Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học lá sơn trà nhật bản eriobotrya japonica (thunb ) lindl

ĐẶT VẤN ĐỀ
Khí hậu nhiệt đới gió mùa đã tạo điều kiện cho thảm thực vật của nước
ta phát triển phong phú, đa dạng với hơn 12.000 loài bao gồm 2.500 chi và
300 họ. Nhiều loài trong số đó đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Với
khoa học công nghệ phát triển như hiện nay, đã có nhiều cây thuốc được
nghiên cứu khá đầy đủ, có hệ thống và được bào chế dưới dạng thuốc cổ
truyền đạt tiêu chuẩn GMP hay chiết xuất ra các hoạt chất có tác dụng chữa
bệnh. Tuy nhiên vẫn còn nhiều cây chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu
chưa đầy đủ, việc sử dụng để chữa bệnh vẫn dựa vào kinh nghiệm dân gian.
Sơn trà Nhật Bản với tên khác là Tỳ bà, có tên khoa học là Eriobotrya
japonica Lindl. thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc
và Nhật Bản sau đó được du nhập vào Việt Nam, hiện có nhiều nhất ở Cao
Bằng, Lạng Sơn, Hà Nội. Đây là dược liệu được sử dụng nhiều trong y học cổ
truyền với tác dụng: bình suyễn, lợi đờm, chống viêm , kháng khuẩn… Hiện
nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về dược liệu này, đã phân
tách được một số hoạt chất trong cây và nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của
các hoạt chất đó như tác dụng chữa tiểu đường của acid corosolic, tác dụng ức
chế khối u của các acid oleanolic… Tại Việt Nam, hầu như chưa có nghiên
cứu nào về cây Sơn trà Nhật Bản được công bố, vì vậy chúng tôi đã thực hiện
đề tài “Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học lá Sơn trà Nhật Bản
Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.” với mục tiêu:
- Xác định các nhóm hợp chất hữu cơ có trong lá Sơn trà Nhật Bản.
- Khảo sát các phân đoạn dịch chiết và phân lập một số chất từ lá Sơn
trà Nhật Bản.

1

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. THỰC VẬT HỌC
1.1.1. Họ Hoa hồng (Rosaceae)

* Đặc điểm thực vật [1],[3]
Đa dạng về dạng sống : gỗ, bụi, dây leo, cỏ. Lá đơn hay kép, mọc so le.
Hoa lưỡng tính, đều, bao hoa kép, thường mẫu 5. Nhị thường nhiều, có
khi chỉ có 5 hoặc 10 nhị, có tuyến mật trong nhị. Lá noãn thường nhiều, rời
hoặc hợp (hợp nguyên lá noãn), mỗi lá noãn thường có 2 hoặc nhiều noãn,
bầu trên hay dưới. Quả nhiều đại (Spiraeioideae, Rosoideae), mọng
(Maloideae), hay quả hạch (Prunoideae). Hạt không có nội nhũ.
Họ Hoa hồng được đặc trưng bởi các ống hoa hình chén, mà phần dưới
của nó tương ứng với đế hoa lõm còn phần trên do các lá đài, cánh hoa và đôi
khi cả chỉ nhị hợp lại tạo thành.
* Phân bố [3]
Họ Hoa hồng phân bố khắp nơi, chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu.
Việt Nam có 20 chi, khoảng 130 loài, chủ yếu mọc hoang, một số loài được
trồng làm cảnh (Hoa hồng, Đào); ăn quả (Táo, Lê, Mận,…) và một số được
dùng làm thuốc: Đào, Mâm xôi, Kim anh, Táo mèo, Tầm xuân…
1.1.2. Chi Eriobotrya
Eriobotrya Lindl. Là một chi nhỏ có 7 -8 loài ở Việt Nam [1].
1.1.3. Cây Sơn trà Nhật Bản
* Đặc điểm thực vật [8]
Cây cao 6-8 m, cành non có nhiều lông. Lá mọc so le, hình mác, nhọn,
dai, dài 12-30 cm, rộng 3-8 cm, mép có răng cưa, mặt dưới có nhiều lông,
màu xám hay vàng nhạt.

2

Hoa rất nhiều, gần như không có cuống, mọc thành chùm, đường kính
15-20 mm, có lông màu hung đỏ. Quả thịt, hình hơi cầu, có lông, khi chín có
mầu vàng, dài 3-4 cm, đỉnh quả có hình mắt, quanh mép mang đài tồn tại, thịt
dày, có 4 hạch đơn, hơi dày, mỗi hạch mang 1-2 hạt không có phôi nhũ.
Hình 1.1: Cây Sơn trà Nhật Bản ( Eriobotrya japonica Lindl. )

* Phân bố, sinh thái [9]
Sơn trà Nhật Bản có nguồn gốc ở vùng Đông Nam - Trung Quốc, sau
được trồng ở nhiều vùng cận nhiệt đới hoặc ôn đới ấm như địa Địa Trung Hải,
Australia, Nam Phi, Nam Mỹ, Hoa Kỳ (california), Nhật Bản, Đài Loan, Bắc
Việt Nam và một số nơi thuộc vùng núi trên 1000m ở các nước Đông Nam Á
và Ấn Độ.
Ở Việt Nam, cây Sơn trà Nhật Bản được nhập trồng từ lâu đời và hiện
nay được trồng rải rác trong vườn các gia đình ở tỉnh Lạng Sơn, Cao Bằng,

