thiết bị và ktcnsh

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (617.42 KB, 17 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH VIRUS XOẮN LÁ VÀ VÀNG MÉP LÁ

TRÊN CÂY DÂU TÂY IN VITRO BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Giáo viên hướng dẫn : TS. Huỳnh Văn Biết ThS. Trương Quang Toản Nhóm sinh viên thực hiện : Lê Hồng Duy – 21126314

Nguyễn Thị Thanh Ngân – 21126417 Phan Thị Mai Trúc – 21126220 Lê Thái Văn – 21126577

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH VIRUS XOẮN LÁ VÀ VÀNG MÉP LÁ

TRÊN CÂY DÂU TÂY IN VITRO BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

TS. Huỳnh Văn Biết Lê Hồng Duy 21126314 ThS. Trương Quang Toản Nguyễn Thị Thanh Ngân 21126417 Phan Thị Mai Trúc 21126220 Lê Thái Văn 21126577

TP. Thủ Đức, 10/2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

1.3 Nội dung thực hiện ... 1

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 2

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 4

3.2.1 Tạo môi trường nuôi cấy ... 5

3.2.2 Thiết lập hệ thống nuôi cấy ... 5

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy ... 5

3.2.4 Thu mẫu và tách chiết RNA ... 5

3.2.5 Quy trình chẩn đốn bệnh SCV và SMYEV bằng kỹ thuật RT-PCR ... 6

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 8

4.1 Kết quả ... 8

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

SCV: Strawberry Crinkle Virus

SMYEV: Strawberry Mild Yellow Edge Virus MS: Murashige and Skoog medium

TDZ: Thidiazuron

RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction DEPC: Diethyl pyrocarbonate

SDS: Sodium dodecyl sulphate

EDTA: Acid Ethylen Diamin Tetra Acetic ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 4.1. Tỷ lệ mẫu cây Dâu tây in vitro bị nhiễm và sạch bệnh SCV và SMYEV...8

Bảng 4.2. Tỷ lệ mẫu bị nhiễm bệnh SCV và SMYEV của từng giống Dâu tây...8

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 4.1. Cây Dâu tây bị nhiễm bệnh; a) Cây bị nhiễm SCV, b) Cây bị nhiễm SMYEV...8

Hình 4.2. Các cây Dâu tây sạch bệnh virus tái sinh từ mô lá; A) Mơ sẹo hình thành từ mơ lá, B) Chồi tái sinh từ mô sẹo, C) Cây Dâu tây in vitro, D) Cây Dâu tây trồng ngoài vườn ươm...9

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây Dâu tây Fragaria vesca L. Thuộc họ hoa hồng Rosaceae được trồng nhiều ở Đà

Lạt và trở thành loại cây ăn quả đặc sắc của vùng này. Quả Dâu tây được xếp vào loại thực phẩm tốt cho sức khỏe. Dịch chiết của quả Dâu tây có khả năng chống oxy hóa, những chất này có tác dụng như làm giảm khả năng của các chất sinh ung thư, làm chậm quá trình lão hóa, bảo vệ cơ thể chống lại các tế bào ung thư. Cây Dâu tây chứa nhiều loại khoáng chất như Ca, K, P, Mg,... và nhiều vitamin cần thiết cho con người như vitamin A, vitamin B, vitamin C. Hàm lượng vitamin C ở Dâu tây được đánh giá nhiều hơn ở cả cam và dưa hấu. Dâu tây được xem là loại cây đem lại nhiều tiềm năng kinh tế cho Việt Nam nói chung và Đà Lạt nói riêng. So với các loại rau và hoa khác, Dâu tây được xếp vào danh sách những loại cây trồng được ưu tiên đầu tư theo hướng công nghệ cao ở tỉnh Lâm Đồng. Tuy nhiên, việc trồng Dâu tây chưa thể mở rộng do dịch bệnh lây lan trên cây Dâu tây, trong đó có bệnh do virus SCV và SMYEV gây ra. Vì vậy, cần tìm ra giải pháp để tăng năng suất cho cây trồng, đem lại hiệu quả kinh tế cao.

1.2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán bệnh xoắn lá và vàng mép lá

trên cây Dâu tây in vitro.

