Luận văn thạc sĩ khoa học lâm nghiệp: Nhân giống một số loài phong lan bản địa bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm (Invitro)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.57 MB, 105 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO. BO NÔNG NGHIỆP VÀ PINT‘TRUONG ĐẠI HỌC LAM NGHIỆP.

NHÂN GIỐNG MỘT SỐ LOÀI PHONG LAN BẢNDIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRONG

ỐNG NGHIÊM (IN VITRO)

LUẬN VĂN T11\C SI KHOA HỌC LAM NGHIỆP.

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC:

PGS. TS. Dương Mộng Hùng

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

MỤC LỤC“hư

<small>Trang</small>Chương 1: Mở đầu. 1

1.1. Đặt vấn để 2

1.2. Mục tiêu. 51.3. Đối tượng. 5

Chương 2: Tổng quan vấn để nghiên cứu, 6

2.1. Lịch sử phát triển nuơi cấy mơ tế bào thực vật. 62.2. Lịch sử nuơi trồng lan. 9

2.2.1. Trên thé giới 9

2.2.2. 6 Việt Nam. 10

2.3. Giới thiệu vẻ phong lan. it2.3.1. Nguồn gốc, vj tf, phân loại của cây hoa phofigylan. "2.3.2. Vài nét về hình thái phong lan. 22.3.3. Giá trị kính tế và sử dụng của cây phong lan. 12.4. Cơ sở khoa học của phương pháp nhan giống bằng nuơi cấy mơ tế bào. 172.4.1. Khái niệm phương pháp nhân giống bằng nuơi cấy mơ tế bào. „

2.4.2. Cơ sở khoa học của nuơi cấy mơ tế bao, 1

2.4.3. Các giai đoạn trong quá tình nhân giống in vitro. 192.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá tình phát sinh hình thái mơ tế bào trong — 21nhân giống bằng phương pháp nuơÏ ©ấy in vi

2.5.1. Mơi trường nuơi dưỡng 22.5.2. Moi trường vật lý. a

2.5.3. Vat liệu nuơi cấy. 282.5.4. Điều kiện vơ trùng. 22.5.5. Buéng nuơi cấy. 30

2.6. Ứng dung muơi cấy mơ tế bào thực vật (nuơi cấy in vitro) trong cơng tác —_ 30

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

3.1.2. Môi trường nhân nhanh chối.. Mơi trường kéo đài chổi|. Tạo cây hồn chỉnh.3.1.5. Giai đoạn vườn ươm.

3.2. Phương pháp nghiên cứu.

3.2.1. Địa điểm bố trí thí nghiệm.

3.2.2. Cơng thức thí nghiệm và cách bổ tr.3.2.3. Các chỉ tiêu theo di.

3.3. Phương pháp thống kê và sử lý số liệu.Chương 4: Kết quả nghiên edu và thảo luận.4.1. Tạo thể chổi và chổi.

4.1.1. Phương pháp khử trùng,

4.1.2. Tạo thể chổi và chổi

4.1.3. Ảnh hưởng của thời điểm lấy hạt đến khẵ oăng nảy mắm và tạo thể ch4.1.4. Ảnh hưởng của số lượng thể chổi và chồi trong một cum đến khả năng

nhân chổi

4.2. Giai đoạn nhân nhanh thể chồi và chổi.

4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân chối.

4.2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chi.

4.2.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chối.

4.2.4. Ảnh hưởng của hỗn hợp Kinetin + BAP và Kinetin + NAA đến khả năng.

nhân chối.

4.3. Giai đoạn kéo dai chối

4.4. Giai đoạn tạo cây huditchinh,

4.4.1. Ảnh hưởng của nổng độ TBA đến khả năng ra rể.4.4.2. Ảnh hưởng của phương pháp huấn luyện cây con.

4.5. Giai đoạn chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm.Chương 5: Kết luận tôn tại và dé nghị.

5.1. Kết luận,

5.2. Tổn5.3. Để nghị.

‘Tai liệu tham khảo.

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

LỜI NÓI ĐẦU

Nang cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là một trongnhững mục tiêu quan trọng của q trình hồn thiện chương trình cao học lâm.

nghiệp - Trường đại học Lam nghiệp. Để đánh giá kết quả học tập và nghiên

cứu trong 3 năm đào tạo sau đại học - hệ cao học, tôi được thực hiện để tài:

“Nhân giống một số loài phong lan bản địa bằng phương pháp nuôi cấy trong

ống nghiệm (in vitro).

Hồn thành bản luận van này, trước hết tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâusắc đến PGS.TS. Dương Mộng Hùng, chủ nhiệm bợ thôn Di truyền chọn giống,

Khoa Lâm nghiệp - Trường đại học lâm nghiệp, người trực tiếp hướng dẫn tơitrong q trình nghiên cứu khoa học. Nhân địp sầy tôi xin bày tổ sự biết ơn

chân thành tới tất cả các nhà chun mơn, ếc bạn đồng nghiệp đã tận tình"hướng dẫn chỉ bảo và diu đất tơi trong suốt q trình học tap.

Trong thời gian học tập và thực hiện bản luận văn này, tôi cũng đã luônnhận được sự ủng hộ, động viên, tạo điều kiện thuận lợi của Khoa nang cao, các

đồng nghiệp và tồn thể bộ mơi! Di trun chọn giống Khoa Lâm nghiệp “Trường Đại học lãm nghiệp. Nis dịp này, tôi xin chan thành cảm ơn về tất cảsự ủng hộ và giúp đỡ nhiệt tình, q báu đó.

-Nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô là một vấn để khó trong lâm

nghiệp, nhưng nhân giống phong lan bản địa lại càng khó hơn. Việc nghiên cứu.

nhân giống bai lồi nH địa trong dé tài này nhằm góp phẩn xây đựng cơ sởhồn thiện quy tình cde hệ sản xuất cây với số lượng lớn, đồng đều có chấtlượng cao do vậy không thể tránh khỏi những khiếm khuyết, rất mong được sựchỉ bảo, bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp để cơng

trình nghiên cứu này được hoàn thiện hơn.đit châm thank edn on.

“Ngày 30 tháng 11 năm 1999Vũ Thị Huệ

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ:

Rừng nhiệt đới Việt Nam là nguồn tài ngun thiên nhiên vơ cùng q.

giá. Ngồi khả năng cung cấp gỗ thì rừng cịn là một nơi cung cấp một lượng

lớn đặc sản quý, được liệu cho nén kinh tế quốc dan và cho xuất khẩu. Ngàynay khi nói đến lợi dung rừng thì người ta nghĩ ngay đến lợi dụng rừng tổng.hợp. Một trong những sản phẩm quý của rừng hiện nay được mọi người

quan tâm đến là các loài lan, nhất là phong lan thột lồi thực vật cảnh mà

thiên nhiên ưu đãi, tơ điểm cho cảnh quan núi rừng. Phong cách đặc biệt của

phong lan là vẻ đẹp trang nhã, với sắc hoa đẹp, Hương thơm thanh nhã phẳng

phat bay xa đã gợi cho ta cảm giác thanh 46, tỉnh khiết, đạm bạc, hương sắccủa phong lan đã di vào thế giới nội tâm của người dân dat Việt, vừa gắn bó

<small>với phong tục tập quán, vừa hoà đồng với tập tục nghỉ lễ [6]. Chính phong</small>lan cũng như bất kỳ cây cảnh nào đều gép phần vào việc cải tạo môi trường

sống, là điều kiện tốt để con người tăng thêm lượng 6 xy. Khơng ding ở lại

đây, phong lan cịn có vai tid đi (Lai trong chúng ta ngờ tới đó là khả năng

điều chỉnh hành vi, phong cách của con người nhờ sự tao nhã của nó. Ngắm

nhìn phong lan con người có thể thanh thản hơn, yêu đời hơn và quên di

những mệt mỗi căng ti#ig trong mỗi ngày lao động vat va của đời thường.Hoa lan là một lồÏ Hoa tất giá tri, ngồi tác dụng lục hố cịn làm dep,

thơm mơi trường. Giá uj của chúng vượt xa nhu cầu là để thưởng thức, nó cồncó hiệu ích kinh tế xã hội, sinh thái và trở thành nghề kinh doanh mới. Bêncanh đó nó cịn là nguồn dược liệu cho y học và là nguồn hương liệu chế biến

<small>nước hoa, xà phịng thơm... chúng có giá ti kinh tế rất cao, thị trường quốc tế.</small>

tiêu thụ phong lan rất nhiều. Có người nổi: “Vang có giá nhưng hoa lan thì vơ

i"; “Một tấc hoa lan một te vàng” [48]. Chính vì vậy kink doanh phong lan

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

đã làm tăng thêm thu nhập và trở nên giàu có cho một số nước có kinh

nghiệm và khả năng gây trống. Ở nước ta có nhiều vùng (thành phố Hồ Chí

Minh, Đà Lạt...) đã giải quyết cơng ăn việc làm cho khơng ít người lao động,và đã nổi tiếng trên toàn quốc. Đất nước chúng ta được thiên nhiên ưu đãi vềđịa lý, khí hậu, điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng thích hợp với việc trồng

hoa lan, không những thế nước ta ở vị trí thug lợi cho việc giao lưu quốc tế

mà rùng của chúng ta lại có nhiều lồi lan q, hoa của chúng có nhiều màu

sắc rực rỡ và đa dạng. Theo Phan Thúc Huân thì bẩu trời Việt Nam là nhàkính thiên nhiên vĩ đại phi hợp với ni trồng lan. Song trong những năm gần.day rừng ngày càng bị thu hẹp dẫn và đang ở mức báo động. Rừng bị thn phá

thì khơng những ảnh hưởng đến mơi trường sinh thái mà rồi đây các nguồn

gen quý hiếm sẽ bị diệt vong. Đến nay nguén tài nguyên hoa lan hoang đạingày càng ít, các chủng tốt ngày càng th’ nên quý. Vì vậy điều đáng quantâm ở đây là ngoài nhu cẩu thị trường, tài nguyên hoa lan cẩn phải được bảovệ, thuần hố, nhân giống và ni đưỡng chúng. Đó là việc làm hết sức cầnthiết đối với chúng ta trong giai đoạn hiện nay.

