hình 4.14 Khả năng sinh amylase của 30 chủng nghi là Bacillus ............................. 70
Hình 4.15 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh cellulose của một số chủng nghi là
Bacillus sp. trên môi trường CMC. ............................................................................ 71
Hình 4.16 Khả năng sinh cellulase của 30 chủng nghi là Bacillus ............................ 71
Hình 4.17 Kết quả PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng BRB2.1 ................. 73
Hình 4.18 Kết quả sàng lọc đoạn gen sboA trong vector pJET1.2............................. 74
Hình 4.19 Cây phả hệ trình tự axít amin subtilosin A của chủng Bacillus BRB 2.1 và
10 chủng tham chiếu. ................................................................................................. 75
Hình 4.20 So sánh đối chiếu trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 với
10 chủng tham chiếu. ................................................................................................. 76
Hình 4.21 Cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 và 10 chủng
tham chiếu. ................................................................................................................. 77
Hình 4.22 So sánh đối chiếu trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10
chủng tham chiếu. ...................................................................................................... 78
Hình 4.23 Cây phát sinh chủng loại của 26 chủng Bacillus với các chủng tham chiếu
dựa trên trình tự 16S rDNA........................................................................................ 79
Hình 4.24 Kết quả khuếch đại bằng PCR các vùng gen ptA (A); rpoD (B); ilvD (C);
glpF (D); pycA (E); purH (F); tpiA (G)...................................................................... 80
Hình 4.25 Cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả phân tích MLST của 26 chủng

Bacillus....................................................................................................................... 83
Hình 4.26 Mô gan tụy của tôm thẻ chân trắng khi lây nhiễm với chủng V.
parahaemolyticus BNB3.1v (A) và BĐB1.4v (B), độ phóng đại 200X. ................... 89
Hình 4.27 Tương quan giữa mật độ cảm nhiễm của chủng V. parahaemolyticus
BĐB1.4v và tỉ lệ tôm chết (tính theo giá trị probit) ................................................... 90
Hình 4.28 Mô gan tụy của TTCT 24 giờ sau cảm nhiễm với chủng V.
parahaemolyticus BĐB1.4v ....................................................................................... 91
Hình 4.29 Tế bào gan tụy tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) .............. 95
độ phóng đại 200X ..................................................................................................... 95

xii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC

TIẾNG ANH

TIẾNG VIỆT

AHPND

Acute Hepatopancreatic
Necrosis Disease

Bệnh hoại tử gan tụy cấp

BHI

Brain heart infusion

Môi trường canh thang não
– tim
Bộ Nông Nghiệp và Phát
triển Nông thôn

BNNPTNT
CMC

Carboxymethyl cellulose

Môi trường CMC

CFU

Colony forming unit

Khuẩn lạc

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axid nucleic

DO

Dissolved oxygen

Oxy hòa tan

EHP

Enterocytozoon Hepatopenaei

Vi bào tử trùng

EMS

Early Mortality Syndromy

Hội chứng tôm chết sớm

ĐC

Đối chứng

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

FAO

Food and Agriculture
Organization of the United
Nations

Tổ chức Nông Lương Thế
giới

IHHNV

Infectious hypodermal and
hematopoietic necrosis virus

Vi rút gây bệnh hoại tử cơ
quan tạo máu và cơ quan lập
biểu mô

IMNV

Infectious myonecrosis virus

Vi rút gây bệnh hoại tử cơ

LAB

Lactic acid bacteria

Vi khuẩn lactic

LB

Luria-Bertani broth

Môi trường LB

MLST

Multi-locus Sequence Typing

Kỹ thuật MLST

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe
agar

Môi trường MRS

NA

Nutrient Agar

Môi trường
dưỡng
xiii

thạch

dinh


NB

Nutrien Broth

Canh trường dinh dưỡng

NCBI

National Center for
Biotechnology Information

Trung tâm Quốc gia về
Thông tin Công nghệ Sinh
học

NGS

Next Generation Sequencing

Giải trình tự thế hệ mới
Nghiệm thức

NT
PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi Polymerase

RFLP

Restriction Fragment Length
Polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn
cắt

