NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA HÓA CHẤT KHỬ TRÙNG VÀ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI
CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
Võ Hà Giang
1
, gô Xuân Bình
1
,
guyễn Tiến Dũng
1
SUMMARY
Study on the effect of sterile reagents and culture mediums in in vitro propagation of
Duoi Chon orchid (Rhynchostylis retusa [L.] Blume)
Study on the effect of sterile reagents and culture mediums to the seed germination of
Duoi Chon orchid showed that: the sterile reagents have strongly effected to sterility of
culture sample (seed). Treatment with Clorox 7% in 10 minutes obtained alive samples to
33,3%; Sterized by H
2
O
2
with 10% in 20 minutes obtained the alive samples to 40%;
Sterized by Ca (OCL)
2
with 10% in 10 minutes obtained the alive samples to 46,7%;
Sterized by burning sample (orchid fruit) with alcohol (96%) within 3 seconds obtained
alive samples to 88,9%.
The examized culture mediums have obtained rate of seed germination from 6,7% to
66,7%. Suitable culture medium to assist seed germination are 1/2MS, Hyponex and MS.
Of which, the medium of 1/2MS obtained highest rate of germination to 66,7%
Keywords: Sterility, Duoi Chon orchid, Culture medium, Culture samples,
Germination
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
2
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa [L.] Blume) là loài lan rừng rất được ưa
chuộng vì hoa đẹp và hương thơm. Hiện nay tại các khu rừng ở Việt Nam, các loài lan
rừng bị khai thác quá mức, đang có nguy cơ cạn kiệt, trong đó hai loài lan rừng là Đuôi
Chồn và Đai Châu đang được khai thác nhiều cho mục đích thương mại và có nguy cơ
mất dần trong tự nhiên. Việc nghiên cứu phát triển các loài lan nêu trên, vừa bảo tồn và
có khả năng nhân giống cho mục tiêu thương mại là rất cần thiết. Trong hai loài lan nêu
trên, loài lan Đai Châu đã được nghiên cứu nhiều và đã có một số kết quả trong nhân
giống in vitro còn loài lan Đuôi Chồn chưa được nghiên cứu nhiều, nhất là các nghiên
cứu về nhân giống. Từ thực tế trên, việc nghiên cứu nhân giống lan Đuôi Chồn là rất cần
thiết. Phạm vi bài báo trình bày kết quả "Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng
và môi trường nuôi cấy trong nhân giống phong lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa [L.]
Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào".
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
Quả lan Đuôi Chồn độ tuổi khoảng 10-12 tháng được thu hái trong tự nhiên (khu vực
Vườn Quốc gia Ba Bể) từ những cây lan khỏe mạnh. Hạt được sử dụng làm mẫu nuôi
cấy.
2 Phương pháp nghiên cứu
ội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt lan
Đuôi Chồn.
Thí nghiệm 1: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng Clorox đến khả năng vô
trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn)
Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa bằng dung dịch xà phòng 5%,
rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, chuyển quả lan qua bình tam giác và được khử trùng
bằng dung dịch Clorox dạng thương phNm (cha 5% Javel). Các công thc thí nghim b
trí như sau:
CT
Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý
1 Không xử lý 4 10% + 5 phút
2 7% + 5 phút 5 10% + 10 phút
3 7% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thc.
Sau 10 ngày nuôi cy, tin hành theo dõi các ch tiêu: T l mu b nhim, t l sng
(ch tính nhng mu sng và không b nhim), t l cht ca mu.
1
ại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
3
Thí nghiệm 2: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H
2
O
2
đến khả năng vô
trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn)
Qu lan uôi Chn còn nguyên vn ưc thu hái, ra bng dung dch xà phòng 5%,
ra sch bng nưc ct nhiu ln, chuyn qu lan qua bình tam giác và kh trùng bng
dung dch H
2
O
2
nng và thi gian theo các công thc như sau:
CT
Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý
1 Không xử lý 5 5% + 20 phút
2 3% + 10 phút 6 10% + 10 phút
3 3% + 20 phút 7 10% + 20 phút
4 5% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thc.
Sau 10 ngày nuôi cy, tin hành theo dõi các ch tiêu: T l mu b nhim, t l
sng ca mu (ch tính nhng mu sng và không b nhim), t l cht ca mu.