3

Thái Nguyên và Hà Nội. Cây ưa khí hậu ấm mát, có thể chịu được nhiệt độ
thấp tới -10
o
C vào mùa đông ở Trung Quốc và Nhật Bản.
Cây sinh trưởng tốt ở đất mùn trên núi, ít sỏi đá và có thể hơi chua, ra
hoa nhiều nhưng kết quả hạn chế. Do mùa hoa ở Việt Nam thường có mưa
xuân nên giống Sơn trà Nhật Bản ở nước ta thường cho quả chua, ít được sử
dụng. Nhưng ở Nhật Bản đó là cây ăn quả quan trọng, sản lượng mỗi năm đạt
hơn 10.000 tấn.
Sơn trà Nhật Bản dễ trồng: bằng cách chiết cành hay từ rễ, ngoài ra còn
có thể trồng bằng hạt.
Bộ phận dùng làm thuốc là lá thu hái vào xuân – hạ, chải hết lông, rửa
sạch đem phơi hay sấy khô. Khi dùng, thái nhỏ, tẩm mật sao.
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Thành phần hóa học của cây Sơn trà Nhật Bản rất phong phú với nhiều
nhóm chất như: tinh dầu, triterpenoid, sesquiterpen glycoside, flavonoid, …
1.2.1. Triterpenoid
Triterpenoid trong lá Sơn trà Nhật Bản là nhóm hoạt chất có tác dụng
dược lý quan trọng như chống tiểu đường, chống khối u, chống virus và

chống viêm. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nhóm hoạt chất này và các
tác dụng của nó. Năm 2005, Banno N. và cộng sự đã phân lập được mười sáu
triterpen từ phân đoạn EtOAc của dịch chiết MeOH từ lá Sơn trà Nhật Bản
bằng phương pháp sắc ký cột silicagel pha thuận với hệ dung môi n-Hexan :
EtOAc (9:1→0:10), tiếp đó là chạy cột HPLC pha đảo [11]. Những năm sau
đó cũng có một số triterpen khác được phân lập [13],[16],[18].

4

Bảng 1.1 : Các triterpen phân lập được từ lá Sơn trà Nhật Bản và hàm
lượng(%) của chúng so với tổng lượng phân đoạn EtOAc.
Ký hiệu Tên hợp chất Hàm lượng(%)
(1)
Acid 2α,3α,19α-trihydroxyolean-12-en-28-oic
1,3
(2) Acid tormentic 7,5
(3) Acid maslinic 1,7
(4) Acid corosolic 4,4
(5)
Acid 2α,3α-dihydroxyursolic
-
(6) Acid oleanolic 2,7
(7) Acid ursolic 9,7
(8) Acid ursolic lacton 0,1
(9) Acid betulinic 0,1
(10) Acid hyptadienic -
(11) Methyl arjunolate 0,2
(12)
Acid δ-oleanolic
0,1

(13) Methyl ursolate 0,2
(14) Acid 3-O-cis-p-coumaroyltormentic 0,8
(15) Acid 3-O-trans-p-coumaroyltormentic 4,0
(16) Acid 3-epicorosolic 0,2
(17) Acid euscaphic 4,9
(18)
Acid 1β-hydroxy euscaphic
2,9
(19) Methyl betulinate 0,1
COOH
HO
HO
HO
(1)
COOH
HO
HO
HO
(2)
COOH
HO
HO
(3)

5

COOH
HO
HO
(4)

COOH
HO
HO
(5)
COOH
HO
(6)
COOH
HO
(7)
HO
O
O
(8)
HO
COOH
(9)
Hình 1.2: công thức cấu tạo của 9 triterpenoid
1.2.2. Sesquiterpen glycoside
Sau khi tách bằng cột nhựa D101, cột silicagel và cột pha đảo RP-18,
Chen J. và cộng sự đã phân lập được 50 mg hợp chất sesquiterpen glycoside:
nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-α-L- rhamnopyranosyl(1→2)-[α-
L- rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside (20) từ phân đoạn n-
Buthanol của dịch chiết EtOH 75% của 5 kg lá Sơn trà Nhật Bản [12]. Một số
sesquiterpen glycoside khác cũng đã được phân lập là : nerolidol-3-O-[α-L-
rhamnopyranosyl(1→4)-α-L- rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside
(21), isohumbertiol-3-O-{α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-α-L-
rhamnopyranosyl(1→2)-[α-L- rhamnopyranosyl(1→6)]}-β-D-
glucopyranoside (22), isohumbertiol-3-O-{α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-α-L-
rhamnopyranosyl(1→2)-[α-L-(4-trans-feruloryl)- rhamnopyranosyl(1→6)]}-

β-D-glucopyranoside (23) [13].