RNA

Ribonucleic acid

Axít ribonucleic

SBO

Subtilosin

Môi trường SM

Skim milk medium

Môi trường sữa gầy

TCBS

Thiosulfate-Citrate BileSucrose agar

Môi trường TCBS

TDH

Thermostable Direct
Hemolysin

Độc tố TDH

TRH

TDH Related Hemolysin

Độc tố TRH

TLH

Thermolabile Hemolysin

Độc tố TLH

TSB

Trypto-casein soy broth

Môi trường TSB

TSV

Taura syndrome virus

Vi rút gây hội chứng Taura
Tôm thẻ chân trắng

TTCT
VASEP

Vietnam Association of
Seafood Exporters and
Producers

Hiệp hội Chế biến và Xuất
khẩu Thủy sản Việt Nam

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

WSSV

White spot syndrome virus

Vi rút gây bệnh đốm trắng

YHV

Yellow head virus

Vi rút gây bệnh đầu vàng

pirA

Photorhabdus insect-related
toxin – like gene A

Gen mã hóa độc tố liên
quan Photorhabdus A

pirB

Photorhabdus insect-related
toxin – like gene B

Gen mã hóa độc tố liên
quan Photorhbdus B

xiv


toxR

Cholera toxin transcriptional
activator gene

Gen mã hóa hoạt hóa phiên
mã độc tố tả

tdh

Thermostable direct
hemolysin gene

Gen mã hóa hemolysin trực
tiếp bền nhiệt

trh

TDH-related hemolysin gene

Gen mã hóa hemolysin liên
quan TDH

xv


Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Nuôi tôm nước lợ ở quy mô công nghiệp hiện đang phát triển rất mạnh ở
Đông Nam Á, Nam Á và Châu Mỹ La tinh. Các loài tôm nước lợ được nuôi công
nghiệp nhiều nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm sú
(Penaeus monodon). Nuôi tôm nước lợ công nghiệp là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn,
góp phần quan trọng trong tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của nước ta, đưa Việt
Nam vào nhóm các quốc gia xuất khẩu thủy sản đứng đầu trên thế giới. Năm
2017 cả nước có diện tích nuôi tôm nước lợ là 721.100 ha, đạt sản lượng 701.000
tấn. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với
hơn 91,8% về diện tích và 82,5% sản lượng thu hoạch so với cả nước (Tổng cục
thủy sản, 2018).
Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm
2012, nguồn nguyên liệu tôm nuôi nước lợ cho xuất khẩu thiếu hụt nghiêm trọng,
do dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL; trong đó bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội
chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndromy - EMS) (Lightner et al., 2012) là
nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề nhất. Năm 2010, AHPND bắt đầu xuất hiện tại
vùng ĐBSCL. Đến năm 2011, bệnh này bùng phát thành dịch tôm trên diện rộng,
gây thiệt hại trên 97.000 ha tập trung ở các tỉnh: Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau,
Bến Tre. Năm 2012 dịch bệnh bùng phát thêm các tỉnh Trà Vinh, Kiên Giang,
Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh
Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. Theo báo cáo thống kê của Tổng cục Thủy sản,

năm 2012 diện tích tôm nuôi nước lợ bị AHPND là 46.093 ha, chiếm 45,7% diện
tích tôm nuôi bị bệnh. Trong năm 2017 theo báo cáo của Cục Thú Y, trong cả
nước tổng diện tích tôm nuôi thiệt hại do AHPND là 6.793 ha, chiếm hơn 17,9 %
tổng diện tích tôm nuôi bị bệnh (Báo cáo tổng kết 2017, Cục Thú Y).
Tháng 5/2013, nhóm nghiên cứu của GS. Lightner (Đại học Arizona) đã
công bố kết quả xác định tác nhân gây bệnh của hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở
tôm chính là một chủng vi khuẩn thuộc loài V. parahaemolyticus, chủng Vibrio
này bị nhiễm thể thực khuẩn (phage) tiết ra các độc tố gây chết tôm (Tran et al.,
2013). Ngày 12/6/2013, tại Sóc Trăng, Tổng cục Thủy sản đã đưa ra những kết
luận về tác nhân gây AHPND là do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra (chủng V.
parahaemolyticus có mang phage, và có thể do các loài Vibrio khác). Bên cạnh
1