Dé có số lượng, chất lượng đáp ứng được nhu cẩu thị hiếu của khách

"hàng trong và ngoài nước, kết hợp với định hướng phát triển nông nghiệp nước

ta giai đoạn 1996 - 2000, chúng ta không chỉ đơn thuần khai thác tiểm năng,

sẵn có của thiên nhiên mà vấn để dat ra là cẩn giải quyết cả về mặt tổ chức

kinh doanh và kỹ thus (B2! luan giống và cham sóc các lồi phong lan có giátrị. Hiện nay. kỹ thuật /t9ơ: cấy mô tế bào thực vật được áp dụng rộng rãi và

có kết quả tiên một số cây giống đặc biệt trong lĩnh vực hoa tưới, hoa lan đã

thừa hưởng sớm các cơng trình nghiên cứu này. Từ lâu ở các nước tiên tiến

như: Anh, Pháp, Mỹ, Nhật... hoa lan đã trở thành nhu cầu lớn trong các buổi

18 trang trong tại gia đình, giá rất cao, chỉ có gia đình khá giả mới mua được.‘Vi vậy người ta đã suy nghĩ: khi có một giống lan đạc sắc, thì làm thế nào để

phổ biến rộng rãi giống lan này cho mọi người và ai cũng có thể mua được với

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

giá phải chăng, hợp túi tiền. Hơn nữa làm sao người ta có thể làm chúng thích

nghị với khí hậu bản xứ nếu giống lan đó lấy từ các vàng khí hậu khác nhautrên thế giới. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật sẽ giải quyết được cácvấn để trên. Vì vậy trong cơng nghệ sin xuất hoa thương mại, việc ứng dụngkỹ thuật nudi cấy mô tế bào thực vật được đặc biệt quan tâm và ứng dụng rấthiệu quả trong lai tạo và nhân giống vơ tính các cây hoa, cây cảnh q lạ cógiá trj kinh tế cao nhờ ni cấy đỉnh sinh trưởng và các cơ quan sạch bệnh

khác như (hat, lá, rễ...) Có thể tạo ra những cây sạch bệnh cho chất lượng hoa

cao và khả năng sinh trưởng tối hơn cây me rất nhiễu. Phương pháp nhângiống để sản xuất ra hàng loạt cây con từ một bộ pẬN của cây bằng cách nuôi

cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện mơi trường thích hợp và được kiểm

sốt (in vitro) là phương pháp duy nhất hiện nay ©ó thể nhân giống nhanh với

số lượng lớn để đưa vào sản xuất cây con dip ng được các yêu cầu mongmuốn. Cho nên tit những lồi lan có-ưong thiên nhiên đến nay đã có trênhàng tram hàng ngần giống khác nhau, từ một số ít cây q hiếm chỉ có mộtsố người khá giả hoặc biết thưởng thức mới dám nghĩ tới, đến nay hầu như các

giống quý hiếm được phổ biến đến nhiều người trong thời gian ngắn bởi vì

trình độ thưởng ngoạn về hoá của con người đạt đến đỉnh cao và trình độ khoahọc của con người đã giải đáp được nhiều điều bí ẩn của lồi lan: đó là khả

năng lai tạo để tạo ra các giống lan mới mà thiên nhiên khơng thể nào có

được, đồng thời nhờ bã uang nhân giống các loài lan trong phịng thí nghiệm

được thực hiện bởi mote độ mà ngồi thiên nhiên không thể đáp ứng đượctrong thời gian ngắn. Ngày nay đời sống vật chất và tri thúc của con người

ngày càng tăng lên, cùng với sự phát triển vé tí tuệ, con người ngày càng,

nhận thức vẻ đẹp, vẻ tao nhã của phong lan. Vì vậy phát triển nuôi trồngphong lan là điều không thể không xảy ra. Trong khi đó nhân giống phong lanbằng phương pháp kinh điển có nhiều han chế như: số lượng tạo ra cịn ít, cầnkhơng gian lớn và thời gian dài để ươm cây, cây bị lão hoá nhanh, sinh trưởng

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

kém do không sạch bệnh. Việc nhân giống bằng phương pháp ni cấy mơ‘cho một số lồi lan bản địa sẽ khắc phục những hạn chế trên và góp phần choviệc lưu trữ phát tiển nguồn gen quý hiếm, tạo nguồn cây giống phong phúphục vụ cho nhu cẩu trổng hoa lan tai địa phương cũng như sự phát tiển

ngành sản xuất lan. Xuất phát từ ý tưởng trên, đồng thời g6p phân hồn thiện

quy tình sin xuất hoa phong lan khắc phục những khó khăn, tổn tai trong

khâu sin xuất cây giống, phong lan, chúng tôi tiến hành dé tài: "Nhu giốngmột số loài phong lan bản địa bằng phương pháp nudi cấy trong ống

<small>nghiệm (in viiro)."</small>1.2. MỤC TIÊU:

Nghiên cứu tồn điện các cơng đoại tong bệ thống nhân nhanh.in vitro cho hai loài lan nghiên cứu, im ra mơi liường thích hợp nhất để nhân.

giống, từng bước hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất hai loài hoa lan

bin địa en với số lượng lớn, đồng đều; có chất lượng cao, đồng thời để xuất

những giải pháp cụ thể góp phần xây dựng quy trình nhân nhanh các giống

lan nói chung

1.3. ĐỐI TƯỢNG:

Do đặc điểm các loài phong lan bản địa đã quen sống hoang dã ở<small>trong các rừng già mà chứa được thuần hoá nên rất khó điều khiển và nhan</small>giống trong tự nhiên. Vì vậy nuôi cấy mô tế bào là biện pháp duy nhất hiện

nay có thé nhân ging alan với số lượng lớn để đưa vào sản xuất cây con

có tính trạng mong rauốĐ, Để tài tập trung nghiên cứu nhân giống in vitrocho 2 loài phong lan

Hoang thảo Giả hac (Phi điệp) - Dendrobium anosmum Lindl

Bắp ngô nhiều hoa (Lan huong) - Acampe rigida P. F Hunt Cịn có.

tên là Acampe multiflora Lindl .

Vat ligu nghiên cứu: Hạt lấy ở các giai đoạn chín khác nhau.

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

Chương 2

TONG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN COU

2.1. LICH SỬ PHÁT TRIEN CUA NUÔI CẤY MÔ TẾ BẢO THUC VAT:

2.2.1. Trên thế giới.

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vat được khởi xướng vào nhữngnăm cuối thế kỷ 19, cho đến nay đã trải qua trên 90 năm phát triển. Có thể

tạm chia quá trình này thành 4 giai

2.2.1.1. Giai đoạn khỏi xướng: (1898 + 1930).

Haberlandt (1898) là người đâu tiên để xuất phương pháp muôi cấy mô

tế bào thực vat. Ơng đã tìm cách ni cấy cất tế bào đã phân hoá tách từ lá.

một số cây một lá mầm nhưng không thành eông. Ngày nay, chúng ta đã biếtrất rõ nguyên nhân thất bại của Haberlandt vì các cây một lá mắm là đốitượng rất khó ni cấy. Hơn nữa ông lại dùng tế bào đã mất hết khả năng táisinh. Nhiều nhà khoa học khác Winker (1902), Thielmann (1924), Kuster(1928), cũng tiến hành nuôi cấy lế bào tương tự nhưng không thu được kếtquả. Năm 1909 Berard đã tình eờ phát hiện ra rằng nấm rất quan trọng cho

sự nảy mầm của hạt phong lan. Điều đó thể hiện rằng cây phong lan sống.

nhờ mối quan hệ cộng sinh Với nấm kể từ lúc mới nảy mầm. Nấm quan trọng.

nhất mà có mối quan bê cộng sinh với phong lan là giống nấm Rhiroetonia.

'Từ những ngày đâu (Ít clip thập kỷ (1900-1910) người ta đã cho rằng phong.lan chỉ có thể nay main in vitro với sự tham gia của nấm, (chi sự nảy mắmcộng sinh của phong lan), các cây phong lan mới nẫy mắm và thể chổi là dịdưỡng phụ thuộc vào nấm cho sự cung cấp các chất đỉnh dưỡng.

‘Nguyen nhân chính cho giả thuyết này là một số lượng nhỏ chất dự trữ đượctìm thấy trong các hạt phong lan. Nam 1922 Knudson chỉ ra rằng sự nảy

mầm của hạt phong lan là có thể trong một môi trường đơn giản chứa các

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

chất khoáng và đường với sự vắng mặt của nấm. Nấm ít quan trọng đối với

cây sau thời kỳ non trẻ bởi vì sau đó thực vật là sinh vật quang hợp tự dưỡng(Withner, 1974). Những nghiên cứu của Knudson vào khoảng những năm.

1922 đã làm simg sốt đối với. giới nghiên cứu phong lan bởi vì Ong ta đã chỉra ring các hạt của Cattleya, Epidendrum và nhiều loại phong lan khác cókhả nang nay mầm khơng cộng sinh in vitro. Mặc dù phát hiện của Knudsonđược cơng nhận ngay nhưng thường rất khó có thé tạo nên một mơi trườngmà trong đó các lồi phong lan được lựa chon có thé nảy mắm và phát triển.Nhiều môi trường dinh dưỡng đã được mô tả cho nhiều loài khác nhau. Vào.

những năm 1930, Schmacker (1929), Scheittefér (1931), Pfeiffer (1931),

Laurue (1933) đã bước đầu nuôi cấy thành ng đầu rễ phân lập trong môi

trường nhân tạo. Day là những tiến bộ rất có ý ghia.2.2.1.2. Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 +1950).

