Khóa luận tốt nghiệp: Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài tía tô Perilla frutescens

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.74 MB, 68 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI TÍA TƠ

Perilla frutescens

Giáo viên hướng dẫn : TS. CẦM THỊ ÍNH

HÀ NỘI – 2021

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI TÍA TƠ

Perilla frutescens

HÀ NỘI - 2021

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em muốn gửi lời cảm ơn và biết ơn chân thành của mình tới tất cả các thầy cơ, gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Em xin chân thành tỏ lòng biết ơn đến TS. Cầm Thị Ính, người cơ đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho em hồn thành khóa luận này.

Và em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học và các cán bộ nghiên cứu Phịng Hóa sinh Nơng nghiệp và Tinh dầu, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất cho em hồn thành khóa luận.

Cuối cùng em xin dành tất cả sự quý trọng tới gia đình, bạn bè và những người thân thiết đã động viên em trong việc hoàn thành giai đoạn học tập quan trọng này.

Một lần nữa, xin cảm ơn tất cả mọi người. Kính chúc mọi người nhiều sức khỏe và hạnh phúc trong cuộc sống.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 1 tháng 5 năm 2021.

Sinh viên

Bùi Thùy Linh

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của Perilla frutescens ... 6

1.2.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Perilla frutescens ... 20

1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước về Tía Tơ ... 24

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu ... 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu ... 26

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học ... 26

2.2.2 Điều kiện thực nghiệm nghiên cứu thành phần hóa học ... 27

2.2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ... 27

2.3 Thực nghiệm nghiên cứu ... 29

2.3.1 Thực nghiệm xử lý nguyên liệu ... 29

2.3.2 Thực nghiệm đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ... 31

2.3.3 Thực nghiệm phân lập các hợp chất ... 31

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 34

3.1 Kết quả thu nhận tinh dầu Tía Tơ và xác định thành phần các hợp chất có trong tinh dầu ... 34

3.1.1. Thu nhận tinh dầu Tía Tơ ... 34

3.1.2 Thành phần các hợp chất có trong tinh dầu ... 35

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại khoa học của Tía Tơ ... 5 Bảng 1.2. Các axit phenolic, flavonoid và anthocyanin đã được tìm thấy trong

lồi Tía Tơ P. frutescens ... 8 Bảng 1.3. Các hợp chất dễ bay hơi được tìm thấy trong lồi P. frutescens

... 10

Bảng 1.4. Các hợp chất triterpene, phytosterol, axit béo, polyconsanol và

tocopherrol có trong lồi P. frutescens. ... 18

Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu có trong Tía Tơ tươi bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ... 34 Bảng 3.2. Thành phần các hợp chất có mặt trong tinh dầu Tía Tơ khơ (TT1) ... 36 Bảng 3.3. Thành phần các hợp chất có mặt trong tinh dầu Tía Tơ tươi (TT2) ... 38 Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ... 40

Bảng 3.5. Số liệu phổ của T1A1 ... 44

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Perilla frutescens var crispa ... 4

Hình 1.2. Perilla frutescens var frutescens ... 4

Hình 1.3. Cây Tía Tơ ... 5

Hình 1.4. Hình vẽ mơ tả bộ phận cây Tía Tơ ... 6

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các hợp chất ưa nước chính được xác định

Hình 2.1. Lá Tía Tơ đã được cắt nhỏ ... 29

Hình 2.2. Mẫu đã cắt đổ ngập nước trong nồi chưng cất ... 29

Hình 2.3. Bộ chưng cất tinh dầu ... 29

Hình 2.4. Tinh dầu Tía Tơ ... 29

Hình 2.5. Tía Tơ sau sấy ... 30

Hình 2.6. Ngâm chiết Tía Tơ ... 30

Hình 3.1. Tinh dầu Tía Tơ tươi và tinh dầu Tía Tơ khơ ... 35

Hình 3.2. Sắc ký đồ của tinh dầu Tía Tơ khơ (TT1)... 36

Hình 3.3. Sắc ký đồ của tinh dầu Tía Tơ tươi (TT2) ... 38

Hình 3.4. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn chiết của Tía Tơ ... 41

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-13

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DPPH : 1,1 - diphenyl -2- picrylhydrazyl

ESI-MS : Electrospray Ionisation Mas Spectrometry GC-MS : Gas Chromatography - Mass Spectrometry HMBC : Heteronuclear Muiltiple Bond Conelation