6


O
O
R
1
O
OH
OH
R
2
0

O
O
R
1
O
OH
OH
R
2
0
(20), (21) (22), (23)
Hợp chất R
1
R

2
(20)
H
α-L-Rha(1→4)-α-L- Rha(1→)
(21)
α-L-Rha(1→4)-α-L- Rha(1→) α-L-Rha(1→)
(22)
α-L-Rha(1→4)-α-L- Rha(1→) α-L-Rha(1→)
(23)
α-L-Rha(1→4)-α-L- Rha(1→) (4-trans-feruloyl)- α-L-Rha(1→)

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của một số sesquiterpen
1.2.3. Hợp chất phenolic
1.2.3.1. Flavonoid glycoside
Năm 2003, Louati S. và cộng sự đã tìm và xác định được một số
flavonoid trong lá Sơn trà Nhật Bản: quercetin 3-O- rutinoside (rutin) (24),
kaempferol 3-O- glucoside (35), kaemferol 3-O- galactoside (26), kaemferol
3-O-dihexoside (27), kaemferol 3-O- rutinoside (28), isorhamnetin 3-O-
glucoside (29), isorhamnetin 3-O- galactoside (30) [20].
Đến năm 2009, khi nghiên cứu lá, vỏ quả và thịt quả của cây Sơn trà
Nhật Bản trồng ở nhiều nơi khác nhau bằng phương pháp phân tích HPLC-
DAD- ESI-MS/MS đã xác định được sự có mặt của mười flavonoid
glycoside: naringenin-6,8-di-C-glucoside(31), naringenin-8-C-rhamnosyl
(1→2)glucoside (32), quercetin-3-O-neohesperidoside (33), quercetin-3-O-
sambubioside (34), quercetin-3-O-galactoside (35), quercetin-3-O-glucoside
(36), quercetin-3-O-rhamnoside (37), kaempferol-3-O-neohesperidoside (38),

7

kaempferol-3-O- sambubioside (39), kaempferol-3-O- rhamnoside (40). Tất

cả các flavonoid đều được tìm thấy trong lá cũng như trong vỏ quả ( trừ (31),
(32)). Trong thịt quả không tìm thấy flavonoid [14].
1.2.3.2. Dẫn xuất hydroxycinnamic acid
Đã xác định được 8 dẫn xuất hydroxycinnamic acid trong lá Sơn trà Nhật
Bản: acid 3-caffeoylquinic (41), acid 3-p-coumaroylquinic (42), acid 5-
caffeoylquinic (43), sinapoyl glucoside (44), acid 1-p- coumaroylquinic (45),
acid 5-p- coumaroylquinic (46), acid 1-feruloylquinic (47), acid 5-
feruloylquinic (48) [14].
Lá Sơn trà Nhật Bản là nguyên liệu chứa số lượng lớn dẫn xuất
hydroxycinnamic acid. Hợp chất (41), (42), (43) và (48) có cả ở lá, vỏ quả và
thị quả. Trong đó (43) có nhiều ở trong lá và thịt quả, (41) có nhiều ở vỏ quả
và (44) không tìm thấy trong lá.

O
HO
OH O
O
OH
OH
glc

HO
HO
H
C
C
H
C
O
O

OH
OH
HO C
OH
O
(36) (41)
Hình 1.4: Công thức của một số hợp chất phenolic.
1.2.3.3. Hàm lượng phenolic
Hàm lượng phenolic trung bình có trong lá (64mg/kg) ít hơn trong vỏ
quả (1337 mg/kg) và thịt quả (1668mg/kg). Trong đó dạng phenolic acid ở vỏ
quả cao hơn trong lá (94% so với 68% trên tổng lượng phenolic). Tổng lượng
flavonoid trong lá thấp nhưng lại cao hơn rất nhiều trong vỏ quả (33% so với
8% trên toàn lượng phenolic). Trong thịt quả chỉ có phenolic acid. Hàm lượng
các hợp chất phụ thuộc vào điều kiện nuôi trồng và bộ phận dùng [14].

8

Bảng 1.2: Hàm lượng (%) so với toàn lượng phenolic của một số hợp chất
phenolic trong lá, vỏ quả, thịt quả của cây Sơn trà Nhật Bản.
Nơi trồng
Lá Vỏ quả Thịt quả
(41) (43) (46) (48) (41) (43) (46) (48) (41) (43) (46) (48)
Nectar de
Cristal
34 17 53 28 54 46
Centenári
a
22 31 53 28 56
NE-3 22 31 83
Mizauto 22 31 53 28 54

Mizuho 34 17 17 49 56
Mizumo 34 17 53 28 13 84
1.2.4. Tinh dầu
Có rất nhiều loại tinh dầu có trong lá Sơn trà Nhật Bản như : nerolidol,
farnesol, α-pinene, β-pinene, camphene, β-myrcene, camphor, nerol, geraniol,
α-cadinol, cis-β,γ-hexanol, linalool, trans-linalool oxide. Trong đó nerolidol
chiếm 61-74%.
1.2.5. Carotenoid
Điều kiện nuôi trồng, sinh trưởng và nguồn gốc địa lý là những yếu tố
ảnh hưởng tới hàm lượng các carotenoid có trong quả Sơn trà Nhật Bản.
Nghiên cứu những mẫu quả Sơn trà Nhật Bản thu hái ở các khu vực khác
nhau tại Brazil bằng phương pháp HPLC- PAD-MS/MS xác định được 25
carotenoid. Trong đó các carotenoid chính có là: trans-β-carotene (19-55%);
trans-β-cryptoxanthin (18-28%); 5,6-diepoxy-β- cryptoxanthin (7-10%);
5’,6’- diepoxy-β- cryptoxanthin ( 9-18%) [10].
1.3. ỨNG DỤNG CỦA SƠN TRÀ NHẬT BẢN
1.3.1. Theo y học cổ truyền