Giai đoạn này được bắt đầu bởï Cơng trình của White (1934) khi nicấy thành cơng đầu rễ cà chua. Rễ sinh trưởng mạnh trong môi trường nhântạo. Cùng thời kỳ này có sự phát hiện ra Auxin của Thimann (1935). Nhiềunhà khoa học đã sử dụng Auxin (IAA) và cả Vitamin bổ sung vào môi

trường ni cấy. Các tác giả đã khẳng định vai trị của Vitamin và Auxin

<small>trong môi trường nuôi cấy mô. Năm 1939, Gautheret đã thành cơng trong</small>

Việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt (Dancus

carota) tiên môi trườy¡g gảo bằng cách cấy truyền 6 tuần 1 lần.

Năm 1954, StuðE và Miller đã tìm ra Kinetin trong địch thuỷ phân

ADN của tinh dich cá be. Cùng với việc phát hiện vai trò của IAA, 24D,

NAA, các Vitamin và nước dita là những bước tiến rất quan trọng trong giai

đoạn thứ hai cia lịch sử ni cấy mơ thực vật đó là tiền để kỹ thuật cho việc

xây dựng các moi trường nuôi cấy.

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

2.2.1.3. Giai đoạn phái sinh hình thái (1957 + 1960)

Năm 1957 Skoog và Miller đã công bố kết quả nghiên cứu về ảnh.

hưởng của tỷ lệ Kinetin/Auxin trong mơi trường ni cấy đối với sự hìnhthành cơ quan của mơ sẹo thuốc lá. Từ đó dẫn đến nhiễu phát hiện quantrọng khác. Mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực

vật..Vào những năm 1958 -1959, Reinert (Đức) va Steward (Mỹ) đã thu đượcphôi xô ma từ mô cây Cà rốt. Năm 1960 Bergman đã tái sinh thành công tế

"bào đơn thuốc lá bằng kỹ thuật gieo tế bào.

2.2.1.4. Giai đoạn nghiền cứu di truyền (1960 cho tới nay)

'Các thành tựu của giai đoạn này đã thực sự đưa nuôi cấy mô thực vatin vito vào ứng dụng trong công tác giống và nghiền cứu di truyền. Các

thành tựu có tính chất đánh đấu giai đoạn này lầt

Sau năm 1960 một cuộc cách mạng điễn ra trong nhân giống sinh

dưỡng cây phong lan. Morel (1960) đã nhân giống loài Địa lan (Cymbidium)

bằng việc nuôi cấy mo phan sinh và đã nhận được từ các đỉnh chổi này cácchối mắm giống như nay mắm từ hạt, Các mắm rễ có khả năng tự phân chianhưng thường nó nhận được bằng cách cất mắm rễ thành từng mẫu. Vềnguyên tắc sy cắt này của mắm tễ có thể lặp lại vơ hạn. Khi dừng cắt đầuchối trong mỗi mắm rễ về nguyên tắc có thể phát triển thành chéi với lá và18, Bằng cách thức này Morel đã lạo ra hàng ngần cây trong một năm bắt đầuchỉ với một đỉnh chéi, 3/ ấy dịng phong lan bằng cấy mơ phân sinh trởthành ứng dụng thương le! nhân giống sinh dưỡng, đầu tiên trong in vitro.Phương pháp này đầu tiên được phát triển cho Cymbidium sau đó được chỉnh

lý và sử dụng cho Cattleya và nhiều thế hệ phong lan khác.

<small>~ Nitsch (1967), Nakata, Tanaka (1968) đã nuôi cấy bao phấn thuốc</small>0 thành công cây thuốc lá đơn bội

- Năm 1971, Takabe tái sinh được cây thuốc là hoàn chỉnh từ.

lá,

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

~ Năm 1972, Carlson đã tạo được con lai xơ ma đầu tiên giữa hai lồi

thuốc lá

~ Năm 1977 Melchers dung hợp protoplast thành cơng giữa Khoai tây

và Cà chua tạo cây “pomate”. Từ năm 1980 đến nay hàng loạt thành cơngmới trong lĩnh vực cơng nghệ gen thực vật đã được cơng bố. Nuơi cấy mơ tế

bào thực vật trở nên một cơ sở khơng thể thiếu của cơng nghệ sinh học hiệnđại (chủ yếu sử dụng cơng nghệ ADN tái tổ hợp). Nuơi cấy mơ tế bào trở

thành một cơng cụ quan trọng trong cơng nghệ tạo giống và nhan giống hiệnđại. Nuơi cấy mơ tế bào thực vật cũng mang lại nhiều lý luận mới mẻ cho ditruyền học và sinh lý thực vật

2.2, LICH SỬ NUOLTRONG LAN.

2.2.1. Trên thế giới .

“Trong thế giới lồi hoa, cây cảnh Hộ lan là một trong những lồi hoađẹp nhất. Hoa lan khơng những dep vẻ mầu sắc mà cịn đẹp cả vẻ hình dáng.

Cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đường nét của cánh hoa tao nhã đến

những dạng hình duyên dáng của thân, lá, cành, hoa mà ít cĩ hoa nào sánhnổi.

Ho lan Orchidaceae là mi0t trong những đỉnh cao của sự tiến hố các

lồi cây cĩ hoa. Hoa lan đến với con người từ rất sớm. Ở Châu Á, lan rừng.

đã được dùng làm thuốc chữa bệnh từ thời vua thin nơng (2800 trước cơng,

nguyên) [2]

"Trong quyển cược thio và phương pháp dưỡng sinh của Maosiang đờinhà Tống Trung quốc (niin 960 - 1279) đã tình bày rất rõ những cơng dụngchữa bệnh của nhiều lồi lan thuộc chi Dendrobium .

Vio đời nhà Minh (1368-1644), hoa lan đã được nhiều hoạ sĩ nổi tiếng,của Trung Quốc lúc bấy giờ vẽ vào tranh tạo nên những tác phẩm nghệ thuật

phu vụ cho việc trang tr.

Năm 1728, Matuka (Nhật Bản) đã viết lên những kiến thức ban đâu,những kinh nghiệm trồng và chăm sĩc các lồi hoa lan.

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

© Châu Âu, hoa lan được con người biết đến từ trước công nguyên.Phrastus (376-285 Trước công nguyên) là người đẩu tiên dùng danh từ

erchis chỉ một lồi lan có cũ trịn dùng làm thuốc chữa bệnh [9]

Các thế kỷ 16,17,18, người Chau Âu đặc biệt là người Anh đã đi khắp

thế giới nghiên cứu, sưu tập cây cỏ. Trong thời kỳ này, nhiều loài lan nhiệt

đối đã được đưa về Anh. Năm 1974, ở Anh người ta đã biết được 15 loài lan

nhiệt đới và đến năm 1812 Loridiges đã thiết lập vườn lan thương mại đầu

tiên tên thế giới.

'Về phân loại, nấm 1783 Linne đã dùng danh từ orchis để chỉ các loàilan. Năm 1836 John Lindley cũng sử dụng danh từ orchis để chỉ chung cho

các lồi lan và từ đó các lồi lan được xếp thành một bọ trong hệ thống phân

loại chung gọi là Orchidaceae .

Ngày nay lan rừng đã được xác định có khoảng 750 giống, hơn 25.000

lồi và đã có hơn 30.000 lồi lan lai

2.2.2. Ở Việt Nam :

Đấu vết nghiên cứu buổi ban đậu khong rõ. Có thé nói người đầu tí

khảo cứu lan là Joannis Loueire là nhà tuyên giáo Bổ Đào Nha vàonăm 1789. Sau khi người Pháp đến Việt Nam cũng có rất nhiều nhà khoa học

Pháp đã nghiên cứu khảo sát về lan và đã có nhiều cơng tình rất đáng kể

như của F.Gaynepain và A Gullanmin đã mô tả 101 chi gồm 750 lồi cho cả3 nước Đơng Dương (30 Ðộ, *Thực vật chí đơng” xuất bản năm 1932-1934,

Ngồi ra cịn có một ð lẤc phẩm khác cũng để cập đến phong lan Việt Nam

của Schmid, Tixer... Bên cạnh đó một số tác phẩm người Việt Nam cũng

bước du nghiên cứu vẻ phong lan, đáng kể nhất là cơng trình nghiên cứu

“Cay cỏ miễn Nam” của giáo sư Pham Hoàng Hộ. Sau này cũng chính

sư. đã bổ sung rất nhiều lồi trong tác phẩm “Phong lan Việt Nam”. Mặtkhác các cơng trình nghiên cứu vẻ kỹ thuật gây trồng phong lan như của

Huỳnh Văn Thới, Nguyễn Tịch. Trổng hoa lan của kỹ sư

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

"Nguyễn Công Nghiệp, kỹ thuật lai tạo và phương pháp nhân giống phong lancủa tiến sỹ Dương Công Kiên. Hoa lan nuôi trồng và kinh doanh của Phan.Thúc Huan. Phong lan Việt Nam của Trin Hợp và một số để tài về nhângiống phong lan của trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã thúc đẩy

thêm cho việc phát tiển, gây trồng phong lan ở nước <sup>ta .</sup>2.3, GIỚI THIỆU VỀ. PHONG LAN.