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton H-1

HSQC : Heteronuclear Muiltiple Quantum Cohenrence MIC : Minimum Inhibitory Concentration

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, mưa nhiều, cây cối tươi tốt quanh năm, thảm thực vật rất phong phú và đa dạng. Theo thống kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” (của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới IUCN) tại Việt Nam hiện có gần 12.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, Tía Tơ là một lồi cây gia vị được trồng nhiều và sử dụng rất phổ biến ở Việt Nam. Đây là loại cây khơng chỉ có giá trị dinh dưỡng cao, dùng để ăn kèm với nhiều món ăn ngon mà cịn là vị thuốc trong y học Việt Nam. Trong y học cổ truyền Tía Tơ được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa nhiều bệnh như ngộ độc, đau bụng, nôn mửa, cảm mạo, ho,… [1][2].

Ngồi ra, tinh dầu lá Tía Tơ có hoạt tính sinh học và dược lý cao nên đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như thực phẩm, y học và mỹ phẩm [46]. Tinh dầu lá Tía Tơ được sử dụng làm hương liệu, phụ gia thực phẩm khá phổ biến tại các quốc gia như Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Mỹ… Tinh dầu Tía Tơ cịn được sử dụng bảo quản thịt cá và các loại thực phẩm khác. Chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ, hoạt tính cao, an tồn cho sức khỏe và có thể áp dụng cho mọi loại thực phẩm ở mọi giá trị pH [14]. Trong lĩnh vực y học, nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh tác dụng dược lý của tinh dầu Tía Tơ như trị ho, hạ sốt, kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống dị ứng, điều trị khối u và ung thư. Với tác dụng kháng khuẩn và tạo hương, tinh dầu Tía Tơ cịn được sử dụng nhiều trong sản xuất nước hoa, kem trị mụn và các sản phẩm hóa – mỹ phẩm như xà phòng, sữa dưỡng thể, kem dưỡng và muối tắm [32]. Tinh dầu Tía Tơ cịn được sử dụng để làm giảm căng thẳng, mệt mỏi và giúp cơ thể tươi trẻ hơn bằng việc xông hơi, massage [14].

Có thể nói Tía Tơ được xem là loại cây có giá trị sử dụng và giá trị kinh tế to lớn và đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Nhằm mục đích nghiên cứu xác định một số thành phần hóa học trong

Tía Tơ, đề tài “Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của lồi Tía Tơ Perilla frutescens” được tiến hành.

Mục tiêu nghiên cứu:

- Thu nhận tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Xác định thành phần các hợp chất có trong tinh dầu của Tía Tơ bằng phương pháp sắc ký GC-MS.

- Tạo các cặn chiết etanol, diclometan, etyl axetat từ lồi Tía Tơ. Phân lập cặn chiết etyl axetat và xác định cấu trúc của chất sạch.

- Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu Tía Tơ. Ý nghĩa thực tiễn

- Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Tía Tơ, khai thác và tìm hiểu ứng dụng của cây Tía Tơ.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Chi Perilla

Chi Perilla (chi Tía Tơ) là một chi có thể có nguồn gốc từ vùng Đơng Á,

thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae). Chi này bao gồm một số giống thảo mộc, hạt giống và cây rau khác của Châu Á. Nguồn gốc chi Perilla có thể từ vùng núi của Ấn Độ và Trung Quốc, sau được nhân trồng khắp nơi ở châu lục. Các loài trong chi này cũng được trồng ở vùng có khí hậu ơn hịa của Châu Âu. Ở Mỹ

và Ukrina còn thấy chúng mọc trong tự nhiên [1]. Đến nay chi Perilla được

ghi nhận có 4 lồi và có khá nhiều “thứ”.

Tía Tơ có tên khoa học là Perilla frutescens, tuy nhiên đến nay cũng ghi

nhận nhiều dạng chemotaxonomy của Tía Tơ [1]. Do đặc điểm hình thái rất đa dạng nên việc phân loại các giống Tía Tơ vẫn cịn được bàn luận mà chưa đi đến thống nhất. Theo màu sắc lá, Tía Tơ có 2 giống: lá xanh và lá tím. Dựa trên mục đích sử dụng, Tía Tơ được chia thành hai giống chính [6]:

- Perilla frutescens var crispa: Thường trồng làm thuốc, cất tinh dầu hoặc làm

rau gia vị. Trong thành phần tinh dầu của giống này có chứa hàm lượng lớn perilla aldehyde – chất tạo hương thơm của cây. Giống này được trồng rộng rãi ở Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam hay Mỹ...