Thí nghiệm 3: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng Calcium hypochloride Ca
(OCl)
2
đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn)
Qu lan uôi Chn còn nguyên vn ưc thu hái, ra bng dung dch xà phòng
5%, ra sch bng nưc ct nhiu ln, chuyn qu lan qua bình tam giác và kh trùng
bng dung dch Calcium hypochloride dng thương phNm (cha 5% Ca (OCl)
2
). Các
công thc thí nghim b trí như sau:
CT
Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý
1 Không xử lý 4 10% + 5 phút
2 7% + 5 phút 5 10% + 10 phút
3 7% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thc
Sau 10 ngày nuôi cy, tin hành theo dõi các ch tiêu: T l mu b nhim, t l sng
(ch tính nhng mu sng và không b nhim), t l cht ca mu.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng bằng đốt quả đến khả năng
vô trùng mẫu nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn)
Qu lan uôi Chn còn nguyên vn ưc ra sch bng nưc ct nhiu ln, lau khô
qu, tin hành t qu bng cách nhúng ngp qu vào dung dch cn 96%, ưa qu ra
khi dung dch cn và t qu cn cháy thi gian theo các công thc sau: CT1:
(/C): Không t; CT2: t trong 3 giây; CT3: t trong 5 giây; CT4: t trong 10
giây; CT5: t trong 15 giây.
Sau 10 ngày nuôi cy, tin hành theo dõi các ch tiêu: T l mu b nhim, t l sng
(ch tính nhng mu sng và không b nhim), t l cht ca mu.
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
4
ni dung 1 (cho c 4 thí nghim), các thí nghim ưc b trí ngu nhiên 3 ln
nhc li, mi ln nhc li gm 15 bình nuôi cy (loi 250 ml), mi bình nuôi cy ưc
tính là mt mu, trung bình lưng ht ca mt qu lan ưc gieo u cho 3 bình.
ội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt
phong lan Đuôi Chồn trong nhân giống in vitro.
Quả lan sau khi khử trùng được chuyển vào đĩa peptri. Dùng dao tách bỏ vỏ quả và
lấy hạt gieo trong bình nuôi cấy (250 ml) đã chuNn b sn môi trưng khác nhau, trung
bình theo công thc thí nghim. Ht thu t mt qu lan uôi Chn ưc chia u và nuôi
cy trên 3-4 bình. Thí nghim ưc b trí ngu nhiên 3 ln nhc li, mi ln nhc li gm
10 bình nuôi cy (loi 250 ml), mi bình cy ưc tính là mt mu. Sau 12 tun tin hành
theo dõi s bình ny mm, t l ny mm.
Thí nghiệm 5: ghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt
lan Đuôi Chồn.
Thí nghim b trí vi 5 công thc (CT): CT1: 1/2 MS; CT2: MS; CT3: VW; CT4;
N 6; CT5: Hyponex. các công thc, trong 1 lít môi trưng b sung: ưng 30 g +
nưc da 120 ml + than hot tính 2 g + agar 6,5 g.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt lan
Đuôi Chồn
Kt qu nghiên cu nh hưng ca hóa cht kh trùng Clorox n t l sng ca mu
ht nuôi cy (ht phong lan uôi Chn) ưc th hin bng 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng Clorox đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn
(sau 10 ngày nuôi cấy)
CT Số bình nuôi Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%)
1 45 100,0 0,0 0,0
2 45 66,7 20,0
*
13,3
3 45 46,7 33,3
*
20,0
4 45 42,2 24,5
*
33,3
5 45 37,8 13,3
*
48,9
LSD
0,05
5,1 3,6 3,6
CV% 8,5
* Sai khác có ý nghĩa.
Công thc 1 (i chng không x lý) sau 10 ngày t l các bình nuôi cy b nhim
là 100%. các công thc còn li, khi qu lan ưc kh trùng bng dung dch nưc
Clorox nng 7% và 10% trong thi gian khác nhau (5 phút, 10 phút) t l ht lan b
nhim gim so vi khi không x lý (CT1). Tuy nhiên thi gian x lý và nng càng
cao thì t l ht nhim gim nhưng t l ht cht tăng. Hiu qu kh trùng qu lan tt
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
5
nht khi s dng Clorox nng 7% trong 10 phút (CT3), t l ht sng và không
nhim t 33,3% ( tin cy 95%).
Kt qu bng 2 cho thy thi gian và nng x lý H
2
O
2
nh hưng n hiu qu
kh trùng qu lan uôi Chn.
Bảng 2. Kết quả nghiên cứu khử trùng bằng H
2
O
2
đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn
(sau 10 ngày nuôi cấy)
CT Số bình nuôi cấy Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%)
1 45 100,0 0,0 0,0
2 45 93,3 6,7
*
0,0
3 45 80,0 13,3
*
6,7
4 45 66,7 20,0
*
13,3
5 45 53,3 26,7
*
20,0
6 45 42,2 31,1
*
26,7
7 45 28,9 40,0
*
31,1
LSD
0,05
3,9 2,7 2,7
CV% 9,6
*S sai khác có ý nghĩa.