2.3.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại của cây hoa phong lan:

Lan thuộc ngành ngọc lan (hạt kín, Magnoliophyta), lớp hành (một lámắm Liliopsida), bộ lan (Orchidales), họ lan (Orchidaceae ) với 750 chỉ và

20.000 ~ 25.000 loài (theo A.L. - Takhtajan, 1987). Họ lan chiếm vị tí thứ 2sau họ cúc trong ngành thực vật hat kín và là họ lớn nhất trong lớp một lá

mắm (Monocotyledones). Hoa lan phân bố khắp nơi trên trái đất, nhưngphong phú nhất là ở các rừng ẩm nhiệt đếi, các ving Đông Nam A và Trung

'Nhìn chung, họ lan phân bố từ 68 độ vĩ bắc đến 56 độ vĩ nam. Tuynhiên trung tâm phân bổ của phofig lan vẫn là khu vực nhiệt đới, đặc biệt ở

Châu Mỹ và Đông Nam Châu Ấ: Theo nghiên cứu của R.LPresley (1981) ở

vùng nhiệt đới Châu Mỹ có khoăng 306 chi và 8.266 lồi, & vùng nhiệt đới

Châu A có khoảng 250 chỉ Và 6.800 lồi, trong đó có 1.400 lồi thuộc chi

Dendrobium. Coelogye ©4 200 lồi, chi Phalaenopsis có 35 lồi, chi Vanda

có 60 lồi. Cịn vùng ne đói Chau Mỹ TA quê hương của nhiều chỉ, loài nổitiếng trên thế giới Cattleya (60loài ), Epidendrum (500lồi) ở các vùng nhiệt

đới khác cũng có nhiều lồi: Colombia có 1300 lồi và Tân Ghine có 1.450lồi [9J. Theo F.G Briger (1971) họ phong lan phân bố giảm din khi vượt

quá vĩ độ nhiệt đới đến vùng khí hậu lạnh. Ở vùng bán cẩu Bắc có khoảng.

75 chỉ và 900 lồi, ở vùng ơn đổi bán cầu Nam số chỉ, số lồi cịn ít hơn 40

chỉ và 500 loài

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

'Ngay ở các vùng nhiệt đới, họ phong lan càng phân bố rộng khắp tir

vũng đấm lấy sát bờ biển qua vùng đổi núi thấp lên cả vùng đổi núi cao. Mặcdi da số loài phong lan sống ở độ cao dui 2000" so với mặt biển, tuy nhiên

có một số lồi sống được ở độ cao 5000" so với mat nước biển. Ở Colombia

có lồi phong lan sống ở vùng núi quanh năm phủ tuyết (6) .

“Số lượng các chi, các loài được phát hiện ngày càng nhiều. Theo thống

kê của các nhà thực vat học Việt Nam hiện nay nước ta có khoảng 125 chỉ và

hơn 800 loài. Lẽ di nhiên con số này còn xa so với thực tế. Như vay, họ Lan

đã trở thành một đối tượng cực kỳ phong phí và dic sắc của hệ thống thực

vật Việt Nam, nó chẳng những là hệ thực vật phong phú nhất mà còn đóng.

góp nhiều mặt về giá tr sử dụng và thắm mf cho nên kinh tế, văn hoá củanước ta.

2.3.2, Vài nét về hình thái phong lan.

<small>Họ lan (Orchidaceae) là một họ tất phong phú và phúc tạp, nhìn chung.</small>

là những loài cây than thảo sống IA năm ở dưới đất hoặc trên kế đá (Địa lan,Thạch lan) hoặc sống bám tên những cây gỗ lớn với bộ rế khí

(Phong lan).

Khi sống ở đất nó thường có dạng cũ nạc, rễ mập và xum xuê hoặc.

than tế bò dài hoặc ngắn.

Lối sống độc đáo nhất của phong lan là lối sống phụ sinh, treo lơ lửngtrên các vỏ các cây gố khi,

Hệ rễ khí sinh vài Piru nhiệm vụ lấy nước, muối khống trên vỏ cây

số và từ khơng khí, vừa bám chặt vào giá thể để lấy thế cho cây, nó cịn làm

nhiệm vụ bấp thy chất định dưỡng. Hệ rễ được bao bởi một lớp mô hút ẩmồm một lớp tế bào chết chứa đẩy khơng khí. Với lớp mơ xếp đó rễ khơng

những lấy được nước mưa chảy dọc thân cây gỗ mà cịn hấp thụ nước từ

ngồi khơng khí. Ở một số lồi phong lan có thân kém phát triển (thậm trí

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

tiêu giảm hoàn toàn), hệ rễ phát triển day đặc kiêm cả mhiệm vụ quang hợp.

Do 46 có dang đẹp, bị dài và màu xanh như lá [6]

“Thân cây họ lan cũng phong phú về kiểu dáng ngắn hay kéo dài, cómang lá hoặc khơng ... (Theo MLE. Pfitzer-1882). Cay lan có thể xắp xếp

thành hai nhóm :

+ Nhóm da thân (Sympodial) gồm các giống Catleya, Dendrobium,

‘Cymbidium. Cây trong nhóm này thường khơng tăng trưởng liên tục mà cóthời gian nghỉ sau mùa tăng trưởng.

+ Nhóm đơn thân (Monopodial) gồm các giống Vanda, Phalaenopsis,

Rhynclostylis. Cay trong nhóm này thường tang-trtiing (heo chiều cao.

'Ngồi ra cịn có một ít giống trung gian giữa hai nhóm trên như cácgiống Pachyphyllum, Centropelalum, than Cũa ching thường biến động từ

0,1 ;0,2m đến 3 ; 4m.

Hầu hết các lồi lan sống tự dưỡng nên nó phát triển đây đủ hệ thống,14, Lá mềm mại duyên đáng và hấp dẫn. Lá đơn nguyên dày, cứng hay mềm

có gân giữa nổi rõ, có lồi lá biến đổi thành vảy hay tiêu biến hồn tồn.

Hình dang lá rất phong phú: hình trụ, hình kim, bau dục, tiết diện tồn hay

có rãnh. Lan ở các ving nhiệt đổi thường rụng lá trong mùa khơ hạn.

Hoa lan có cấu tạơ cực kỳ phong,_phú và hấp din. Hoa có cấu trúc cơbản của hoa mẫu 3. Hoa cổ 3 lá đài thường có dạng cánh hoa và giống nhau.

"Trong số 3 cánh hos {esi tring) ở đa số các loài lan, cánh giữa khác bivới các cánh cịn lai, có chite năng đặc biệt trong thụ phấn và được gọi là

cánh môi. Môi thường lớn hơn các cánh khác của bao hoa. Bầu hạ, nhị nhuyhợp thành trục. Sau khi thụ phấn các tiểu noãn sẽ biến đổi thành hạt, bầunoãn to dân thành quả. Quả chín sẽ nứt đọc theo 3 đường để hạt bay rangoài. Quả lan thuộc loại quả nang, có nhiễu hình dạng khác nhau: Hình trụphình ở giữa hoặc thn dài ... Quả lan có nhiều hạt và nhỏ bé, mỗi quả lancó đến hàng triệu hat. Hạt chỉ cấu tạo bởi phơi chưa phân hố trên mạng lưới

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

nhỏ, xốp, chứa đấy khơng khí, phải qua từ 2 - 18 tháng hạt mới chín, hạtmuốn nảy mầm được ở ngồi tự nhiên thì phải gặp nấm cộng sinh cản thiết

“Trọng lượng hạt cực kì nhỏ bé nên được gió mang di rất xa khi quả nứt ra

Muốn phát triển ngành trồng lan ở Việt Nam chúng ta phải đầu tư và

«mg dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật hiện đại vào công việc nghiên cứusản xuất lan. Phải khẳng định rằng, chỉ có bằng phương pháp ni cấy mơ vàtế bào mới có một số lượng lan nhiều và đồng nhất trong một thời gian ngắn.

và chỉ có kết hợp lai tạo với gieo hạt lan bing phương pháp nảy mam không,cộng sinh trong phịng thí nghiệm chúng ta mới có nhiều giống lan độc đáo

6 thể cạnh tranh với thị trường thế giới trong tương lai .

2.3.3. Giá trị kinh tế và sử dụng của cây phong lan.

Hoa lan là một loài hoa quý được nhiều người tra thích, với vẻ đẹp mê

hồn, màu sắc cực kỳ phong phú, cùng với Sự đa dang về lồi, hình đáng, bộ18 độc đáo hương thơm thoang thoảng, nhẹ nhàng thanh cao. Hoa lan đượccoi là loài hoa cao quý hoa lệ nhất trong thế giới cỗ cây. Người phương tâygọi là “Bách hoa nữ vương” (vua của trăm thứ hoa). Có nhiều ti liệu ghỉ

chép, hoa lan đều có tất ck mau $ắc của hoa có trong thiên nhiên, điều đó đã

khiến nó mang lại nhiều giá trị sử dụng cho cơn người [48]. Ngồi việc phụcvụ như cầu giải tí, thưởng thife cái đẹp của con người, hoa cũng đồng thời

mang lại một nguồn lợi kinh tế quan trọng . Theo I.T.C (Trung tâm phát triển

xuất khẩu của Liên hợp quốc): tổng kim ngạch xuất nhập khẩu về hoa, lan,cây cảnh của thế pigiyiiat 1.8 tỷ USD vào năm 1989 [9]. Nhưng

Tito j Rimando cho cya: hàng năm kisn ngạch xuất nhập khẩu hoa, lan, cây

cảnh trên thế giới đạt tị giá $0 tỷ USD [47]. Các nước thuộc Châu á nhiệtđới như Thái Lan, Singapore, Philippin, Indonexia ... là những nước sản xuất

và xuất khẩu lượng lớn hoa lan. Đặc biệt Thái lan là nước điển hình về ni

trồng và xuất khẩu hoa lan. Kim ngạch xuất khẩu của hoa lan ở Thái Lan

1987 là 21 triệu USD, năm 1990 là 26 triệu USD, 1991 lên tới 30 triệu USD

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

"Việt Nam nằm trong vùng khí Bu nhiệt đới ẩm, nên các loài hoa lan

Viet Nam là những thành phẩn quan trọng trong hệ sinh thái rừng tạo chonước ta thành một trong những vùng phân bố các loài hoa lan quý trên thế

