(Luận Văn Thạc Sĩ Hoá Hữu Cơ) Chế Tạo Và Nghiên Cứu Độ An Toàn Và Khả Năng Hỗ Trợ Lành Thương Của Tấm Màng Đa Lớp Pcl-Ag-Cos Trên Mô Hình Động Vật Định Hướng Ứng Dụng Trong Băng Gạc Vết Thương

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.79 MB, 75 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

Bä GIÁO DĂC

VÀ ĐÀO T¾O VIàN HÀN LÂM KHOA HâC VÀ CƠNG NGHà VIàT NAM

Phan Thß Thanh Tâm

LÀNH THƯƠNG CỵA TM MNG A LP PCL-AG-COS TRấN Mễ HèNH ịNG VẬT ĐÞNH HƯàNG ĀNG DỤNG

TRONG BĂNG GẠC VẾT THƯƠNG

TP.HCM - 2023

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

VÀ O TắO V CễNG NGH VIT NAM

Phan Thò Thanh Tâm

TRÊN MƠ HÌNH ĐÞNG VẬT ĐÞNH HƯàNG ĀNG DỤNG TRONG BĂNG GẠC VẾT THƯƠNG

Mã sß: 8440113

NGƯÞI HƯàNG DÀN KHOA HàC : PGS.TS. Nguyßn Thß Hiáp

TP.HCM - 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

VÀ ĐÀO T¾O VÀ CƠNG NGHà VIàT NAM

Phan Thò Thanh Tõm

LNH THNG CỵA TM MNG ĐA LàP PCL-AG-COS TRÊN MƠ HÌNH ĐÞNG VẬT ĐÞNH HƯàNG ĀNG DỤNG

TRONG BĂNG GẠC VẾT THƯƠNG

NGƯÞI HƯàNG DÀN KHOA HàC

PGS.TS. Nguyßn Thò Hiỏp

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

LịI CAM KT

Tụi xin xác nhÁn rằng cơng viác đ°āc trình bày trong ln án cąa tơi là hồn tồn do tơi thực hián, toàn bå nåi dung đ°āc hoàn thành sau khi tơi đng ký hãc ch°¢ng trình Th¿c sĩ t¿i Hãc viỏn Khoa hóc v Cụng nghỏ v trỗc ú nú không phÁi là måt phần cąa luÁn án hoặc bài nghiên cću khác đã hãc vián hoặc bÃt kỳ tá chćc nào khác để lÃy bằng cÃp, bằng tát nghiáp hoặc các bằng cÃp khác. NÁu bÃt kỳ kÁt quÁ nào khơng chính xác, tơi xin cháu hồn tồn trách nhiám.

TP.Hß Chí Minh, 2023

Phan Thá Thanh Tâm

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

LịI CắM N

Trỗc ht, tụi c biỏt cm Ân ngội hỗng dn ca tụi, PGS.TS. Nguyòn Thỏ Hiỏp đã cung cÃp cho tôi chą đề thú vá này, c¢ håi làm viác đåc lÁp và nhāng cuåc thÁo ln có giá trá. Cơ đã ln tin t°ëng và đång viên tơi trong st q trình thực hián ln vn ny. Cụ ó tn tỡnh hỗng dn tụi trong suát théi gian nghiên cću và viÁt luÁn vn này. Tơi cũng xin cÁm ¢n cơ vì đã d¿y tơi cách làm viác hiáu quÁ, cách giÁi quyÁt vÃn đề và cách nghiên cću måt cách đåc lÁp.

Tôi cũng muán cÁm ¢n Hãc vián Hàn lâm Khoa hãc và Công Nghá đã t¿o điều kián cho tôi hãc tÁp và làm viác.

LuÁn án này đã nhÁn đ°āc rÃt nhiu s hỗng dn v hó tr t cỏc òng nghiáp cąa tơi: chá Võ Hßng Phúc, anh Vũ Thanh Bình, chá Đặng Ngãc ThÁo Nhi, chá Ngun Thá Thanh Ngãc, anh Nguyßn Vn Khiêm, và b¿n Tng TuÃn Ng¿n, em LÂng i Tớn v em Nguyòn Thỏ Ph°¢ng ThÁo t¿i phịng thí nghiám Kỹ thuÁt mô & Y hãc tái t¿o (TERM). S¿ khơng thể thực hián đ°āc nÁu khơng có nhāng cá nhõn hó tr v hỗng dn tụi cho viỏc hon thành luÁn án này.

Cuái cùng nh°ng không kém phần quan tróng, tụi xin by tò lũng bit Ân sõu sc nht tỗi gia ỡnh tụi. Hó ó hó tr và dành cho tôi mãi điều tát đẹp nhÃt trong suát quá trình làm luÁn vn. Sự hã trā về tinh thần và vÁt chÃt cąa hã đã giúp tôi v°āt qua rÃt nhiều khó khn.

Đó là niềm vinh dự cąa tơi khi có tÃt cÁ các b¿n ąng hå tơi. NÁu khơng có các b¿n có l¿ tơi không thể thực hián thành công luÁn vn nh° thÁ này. Måt lần nāa, cÁm ¢n b¿n rÃt nhiều.