9

* Tính vị, quy kinh: Lá Sơn trà Nhật Bản có vị đắng, tính bình, quy vào
kinh phế, vị [6].
* Công năng: Thanh phế, hòa vị, giáng khí, hóa đờm [9] .
* Chủ trị: Lá Sơn trà Nhật Bản dùng để chữa phế nhiệt sinh ho, ho khan,
ho có đờm, khô cổ khản tiếng, ho ra máu, chảy máu cam, nôn [9].
Liều lượng: 10-20g/ngày. Sắc nước uống, thường dùng phối hợp với một
số thuốc khác như Tiền hồ, Tang diệp chữa ho phong nhiệt; với Đạm trúc
diệp chữa khản tiếng.
Một số bài thuốc y học cổ truyền có sử dụng lá Sơn trà Nhật Bản dùng
để chữa ho, viêm họng, viêm phế quản… được thể hiện ở bảng 1.3.

Bảng 1.3: Một số bài thuốc có Sơn trà Nhật Bản (Tỳ bà)
Bài thuốc Các vị thuốc Cách dùng
1. Chữa ho,
viêm họng
Lá Tỳ bà 20g
Khoản đông hoa 10g
Cam thảo 5g
Sắc với 600ml nước đến khi
còn 200 ml, chia làm 3 lần
uống trong ngày.
2. Chữa phế Lá Tỳ bà 12g

10

nhiệt, ho khan
lâu ngày
Mạch môn 10g
Tang bạch bì 10g
Thiên môn 10g
Sinh địa 10g
Sắc nước uống.
3. Chữa viêm
phế quản mạn
tính
Lá Tỳ bà 2g
Hoàng kỳ 1,5g
Trần bì 1,5g
Phụ tử chế 1g
Bạch thược 1g
Cam thảo (chích) 1g

Nhục quế 1g
Can khương 1g
Nghiền thành bột, chế thành
viên hoàn, chia 2 lần uống
trong ngày.
4. Chữa chảy
máu cam Tỳ bà
Lá Tỳ bà lau sạch lông, sao
vàng, tán nhỏ. Ngày uống 2
lần, mỗi lần 2g bột, chiêu bằng
nước chè.
Ở Ấn Độ người ta dùng quả để chống nôn, giải khát. Hoa dùng để trị ho,
long đờm. Lá làm thuốc chữa ho, viêm phế quản mạn tính, suyễn khó thở có
đờm, sốt, nóng, cảm mệt, nôn mửa nhất là khi có thai, nôn khan, miệng khát,
ăn uống khó tiêu, chảy máu cam [4].
1.3.2. Theo các nghiên cứu dược lý
Sơn trà Nhật Bản là dược liệu được sử dụng rộng rãi trên thế giới với
nhiều tác dụng khác nhau như chống viêm, chống đái tháo đường, chống
virus, chống oxy hóa… Các tác dụng này đã được chứng minh qua nhiều
nghiên cứu dược lý.
1.3.2.1. Tác dụng lợi đờm

11

Dịch chiết bằng cồn và dịch chiết EtOAc của lá Sơn trà Nhật Bản với
liều 0,5ml/chuột, dùng đường uống có tác dụng tăng cường sự bài tiết
phenolsulfonphthalin ở đường hô hấp, chứng tỏ có tác dụng lợi đờm [3].
1.3.2.2. Tác dụng chống viêm
Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của
các triterpen acid chiết tách từ lá Sơn trà Nhật Bản trên mô hình gây viêm phế

quản thực nghiệm trên chuột với liều dùng đường uống tương ứng 50, 150,
450 mg triterpen acid/Kg/ngày trong 3 tuần cho thấy số bạch cầu trung tính,
đại thực bào và các yếu tố trung gian hóa học TNF-α, IL-8 ở dịch phế nang
giảm so với nhóm chứng. Điều này chứng tỏ hỗn hợp triterpen acid từ lá Sơn
trà Nhật Bản có tác dụng chống viêm phế quản mạn [15].
Trong một nghiên cứu khác các triterpen được phân lập từ phân đoạn
EtOAc của dịch chiết MeOH lá Sơn trà Nhật Bản có tác dụng ức chế TPA
(12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetat) - yếu tố gây viêm ở chuột. Tác dụng
ức chế TPA của các triterpen acid (ID
50
= 0.03- 0.43 mg/ tai chuột) tốt hơn
Indomethacin (ID
50
= 0.3 mg/ tai chuột) [11].
1.3.2.3. Tác dụng chống đái tháo đường
Trong quá trình sử dụng Sơn trà Nhật Bản làm thuốc, các thầy thuốc
Trung Quốc đã phát hiện ra tác dụng chữa bệnh đái tháo đường của cây này.
Nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường của sesquiterpen glycoside :
nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-α-L- rhamnopyranosyl(1→2)-[α-
L- rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside từ phân đoạn n-Buthanol
của dịch chiết EtOH 75
0
lá Sơn trà Nhật Bản trên mô hình gây tiểu đường
chuột bằng aloxan. Kết quả cho thấy lượng glucose huyết giảm đáng kể.
Chứng tỏ rằng sesquiterpen glycosid từ lá Sơn trà Nhật Bản có tác dụng làm
giảm đường huyết trong bệnh đái tháo đường [12].