“Tir xa xưa Ong cha chúng ta cũng đã biết đến hoa phong lan, biết cách

trồng và chăm sóc hoa nhưng hoa lan chúng ta trồng chủ yếu là hoa rừng tự

nhiên nên khó nhân giống và chăm sóc mà hoa chỉ ra mỗi năm một lần,

không thuận lợi cho sản xuất và xuất khẩu. Ở Việt Nam việc sản xuất vàxuất khẩu hoa phong lan mới được hình thành và phát triển hơn 10 năm gần

đây. Từ khi thực hiện kế hoạch phát triển kinh doanli xuất khẩu hoa lan trongba năm đầu thành phố Đà Lạt đã đạt được giá trị sẵn lượng xuất khẩu là

320,000USD. Ở miễn Bắc điển hình có xã Đằng Hải - An Hải - Hải Phòng,

những năm qua bước đẩu đã sản xuất và Xuất khẩu hoa tươi đi các nước

khác, và trong ba năm đầu thu được giá trị sản phẩm xuất khẩu là 350.000

USD [9]. Bên cạnh đó trong những năm qua Việt Nam đã nhập nội các loàihoa lan từ Thái Lan, Singapore, Pháp.... va một số nước khác về làm cho tậpđoàn hoa lan Việt Nam vốn di đã phong phú càng thêm phong phú hơn.

"Ngày nay nhu cầu sử dụig hoa phong lan rất lớn với những cành hoa

đẹp mau sắc phong phú đã làm cho giá tri của một gid phong lan lên tới cả

chục ngần đô 1a như: Paphlopedium, Volontennum. Đặc biệt một số loài nở

“đúng dip tết nguyên đán nhyt: Ngọc điểm, Mạc lan, Bạch cấp.... đã làm tănggiá tri của lan gấp sib '@/ Mao. Không chỉ cho hoa đẹp mà hoa phong lan cịn

rất bén với thời gian. Có những loài hoa như Hồ điệp hoa nở 2 đến 3 tháng

mới tàn, đó là ưu điểm mà khơng lồi hoa nào có được.

“Trồng hoa phong lan khơng cẩn diện tích lớn, du tư chỉ phí vừa phải

nhưng với giá cả và mức tiêu thy hiện nay thì nó đem lại nguồn lợi vô cùng

lớn cho người sin xuất.

Hoa lan khơng chỉ là để thưởng thức mà người ta cịn làm tỉnh dầuthom, làm thực phẩm và dược liệu.

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

Giá tị được liệu: Cá loài hoa lan mọc núi để có giá tr chữa bệnh mắt

mát dịu, hơn lan đốt lên có giá tị chữa ho mắt cổ họng, Tịng lan có thể cắm

máu, sinh cơ, Lan hành có thể tiêu viêm, lợi tiểu.[48}

dưỡng đặc biệt dùng cho người bị viêm da dày [48]

“ic loại lan Hồng mơn có thể làm chế phẩm dinh

2.3.4, Đặc dl

2.3.4.1, Loài Lan Phi điệp (Dendrobium anosmum Lindl): lan sống phụ,thân hình trụ dhi, phân đốt, có các khía mờ đọc thân cây, thân. bng thống

sinh học của lồi lan nghiên cứu:

xuống, lá hình giáo thn, mềm, xếp hai day dễ dụng, mặt dưới l4 màu xanhnhạt, sau khi rụng lá thì mang hoa, cum hoa ngắt Cổ hai hoa trên mỗi đốt lárụng. Hoa mầu hồng tím, hai cánh trang hai bên bằng nhau, mễm uốn cong

ra. Cánh mơi lớn, cuộn lại, mầu tím với hai đến: lớn màu tím đệm phủ một

lớp lơng màu trắng. Nhị bình khối 1Ìqyễ nhơ, nhiều mọc cum dưới gốc thân.<small>Huong thom đậm đà.</small>

<small>2.3.4.2. Loài Lan hương (Acampe rigida PF Hunt): lan sống phụ, than lớn,</small>hoá gỗ, nhiều rễ chống to map mọc tản ở tiên thân, có màu xanh. Lá lớn, đầygấp theo gân giữa, đâu chia hai thu? tròn khơng đều. Cụm hoa dài, cứng cónhiều hoa. Cánh hoa dày mầu vàng có nhiễu đốm nâu đỏ. Cánh mơi màutrắng hay vàng nhạt, điểm nhiễu vệt màu nâu đậm, gốc có túi ngắn. Hương

Ảnh]: Lồi Lan Phi điệp. Ảnh2: Loài Lan hương.

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

2.4. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI'CẤY MÔ TẾ BÀO.

2.4.1. Khái niệm phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào:'Nuôi cấy mô tế bào (vi nhân giống) là phương pháp sản xuất hàng loạtcây con từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy.chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vơ trùng có mơi trường thích hợp vàđược kiểm sốt.

2.4.2, Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào:2.4.2.1.Tink toàn năng (Totipotence) của tế bào:

'Ngay cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh lý thực vat học người Đức

Haberlandt đã phát biểu tính tồn năng của té bào. Theo ông: tế bào bất kỳ

của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền.

(ADN) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. kiện thích hợp, mỗi

tế bào đều có thể phát triển thành một cấ thể hồn chỉnh.

“Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luậncủa phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã

'hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh.

từ một tế bào riêng rế.

2.4.2.2. Tuổi giai đoạn.

Vào thế kỷ 17, 18 người la cho rằng các dịng vơ tính bị thối hố di

theo tuổi và chỉ có thể iné fos thơng qua sinh sản bằng hat, song thực tế chothấy đời sống của mội đễn¿ vô tính là vơ hạn nếu như nó sống trong mơitrường thích hợp và liên tục đổi mới bằng sinh sản sinh dưỡng. Nguyên nhân

thoái hoá chủ yếu do tác hại của vi rút. Khả năng tái sinh là một đấu hiệuquan trọng xác định sự chuyển giai doan từ non trẻ sang thành thục, khả

năng ra chồi, rễ ở các thành phẩn khác nhau là rất khác nhau, nuôi cấy ở

đoạn non tré sẽ ra chi, ra rễ tốt hơn các bộ phận thành thục.

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

Vi vậy việc xử lý trẻ hoá là một biện pháp quan trọng nhất trong việc

nhân giống sinh dưỡng.

(Qué trình phát sinh hình thái trong ni cấy thực vật in vitro thực chấtlà kết quả phân hoá và phần phân hoá tế bào.

2.4.2.3.Su phân hoá va phan phân hoá tế bào:

Co thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm.

nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau.

thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào

đồ đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh.

‘Sy phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phi sinh thành các tế bàocủa mơ chun hố, dim nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể.

Quá trình phan hố tế bào có thể biểu th

'Tế bào phôi sinh => Tế bào din =3 “Tế bào phân hoá chức năng. Tuy

nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành mo chức năng chúng khơng hồn tồn

mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cẩn thiết, điều kiện

thích hợp, chúng lại có thể trở vẻ dạng tế bào phơi sinh và lại phan chia

mạnh mẽ, Q trình đó gọi là sự phần phan hóa tế bào, ngược lại với sự phân

hoá tế bào.

KT Phân hoá tếbào—— |

“Tế bào pho} sis > Tế bào din > Tế bào chuyên hos

l ~~ Phan phân hoá tế bào4 |

‘Vé bản chất thì sự phân hóa và phản phân hố là một q trình hoạt

hố phân hố gen. Tại một thời điểm nào đó trong q tình phát triển cá thể,có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính

trang mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xây ra theo

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

một chương trình đã được mế hoá trong cấu trúc của phân từ ADN của mỗi

tế bào.

Mật khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường <sup>bị ức</sup>

chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuậnlợi thì các gen được hoạt hố, q trình phân hố sẽ được xảy ra theo mộtchương trình đã định sẵn.

2.4.3. Các giai đoạn trong quá trình nhân giống in vitro.(Q trình ni cấy in vitro được chia ra 5 giai đoạn:+ Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị.

Giai đoạn này coi như là một bước thuần WOK vật liệu để nuôi cấy. Cay

giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên của nó để chúng thích ứng với

mơi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng Thiễm bệnh của mẫu nuôi cấy

và chủ động trong cơng tác nhân giống. Trồng trường hợp cẩn thiết có thểlàm trẻ hoá vật liệu giống. Ở một số tøài phong lan khó thụ phấn và hình

thành quả trong tự nhiên, có thể thụ phấn nhân tạo cho chúng một cách

thuận tiện .

+ Giai đoạn 2: Cấy khỏi động.

LA giai đoạn tạo ra cấe chối mới từ các mẫu vật đã được khử trùng và

được nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Giai đoạn này cân dim bảo các

yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tổn tại và sinh trưởng tốt. Kếtquả của giai đoạn này piu thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy cho nên khi

Mấy mẫu cần chọn đồng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Theo

Bhatt thì mơ lấy tir cây non có khả năng tdi sinh cao hơn các mô cũa cây

trưởng thành (Bhatt,1979}. Đối với mẫu dễ bị hố nâu khi ni cấy có thể bổ

sung vào mơi trường than hoạt tính (Aetivalis chacoal) hay ngâm mẫu trước

khí cấy vào hỗn hợp Axit aseobie và Axit xitric (25 - 150mg/)).