đó, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy nguồn gốc gây bệnh do vi
khuẩn ở tôm nuôi chủ yếu do vi khuẩn Vibrio gây nên. Vi khuẩn Vibrio có thể
làm chết ấu trùng tôm, chết tôm giống và tôm trưởng thành, gây thiệt hại đáng kể
trong nghề nuôi tôm công nghiệp.
Để khống chế dịch bệnh ở tôm nuôi, hạn chế tác động của AHPND ở tôm nuôi do
nhóm vi khuẩn Vibrio, cần thiết phải nghiên cứu ứng dụng các giải pháp công
nghệ sinh học, kết hợp sử dụng chế phẩm sinh học hữu hiệu để hạn chế sự phát
triển của vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp. Một số chủng Bacillus
đã được áp dụng thành công trong chế phẩm sinh học, ví dụ, chủng B. subtilis
UTM 126 có khả năng sinh chất kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus
(Balcázar et al., 2007), hay hỗn hợp hai chủng B. subtilis L10 và G1 trong thức
ăn giúp tôm tăng trưởng nhanh hơn 1,5 lần và giúp tăng khả năng đề kháng với V.
harveyi thông qua việc kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm (Zokaeifar et al.,
2012). Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio
parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp” được thực hiện nhằm tìm kiếm
giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus, hạn chế dịch

AHPND, đóng góp các giải pháp nuôi tôm công nghiệp hiệu quả và bền vững.
1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu các giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus nhằm kiểm soát dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi.
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
- Phân lập, lựa chọn và đánh giá các chủng Bacillus sp. đối kháng được vi
khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi.
- Đánh giá và xác định được đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn
Bacillus sp. trong ao nuôi tôm sú/tôm thẻ thâm canh.
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng V. parahaemolyticus từ ao nuôi tôm công nghiệp và
nghiên cứu về các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. bằng PCR
- Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến
sự phát triển của chủng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp.

2


- Phân lập các chủng Bacillus sp. từ ao nuôi tôm công nghiệp và đánh giá
tính đối kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus, khả năng sinh enzyme thủy
phân của các chủng phân lập được và xác định gen mã hóa bacteriocin ở chủng
có hoạt tính đối kháng cao.
- Xác định đa dạng di truyền của nhóm Bacillus sp. trong ao nuôi tôm công
nghiệp.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến
sự phát triển của các chủng Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng cao.
- Thử nghiệm khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ
chân trắng (L. vannamei) của vi khuẩn Bacillus sp. ở qui mô phòng thí nghiệm.
1.4 Ý nghĩa nghiên cứu

Kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở khoa học và thực tiễn về đa
dạng di truyền của nhóm vi khuẩn Bacillus sp. và khả năng đối kháng của
Bacillus sp. đối với V. parahaemolyticus trong ao nuôi tôm nước lợ công nghiệp;
tìm kiếm các giải pháp ức chế sự phát triển V. parahaemolyticus gây bệnh Hoại
tử gan tụy cấp trong nuôi tôm công nghiệp.
Kết quả của luận án góp phần vào các giải pháp nuôi tôm công nghiệp bền
vững theo hướng phòng chống bệnh Hoại tử gan tụy cấp bằng giải pháp sinh học.
1.5 Tính mới của luận án:
Luận án đã phân lập được hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis
BĐK2.3 có khả năng đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng
gây AHPND. Lần đầu tiên luận án ứng dụng thành công phương pháp MLST để
phân loại Bacillus sp.
1.6 Thời gian thực hiện
Từ tháng 9/2013 đến 9/2017

3


Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ)
2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới
Ngành nuôi tôm là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn tại nhiều quốc gia trên thế
giới, đặc biệt là tại Châu Á. Giá trị kim ngạch ngành tôm trên toàn thế giới hiện
được ước tính khoảng 40 tỷ USD và dự đoán sẽ đạt mức 68 tỷ USD trong mười
năm tới (Moss, 2018). Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu thị trường, các quốc gia
sản xuất tôm hiện đang gặp rất nhiều thách thức như sự thiếu hụt nguồn cung,
dịch bệnh, ô nhiễm môi trường, sự lạm dụng kháng sinh, hàng rào kỹ thuật của
quốc gia nhập khẩu…
Trước năm 2000, Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia, Ấn Độ có sản lượng
tôm nuôi lớn nhất thế giới trong đó chủ yếu nuôi tôm sú (Portley, 2016). Từ sau