12

Acid corosolic là một triterpnen acid có trong lá Sơn trà Nhật Bản, tác

dụng của nó trên chuyển hóa carbohydrat và sự biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1
cũng đã được nghiên cứu. Kết quả đưa ra rằng tỷ lệ hấp thu glucose vào tế
bào tạo mỡ 3T3-L1 là khác nhau giữa các nồng độ acid corosolic (15µmol/L,
30µmol/L, 45µmol/L) tương ứng là 108.1%, 112.2%, 118.6% so với nhóm
chứng (không có acid corosolic). Đồng thời acid corosolic còn ngăn chăn sự
biệt hóa của tiền tế bào tạo mỡ 3T3-L1 [24]. Qua đó có thể thấy rằng acid
corosolic phân lập từ lá Sơn trà Nhật Bản có hiệu quả tốt trên bệnh nhân đái
tháo đường đi kèm béo phì.
Ngoài ra acid corosolic còn có tác dụng làm tăng Fructose-2,6-
biphosphat (F-2,6-BP) thông qua làm giảm AMPc. F-2,6-BP là một chất có
vai trò quan trọng trong tạo glucose và glycogen. F-2,6-BP hoạt hóa 6-
phosphofructo-1-kinase (PFK-1), một enzym có giới hạn nhất định trong quá
trình tạo glycogen và ức chế Fructose-1,6-biphosphatase ( F-1,6-BPase ), một
enzym hoạt hóa quá trình tạo glucose. Vì vậy acid corosolic có tác dụng ức
chế tạo glucose và kích thích tạo glycogen [26].
Một nghiên cứu khác cũng đưa ra rằng acid corosolic và acid maslinic có
tác dụng giảm đường huyết trên mô hình chuột gây đái tháo đường bằng
adrenalin thông qua tác dụng ức chế emzym glycogen phosphorylase làm
giảm sự thoái hóa glycogen ở gan [25].
1.3.2.4. Ức chế sự phát triển của khối u
Năm 2005, các nhà khoa học Nhật Bản đã thử tác dụng ức chế sự phát
triển khối u của các triterpen acid. Kết quả cho thấy các hoạt chất này có tác
dụng ức chế hoạt tính kháng nguyên của siêu vi trùng Epstein-Barr ( EBV-
EA) ở tế bào Raji gây ra bởi TPA [11]. Acid oleanolic và acid ursolic cũng có

13

tác dụng ức chế sự hình thành và phát triển của khối u gây ra bởi TPA ở in
Vitro và in vivo. Điều trị cho chuột bằng acid oleanolic (200 ppm) cho vào
khẩu phần ăn hàng ngày trong 3 tuần đã làm giảm tỷ lệ mắc bệnh khối u ruột

gây ra bởi azoxymethan [19].
1.3.2.5. Tác dụng bảo vệ gan
Tác dụng bảo vệ gan của acid oleanolic được báo cáo lần đầu tiên vào
năm 1975. Năm 1977 ở Trung Quốc đã điều trị thành công cho người viêm
gan cấp và mạn tính cũng như các rối loạn chức năng gan bằng acid oleanolic
dạng uống. Người ta cũng đã chứng minh được acid oleanolicvà acid ursolic
đều có tác dụng bảo vệ gan, chống lại các tổn thương gan gây ra bởi các chất
hóa học như CCl
4
, acetaminophen, bromobenzen… Cơ chế bảo vệ gan của hai
hợp chất này là ức chế hoạt tính của các chất độc hại cho gan và tăng cường
hàng rào bảo vệ cơ thể bằng cách ức chế cytocrom P
450
và tăng cường hệ
thống glutathione ở gan [19].
1.3.2.6. Chống oxy hóa
Dịch chiết EtOH của vỏ quả, thịt quả, hạt và dịch chiết nước của vỏ quả
Sơn trà Nhật Bản có tác dụng mạnh làm sạch gốc 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl (DPPH). Còn dịch chiết EtOH của hạt ức chế 2,2’-azobis(4-
methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) (MeO-AMVN) gây oxy hóa LDL [17].
Acid oleanolic và acid ursolic có tác dụng chống oxy hóa do làm giảm
hoạt tính của enzym glutathion peroxidase tương ứng 12% và 10%, tăng hoạt
tính của superoxide dismutase tương ứng 12% và 22% [22].
Như vậy, tác dụng của lá Sơn trà Nhật Bản đã được nghiên cứu, chứng
minh và áp dụng trong điều trị ở nhiều nước trên thế giới. Một số thành phần
trong lá có tác dụng dược lý có thể ứng dụng tốt trong điều trị bệnh. Nghiên
cứu thành phần hóa học của lá Sơn trà Nhật Bản sẽ góp phần nâng cao hiệu

14

quả trong việc sử dụng lá Sơn trà Nhật Bản trong y dược học. Các hoạt chất
có tác dụng sinh học đã được chứng minh chủ yếu là nhóm triterpenoid - một
nhóm chất ít phân cực. Chính vì vậy, trước tiên chúng tôi quan tâm nghiên
cứu thành phần hóa học ở phân đoạn chloroform.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên liệu