- Perilla frutescens var frutescens: hạt lớn có hàm lượng dầu cao, thường

được trồng để sản xuất dầu hạt. Tinh dầu của giống này thường khơng chứa perilla aldehyde. Lá có mùi hương gần giống lá vừng, thường được trồng và sử dụng phổ biến ở Hàn Quốc.

Ở Việt Nam cây Tía Tơ cịn được gọi là cây Tử Tô, Tử Tô Tử hay Tô Ngạnh, Hom Tô (tiếng Thái), Phằn Cưa (tiếng Tày) [1][2]. Theo nghiên cứu người ta chia Tía Tơ thành hai giống dựa trên đặc điểm hình thái. Một giống Tía Tơ có mép lá phẳng, mặt trên màu xanh, mặt dưới màu tím đỏ, thân có sọc đỏ, hoa đỏ và có mùi thơm nhẹ. Giống thứ hai có mép lá quăn, màu tím đậm hơn ở cả hai mặt lá và có mùi thơm mạnh hơn. Tuy nhiên cả hai giống đều có perilla andehyde trong tinh dầu. Các giống Tía Tơ trên đều được trồng

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

hoặc mọc hoang, trong đó giống Tía Tơ lá tím là giống được trồng phổ biến nhất và ứng dụng rộng dãi trong nhiều lĩnh vực [1].

Hình 1.1. Perilla frutescens var

crispa

Hình 1.2. Perilla frutescens var frutescens

Tía Tơ là cây ưa sáng và ưa ẩm; thích nghi với những vùng khí hậu ơn hịa, nhiệt độ trung bình năm là 18 đến 23°C. Ở những vùng có khí hậu nhiệt đới điển hình như các tỉnh phía nam, cây thường chỉ trồng được vào mùa mưa. Tía Tơ ra hoa kết quả nhiều. Sau khi quả già, cây tàn lụi, hạt giống phát tán xung quanh, đến mùa mưa ẩm năm sau mới nẩy mầm. Tuy nhiên, do nhu cầu sử dụng rau gia vị nhiều, nên ở vùng ngoại thành Hà Nội, người ta có thể trồng Tía Tơ gần quanh năm. Ở Hàn Quốc, Nhật Bản và Trung Quốc, Tía Tơ được trồng đến hàng chục ngàn hecta để thu hoạch hạt cất tinh dầu [1].

1.2 Tía Tơ Perilla frutescens

Tía Tơ có danh pháp khoa học là Perilla frutescens L. thuộc họ Bạc Hà

(Lamiaceae). Tên thường gọi: Tử Tô, Tô Ngạnh, Tô Diệp [2].

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Hình 1.3. Cây Tía Tơ

Cây Tía Tơ được phân loài trong hệ thống phân loại khoa học như sau [3]:

Bảng 1.1. Phân loại khoa học của Tía Tơ

Giới Thực vật (Plantae)

Ngành Thực vật có mạch (Magnoliophyta)

Lớp Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida)

Bộ Hoa môi (Lamiales)

Họ Hoa mơi (Lamiaceae) hay Húng hoặc Bạc Hà

Lồi Perilla frutescens (L.) Britton

1.2.1 Đặc điểm thực vật [1][2]

Cây nhỏ, cao 0,5 – 1m. Thân vuông, mọc đứng, phân cành nhiều, có rãnh dọc và có lơng. Lá mọc đối, hình bầu dục, dài 2 – 3cm, gốc trịn, mép khía răng và uốn lượn, mặt trên xanh lục, mặt dưới màu tía, có khi cả hai mặt đều tía, có lơng. Cuống lá dài. Khi vị ra, lá có mùi thơm đặc biệt.

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Cụm hoa mọc ở kẽ lá và đầu cành, dài 6 – 20cm. Lá bắc hình mác, dài hơn hoa; hoa nhỏ, màu trắng hay tím, dài hình chng, phình ra ở phía dưới, môi trên cụt, 3 răng bằng nhau, ngắn, môi dưới 2 răng; tràng có ống hình chng, có lơng ở mặt ngồi, gồm 5 cánh; nhị 4, ẩn trong tràng, bao phấn hình chim, lúc đầu song song sau chẽ ra; bầu có vịi nhụy xẻ đơi.

Quả bế, hình cầu, đường kính 1mm, màu nâu sáng.

Hình 1.4. Hình vẽ mơ tả bộ phận cây Tía Tơ

Mùa hoa quả: tháng 5 – 8.