1.3 Nội dung thực hiện

Ly trích mẫu Dâu tây in vitro thu nhận RNA.

Sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán virus gây bệnh xoắn lá và virus gây bệnh

vàng mép lá trên cây Dâu tây in vitro.

Điện di trên gel agaroe và thu nhận kết quả dưới tác động của tia UV để ghi nhận vạch của sản phẩm tương ứng với thiết kế.

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Các virus gây bệnh SCV và bệnh SMYEV thuộc nhóm Cytorhabdovirus và nhóm

Luteovirus có genome là RNA sợi đơn. Chúng gây hại phổ biến trên các giống Dâu tây ở

nhiều nước trên thế giới. Bệnh SCV làm lá Dây tây bị biến dạng, có những đốm vàng; các lá có kích thước không đồng đều, uốn cong và nhăn lại; cuống lá và lá có thể giảm kích thước. Bệnh SMYEV làm lá Dâu tây bị cong, xuất hiện những đốm vàng nhỏ trên gân phụ của lá. Khi triệu chứng phát hiện, các đốm vàng càng đậm và các mô bị chết. Cả hai bệnh này đều làm giảm sức sống, năng suất và kích thước trái của cây Dâu tây.

Virus SCV gây bệnh xoắn lá cây Dâu tây. Virus SCV có genome là RNA sợi đơn, được lan truyền nhanh qua các môi giới truyền bệnh. Loại virus này làm giảm độ cứng của cây, khả năng sinh trưởng, kích thước quả và năng suất, đồng thời gây biến dạng và nhăn lá. Khi cây bị nhiễm bệnh, rất khó phát hiện ở giai đoạn sớm, khi cây biểu hiện triệu chứng bệnh thì khơng thể khắc phục được.

Virus SMYEV gây bệnh vàng mép lá cây Dâu tây. Virus SMYEV lây truyền qua các loài rệp thuộc chi Chaetosiphon, là một loại virus tiềm ẩn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng quả dâu tây. SMYEV là một loại virus “dai dẳng, lây truyền theo

đường tuần hoàn” lây lan bởi một số lồi rệp (nhưng khơng phải tất cả) – Chaetosiphon

fraegolii (rệp Dâu tây), C. thomasi và C. jacobi. “dai dẳng” có nghĩa là những con rệp này

cần ăn hàng giờ hoặc hàng ngày để “lấy” và lây lan virus. Tuy nhiên, “dai dẳng” và “lây truyền” cũng có nghĩa là virus lây lan qua cơ thể côn trùng sau khi nhiễm virus và khi rệp có virus, virus vẫn tồn tại trong rệp trong hầu hết hoặc tồn bộ vịng đời của nó.

Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện virus trên cây trồng. Phương pháp ELISA thực hiện khá đơn giản, cho kết quả nhanh. Tuy nhiên trong trường hợp nồng độ virus trong tế bào thấp (vài chục pg) thì phương pháp này cho kết quả kém chính xác. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép chẩn đoán các bệnh virus hại thực vật nhanh, nhạy và đặc hiệu. Phương pháp PCR được áp dụng trực tiếp để chẩn đốn các bệnh virus hại thực vật có genome ở dạng DNA. Đối với các bệnh virus gây hại thực vật có genome ở dạng RNA được chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR. Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), còn được gọi là PCR phục vụ phiên mã ngược.

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

Phương pháp RT-PCR dùng để khuếch đại DNA bổ sung (cDNA) nhờ enzyme Reverse Trancriptase. Phân tử RNA sẽ được chuyển mã ngược (reverse transcription) thành cDNA trước khi thực hiện phương pháp PCR thông thường . Trong canh tác cây Dâu tây, việc chấn đoán nhanh virus SCV và virus SMYEV trên cây Dâu tây bằng phương pháp RT-PCR là rất cần thiết giúp loại bỏ sớm cây giống Dâu tây nhiễm bệnh virus SCV và virus SMYEV trên đồng ruộng vì khi cây bị nhiễm bệnh, rất khó phát hiện ở giai đoạn sớm nhưng khi cây có biểu hiện triệu chứng bệnh thì khơng thể khắc phục được. Chính vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm chọn được các cây Dâu tây sạch virus SCV và virus SMYEV, làm nguồn nguyên liệu phục vụ cho công tác nhân giống Dâu tây sạch bệnh virus cung cấp cho các vùng trồng dâu tây, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng trái dâu tây. Đồng thời giới thiệu quy trình chẩn đốn nhanh virus bằng phương pháp RT-PCR phục vụ cho cơng tác chẩn đốn bệnh virus gây hại cho cây Dâu tây và cho các loại cây trồng khác.