Công thc 1 (/c) sau 10 ngày t l các bình nuôi cy b nhim là 100%. các
công thc còn li, khi qu lan ưc kh trùng bng nưc H
2
O
2
nng 3%, 5% và
10% trong thi gian khác nhau (10 phút và 20 phút) t l ht lan b nhim gim dn.
Tuy nhiên thi gian và nng x lý càng cao thì t l ht nhim gim và t l ht
cht tăng không áng k. Do qu lan v qu dày nên khi x lý các nng và thi
gian như trên thì mu cht do hoá cht không áng k mà ch yu cht do b tp
nhim.
Bảng 3. Kết quả nghiên cứu khử trùng của Ca (OCl)
2
đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi
Chồn (sau 10 ngày nuôi cấy)
CT Số bình nuôi Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%)
1 45 100,0 0,0 0,0
2 45 62,2 17,8
*
20,0
3 45 40,0 33,3
*
26,7
4 45 28,9 40,0
*
31,1
5 45 20,0 46,7
*
33,3
LSD
0,05
5,1 3,6 3,6
CV% 7,2
* Sai khác có ý nghĩa.
Kt qu bng 3 cho thy, thi gian và nng x lý Ca (OCl)
2
nh hưng n
hiu qu kh trùng qu lan uôi Chn. Công thc 1 sau 10 ngày t l các bình nuôi
cy b nhim là 100%. các công thc còn li, khi qu lan ưc kh trùng bng
dung dch Ca (OCl)
2
nng 7% và 10% trong thi gian khác nhau (5 phút, 10
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6
phút) t l ht lan b nhim gim dn. Không x lý (CT1: /c) t l nhim rt cao.
Tuy nhiên thi gian và nng x lý tăng thì t l ht nhim gim.
Bảng 4. Kết quả khử trùng bằng phương pháp đốt cồn (sau 10 ngày nuôi cấy)
CT Số bình nuôi (bình) Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%)
1 45 100,0 0,0 0,0
2 45 2,2 88,9
*
8,9
3 45 0,0 64,4
*
35,6
4 45 0,0 44,4
*
55,6
5 45 0,0 0,0
ns
100,0
LSD
0,05
3,1 5,4 5,4
CV% 8,4
ns: Sai khác không có ý nghĩa; * Sai khác có ý nghĩa.
Kt qu bng 4 cho thy, kh trùng qu lan uôi Chn bng phương pháp nhúng
qu vào dung dch cn 96% ri ly ra t nhanh trên ngn la èn cn cho hiu qu
cao hơn so vi phương pháp kh trùng bng hóa cht. Tuy nhiên nu t qu quá lâu
s nh hưng n sc sng và kh năng ny mm ca ht. công thc 3 khi qu lan
ưc t nhanh trên ngn la èn cn trong thi gian 5 giây cho t l ht lan sng và
không b nhim t 64,4%, nhưng ht lan b nh hưng do nhit t nóng (35,6% mu
b cht). Khi t nhanh qu lan trên ngn la èn cn trong thi gian 3 giây (CT2)
hiu qu kh trùng khá cao (88,9% mu sng không b nhim) ht lan b nh hưng
do nhit t nóng không áng k (8,9%). Công thc 4, khi tăng thi gian t lên 10
giây t l mu b cht tăng lên áng k (55,6% mu b cht), tăng 7 ln so vi CT2.
Công thc 5, khi tăng thi gian t lên 15 giây t l cht là 100%. Như vậy khi khử
trùng bằng đốt quả lan Đuôi Chồn, CT2 (nhúng cồn và đốt trong 3 giây) cho kết quả
tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống không bị nhiễm là 88,9% (độ tin cậy 95%).
Từ các kết quả thu được ở bảng 1, 2, 3 và bảng 4 cho thấy, khi khử trùng riêng rẽ các
dung dịch đều cho kết quả khử trùng tương đối tốt. Khử trùng bằng phương pháp đốt cồn
96
0
trong thời gian 3 giây cho hiệu quả khử trùng tốt nhất.
2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan
Đuôi Chồn (sau 12 tuần nuôi cấy)
Bảng 5. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi Chồn
(sau 12 tuần nuôi cấy)
CT Môi trường Số bình nuôi cấy
Số bình có hạt nảy
mầm
Tỷ lệ nảy mầm (%)
1 1/2MS 30 20 66,7
2 MS 30 15 50,0
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
3 VW 30 10 33,3
4 N6 30 2 6,7
5 Hyponex 30 11 53,3
LSD
0,05
9,3
CV% 11,2
Kt qu thí nghim bng 5 cho thy: CT1 (1/2 MS) t l ht lan ny mm t
66,7%, t l ny mm gim dn theo th t các môi trưng sau: Môi trưng Hyponex
(CT5) t 53,3%, môi trưng MS (CT2) t 50,0%, môi trưng VW (CT3) t 33,3%,
môi trường N6 đạt giá trị thấp nhất (6,7%). Môi trường 1/2MS có tỷ lệ hạt lan nảy mầm
cao nhất (66,7%) ở mức độ tin cậy 95%.