– Tía Tơ có mùi thơm rất đặc trưng, thương dùng làm gia vị.

– Tính vị: có vị cay, tính ơn, mùi thơm, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu thủng. Lá Tía Tơ có tác dụng làm cho ra mồ hôi, trị cảm, giải độc,…Cành Tía Tơ có tác dụng chữa ho có đờm, hen suyễn, tê thấp. Dầu hạt Tía Tơ ở Ấn Độ, Trung Quốc và Nhật Bản được dùng trong kỹ nghệ vẽ trên đồ sứ, thực phẩm.

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của Perilla frutescens

Trên thế giới có rất nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học về thành phần hóa học của Tía Tơ.

Trong hạt, thân và lá Tía Tơ có 271 hợp chất đã được nhận biết hoặc phân lập. Dựa trên các đặc tính hóa học, các tác giả phân loại 271 hợp chất thành 2 nhóm: nhóm các hợp chất ưa nước và nhóm các hợp chất kỵ nước. Trong đó, nhóm các hợp chất ưa nước gồm có các axit phenolic, flavonoid, anthocyanin và nhóm các hợp chất kỵ nước (ưa béo) là các hợp chất dễ bay hơi như các triterpene, phytosterol, axit béo, tocopherol và policosanol [9].

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Các hợp chất đã được phân loại, liệt kê trong bảng 1.2, 1.3 và 1.4 và cấu trúc của một số hợp chất có trong hình 1.5, 1.6, 1.7 và 1.8.

 Các hợp chất phenolic, flavonoid và anthocyanin

Trong Tía Tơ thường có các hợp chất phenolic. Peng và cộng sự đã xác định được các hợp chất catechin, axit ferulic, apigenin, luteolin, axit rosmarinic và axit caffeic bằng phương pháp điện di mao quản trong lá và hạt Tía Tơ [39]. Meng và cộng sự đã xác định các polyphenol khác nhau từ các

giống Tía Tơ khác nhau (var crispa và var frutescens). Bao gồm các dẫn xuất

của axit cinnamic (axit coumaroyl tartaric, axit caffeic, axit rosmarinic), flavonoid (apigenin 7- O -caffeoylglucoside, scutellarein 7- O -diglucuronide, luteolin 7 O diglucuronide, apigenin 7 O diglucuronide, luteolin 7 O -glucuronide, scutellarein 7- O -glucuronide) và các anthocyanin (chủ yếu là cisshisonin, shisonin, malonylshisonin và cyanidin 3 O (E) -caffeoylglucoside-5- O -malonylglucoside) [36].

Axit rosmarinic là một trong những hợp chất phenolic chính trong lá Tía Tơ và nghiên cứu gần đây cho thấy xuất hiện nhiều các thành phần phenolic ở giai đoạn ra hoa đầy đủ [32]. Meng và các cộng sự đã chứng minh rằng màu đỏ được tạo ra bởi sự hiện diện của một anthocyanin chính là malonylshisonin, 3- O - (6- O - (E) -p-coumaryl-β- D -glucopyranosyl) -5- O -

(6 - O -malonyl-β-d-glucopyranosyl) –cyanidin [36], và các hợp chất anthocyanin khác cũng có liên quan trong hình thành cao tế bào biểu bì của lá và thân cây lá đỏ [45]. Các mẫu lá xanh chỉ cho thấy một lượng nhỏ các hợp chất loại anthocyanin trong số tất cả các hợp chất polyphenol. Bảng 1.2 dưới đây chỉ ra các hợp chất thuộc nhóm axit phenolic, flavonoid và các anthocyanin đã tìm thấy ở các phận khác nhau của Tía Tơ.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Bảng 1.2. Các axit phenolic, flavonoid và anthocyanin đã được tìm thấy trong lồi Tía Tơ P. frutescens

3 Axit caffeic-3-O-glucoside Hạt giống [19,49]

6 Axit Rosmarinic Thân, Lá, Hạt [18,19,28,32,36,39, 45,49]

7 Axit Rosmarinic metyl este Hạt giống [28,49]

8 Axit Rosmarinic-3-O-glucoside Hạt giống [19,49]

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Tinh dầu (EOs) là một loại chất chuyển hóa thứ cấp có thể được chiết xuất từ các cơ quan thực vật có mùi thơm khác nhau như hoa, chồi, thân, vỏ, lá, quả,… [9]. Các thành phần phổ biến nhất của chúng là tecpenoid, các hợp chất thơm và béo. Một số giống được phân biệt bởi các thành phần hóa học khác nhau của tinh dầu chiết xuất từ các cơ quan thực vật của chúng như một thành phần chính của dầu được gọi là chemotype.