Vì vậy, việc ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán bệnh SCV và bệnh SMYEV

trên cây Dâu tây in vitro, nhằm thu nhập nguồn cây Dâu tây sạch bệnh virus để phục vụ

công tác nhân giống, góp phần đáp ứng nhu cầu về cây giống sạch bệnh virus, đồng thời nâng cao năng suất và chất lượng của trái Dâu tây là mục đích đặt ra của cơng trình nghiên cứu này.

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu 3.1.1 Mẫu

Cây Dâu tây in vitro thuộc ba giống: Mỹ Đá, Mỹ Hương và Pháp. Mẫu lá Dâu tây

in vitro được cắt nhỏ khoảng 7 x 7 mm và được nuôi cấy trên môi trường hình thành mơ

sẹo. Sau 30 ngày ni cấy, các cụm mô sẹo được tách ra và được nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi. Sau 45 ngày nuôi cấy, các chồi tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường tạo rễ. Sau 30 ngày nuôi cấy, các cây Dâu tây con hình thành, có bộ lá và rễ phát triển hoàn chỉnh. Chúng được dùng là nguồn mẫu để tiến hành chẩn đoán virus.

Dâu tây in vitro sạch bệnh virus, được dùng làm nguyên liệu cho quá trình nhân

giống Dâu tây sạch bệnh. Quá trình nhân giống này tương tự: mẫu lá in vitro cắt nhỏ 7 x 7 mm, được ni cấy trên mơi trường hình thành mơ sẹo. Mơ sẹo thu được sau 30 ngày nuôi cấy được chuyển sang môi trường tạo chồi. Các chồi thu được sau 45 ngày nuôi cấy tiếp tục trong môi trường tạo rễ. Sau 30 ngày, cây con hoàn chỉnh được đưa ra ngồi vườn ươm.

3.1.2 Hóa chất

Môi trường MS Agar Chloroform TDZ Vitamin B5 Isoamyl Đường Sucrose Tris-HCl EtOH

LiCl EDTA Sodium Acetate SDS Phenol Gel Agarose EtBr

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Bình thủy tinh Các túi polyethylen Máy ly tâm Các tube

Máy PCR Bồn điện di Máy soi gel bằng tia cực tím

3.2 Phương pháp

3.2.1 Tạo môi trường nuôi cấy

Môi trường hình thành mơ sẹo là mơi trường MS (Murashige, Skoog, 1962) có bổ sung 1 mg/l TDZ, 0,1 mg/l 2,4-D, 30 g/l sucrose và 8 g/l thạch; môi trường tạo chồi là mơi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và 8 g/l thạch; mơi trường tạo rể là mơi trường MS có bổ sung 5 ml/l vitamin B5, 30 g/l sucrose và 8 g/l thạch. Độ pH của các môi trường từ 5,7 đến 5,8.

3.2.2 Thiết lập hệ thống nuôi cấy

Giai đoạn tạo nguồn mẫu chuẩn đoán virus là các chai thủy tinh có dung tích

250 ml (chứa 30 ml môi trường/chai) ở giai đoạn tạo mô sẹo, cấy 3 mẫu lá/chai; ở giai

đoạn tạo chồi, cấy 3 cụm mô sẹo/chai và ở giai đoạn tạo rễ, cấy 1 chồi/chai.

Giai đoạn nhân giống Dâu tây sạch bệnh virus là các túi nylon làm từ polyethylen đã được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm trong 20 phút. Các túi được mở ra và rót mơi trường ni cấy vào (100 ml môi trường/túi thao tác trong tủ cấy vô trùng); ở giai đoạn tạo mô sẹo, cấy 3 mẫu lá/túi, ở giai đoạn tạo chồi, cấy 3 cụm mô sẹo/túi và ở giai đoạn tạo rễ, cấy 3 cụm chồi/túi.