Nhân giống in vitro cây phong lan nói chung có th s dng nhiu loi mu khác
nhau như: Mu lá, nh sinh trưng, chi cung hoa [1],[2],[6]. Các loi lan công
nghip (H ip, a Lan, Vanda ) khi nhân ging có th s dng mu khác nhau
tùy vào iu kin, môi trưng và mc ích nhân ging [3]. Tuy nhiên, vi các loi
lan rng như ai Châu, uôi Chn, vic nhân ging t ht có ý nghĩa quan trng,
các thí nghim nhân ging in vitro t mu lá cây lan uôi Chn cho kt qu chưa
kh quan. Vì vy, ngun ht phong lan có th là mu nuôi cy rt cn ưc quan
tâm nghiên cu. Trong t nhiên ht lan thưng rt khó ny mm vì ht không cha
abumin và mt phôi chưa phân hóa; ht lan rt nh không d tr hoc d tr rt ít
dinh dưng; ny mm ưc ht lan phi cng sinh vi nm [5]. T l ht lan ny
mm trong t nhiên ch vào khong 1-2% [5]. Qu và ht phong lan có th ưc
hình thành qua quá trình t th và có th s dng làm mu nhân ging in vitro. Năm
1992 Knudson cho rằng có thể trợ giúp hạt phong lan nảy mầm trên môi trường
nhân tạo có bổ sung nguồn dinh dưỡng khoáng và đường mà không cần sự có mặt
của nấm. Có nhiều loại môi trường sử dụng để nảy mầm hạt các loài phong lan khác
nhau [5], [6]. Tuy nhiên, đối với môi trường nuôi cấy hạt lan Đuôi Chồn, cho đến
nay, chưa có các nghiên cứu cụ thể. Kết quả nội dung 2 cho thấy: có thể sử dụng
môi trường 1/2MS và Hyponex và MS trong nuôi cấy hạt phong lan Đuôi Chồn.
Mẫu hạt nảy mầm được tiếp tục nuôi cấy để phát triển thành cây hoàn chỉnh, hiện
nay nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ mẫu hạt phong
lan Đuôi Chồn đã nảy mầm trong thí nghiệm nêu trên.
IV. KẾT LUẬN
Phương pháp khử trùng quả lan Đuôi Chồn để sử dụng hạt làm mẫu nuôi cấy trong
nhân giống in vitro có hiệu quả tương đối tốt là các phương pháp: Xử lý quả với Clorox
nồng độ 7% trong 10 phút (tỷ lệ hạt sống và không nhiễm đạt 33,3%); khử trùng bằng
nước H
2
O
2
nồng độ 10% trong 20 phút (tỷ lệ hạt sống và không nhiễm đạt 40,0%); khử
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8
trùng bằng dịch Ca(OCl)
2
nồng độ 10% trong 10 phút (tỷ lệ mẫu sống và không nhiễm
đạt 46,7%); khử trùng bằng phương pháp nhúng cồn và đốt nhanh cho hiệu quả cao nhất,
tỷ lệ mẫu sống không bị nhiễm đạt 88,9%.
Các môi trường này nuôi cấy, hạt nảy mầm đạt tỷ lệ từ 6,7% đến 66,7%. Môi
trường phù hp giúp cho ht nNy mm là môi trưng 1/2MS và Hyponex hoc MS,
Trong ó môi trưng 1/2 MS cho t l mu ny mm t giá tr cao nht (66,7%).
TÀI LIU THAM KHO
1 guyễn Công ghiệp, 1998. Trng hoa lan, N XB. Tr TP. H Chí Minh.
2 Hội Lan Hà ội, 2005. S tay ngưi trng lan, N XB. N N Hà N i.
3 Arditti, 1982. Orchild Biology. Reviews and perspective II. Cornell Univ. Press,
Ithaca: 1-310.
4 Bermard, 1999. Introduction of some orchid species. Ann. Sci. Bot.9: 1-196.
5 Knudson, 1992. Use of seed for orchid propagation in vitro. Bot. Gaz.73: 1-25.
6 R.L.M. Pierik, 1987. In vitro culture of higher plants, Martinus Nijhoff Publishers.
gười phản biện: TS. Trịnh Khắc Quang