Tới nay từ tinh dầu của P. frutescens đã xác định được 193 hợp chất khác

nhau (bảng 1.3), trong đó các hợp chất chủ yếu là 2-acetylfuran, perilla aldehyde, caryophyllene, laurolene, 2-hexanoylfuran, 2-butylamine, α-asarone, farnesene, α-caryophyllene, (Z, E) -farnesene, perilla ketone, dehydro-elsholtzia ketone, limonene, shisofuran, farnesene (Z, E, α), β-caryophyllene, và trans-shisool [9].

Ngồi ra, phương pháp chiết xuất cũng có thể có ảnh hưởng đáng kể đến thành phần của chất chiết xuất. Huang và cộng sự [20] so sánh q trình chưng cất lơi cuốn hơi nước, trích ly chất lỏng siêu tới hạn (SFE-CO2) và vi chiết pha rắn (HS-SPME) sau đó phân tích sắc ký khí-khối phổ (GC-MS) các hợp chất dễ bay hơi và tìm thấy 64 hợp chất, chủ yếu là perilla aldehyde và xeton. Tian và cộng sự [42] đã xác định được 119 hợp chất từ tinh dầu Tía Tơ từ 11 bộ phận khác nhau. Bảng 1.3 dưới đây cho biết các hợp chất dễ bay hơi

được tìm thấy trong loài P. frutescens.

Bảng 1.3. Các hợp chất dễ bay hơi được tìm thấy trong lồi P. frutescens

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

77 All- trans –squalene Lá [20]

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

141 Cis oxide cris Lá [15]

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất bay hơi được xác định trong P. frutescens.

Carotenoid là các sắc tố hữu cơ, thuộc nhóm tetraterpenoid và phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có trong lục lạp. Hàm lượng carotenoid của Tía Tơ so với các loại cây giàu β-caroten (cà rốt, rau bina) hoặc giàu lutein (rau bina, bông cải xanh, rau diếp) cao hơn gấp 5 lần [9]. Các triterpene (bảng 1.4, hình 1.7) bao gồm cả axit dayic, axit oleanolic và axit ursolic được xác định trong Tía Tơ bằng phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Ngoài ra cịn có một số phytosterol (bảng 1.4, hình 1.8) như các hợp chất ampesterol, stigmasterol, β-sitosterol, β-amyrin, axit oxalic, triacylglycerol đã được tìm thấy trong hạt Tía Tơ. Hàm lượng của β-sitosterol đã được chứng minh là tương quan với hàm lượng của axit linolenic [30].

Các chất sáp, độ ẩm và chất béo thơ từ hạt Tía Tơ lần lượt chiếm khoảng 72mg/100g, 5,6–8,2% và 51,2–48,4%. Các thành phần chính của sáp là policosanol (25,5–34,8%), este sáp, este steryl và aldehyde (53,0–49,8%), hydrocacbon (18,8–10,5%), axit (1,7–2,1%) và triacylglycerol (1,0–2,9%),

được phân tích bằng HPLC. Policosanol được chiết xuất trong sáp của hạt P.

frutescens cũng được xác định bằng GC là 67–68% octacosanol, 16–17%

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

hexacosanol, và 6–9% triacontanol. Hạt của cây Tía Tơ rất giàu chất Policosanol với 427,83mg/kg dầu [27]. Bảng 1.4 cho biết các hợp chất

triterpene, phytosterol, axit béo, polyconsanol và tocopherrol có trong lồi P.

frutescens.

Bảng 1.4. Các hợp chất triterpene, phytosterol, axit béo, polyconsanol và tocopherrol có trong lồi P. frutescens.

252 Axit linoleic Hạt giống [11,30,31,33,34,40]

253 Axit linolenic Hạt, lá [11,30,31,33,34,40]

254 Axit oleic Hạt giống [11,20,30,31,33,40]

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

256 Axit pentadecanoic Hạt giống [30]

257 Axit stearic Hạt giống [11,30,31,33,34,40]

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của các hợp chất kỵ nước chính được xác định

trong P. frutescens.

1.2.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Perilla frutescens

Hoạt tính sinh học của Tía Tơ P. frutescens là do các hợp chất có mặt

trong lồi rất phong phú, sự hiện diện của các nhóm hợp chất làm cho Tía Tơ có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau.