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy

Các hệ thống được nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ phòng 23-27oC (±25oC), với thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày cường độ ánh sáng 3000 lux.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

chọn những cây có chiều cao 4-5 cm có 4-5 lá, lá rộng khoảng 1cm sau đó dùng kéo cắt 2 lá mỗi cây.

Quá trình tách chiết RNA diễn ra như sau:

Bước 1: Dùng 200-300 mg lá của mẫu cần chuẩn đoán virus sau đó nghiền với N2

chứa trong các ống ly tâm 1,5 ml đã được ký hiệu, sau đó bổ sung thêm 600 𝜇l dung dịch đệm bao gồm (50 mM Tris-HCl có pH = 8,9, 150 mM LiCl, 5 mM EDTA và 5% SDS) và lắc đảo trong 2 phút.

Bước 2: Bổ sung 600𝜇l hỗn hợp PCI (Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol với tỉ lệ 25:24:1) trộn đều trong 3 phút sau đó ly tâm với tốc độ 9.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.

Bước 3: Chuyển phần dịch nổi sang ống ly tâm mới và lặp lại bước ly trích bằng Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol.

Bước 4: Phần dịch lỏng phía trên được chuyển sang ống ly tâm mới và bổ sung 1/3 thể tích tương ứng của LiCl 2M ( pH=9,2) sâu đó ủ qua đêm 80oC để kết tủa RNA và ly tâm 11.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC.

Bước 5: Thu lại kết tủa và rửa lại bằng 300 microlit EtOH 70%, 0,15 M NaCl sau đó ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC.

Bước 6: Thu và làm khô kết tủa ở nhệt độ phịng sau đó thêm 30𝜇l nước cất đã được xử lý DEPC và hấp khử.

Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng/phút để cặn lắng xuống đáy ống và chuyển phần dịch nổi chứa RNA sang ống ly tâm mới.

Bước 8: Xác định nồng độ RNA tổng số bằng máy quang phổ sau đó RNA tổng số được tính bằng 1/10 thể tích sodium acetate (pH=5,2), 2,5 thể tích EtOH 100% và ủ 20oC trong 1 giờ.

Bước 9: Kết tủa được hòa lại bằng nước cất đã được xử lý DEPC tạo thành dung dịch RNA 5ug/ul được sử dụng để chuẩn đoán bệnh SCV và SMYEV.

3.2.5 Quy trình chẩn đốn bệnh SCV và SMYEV bằng kỹ thuật RT-PCR

Virus được phát hiện bằng cách thiết kế các cặp mồi đặc hiệu tương ứng trong phản ứng RT-PCR với trình tự sau:

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Cặp mồi phát hiện bệnh SCV:

Mồi xuôi (SC1DFW): 5’- TTCAGGACCTATT TGATGACA - 3’ Mồi ngược (SC1DRV): 5’- CATTGGTGGCA GACCCATCA - 3’ Cặp mồi phát hiện bệnh SMYEV

Mồi xuôi (SM1DFW): 5’- GTGTGCTCAATCC AGCCAG - 3’

Mồi ngược (SM1DRV): 5’- CATGGCACTCAT TGGAGCTGGG - 3’

Hai cặp mồi này có nhiệt độ bắt cặp lần lượt là 58oC và 50oC; sản phẩm khuếch đại sau phản ứng của mỗi loại virus SCV và SMYEV có kích thước tương ứng là 345 bp và 271 bp.

Phản ứng RT-PCR được thực hiện theo quy trình của bộ sản phẩm StrataScript® One-Tube- RT-PCR của ITS Việt Nam. RT được thực hiện ở 42oC trong 15 phút. Phản ứng PCR được thực hiện 40 chu kì bao gồm 30 giây ở 90oC, 30 giây ở 58oC (đối với bệnh SCV), ở 50oC (đối với bệnh SMYEV), 2 phút ở 68oC và phản ứng được kết thúc ở 68oC trong 5 phút.

Điện di trên gel agarose 2% ở hiệu điện thế 100 V trong 1 giờ; sau đó nhuộm trong dung dịch EtBr 2 mg/l trong 30 phút. Hình ảnh điện di được chụp dưới tác động của tia UV để ghi nhận vạch của sản phẩm tương ứng với kích thước thiết kế sẵn ở trên thang chuẩn.