15

Mẫu nghiên cứu là lá của cây Sơn trà Nhật Bản được thu hái vào tháng
11 ở Trung tâm cây thuốc Hà Nội – Văn Điển – Hà Nội. Cây này đã được
Th.S Ngô Đức Phương và Th.S Nguyễn Quỳnh Nga khoa Tài nguyên – Viện
dược liệu lấy mẫu kiểm định và kết luận tên khoa học là Eriobotrya japonica
Lindl. Lá được sấy khô ở 40
0
C, xay nhỏ làm mẫu nghiên cứu.
2.1.2. Thiết bị, hóa chất
* Thiết bị
- Tủ sấy dược liệu MEMMERT
- Máy xác định độ ẩm PRECISA
- Cân phân tích PRECISA
- Máy đo điểm chảy STUART
- Máy cất quay lớn BUCHI
- Máy cất quay nhỏ BUCHI
- Bản mỏng silicagel GF
254
( MERCK) pha thuận và pha đảo hoạt hóa
trong tủ sấy ở nhiệt độ 105-110
0

C trong 60 phút.
- Cột sắc ký, bình chiết quả lê, bình nón, bình cầu, cốc có mỏ, ống
nghiệm, pipet pasteur, phễu lọc Buchner.
- Máy đo phổ hồng ngoại IMPAC 410-NICOLET FT-IR
- Máy đo phổ khối HEWLETT PACKARD HP 5890, Serie II
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER AVANCE-500
MHz.
* Hóa chất
- Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết
thích hợp: Silicagel 60 (0,04-0,063 mm), MeOH, EtOH, n-Hexan, Aceton,
Chloroform, EtOAc, n-Buthanol, Petroleum ether và các thuốc thử.

16

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá Sơn trà Nhật Bản bằng
phản ứng hóa học.
- Định lượng tổng các chất chiết được trong các phân đoạn bằng phương
pháp cân.
- Khảo sát các cắn phân đoạn bằng SKLM.
- Phân lập và biện luận cấu trúc một số chất tách được từ lá Sơn trà Nhật
Bản.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
* Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá Sơn trà Nhật Bản: Sử
dụng các phản ứng tạo màu, phản ứng đặc trưng trong ống nghiệm với các
thuốc thử chung của từng nhóm chất để phát hiện sự có mặt của các nhóm
chất trong dược liệu.
* Định lượng tổng các chất chiết được trong các phân đoạn bằng
phương pháp cân
Lá Sơn trà Nhật Bản khô được chiết với Ethanol 80

0
3 lần, mỗi lần 3 giờ
ở 60
0
C, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn khô. Hòa tan cắn
khô với lượng nước nóng tối thiểu, sau đó chiết kiệt lần lượt với n-Hexan,
Chloroform, EtOAc, n-Buthanol, kiểm tra bằng SKLM. Thu các phần dịch
chiết đem cất thu hồi dung môi tới cắn khô sau đó dùng phương pháp cân để
định lượng.
* Khảo sát các cắn phân đoạn bằng SKLM

17

Dùng bản mỏng tráng sẵn silicagel để định tính số lượng chất có trong
mỗi phân đoạn. Tùy từng phần chiết mà ta khảo sát với các hệ dung môi khác
nhau.
* Phân lập và biện luận cấu trúc một số chất tách được từ lá Sơn trà
Nhật Bản
Phân lập các chất tinh khiết từ cắn các phân đoạn bằng phương pháp sắc
ký cột silicagel và kết tinh. Việc lựa chọn hệ dung môi chạy cột dựa vào độ
phân tách của các chất trên SKLM. Độ tinh khiết của các chất phân lập được
kiểm tra sơ bộ bằng SKLM nhận biết bằng soi UV, phun dung dịch H
2
SO
4
10% - hơ nóng, đo điểm chảy…Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích
phổ thích hợp, kết hợp với tham khảo cơ sở dữ liệu phổ đã có để biện giải cấu
trúc các chất phân lập được.
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

18

3.1. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Mục đích : Xác định sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong lá Sơn trà
Nhật Bản, từ đó có hướng chiết xuất và phân lập các nhóm chất.
Lá Sơn trà Nhật Bản được chiết bằng các dung môi thích hợp để thu
được các nhóm chất, sau đó tiến hành loại tạp và làm giàu nhóm chất bằng
các phương pháp khác nhau, dùng các thuốc thử, phán ứng hóa học đặc trưng
để xác định sự có mặt của các nhóm chất.
Định tính Alcaloid: Sử dụng phản ứng với thuốc thử chung: TT. Mayer,
TT. Dragendorff, TT. Bouchardat của alcaloid.
Định tính flavonoid: Phản ứng Cyanidin, phản ứng với kiềm, phản ứng
với dd. FeCl
3
5%.
Định tính Saponin: Hiện tượng tạo bọt, phản ứng phân biệt saponin
triterpen và saponin steroid.
Định tính glycosid tim: Phản ứng Liebermann, phản ứng Baljet.
Định tính coumarin: Phản ứng mở đóng vòng lacton.
Định tính tanin: Phản ứng với dd. FeCl
3
5% và chì acetat 10%.
Định tính anthranoid: Phản ứng Borntrager.
Và định tính một số nhóm chất khác: Acid hữu cơ, đường khử, chất béo,
hợp chất steroid.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá Sơn trà Nhật Bản
được tóm tắt ở bảng 3.1.