2000, phát triển nuôi tôm thẻ chân trắng (TTCT) được chú ý ở nhiều nước. Theo
Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), sản lượng tôm nuôi
thế giới năm 2013 đạt 4,45 triệu tấn; trong đó có gần 80% là TTCT.
Các báo cáo của FAO cho thấy Trung Quốc hiện đang là nước có sản lượng
tôm nuôi lớn nhất Thế giới, xấp xỉ 1,4-1,6 triệu tấn mỗi năm (GOAL, 2017).
Phần lớn sản lượng tôm này là dành để tiêu thụ trong thị trường Trung Quốc
(Portley, 2016). Cần nhấn mạnh rằng do tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp,
tổng sản lượng tôm của Trung Quốc có xu hướng giảm liên tục trong thời gian
vừa qua (GOAL, 2017).
Ngành nuôi tôm nước lợ ở Thái Lan bắt đầu tại các vùng ven biển vào
những năm 1970. Năm 1990, có đến 15.060 trại nuôi tôm. Năm 1995, số trại nuôi
tăng vọt lên 25.210, đối tượng nuôi chủ yếu là tôm sú. Năm 2010, sản lượng
TTCT đã tăng lên 552.319 tấn (chiếm khoảng 90% tổng sản lượng tôm Thái
Lan). Năm 2011, Thái Lan là quốc gia đứng thứ 2 về sản xuất TTCT trên thế
giới, sau Trung Quốc (Holmyard, 2016). Tuy nhiên, cũng do tình hình dịch bệnh,
tổng sản lượng tôm của Thái Lan trong những năm gần đây giảm xuống mức trên
300000 tấn/năm (GOAL, 2017).
Hội chứng tôm chết sớm hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute
hepatopancreatic necrosis disease hay AHPND) đã được ghi nhận tại nhiều quốc
gia: Trung Quốc năm 2009, Việt Nam năm 2010, Malaysia năm 2011, Thái Lan
năm 2012, Mexico năm 2013, Philippines năm 2014 (Flegel, 2012; Lightner et

4


al., 2012). Đây là nguyên nhân chính gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành nuôi
tôm, đặc biệt là TTCT tại các quốc gia châu Á. Năm 2013, có đến 80-90% diện
tích ao nuôi ở Đông Thái Lan phải ngừng sản xuất do AHPND (Tổng cục Thủy
sản, 2013).
2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam

Nghề nuôi tôm ở Việt Nam hình thành vào những năm đầu thế kỷ 20. Năm
1974, diện tích nuôi tôm nước lợ ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đạt
khoảng 70.000 ha. Ở Miền Bắc, trước năm 1975 có 15.000 ha nuôi tôm nước lợ.
Nghề nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam thực sự phát triển từ sau năm 1987 (Vu Do
Quynh, 1989). Năm 2000, diện tích nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam là 250.000 ha,
đến năm 2003 đạt mức 530.000 ha. Năm 2016, tổng diện tích nuôi tôm nước lợ
đạt 697.645 ha trong đó tôm sú là 600.399 ha và TTCT là 94.246 ha, với tổng sản
lượng đạt 657.282 tấn trong đó tôm sú là 263.853 tấn và 393.429 tấn TTCT. Năm
2017, cả nước có tổng diện tích thả nuôi là 721.100 ha, sản lượng 701.000 tấn;
tăng 3,8% về diện tích và tăng 6,7% sản lượng so với 2016 (Tổng cục Thủy sản,
2018).
Với các ưu thế về điều kiện tự nhiên, ĐBSCL là vùng nuôi tôm nước lợ chủ
yếu của cả nước, với tổng diện tích tôm nuôi khoảng trên 600.000 ha. Trong năm
2016, ĐBSCL chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với hơn 91,8% về diện tích và
82,5% sản lượng thu hoạch của cả nước. Năm 2017, diện tích nuôi tôm sú vùng
ĐBSCL chiếm 94,3% và TTCT chiếm 75,8% diện tích nuôi của cả nước; tương
ứng với sản lượng tôm sú chiếm 94,7% và TTCT chiếm 74,4% so với tổng sản
lượng tôm nuôi của cả nước (Tổng cục Thủy sản, 2018).
Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (BNNPTNT),
năm 2010, khoảng 40.000 ha nuôi tôm ở ĐBSCL có mức độ thiệt hại vì dịch
bệnh từ 20 đến 80%, nhất là tại các tỉnh Cà Mau, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng,
Kiên Giang. Đỉnh điểm vào năm 2012, diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại vì
dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL khoảng trên 100.000 ha (trong đó tôm sú là 91.174
ha và tôm thẻ 7.068 ha). Bệnh ở tôm nuôi thường gặp nhất là AHPND, sau đó là
đốm trắng, đầu vàng. Trong hai năm 2010 và 2011, AHPND đã bùng phát thành
dịch, gây thiệt hại hơn 97 nghìn ha, tập trung ở các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà
Mau, Bến Tre. Năm 2012, AHPND tiếp tục diễn ra tại Trà Vinh, Kiên Giang, và
lan rộng tới một số tỉnh ven biển phía Bắc và Bắc Trung bộ, Nam Trung bộ. Ở
nước ta đã có quy hoạch phát triển nghề nuôi tôm nước lợ từ cấp quốc gia, cấp