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

Kết quả chẩn đoán hai loại bệnh SCV và SMYEV trên 50 mẫu Dâu tây in vitro của

các giống: Mỹ Đá, Mỹ Hương và Pháp cho thấy cả ba loại đều bị nhiễm virus.

Tỷ lệ mẫu nhiễm SCV (11,33%) nhiều hơn mẫu bị nhiễm SMYEV (7,33%). Trong đó, tỷ lệ mẫu nhiễm của từng giống cũng khác nhau. Giống Mỹ Đá bị nhiễm 2,66% SCV và 3,3% SMYEV; giống Mỹ Hương bị nhiễm 4% SCV và 2,66% SMYEV; giống Pháp bị

Bảng 4.2. Tỷ lệ mẫu bị nhiễm bệnh SCV và SMYEV của từng giống Dâu tây

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

4.2 Thảo luận

Thơng qua chuẩn đốn bệnh SCV và SMYEV , đã thu được 1 lượng cây Dâu tây in

vitro sạch virus của các giống .Qua kết quả trên, sau 10 ngày ni cấy thì mơ sẹo được

hình thành ở các vết cắt của lá và có màu chanh. Sau 25 ngày, các mơ sẹo lớn hơn và lan ra khắp lá. Đến ngày 30, các mơ sẹo bắt đầu hình thành chồi. Sau 30 ngày nuôi cấy các mô sẹo này được chuyển qua môi trường tạo chồi. Sau 45 ngày nuôi cấy, chồi cao 3-4 cm có lá, có màu xanh và chuyển sang môi trường tạo rễ. Sau 30 ngày nuôi cấy các cây non được đem ra vườn ươm làm nguồn giống phục vụ cho sản xuất.

Hình 4.2. Các cây Dâu tây sạch bệnh virus tái sinh từ mơ lá; A) Mơ sẹo hình thành từ mơ lá, B) Chồi tái sinh từ mô sẹo, C) Cây Dâu tây in vitro, D) Cây Dâu tây trồng ngoài vườn ươm.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Với phương pháp RT-PCR, bước đầu đã chẩn đoán được trên các mẫu dâu in vitro 2 mắc loại bệnh là SCV và SMYEV bằng các cặp mồi ương ứng SC1DFW-SC1DRV và SM1DFW-SM1DRV cho các vạch của sản phẩm đặc trưng trên gel agarose phù hợp với

thiết kế ban đầu. Cả 2 bệnh đều xuất trên cả 3 giống cây dâu in vitro.

Phương pháp này đã tạo ra những cây dâu sạch 2 bệnh virus trên tiếp tục đem ra vườn ươm góp phần giải quyết nhu cầu về giống dâu tây sạch virus.

5.2 Kiến nghị

Trước khi nhân giống dâu hoặc bất cứ loại cây nào cần phải sử dụng phương pháp RT-PCR, điện di.... để phát hiện ra bệnh (nếu có) của cây giống nhằm đảm bảo nguồn giống sạch tránh ảnh hưởng đến chất lượng sản xuất về sau làm hao phí tiền bạc, cơng sức...và đưa đến tay người tiêu dùng những sản phẩm chất lượng nhất.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Duy, Hà Thị Tuyết Phượng, Nguyễn Thị Thu Sương, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Bá Nam, Lê Văn Cơng, Bùi Minh Trí (2009). Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn

đoán bệnh virus xoắn lá và vàng mép lá trên cây Dâu tây in vitro, Tạp chí Cơng nghệ

Sinh học.

2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Đông, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Pham Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt

Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

3. Nguyễn Thị Lan, Bùi Chí Cửu (2005). Sinh học phân tử - Giới thiệu phương

pháp và ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp.

4. Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học tự nhiên; ISSN 1859 – 1388 5. Thư viện số tài liệu nội sinh

6. Tạp chí Khoa học Quốc Tế AUG ISSN 0866 – 8066

IN COLLETOTRICHUM (ANTHRACNOSE) INFECTED STRAWBERRY FRUIT. Acta Hortic. 439, 815-820. Doi: 10.17660/ActaHortic.1997.439.135

</div>