Giai đoạn này thường kéo dài 4 - 6 tuần lễ,

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

+ Giai đoạn 3: Nhân nhanh : Tồn bộ q trình nhân giống in vitroxét cho cùng chỉ nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy

giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Nghĩa là giai

đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh thành nhiều các chổi mầm cung cấp:cho giai đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn 1

và cấy chúng trên môi trường mới theo định kỳ. Hệ số nhân ở giai đoạn này

biến động từ 5 đến 50 lần tuỳ thuộc loài cây và _ phương pháp nhân. Vấn

để là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cóthể có hiệu quả cao nhất. Vai trị cũa hooe mơn trong giai đoạn này là rấtquan trọng để sản sinh ra lượng cay con tối da ffi vẫn đảm bảo sức sống và

bản chất di truyền của cây. Theo nguyên tắc chung trong mơi trường có

nhiễu Xytokinin sẽ kích thích tạo chi. Chế độ nuối cấy thường là 25°. 27°C

và 10 - 16 giờ. sáng/ngày, cường độ ánh sáng 1000 lux [43]. Tuy nhiên.đối với mỗi loại đối tượng, mục đích thé nghiệm mà chế độ nuôi cấy khácnhau.

+ Giải đoạn 4: Cho ra rễ:

Day là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngồi hệ thống vơ.

trùng khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường.

ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, từ những chối

riêng lễ này sẽ xuất hiện rế và trở thành cây hoàn chỉnh. © giai đoạn này moi

trường được giảm lương jẤytokinin và ting lượng Auxin để tạo điểu kiện

thuận lợi cho sự ra ¡Ö cỗ chổi cây. Giai đoạn này thường kéo dài từ 2 - 4tuần lễ, sau đó được chuyển sang mơi trường khơng có Auxin để rễ phát

triển. Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt

động của lá và rể mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng.

+ Giai đoạn 5: Đưa cây ra môi trường ngoài.

Day là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra.ngồi tdi. Tạo điều kiện để cay con tự dưỡng hồn tồn và thích nghỉ dẫn

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

với moi trường tự nhiên, cây con cứng cáp để đủ tiêu chuẩn mang trồng. Đâylà bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sẵn xuất.

Để đưa cây từ ống nghiệm ra mơi trường tự nhiên bên ngồi đạt tỷ lệ

sống cao cần đảm bảo mot số yêu cầu:

Cay trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định.

(số lá, số 18, chiều cao cây).

C6 giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể tơi xốp, thoát<small>nước</small>

Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa từ ống nghiệm ra, cần duy trì độ ẩm.trên 50% để cây con không mất nước.

“Trong 2 - 3 tuần 18 và tránh ánh sáng quá mạnh. Điều kiện moi trườngtrong giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển,cứng cấp và phòng bệnh cho cây.

28. CÁC YẾU TỐ ANH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT SINH HÌNHTHAI MƠ TẾ BẢO TRONG NHÂN GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI.CAY IN VITRO,

Một số lượng lớn các yu tố phức tap ảnh hưởng tới sự phát sinh hình

thái mơ tế bào. Tuy nhiên nliũng yếu tố này phụ thuộc mạnh mẽ vào lồi.

2.5.1, Mơi trường ni dưỡng:

Trong ni cấy in vitro, môi tường nuôi cấy và môi trường xungquanh được xem là án 4È quyết định sự thành bại của q trình ni cấy.

Mơi trường ni cấy n8U Ï2 phần "đệm" để cung cấp các chất cần thiết cho

sự tăng trưởng và phân hố của mơ trong suốt q trình ni cấy in vitro.

"Mơi trường ni cấy của hầu hết các lồi thực vật bao gồm các muối khốngda lượng, vi lượng, nguồn các bon, các axit amin và các chất điễu hồ sinh

trưởng (cũng có thể bổ sung thêm mot số phụ gia khác như than hoạt tink ...)

tuỳ vào từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí uỳ từng cơ quan

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

khác nhau trên cùng cơ thể mà dinh đưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của

(1957). Tuy nhiên mỗi môi trường chỉ thích hợp với vài lồi cây nhất định

Ví dụ: Mơi trường MS-62 thích hợp cho nhiều loại cây trồng nhưng môi

trường Knudson hoặc môi trường Vacin and Went lại thích hyp cho cây

phong lan hơn. Mặc dù mơi trường Thomale GDY không chứa canxi nhưng,môi trường này cực kỳ phù hợp cho lồi Paphiopedilum [45]. Ddi hỏi khống,của phong lan nhìn chung khơng cao và mơi trườg nghèo muối thường phù

hợp. Vì vậy trong ni cấy in vitro, tuỳ thuộc vào quá trình phát triển mà

nhu cầu dinh dưỡng trong mỗi giai đoạn phát triển của mô tế bào khác nhau.Nhiều công tinh nghiên cứu đã chứng minh: thành phần, hàm lượng cácchất trong mơi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát sinh hình tháicủa các bộ phận nuôi cấy, khả năng tái sinh chối, lá, rễ để tạo ra cây hoànchỉnh cũng như sự sinh trưởng phất triển của toàn cây.

Vi vậy vấn để lựa chọn moi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát

triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy in vitro rất quan

trọng, số lượng và céc Ío;š hố chất phải cực kỳ chính xác phù hợp với từng.đối tượng cụ thể,

Các nguồn thành phẩn định dưỡng chính thường được bổ sung vàomôi trường gồm:

Các nguyên tố đa lượng: N, P, K, S, Mg, Ca là cẩn thiết và thay đổituỳ theo đối tượng ni cấy. Nói chung néng độ các nguyên tố trên trongmôi trường khoảng trên 30 ppm. Có nhiều mơi trường có thành phẩn, tỷ lệcác chất khác nhau, chúng ta có thể lựa chọn để sử dụng. Nói chung mơi

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

trường giàu nits và kali thích hợp cho việc hình thành chổi, cịn mơi trường

giàu Kali sẽ xúc tiến mạnh q trình trao đổi chất. Thành phẩn khống của

một mơi trường cấy được xác định một cách chính xác do sự cân bằng các

nông độ của những ion khác nhau trong dung dịch. Để lựa chọn một thành

phần khoáng và để so sánh các sự cân bằng khác nhau vé ion giữa chúng,

người ta sẽ sử dụng các nông độ ion thể biện bằng mg/l. Nhưng việc lựa

chọn một thành phần khống rất khó nên chúng ta cẩn lưu ý và hiểu biết về

sinh lý thực vật đối với đỉnh dưỡng khoáng.

Các nguyên tố vi lượng: Rat nhiều nguyên tố vi lượng đã được chứng‘minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mơ đó là: Sắt, Đồng,

Kém, Mangan, Molybden, Bo, Coban, lốt [38], các nguyên tố này đóng vaitrị quan trọng trong các hoạt động của Enzim, chúng được dùng ở nồng độ

thấp hon nhiều so với các yếu tố đa lượng. Mot vài tác giả đã c¡

thành phần vi lượng từ 5 đến 9 chất đưới dạng Sunfat hoặc Clorua. Nhưng,

khơng có sự cân bằng ion nào cố định, vì vậy người ta có thể pha chế dung,dịch vi lượng riêng cho từng người

Nguồn các bon: Cay in viro sống chủ yếu theo phương thức dị

dưỡng, mặc dù dưới ánh sáng nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp.

lục và quang hợp nhưng bị hạn chế, chính vì vậy mà người ta cẩn thêm vàomơi trường cấy các Gluxid cẩn thiết cho sự phát triển của mô. Cho nênnguồn các bon dưới dug fu cơ là thành phan bắt buộc của môi trường và

phát triển của mô thực YêU giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối. Tuy

thuộc vào mục đích và sự đồi hỏi của từng hệ mô trong trường hợp đặc biệt

eó thé đùng các loại đường khác như: Maltoza (Ragnin, 1984), Glactoza và

Lactoza (Ankler, 1974). Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấykhác nhau nhưng thường ding liễu lượng từ 20 - 40 g/l. Việc trải qua nổi hấp,

điện gây ra việc phân huỷ đường do sự thuỷ phân nhưng không thể hiện điều

bất lợi nào cho sự phát triển của thực vật.

in các

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

Các vitamin và các chất tự nhiên: Các vitamin, các axitamin và các chất

phụ gia hữu cơ thường được bổ sung vào mơi trường dinh dưỡng nhằm thúc

đẩy q trình sinh trưởng, phát triển của mô nuôi cấy. Mặc dù cây in vitro có

thể tự tổng bợp vitamin, nhưng khơng đủ cho như cẩu (Czocnowoki, 1952).Do vay để mô sinh trưởng tối tu, một số vitamin nhóm B (BI, B3, BS, B6)

được bổ sung vào môi trường một lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô vàgiai đoạn nuôi cấy. Nổng độ thường dùng là 1 mg/l, Myo-inositol cần được

bổ sung ở một lượng khá lớn 50 - 500mg/l, chất này tỏ ra có tác dụng rất rõ

đến sự phân chia của mô. Các axitamin thường được bổ sung vào môitrường, một mặt làm nguồn nitơ hữu cơ, khi hàm lng nite trong môi trườngbị thiếu hụt, mặt khác cũng làm tăng sự sinh trưởng của mô cấy khá rõ rệt.

(Che chất phụ gia hữu cơ như nước dita, địch chiết nấm men... được

bổ sung vào mơi trường nhằm kích thích sự sÏnh trưởng của mô sẹo và các cơ

quan [40. Nước dita đã được sử dụng vào nuôi cấy in vitro từ năm 1941 vàđược ứng dung khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro (Phonglan, dứa ...). Trong nước dừa thường chứa các axitamin, axit hitu cơ, đường,ARN và AND. Đặc biệt trong nước đừa eó chứa những hợp chất quan trọng

cho nuôi cấy in vitro đó là Myo-ïnositol, các hợp chất có hoạt tính Auxin,các gluoxit của xytokinin.