5


tỉnh, cấp huyện. Tuy nhiên, do việc phát triển tràn lan diện tích nuôi tôm tại một
số khu vực dẫn đến ô nhiễm môi trường, sự lạm dụng của thuốc thú y, mật độ thả
nuôi cao, dịch bệnh trên tôm nuôi thường xuyên xảy ra, gây thiệt hại lớn cho người
nuôi.
2.2 Tình hình dịch AHPND ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam
Theo Lightner et al. (2012), năm 2009, bệnh hoại tử gan tụy cấp lần đầu
xuất hiện và được gọi tên là “hội chứng tôm chết sớm”. Tới năm 2011 bệnh được
gọi dưới tên “hội chứng hoại tử gan tụy cấp” (AHPNS) dựa trên mô tả bệnh tích.
Tới năm 2013 khi tác nhân gây bệnh được xác định do một số chủng V.
parahaemolyticus, bệnh được gọi tên “bệnh hoại tử gan tụy cấp”. AHPND xảy ra
ở giai đoạn đầu tôm nuôi thương phẩm (cả ở tôm thẻ chân trắng và tôm sú), khả
năng gây thiệt hại có thể lên đến 100% trong vòng 20-30 ngày sau khi thả nuôi.
Tôm bị bệnh có gan tụy sưng hoặc teo, trắng nhạt; vỏ mềm, tăng trưởng chậm,
khi sắp chết tôm chìm xuống chết ở đáy ao (Lightner et al., 2012).
Năm 2010 dịch bệnh lan rộng ở Trung Quốc và bắt đầu lan ra ở một số vùng
nuôi tôm ở Việt Nam. Tại Malaysia, AHPND xuất hiện đầu tiên năm 2010 ở
Johor. Ở Thái Lan, năm 2012, khoảng 0,7% tổng số ao nuôi tôm đã bị nhiễm bởi
AHPND, xảy ra ở các tỉnh Rayong, Chantaburi, Trat (Flegel, 2012). Nghiên cứu
trong và ngoài nước trong thời gian này cho rằng nguyên nhân gây nên AHPND
có thể do nhiều loại tác nhân khác nhau: vi khuẩn, virus, độc tố từ tảo hoặc từ
thuốc trừ sâu và quản lý ao nuôi không tốt.
Ở Việt Nam trong nhiều năm qua ở ĐBSCL, tôm nuôi chết hàng loạt trên
diện rộng do virus gây bệnh đốm trắng và dịch AHPND (Đặng Thị Hoàng Oanh
và Nguyễn Thanh Phương, 2012; Bùi Quang Tề, 2003). Năm 2011, diện tích tôm
chết nhiều nhất, ở một số tỉnh ĐBSCL thiệt hại lên tới 97.691 ha diện tích nuôi.
Năm 2012 cả nước có khoảng 100.776 ha diện tích tôm nước lợ bị thiệt hại do
dịch bệnh (trong đó 91.174 ha nuôi tôm sú và 7.068 ha nuôi tôm thẻ) bao gồm

dịch bệnh đốm trắng, đầu vàng và dịch AHPND. Các tỉnh có diện tích tôm nuôi
bị thiệt hại nhiều là Sóc Trăng 23.371,5 ha (chiếm 56,6 % diện tích thả nuôi); Bạc
Liêu 16.919 ha (chiếm 41,9 % diện tích thả nuôi); Bến Tre 2.237 ha (chiếm 29,1
% diện tích thả nuôi); Trà Vinh 12.200 ha tôm sú (chiếm 49,3 % diện tích thả
nuôi) và 24,2 ha tôm thẻ chân trắng; Cà Mau diện tích tôm nuôi công nghiệp bị
bệnh là 958,58 ha, tăng nhiều hơn so với năm 2011 là 420,02 ha (Tổng cục Thủy
sản, 2012; 2013). Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long của Việt Nam, năm 2015 bệnh
AHPND trên tôm thẻ chân trắng gây thiệt hại 8,9 triệu đôla và trên tôm sú là 1,8
6