 Hoạt tính chống oxy hóa

Khả năng chống oxy hóa cao của P. frutescens là do trong cây chứa hàm

lượng axit phenolic, flavonoid và carotenoid khá cao. Chiết xuất từ hạt và lá Tía Tơ thể hiện hoạt tính chống oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ. Axit

rosmarinic và luteolin được phân lập từ quả P. frutescens var acuta cho thấy

khả năng bao vây các gốc tự do (DPPH) đáng kể với nồng độ ức chế IC50 lần lượt là 8,61 và 7,50µM [18]. Axit rosmarinic được phân lập từ lá Tía Tơ thể

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

hiện hoạt tính bao vây gốc tự do (DPPH) là 88,3 ± 0,7% ở nồng độ 10μg/mL với SC50 (nồng độ sống sót 50%) là 5,5 ± 0,2μg/mL [1]. Tian và cộng sự đã chứng minh rằng hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu Tía Tơ có thể phụ

thuộc vào vị trí trồng trọt [42]. Dịch chiết của P. frutescens thu hoạch từ các

vùng khác nhau cũng thể hiện khả năng loại bỏ các gốc tự do ở các mức độ khác nhau (nồng độ 10mg/mL) với khả năng tỷ lệ ức chế là 94,80 ± 0,03%. Chiết xuất 80% metanol của hạt Tía Tơ thể hiện đặc tính chống oxy hóa mạnh.

Hợp chất flavonoid là luteolin trong hạt Tía Tô đã đảo ngược đáng kể độc tính tế bào do hydrogen peroxide gây ra trong các tế bào thần kinh vỏ não. Luteolin làm suy giảm rõ rệt quá trình phản ứng oxy hóa ROS (reactive oxygen species) và ngăn chặn sự giảm hoạt động của ty thể, catalase và glutathione trong các tế bào thần kinh chính bị ROS tác động, ngăn ngừa các bệnh thối hóa thần kinh. Trong một nghiên cứu khác, luteolin ức chế q trình peroxy hóa của axit linoleic.

Monoterpene là perilla aldehyde đã được chứng minh là một chất cảm ứng thioredoxin mạnh khi nó kích hoạt hệ thống Nrf2-Keap1. Khả năng chống oxy hóa của Tía Tơ có thể khác nhau giữa các loại cây khác nhau, lá Tía Tơ tím cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao hơn và ngăn chặn q trình oxy hóa lipoprotein mật độ thấp (LDL) so với lá xanh. Một nghiên cứu khác cho thấy rằng hợp chất 2′, 3′-dihydroxy-4′, 6′-dimethoxychalcone (DDC) được tìm thấy trong lá Tía Tơ xanh giúp tăng cường khả năng chống lại tổn thương oxy hóa của tế bào thơng qua việc kích hoạt con đường phản ứng chống oxy hóa Nrf2 (ARE) [26].

 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Dịch chiết etanol của hạt Tía Tơ (đã khử chất béo) ức chế yếu sự phát triển của các chủng vi khuẩn gây bệnh ở miệng. Nhưng chiết xuất giàu polyphenol từ hạt Tía Tơ đã thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ chống

lại Streptococci (gây bệnh ở miệng và vi khuẩn Porphyromonas gingivalis

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

(vi khuẩn gây hôi miệng). Trong số các polyphenol, luteolin cho thấy hoạt

tính kháng khuẩn rõ rệt chống lại vi khuẩn ở miệng. Ngồi ra, hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu từ lá Tía Tơ đối với vi khuẩn Gram dương và Gram âm đã được nghiên cứu, và kết quả cho thấy hiệu quả của tinh dầu này trong việc ức

chế sự phát triển của vi khuẩn đã được thử nghiệm. Vi khuẩn Staphylococcus

aureus và Escherichia coli bị ức chế với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là

500μg/mL và 1250μg/mL, tương ứng. Hợp chất perillaldehyde, ức chế hoạt

động của chống lại nấm sợi M. mucedo và P. chrysogenum với giá trị MIC

đối với đã ở nồng độ 62,5pg/mL [9].

Tác dụng diệt nấm của dịch chiết của Tía Tơ đã được chứng minh trong

các trường hợp của các nấm Aspergillus flavus, Aspergillus

oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae và Alternaria alternate [42].