19

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá Sơn trà Nhật
Bản bằng phản ứng hóa học
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Alcaloid
Phản ứng với TT. Mayer -
KhôngPhản ứng với TT. Dragendorff -
Phản ứng với TT. Bouchardat -
2 Flavonoid
Phản ứng Cyanidin ++
Có
Phản ứng với hơi NH
3
-
Phản ứng với kiềm loãng +++
Phản ứng với dd. FeCl
3
5% +++
3 Saponin
Hiện tượng tạo bọt ++
Saponin
Phân biệt 2 Saponin
4 Glycosid tim
Phản ứng Liebermann -
Không
Phản ứng Baljet -
5 Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton + Có
6 Tamin
Phản ứng với dd. FeCl
3

5% ++
Có
Phản ứng với chì acetat 10% ++
7 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Không
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na
2
CO
3
+ Có
9 Đường khử Phản ứng với TT. Fehling ++ Có
10 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không
11 Steroid Phản ứng Liebermann + có
Ghi chú : (-) âm tính, (+) dương tính. (++) dương tính rõ, (+++) dương
tính rất rõ.
Nhận xét: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học ta thấy lá Sơn trà
Nhật Bản có chứa flavonoid, saponin triterpenic, coumarin, tanin, acid hữu
cơ, đường khử, hợp chất steroid, và không chứa alcaloid, anthranoid, chất
béo, glycosid tim.
3.1.2. Định lượng tổng các chất chiết được trong các phân đoạn

20

Mục đích: Xác định tổng khối lượng các chất chiết được bằng các dung
môi có độ phân cực tăng dần, từ đó nhận định sơ bộ về lượng chất không
phân cực, ít phân cực và phân cực có trong lá Sơn trà Nhật Bản.
Mẫu nguyên liệu : 800g lá Sơn trà Nhật Bản khô, nghiền nhỏ.
Độ ẩm: 9,82%.
Quá trình chiết lá được thực hiện như sau: Lá Sơn trà Nhật Bản được
chiết nóng 3 lần với 8 lít EtOH 80
0

, mỗi lần 3 giờ, ở 60
0
C. Tiến hành lọc, cất
thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn, thu được 273,43 g cắn. Hòa tan
cắn vào 300ml nước nóng sau đó chiết kiệt lần lượt với n-Hexan, Chloroform,
EtOAc, n-Buthanol (tỷ lệ 1:1), kiểm tra bằng SKLM. Ta thu được dịch chiết
các phân đoạn, làm khan bằng Na
2
SO
4
khan, lọc rồi cất thu hồi dung môi các
dịch chiết đó tới khô.
Qui trình chiết được trình bày ở hình 3.1.
Hàm lượng tổng các chất chiết được trong từng phân đoạn so với khối
lượng dược liệu khô tính theo công thức :

(%) 100
(1 )
m
A
M b
= ×
−
Trong đó A : Hàm lượng (%) cắn phân đoạn
m : Khối lượng cắn phân đoạn (g)
b : Hàm ẩm dược liệu (%), b = 9,82 %
M: Khối lượng dược liệu (g), M = 800g
Bảng 3.2: Kết quả hàm lượng các phân đoạn so với khối lượng dược liệu
khô
M (g) A (%)

Cắn TH 3,67 0,51
Cắn TC 29,16 4,04
Cắn TE 9,47 1,31
Cắn TB 25,71 3,56

21

Nhận xét: Ta thấy 2 cắn có khối lượng lớn là cắn TC chiếm 4.04 % và
cắn TB chiếm 3,56 % so với khối lượng dược liệu khô, còn cắn TH có khối
lượng nhỏ nhất.
Bàn luận: Chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết xuất là chiết nóng với
dung môi EtOH 80
0
vì theo các tài liệu đã công bố lá Sơn trà Nhật Bản chứa
các hoạt chất có tác dụng sinh học bền với nhiệt và dung môi EtOH 80
0
là
dung môi có khả năng chiết được hầu hết các hoạt chất trong thực vật, rẻ tiền,
dễ kiếm, ít độc hại, sôi ở nhiệt độ cao phù hợp với phương pháp chiết nóng.
Chiết nóng ở 60
o
C có ưu điểm là làm tăng hệ số khuếch tán trong quá trình
chiết xuất, nên làm tăng lượng chất khuếch tán. Do đó, có thể chiết kiệt hoạt
chất và tiết kiệm được thời gian.
Các phân đoạn được chiết bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần
là phương pháp sử dụng phổ biến trong nghiên cứu thành phần hóa học. Nó
giúp cho việc phân nhóm các hoạt chất tương ứng với độ phân cực của dung
môi, tạo điều kiện thuận lợi cho các bước phân lập tiếp theo.