triệu đôla (Tổng cục Thủy sản, 2016). Ngoài ra, tổng diện tích nuôi tôm nước lợ
bị thiệt hại do dịch bệnh năm 2018 là 12.359 ha
Ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã xác định nguyên nhân gây AHPND ở
tôm nuôi bao gồm: tôm giống có chất lượng không đảm bảo (nhiễm Vibrio, có
dấu hiệu bất thường gan tụy, thậm chí đã hoại tử gan tụy cấp), thả nuôi trong điều
kiện môi trường bất lợi (hiện diện của thuốc bảo vệ thực vật, oxy hòa tan thấp, độ
mặn cao, ô nhiễm hữu cơ..) và có hiện diện của Vibrio và phage (Đặng Thị
Hoàng Oanh, 2012). Năm 2013, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I đã phân
lập được một số loài vi khuẩn Vibrio (V. alginolyticus, V. ordalii, V. vulnificus, V.
fischerii) trên tôm bị AHPND, đồng thời khẳng định tảo độc không liên quan đến
hiện tượng tôm chết do hoại tử gan tụy. Khảo sát tại một số vùng vừa xảy ra
AHPND ở khu vực phía Bắc đầu năm 2013, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản
I đã phát hiện tôm bị AHPND có nhiễm Vibrio sp. với tỷ lệ cao, đặc biệt là V.
vulnificus và V. parahaemolyticus.
2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi
Tác nhân gây AHPND là do các chủng V. parahaemolyticus có khả năng
sinh độc tố PirA/PirB. Nhận định này đi từ các thử nghiệm nhân tạo trong đó dịch
nuôi cấy chủng gây bệnh V. parahaemolyticus được lọc tiệt trùng (để loại bỏ vi
khuẩn) trước khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tôm khỏe cũng sẽ gây ra

các triệu chứng tương tự AHPND (Tran et al., 2013). Tiếp đó, bằng cách sử dụng
công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, Yang et al. (2014) đã giải trình tự toàn bộ
hệ gen của 3 chủng V. parahaemolyticus gây AHPND và một chủng không gây
bệnh. Kết quả so sánh dữ liệu giải trình tự cho thấy tồn tại một plasmid đặc trưng
có kích thước khoảng 70 kb ở cả 3 chủng gây bệnh. Plasmid này không tồn tại ở
chủng lành tính và được đặt tên là pVA1 (Hình 2.1). Phân tích trình tự của
plasmid này cho thấy nó có mang hai gen pirA và pirB (Hình 2.2) mã hóa cho các
protein có độ tương đồng cao với độc tố nhị thể PirA/PirB của Photorhabdus vốn
gây độc cho các loài côn trùng (Yang et al., 2014). Vai trò của các protein này
đối với AHPND sau đó được khẳng định bởi nhiều nghiên cứu (Lai et al., 2015;
Tinwongger et al., 2016; Theethakaew et al., 2017). Hiện nay, các protein này
của V. parahaemolyticus chính thức được đặt tên là PirA/PirB.

7


Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pVA1 và vị trí các gen pirA và pirB

Hình 2.2 Vị trí gen pirA và pirB trên plasmid pVA1 của V. parahaemolyticus
2.4 Chẩn đoán AHPND và các biện pháp phòng, trị bệnh trên tôm nuôi
2.4.1 Chẩn đoán AHPND
Bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi có thể được chẩn đoán thông qua phân
tích mô học (quan sát mô gan tụy) hoặc phát hiện gen mã hóa độc tố bằng kỹ
thuật PCR. Khi quan sát các ống gan tụy của tôm bệnh, có thể thấy sự thoái hóa
của mô ở nhiều vị trí khác nhau (các mô gan tụy bị bong tróc thành các hạt hình
tròn trong lòng ống) (Hình 2.3) (Nunan et al., 2014). Ngoài ra, vào giai đoạn cuối
của bệnh, phản ứng viêm và nhiễm khuẩn thứ cấp cũng có thể được quan sát thấy
(Nunan et al., 2014). AHPND cũng có thể được chẩn đoán bằng phương pháp
PCR một bước, phát hiện sự có mặt của gen pirA hoặc pirB với độ chính xác cao
trên 90% (Han et al., 2015; Sirikharin et al., 2015). Ngoài ra, phương pháp PCR

lồng AP4, real-time PCR với mẫu dò TaqMan, hay kỹ thuật khuếch đại đẳng
nhiệt LAMP cũng đã được áp dụng để phát hiện AHPND với độ chính xác cao
mà không cần đến bước làm giàu vi khuẩn (Koiwai et al., 2016).

8