Các chất điều hoà sinh trường: là yếu tố quan trọng nhất trong môi

trường quyết định kết 5Š quoi cấy, 5 nhóm chất điều hồ sinh trưởng của

thực vat: Auxin, Gibbsieliin, Ethylen, Axit absixic, Xytokinin ... Có tácdụng lên sự phát sinh hình thái mơ cấy ở ngay hàm lượng rất thấp

(107-105 M). Đặc biệt sự tương tác của nhóm Auxin và Xytokinin ảnh

hưởng có tính chất quyết định tới sự phân hoá cơ quan thực vật (Skoog vàMiller, 1957).

Auxin: Kích thích sự hình thành mơ sẹo và xuất hiện rễ bất định, kíchthích sự giãn của tế bào. Các Auxin thường sử dụng là (IAA, IBA, NAA,

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

24D). Néng độ Auxin dùng trong nuôi cấy dao động tuỳ từng chất va đối

tượng nuôi cấy nhưng thường là từ. 0,001-10mg/1

‘Cu tạo của một số Auxin:

Indol butyric axit (IBA) _2/4.dichlorophenoxy axetic axit (2,4D)

Xytokinin: Được béisung vào moi trường chủ yếu để kích thích sự

phan chia tế bào và quyết định sự phân hoá chổi bất định từ mô sẹo và cơ<small>quan [40]. Việc sử dung tỷ lệ Auxin/Xytokinin trong moi trường nuôi cấy</small>

quyết định sự phân 04 cha mô theo hướng tạo rễ, tạo chối hay mơ sẹo. Cácchất thuộc nhóm XjtclUnu thường được sử dụng là Kinetin, Benzyl adeninpurin (BAP), Zeatin. Trong các chất này BAP và Kinetin được dùng phổ biến

nhất vì có hoạt tính cao và giá khơng đất, tuỳ từng hệ mơ và mục đích ni

cấy mà Xytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp.107 - 10M các Xytokinin kích thích sự phân bào, nổng độ 105 - 105M kích

thích sự phân hố chổi. Trong ni cấy mơ phân sinh để kích thích sự nhânnhanh người ta thường ding nồng độ Xytokinin cao 10° - 10M.

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

Cau tạo của một số chất thuộc nhóm Xytol

N N

LÍ LP

N " Đ H

Kinetin (K ) 6 - Benzyl amino purine (BAP)

Gibberellin: Được dùng phổ biến nhất là GA, (Axit gibberellic) kích

thích sự giãn dài tế bào, kéo đài lóng đốt than cành cây. Bên cạnh đó GA,

cịn có tác dung phá ngủ các phơi, ức chế tạo ré phụ (Pierik, 1987) cũng nhưtạo chổi phụ (Street, 1973), GA, còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số

thực vật và có tác dung rút ngắn thời gian sinh trưởng đỉnh đưỡng của cây.

Ngồi các chất có tác dụng KÍÊh thích trên, cịn có các chất có tác

dung ức chế sinh trưởng, phát triển khác như ABA, Etylen cũng gây ảnhhưởng khá 16 tới sự phát sinh bình thái của một số cay trồng trong ni cấyin vitro. Khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chổi cao hơn khi ding

BAP riêng rế (Ben et al, 1989, Chang et al, 1991).‘Chit làm dong cứng môi trường - Agar.

Để làm giá thể cho nudi cấy người ta thường sử dụng thạch Agar.

Agar là một loại Folyseetrit của tảo. Khả năng ngậm nước của Agar khá

cao: 6 - 12 g/lt nước. Độ thống khí của mơi trường thạch có ảnh hưởng rất

18 đến sinh trưởng của mơ nuôi cấy. Néng độ của thạch dùng trong nuôi cấy

rất dao động tuỳ thuộc vào độ tỉnh khiết của hoá chất và mục tiêu nuôi cấy(thường từ 6 - 10 g/0.

Môi trường ling thường chỉ sử dụng cho nuôi cấy tế bào và nuôi cấytế bào trấn (protoplast), khi nuôi cấy trong mơi trường lỏng thì vấn đểoxygen rất quan trọng, chính vì thế các bình ni cấy trong mơi trường lồng

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

thường phải đặt trên máy lắc hoặc mô nuôi cấy được dat trên một miếng giấy.

thấm nhúng vào moi trường.

+ Độ pH của môi trường là yến tố ảnh hưởng khá rõ nét tới khả năng,

hồ tan các chất khống trong mơi trường, sự ổn định của môi trường, khả

năng hấp thy chất dinh dưỡng của cay. Nếu pH thấp (<4,5) hoặc cao (7,0)

cđều gây ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro. Như

vay xác định được độ pH ban đâu của mơi trường cho q tình sinh trường,

phát uiển của mô cấy là điều cần thiết.

2.5.2, Môi trường vật lý.

'Các yếu tố chính của mơi trường vật lý là nh sáng và nhiệt độ, độ ẩm,độ ẩm tương đối khơng đáng kể vi nó ln ln bằng 100% trong các bình.

ni cấy.

Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của m0 nuôi cấy phụ thuộc nhiều

vào các yếu tố như: thời gian chiếu 4ág, cường độ ánh sáng, và chất lượng,ánh sáng.

"Thời gian chiếu sáng có vai trồ quan trong trong q tình phát tiển.

của mơ ni cấy, với đa số các lồi cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là từ

12 - 18/ngày.

Cường độ ánh sáng là yếu tố quan trọng tác động lên quá trình phát

sinh hình thái của mơ cấy. Cường độ ánh sáng cao kích thích sink trưởng của

mô sẹo trong khi cưng đà (hấp gây nên sự tạo chổi (Ammirato, 1986). Nhìnchung, cường độ ánh sf thích hợp cho mơ ni cấy là: 1000 - 7000 lux

(Moresin lap, 1974),

Ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình

thái của mơ thực vật in vitro, ánh sáng đỗ làm tăng chiêu cao thân chổi hơnso với ánh sáng trắng, nếu mô nuôi trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn

cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo [20].

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

Do vậy trong các phịng thí nghiệm, sử dụng nguồn cung cấp năng

lượng ánh sống là các din đèn huỳnh quang đặt cách phía trên các ống

nghiệm khoảng 25 - 30cm sẽ cho cường độ ánh sáng dat trên tiêu chuẩn.

2000 - 2500 lux.

"Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan

trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá tinh sinh hoá trong cây.

Tuy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phùhợp. Thường cây nhiệt đới địi hồi nhiệt độ cao hơn so với cây ơn đới. Nhìn‘chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25°C

<small>(White, 1973).</small>

2.5.3. Vật liệu ni cấy.

Việc lựa chọn vật liệu ni cấy thích hợp quyết định đến sự thành bại

của quá trình nhân giống in vitro. Về nguyên tắc, trừ những mô đã hố gỗ,các mơ khác trong cơ thé thực vật đê CĨ thể dùng làm mơ ni cấy. Tuythiên các mơ đang phát triển mạnh (mô phân sinh đầu ngọn, đầu rễ, lá non,

tượng ting ..) có thé ni cấy dễ ding hơn. Trong một số điều kiện thì vật

liệu ni cấy có thể là hạt. Các mơ khác nhau trên cùng một cây tuy mang,một lượng thông tin di truyễn! như nhau, nhưng khi ni cấy có thể cho mơseo phát triển hồn tồn khác nhau, khả năng hình thành chổi, rễ rất khác

nhau. Vì vậy tốc độ nhân giống, chất lượng nhân giống, hiệu quả nhân giống

phụ thuộc rất nhiều vào xiê: chon mẫu. Vì vậy các mơ trẻ sinh lý, chưa bịphân hố q sâu sắc vÀ ©úl trưởng tốt là nguồn mẫu ni cấy lý tưởng bởicó thé dễ tác động và điều khiển quá tình phát sinh hình thái và tái sinh cây

hồn chỉnh từ chúng. Các khả năng trên còn phụ thuộc vào mùa vụ lấy vật

liệu trong năm, kích thước vật liệu ni cấy, tuổi cây mẹ, tuổi của quả, vị trílấy mẫu trên cây mẹ...

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

Tuy nhiên tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu, nguền mẫu vật, giống, loại

cây trồng mà có thé sử dụng các cơ quan khác nhau để có thể thu được kết

qua như ý muốn, có hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt.2.5.4, Điều kiện vo trùng.

'Ni cấy in vitro là q trình ni cấy trong điều kiện vô tring, nếukhông đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị

nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Diu kiện v6 trùng có ý nghĩa quyết định đến

sự thành bại của nuôi cấy in vitro.

Phương pháp khử trùng mẫu ban đầu: Việc tạo nguyên liệu vô trùng

in vitro là khâu đẩu tiên có ý nghĩa thành bai ella cơng việc nhân giống và

tốc độ nhân giống. Chọn đúng được phương pháp khử trùng sẽ cho được tỷ lệsống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đặt toe độ sinh trưởng nhanh.

Phương tiện khử trùng:

= Nổi hấp tiệt trùng: Sử dụng chơ việc khử trùng môi trường muôi cấy,

dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nước cổ áp suất và nhiệt độ cao (1,2 - 1,5 atm,

120 - 130°C).

- Tih sấy: Để sấy khô các dụng cụ (huỷ tinh và dụng cụ cấy.

~ Dung địch khử tring: Để khử trùng mẫu vật đưa vào nuôi cấy người

ta thường ding các dung dịch HgCl,, Hypoclorit natri, Hypoclorit canxi,H,0,, Cén ding để khử trùng sơ bộ mẫu và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.