22
Cắn n- Butanol ( 25,71g)
Thu hồi dung môi
0,8 Kg lá Sơn trà Nhật Bản
Dịch chiết EtOH
Cắn n- Hexan (3,67 g )
Dịch chiết nước
Dịch chiết CHCl
3
( TC)
Cắn CHCl
3
( 29,16g)
Dịch chiết EtOAc (TE)
Dịch chiết nước
Dịch chiết n- Butanol (TB)
Dịch chiết nước
Dịch chiết n- Hexan ( TH)
Cắn thô (273,43g)
Cao lỏng
Dịch chiết nước
Cắn EtOAc ( 9,47g)
Thu hồi dung môi
EtOH 80
0
, 60
0
C (3 lần)
Nước nóng

Thu hồi dung môi n-Buthanol
n-Hexan
EtOAc
Thu hồi dung môi
Thu hồi dung môi CHCl
3

Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết lá Sơn trà Nhật Bản
3.1.3. Khảo sát các cắn phân đoạn bằng SKLM
3.1.3.1. Khảo sát cắn TH
- Mẫu thử: lấy khoảng 2mg cắn TH hòa vào 1ml dung môi MeOH.
- Hệ dung môi khai triển: Thăm dò khả năng tách vết trên các hệ dung
môi khác nhau để tìm hệ có khả năng tách tốt nhất
Hệ 1: n-Hexan : EtOAC = (7 : 3) (v/v)
Hệ 2: CHCl
3
: Aceton = ( 85 : 15)
Hệ 3: Toluen : EtOAc : acid formic = (5 : 4 : 1)
Quan sát các vết dưới ánh sáng thường (AST), ánh sáng UV ở hai bước
sóng 254nm và 365nm, phun dd. H
2
SO
4
10% - hơ nóng cho thấy hệ 2 tách tốt
nhất. Kết quả thể hiện ở hình 3.2 và bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả SKLM của cắn TH với hệ CHCl
3
: Aceton = ( 85 : 15)
STT Rf x 100
Mầu sắc

23

AST UV
254 nm
UV
365 nm
H
2
SO
4
10% /t
0
1 78,75 Nâu
2 75 Hồng sáng Xanh
3 73,75 Xanh nâu Hồng đậm
4 67,5 Hồng
5 61,25 Hồng nhạt
6 58,75 Hồng đỏ
7 56,25 Hồng nhạt
8 52,5 Hồng nhạt Xanh tím
9 40 vàng Xanh sáng Tím hồng
10 37,5 Xám
11 23,75 Đỏ hồng
12 16,25 Hồng
13 11,25 Hồng
14 8,75 Hồng
Nhận xét: Kết quả định tính SKLM cắn TH với hệ dung môi
CHCl
3

: Aceton = ( 85 : 15) cho 14 vết.
3.1.3.2. Khảo sát cắn TC
- Mẫu thử: Lấy khoảng 2mg cắn TC hòa tan vào 1ml dung môi MeOH.
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ 1. n-Hexan : EtOAc = ( 7 : 3)
Hệ 2. CHCl
3
: MeOH = ( 95 : 5)
Hệ 3. n-Hexan : Aceton = ( 8 : 2)
Kết quả cho thấy hệ 1 tách tốt nhất và được thể hiện ở hình 3.2, bảng 3.4.
Bảng 3.4: Kết quả SKLM của cắn TC với hệ n-Hexan : EtOAc = ( 7 : 3)
STT Rf x 100
Mầu sắc
AST UV
254 nm
UV
365 nm
H
2
SO
4
10% /t
0
1 66,1 Nâu vàng
2 63,33 Đen
3 54,5 -
4 49 Tím hồng
5 36.6 Tím xanh
6 31,4 Hồng đỏ

24

7 16,9 Tím đỏ
8 11,2 -
Nhận xét: cắn TC triển khai với hệ dung môi n-Hexan : EtOAc = ( 7 : 3)
có 8 vết trên sắc ký đồ, trong đó có một số vết không rõ màu (-).
3.1.3.3. Khảo sát cắn TE
- Mẫu thử: Lấy khoảng 2mg cắn TE hòa tan vào 1ml dung môi MeOH.
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ 1. n-Hexan : EtOAc = ( 6 : 4)
Hệ 2. CHCl
3
: MeOH = ( 8 : 2)
Hệ 3. Toluen : EtOAc : acid formic = (5 : 4 : 1)
Kết quả cho thấy hệ 3 tách tốt nhất và được thể hiện ở hình 3.2, bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả SKLM của cắn TE
với hệ Toluen : EtOAc : acid formic = (5 : 4 : 1)
STT Rf x 100
Mầu sắc
AST UV
254 nm
UV
365 nm
H
2
SO
4
10% /t
0
1 80 Hồng đỏ

2 63,75 Tím hồng
3 51,25 Đen mờ Xanh sáng
4 50 Xanh sáng
5 45 Đen mờ Xanh sáng Tím đen
6 41,25 vàng Đen mờ Xanh đen Tím đen
7 37,5 Đen mờ Hồng nhạt
8 33,75 Hồng nhạt
9 30 Đen mờ
10 25 Đen mờ Xanh sáng
11 18,75 Xanh đen
12 15 vàng Vàng đậm
13 11,25 Xanh sáng
Nhận xét: trên bản mỏng cắn TE có 13 vết khi triển khai với hệ dung
môi toluen : EtOAc : acid formic = (5 : 4 : 1).

25