 Tác dụng chống dị ứng

Dịch chiết nước của P. frutescens thể hiện tác dụng chống dị ứng in vivo và in vitro. Dịch chiết P. frutescens (0,05 đến 1g/kg) ức chế đáng kể các phản

ứng dị ứng toàn thân được kích hoạt bởi anti-DNP IgE ở chuột theo cách phụ

thuộc vào liều lượng. Tương tự, chiết xuất nước của lá loài P. frutescens đã

được chứng minh là có kết quả tích cực chống lại bệnh viêm da dị ứng trên

mơ hình động vật. Tác dụng chống dị ứng của dịch chiết lá P. frutescens

(PFL) đối với bệnh viêm da dị ứng do 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) gây ra ở chuột C57BL/6 đã được đánh giá và kết quả cho thấy chiết xuất dạng nước (100μg/mL) của PFL có thể ức chế đáng kể tình trạng viêm dị ứng do DNFB gây ra bằng cách làm giảm bớt sự biểu hiện của MMP-9 và IL-31, cũng như tăng cường hoạt động T-bet. Trong một thí nghiệm khác, sử dụng phản ứng phản vệ da thụ động ở tai chuột (PCA), chiết xuất nước từ PFL ức chế đáng kể phản ứng PCA, và các tác giả đã kết luận về vai trò của axit rosmarinic trong tác dụng này [35].

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

 Hoạt tính chống viêm

Luteolin đã được phân lập từ chiết xuất etanol của lá Tía Tô (PFL) đã được chứng minh là có tác dụng có lợi đối với các bệnh viêm thần kinh theo cách phụ thuộc vào liều lượng (IC50 = 6,9μM) thông qua việc ngăn chặn sự biểu hiện của tổng hợp oxit nitric cảm ứng (iNOS) [38].

Dịch chiết etanol của PFL được xác định là có hoạt tính chống viêm đáng kể trong các đại thực bào chuột Raw 264.7 do LPS gây ra thông qua việc ức chế sự biểu hiện của các cytokine gây viêm, ức chế kích hoạt protein kinase (MAPK) do mitogen kích hoạt và yếu tố phiên mã kappa (NF-B) để phản ứng

với LPS [21]. Dầu hạt của P. frutescens cho thấy tác dụng bảo vệ tuyệt vời

chống lại viêm thực quản trào ngược và điều này có thể là do các hoạt động kháng tiết (kháng cholinergic, kháng histaminic), chống oxy hóa và ức chế

lipoxygenase do sự hiện diện của axit α-Linolenic (ALA) (18: 3, n -3). Một

nghiên cứu gần đây (trên chuột) cho thấy chiết xuất PF cải thiện bệnh viêm ruột (IBD) thông qua việc bảo vệ bệnh viêm đại tràng do dextran sulfat natri gây ra, với NF-κB, truyền tín hiệu và kích hoạt phiên mã 3 (STAT3) là mục tiêu giả định. Một loại perillaketone và alkaloid được phân lập từ phần trên mặt đất của Tía Tơ cho thấy tác dụng ức chế đáng kể đối với các cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-6) và chất trung gian gây viêm (NO) trong các tế bào RAW264.7 được LPS kích thích, cho thấy rằng những hợp chất này có thể là thành phần chính cho các rối loạn viêm [43].

 Hoạt tính khác

- Hoạt tính chống khối u: trong một mơ hình gây ung thư (in vivo), việc sử

dụng phần chiết xuất từ Tía Tơ (2,0mg/con chuột) dẫn đến việc làm giảm đáng kể 7,12-dimethylbenz (a) anthracene (DMBA)-initiated và TPA-Promotion tumorgenesis. Điều này có lẽ dựa trên hai hiệu ứng độc lập: ức chế tổn thương DNA do oxy hóa và ức chế phân tử kết dính, chemokine, và tổng hợp eicosanoid. Ngoài ra, Lin và cộng sự đã đánh giá tác dụng ức chế của PFL và họ phát hiện ra rằng nó có hiệu quả gây ra các gen liên quan đến quá

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

trình apoptosis (chết theo chương trình) và có thể ức chế sự tăng sinh tế bào HepG2 (u gan ở người) [9].

- Hoạt tính chống hen suyễn bởi dầu hạt Tía Tơ đã được minh chứng bởi Deng và cộng sự [17]. Mô tả tác dụng chống hen suyễn ở chuột lang và kết

luận rằng tinh dầu của P. frutescens có thể cải thiện chức năng phổi trong

bệnh hen suyễn bằng cách điều chỉnh sản xuất eicosanoid và ngăn chặn sự tạo ra leukotriene (LT). Zhao và cộng sự [47] được cho là có thể có hoạt tính chống thiếu máu cục bộ của luteolin chiết xuất từ PFL, có khả năng thơng qua việc tái cân bằng trạng thái pro-oxidant/chống oxy hóa.