~ Phễu lọc vô lu: Dùng để khử trùng các dung địch, không khử.

trùng được ở nhiệt dd 40 sine dung dich Enzim hoặc một số chất điều hoà

sinh trưởng. Hiện nay người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùngdung tích lớn để thanh trùng các dung dich nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần"hay huyền phù tế bào.

+ Budng và bàn nuôi cấy vô trùng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

~ Buồng vô trùng: Nơi dat bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng,

phải được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp,

chiến đèn tử ngoại.

~ Bàn nuôi cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flowbox. Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc khơng khí vơ trùng qua màng

và thổi khơng khí vơ tring về phía người ngồi thao tác.

2.5.5. Budng ni cấy.

LA buổng đạt các mẫu nuôi cấy. Buồng này cẩn dim bảo các điểnkiện:

= Nhiệt độ 25 - 30°C

- Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux.

~ Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngồi.

2.6. UNG DỤNG NI CẤY MƠ TẾ BAO THỰC VAT (NUÔI CẤY INVITRO) TRONG CÔNG TÁC GIỐNG CÂY TRỔNG.

"Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro được xem là một trong những giảipháp công nghệ mới có ý nghĩa khoa học cơng nghệ sinh học. Trên các môi

trường nhân tao, từ các mô, tế bào thực vat sẽ phân chia, phân hoá và phát

tuiển thành cây hoàn chỉnh. Day là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một

phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giốngvơ tính. Kỹ thuật nay: cho phếp tạo ra một quần thé cây con đồng đều, giữ

ngun đặc tính của Ay rao, có hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được

"hiệu quả kin tế, khơng tơn diện tích cho nhân giống dễ chăm sóc và dễ khắc

phục những ện bất lợi. Phương pháp này đặc biệt tỏ ra ưu việt với các

lồi cây khó nhân giống bằng con đường hữu tính (Phong lan), các giống

qui hiếm có số lượng ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh.

Nôi cấy mô tế bào thực vật cũng được ứng dụng để:

~ Lam phong phú vật liệu di truyền cho cơng tác chọn giống.

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

~ Làm sạch vi rút, phục trắng những giống thoái hố, bị bệnh.

= Nhân nhanh và duy tì các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học có

giá trị kinh tế cao. Ung dụng này được quan tâm hơn cả. Ngồi ra tuỳ thuộc.

vào bộ phận ni cấy và khả năng sử dung chúng trong công tác giống cây

+) Đối với đỉnh sinh trưởng có thể tạo và nhân nhanh dòng đồng nhấtv6 di truyền, làm sạch vi rút và nghiên cứu sinh lý phát triển

+) Với cơ quan sinh sẵn:

~ Hoa cái (bầu quả, non): Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ

lai xa, tạo đơn bội, tạo da phôi.

- Hoa đực: (bao phẩn và hạt phan}- Tạo mô sẹo và cây đới! bội.

- Tạo đột biến & mức đơn bội

- Tao dịng đồng hợp tử.

+) Đối với phơi: - - Nuôi phôi lại xã

= Nhân áơ đồng lai xa.~ Phẩ ngủ nghỉ của hạt

+) Đối với tểbào:.- Tạo đột biến ở mức độ tế bào.

STE bào trần để la vơ tính.

Biến nạp gen, ni cấy tế bào đơn.

+)Mơ sẹo: (PE Tao phôi vo tin.

~ Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trấn.

~ Tạo cây có biến di soma.

Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật dé thấy nhất là trong

Tinh vực nhân giống và phục trắng cây trồng. Với phương pháp nuôi cấy đỉnhsinh trưởng Morel đã mở ra 1 hướng lớn không chỉ là một cuộc cách mạng

trong cơng nghiệp lan mà cịn áp dụng cho nhân giống nhiễu loại cây trồng

khác: Bu đủ, Dâu tây, Khoai tây... (Morel, 1960)

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

Năm 1985 theo Roca có 55 lồi cây trồng được áp dụng để nhân giống

sạch bệnh qua nuôi cấy mô, gồm 11 loài cây ăn quả, 8 loài cây lấy củ, 7 lồi

cây cơng nghiệp và 23 lồi cây cảnh.

<small>Năm 1965, Morel và Martin đã ding kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh</small>

tạo được cây khoai tây không chứa vi rút mang lại ý nghĩa lớn cho ngành sin

xuất Khoai tây thế giới

'Năm 1970 Storrisky đã rất thành công khi nuôi cấy vầy cũ hoa Lay ơn

trên môi trường dinh dưỡng có 5 mg BA/I và cay Dạ lan hương với nồng độ2-8 ppm IAA.

Ở Việt Nam từ năm 1975 đến nay, nhiều pliéng nuôi cấy mô trong cả

nước đã được thành lập và thu được một số kết quả đáng kể,

Viện khoa học Việt Nam đã nghiên cứu tù tình nhan giống in vitro

một số cây trồng có giá trị như Lúa, Thuốc lá, Khoai lang, Dita sợi...

<small>+ Trường Đại học nông nghiệp-I; Viện di truyền nông nghiệp đã</small>

nghiên cứu qui trình nhân giống Khoai tây, Chuối, Du đủ, Phong lan thươngmại, các loại cây cảnh sạch bệnh, chat lượng cao đã đi vào sin xuất.

- Trường Đại học Lâm nghiệp đã nghiên cứu nhân giống in vitro các

loài Bạch đàn, Lan bin địa, Keo lai, Sến mật, Song mây, Tre luồng....

'Ngồi ra cịn một số nơi cũng nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấymô: _- Trang tim sin xuất hoa Đà Lạt

<small>~ Trường Đại học Tog lâm - Thành phố Hồ Chí Minh.</small>

~ Đại học khoa oe tự nhiên - Thành phố Hồ Chí Minh.

'Ở các tỉnh phía nam đã xây dung được ngân hàng Cà phê với 10 dòng

khác nhau, đã nhân giống Cao su và nhiễu loại cây khác (cây ăn quả, câythuốc, cây rừng ..)

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Nội dung của để tài được tóm tắt bằng sơ đồ sau:

3.1.1. Tạo thể chổi và chổi;

~ _ Hiệu quả của phương pháp khử trùng.

~ Môi trường khởi động tạo thé chổi và chồi.

~ Ảnh hưởng của thời điểm lấy hạt đến khả

năng nảy mắm và tgo thể chổi

~_ Ảnh hưởng của số:lượng chối cấy trong 1

3.1.2. Môi trường nhân nhanh chối.

~ __ Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng

<small>"Nhân nhanh chối</small> nhân chổi.

~ _ Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng

nhận chi

- Ảnh hưởng của nổng độ Kinetin đến khả

năng nhân chổi.

>, Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin + BAP đến

khả năng nhân chối.

3.1.3. Môi trường kéo dài chối.

3. “Tạo cây hoàn chỉnh.

- Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra

~ Ảnh hưởng của phương pháp huấn luyện cay

3.1.5. Giai đoạn vườn ươm.

~ _ Tiêu chuẩn cây con.~ Tim giá thể thích hợp.

~ _ Sinh trưởng và phát tiển của cây lan con.

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

3.2, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN COU.

3.2.1. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm.

+ Địa điểm: Các thí nghiệm ni cấy in vitro được tiến hành tại phịng,

ni cấy mơ, Bộ môn Di truyền - Chọn giống - Khoa Lâm nghiệp - Trường

Dai học Lâm nghiệp. Các thí nghiệm được duy tì trong điều kiện nhan tạo

<small>- Số giờ chiếu sáng trong ngày: 10 giờ/ngày.</small>

= Cường độ ánh sáng: 2000 - 3000 lux.

- Nhiệt độ phịng ni: 25° - 27°C ban ngày, ban đêm 18°-20°C

~ Các hạt phong lan được cấy vào mii trường đạc (8g agar ).3.2.2, Các công thức thí nghiệm và cách bố trí.

3.3.2.1. Tạo thể chối và chi.

sa. Hiệu quả của một sốphương pháp khử tràng.‘Thi nghiệm được tiến hành Với 2 phương pháp:

+ Khử tring quả.

+ Khử tring bạt.

Mỗi thí nghiệm lầm với 3 lần lặp lại và theo dõi 10 ống

nghiệm/1 lân lập lại đổi với mỗi lồi.

b. Mơi trường tạo thể chối và chải.

Các thí nghiêm được tiến hành trên các moi trường sau:

Cong thức 1: Mội.tulŠng I (Knudsons C, 1960). Xem phụ biểu 1

‘Cong thức 2: Mpi thường II (Knudsons C cải tiến). Xem phụ biểu 2Mỗi cơng thức thí nghiệm theo dõi 10 ống nghiệm/ 1 lần lặp và được.

lập lại 3 lần đối với mỗi loài.

cc. Ảnh hưởng của thời điểm lấy hạt đến khả năng nảy mắm: và tạo thé

~ Thí nghiệm được lấy hạt vào 3 thời điểm khác nhau đối với mỗi loài.Mỗi thời điểm theo dõi 10 ống nghiệm/1 lần lặp lại và được lặp lại 3lần.

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

d. Anh hưởng của số lượng chối cấy trong một cụm đến sự phân chia

Cée thí nghiệm được bố trí như s

Mơi trường I: - Cấy tách riêng rẽ từng chổi (T1)

<small>- Cấy cụm ( mỗi cụm có từ 3-4 chỗi) (C1)</small>Mơi trường II: - Cấy tách riêng tẽtừng chổi (T2)

= Cấy cụm ( mỗi cụm có từ 3-4 chổi) (C2)

3.2.2.2. Mơi trường nhân nhanh chối.

Mỗi cơng thức thí nghiệm làm với 3 lần lặp lại và theo dõi 10 bình,1 lần lặp lại, mỗi bình cấy 20 chổi. Thí nghiệm được đánh giá sau 6 tuầntheo đối đối với mỗi loài.

1. Nghiên cứu Ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân chổi.