1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước về Tía Tơ

Ở nước ta, các nghiên cứu về cây Tía Tơ tập trung vào tinh dầu và công nghệ chiết xuất tinh dầu là chủ yếu. Ngoài ra, các nghiên cứu về dịch chiết lá Tía Tơ và hoạt tính sinh học cũng đang được quan tâm trong những năm gần đây.

Theo Đỗ Huy Bích và các cộng sự, trong tinh dầu Tía Tơ có chứa perilla aldehyde, perrilla alcohol, limonene, α-pinene, elsholtziacetone,

β-cargophylene và linalool. Tinh dầu Tía Tơ có tác dụng kháng khuẩn in vitro

đối với các loại sinh vật theo thứ tự hoạt tính giảm dần (tụ cầu vàng, trực

khuẩn lỵ Flexner, trực khuẩn lao, Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, liên cầu tan máu, trực khuẩn lỵ Shiga, Salmonella typhi, Proteus vulgaris,

Candida albicans, trực khuẩn coli, phế cầu). Đồng thời, nó có tác dụng diệt

amip lỵ với nồng độ ức chế thấp nhất là 1/1.280. Dịch chiết metanol có tác

dụng kháng nấm Candida albicans. Một hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm

là perilla aldehyde citral. Tía Tơ có tác dụng gây trấn tĩnh, hạ nhiệt, làm tốt mồ hơi, ức chế cơ trơn ruột gây bởi histamine và acetylcholine, và gây ra cảm ứng đối với interferon. Hạt Tía Tơ chứa chất có hoạt tính chống oxy hóa [1].

Trần Hữu Anh (1999) đã nghiên cứu ba phương pháp thu nhận tinh dầu từ lá và hoa của cây Tía Tơ. Tác giả cũng đưa ra các điều kiện tối ưu để chiết

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

tinh dầu thu được từ các phương pháp khác nhau [7]. Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014) đã khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất tinh dầu từ lá Tía Tơ [5]. Nguyễn Thị Hồng Lan và cộng sự (2015) công bố khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Tía Tơ ngun chất và tinh dầu 5%, đồng thời xác định giá trị MIC của tinh dầu đối với một số chủng vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2016) sử dụng tinh dầu Tía Tơ trong bảo quản thịt lợn, chỉ ra tinh dầu lá Tía Tơ có khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn quan trọng trong việc kéo dài thời gian bảo quản thịt lợn. Nguyễn Bá Huy (2019) đã nghiên cứu thiếp lập quy trình thu nhận dịch chiết từ lá Tía Tơ có hàm lượng polyphenol cao nhằm ứng dụng trong sản xuất nước giải khát [3].

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu là loài Perilla frutescens var crispa (tên tiếng

Việt: Tía Tơ) được thu hái vào tháng 1 năm 2021 tại Hà Nội. Mẫu nguyên liệu được giám định tên khoa học bởi TS. Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam (VAST). Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá học Các hợp chất thiên nhiên (INPC).

Mẫu sau thu hái một phần được phơi khơ trong bóng râm và sấy ở 450C cho tới khô; một phần được chưng cất tinh dầu ngay.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

 Phương pháp thu nhận tinh dầu:

Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hịa tan, khuếch tán và lơi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định. Khi hơi nước bốc lên sẽ kéo theo các tinh dầu. Hỗn hợp gặp nước lạnh sẽ ngưng tụ lại thành giọt và do tính chất khơng tan trong nước của tinh dầu mà tinh dầu và nước sẽ tách ra.

Phần mẫu tươi và phần mẫu khô được thái nhỏ và được chiết lôi cuốn hơi nước để thu nhận tinh dầu. Mỗi mẫu được thực hiện cất lơi cuốn nước trong vịng 4 giờ, tính từ thời điểm sơi. Thu được 02 mẫu tinh dầu (Tía Tơ khơ và Tía Tơ tươi). Tinh dầu Tía Tơ được làm khan bằng Na2SO4 và nhận biết thành phần bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp phổ khối (GC-MS).

 Phương pháp phân lập các hợp chất: Sử dụng sắc ký bản mỏng, sắc ký cột pha thường (silica gel) và sắc ký rây phân tử (sephadex LH-20) để phân lập các hợp chất.

</div>