Trân trãng, Thanh Tâm

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

1.1.1. Måt sá khái niám quan trãng ... 15

1.1.2. Đái t°āng nghiên cću ... 15

1.2. Tình hình nghiên cću ... 16

CH¯¡NG 2: ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU ... 19

2.1. HÓA CHÂT ... 19

2.2. CHÀ T¾O VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÂT OLIGOMER CHITOSAN ... 19

2.2.1. ChÁ t¿o Oligomer Chitosan ... 19

2.2.2. Đå đề acetyl cąa oligomer chitosan ... 20

2.1.1. Khái l°āng phân tÿ (GPC) ... 20

2.1.2. KhÁo sát khÁ nng kháng khuẩn cąa Oligomer Chitosan ... 20

2.2. CHÀ T¾O MÀNG PCL-Ag-COS (PAC) ... 21

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

2.2.5. Lỗp ph COS/ PVP trên màng PAP ... 23

2.3. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÂT MÀNG PAC ... 23

2.3.1. KhÁo sát và đánh giá hình thái bề mặt sÁn phẩm màng bằng thiÁt bá SEM ... 23

2.3.2. Đánh giá tính chÃt hóa hãc cąa màng PAC ... 23

2.3.3. KhÁo sát và đánh giá tính kỵ và a nỗc ca mng PAC ... 23

2.3.4. Kho sát và đánh giá tính chÃt c¢ lý cąa màng PAC ... 23

2.3.5. KhÁo sát và đánh giá kh nng hp th nỗc v thoỏt hÂi nỗc (MVTR) cąa màng PAC ... 24

2.1.1. KhÁo sát và đánh giá tác đå phóng thích nano Ag cąa màng theo théi gian ... 25

2.1.2. KhÁo sát và đánh giá tác đå phóng thích cąa COS... 25

2.1.3. KhÁo sát và đánh giá khÁ nng kháng khuẩn cąa màng PAC ... 25

2.1.4. KhÁo sát và đánh giá đåc tính tÁ bào cąa màng ... 26

2.2. KHÀO SÁT Đä AN TOÀN VÀ KHÀ NNG Hâ TRĀ LÀNH TH¯¡NG ... 26

2.2.1. Theo dõi và đánh giá tác dăng điều trá cąa màng PAC quy mơ phịng thí nghiám .... 26

2.2.2. Đánh giá khÁ nng hã trā lành th°¢ng màng PAC ... 26

2.3. PHÂN TÍCH THƠNG KÊ ... 27

CH¯¡NG 3: KÀT QUÀ VÀ THÀO LUÀN ... 27

3.1. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÂT CĄA OLIGOMER CHITOSAN... 27

3.1.1. Đå đề acetyl (DA) cąa oligomer chitosan ... 27

3.1.2. Khái l°āng phân tÿ ... 28

3.1.3. KhÁo sát nßng đå kháng khuẩn cąa COS ... 28

3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÂT MÀNG PAC ... 29

3.2.1. Hình thái cąa màng ... 29

3.2.2. Đánh giá tính chÃt hóa hãc cąa màng ... 33

3.2.3. KhÁo sát và đánh giá tính kỵ và a nỗc ca mng ... 36

3.2.4. Kho sỏt và đánh giá tính chÃt c¢ lý cąa màng ... 37

3.2.5. KhÁo sát và đánh giá khÁ nng hp th nỗc v tỏc ồ thoỏt hÂi nỗc ca màng ... 38

3.2.6. KhÁo sát và đánh giá tác đå phóng thích nano Ag cąa màng theo théi gian ... 39

3.2.7. KhÁo sát và đánh giá tác đå phóng thích cąa COS... 40

3.2.8. KhÁo sát và đánh giá tính kháng khuẩn cąa màng... 41

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

3.2.9. KhÁo sát và đánh giá đåc tính tÁ bào cąa màng ... 42

3.1. KHÀO SÁT Đä AN TOÀN VÀ KHÀ NNG Hâ TRĀ LÀNH TH¯¡NG ... 43

3.1.1. Tác dăng điều trá bằng màng PAC5-3 ... 43

3.1.2. Đánh giá khÁ nng hã trā lành th°¢ng cąa màng PAC5-3 ... 45

CH¯¡NG 4: KÀT LUÀN VÀ KIÀN NGHà ... 47

TÀI LIàU THAM KHÀO ... 49

DANH MĂC CƠNG TRÌNH CĄA TÁC GIÀ ... 48

PHĂ LĂC ... 53

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. C¢ chÁ kháng khuẩn cąa COS dựa vào c¢ chÁ kháng khuẩn cąa chitosan. .. 17 Hình 2. Mơ tÁ quy trỡnh ch to mng ba lỗp PAC. ... 21 Hình 3. KÁt quÁ H-NMR cąa COS. ... 27 Hình 4. Đ°éng chuẩn PEO/PEG và kÁt quÁ GPC từ m¿u COS. ... 28 Hình 5. KÁt q khÁo sát nßng đå kháng khuẩn cąa COS bằng ph°¢ng pháp đĩa th¿ch (A) và đ°éng kính trung bình cąa vịng kháng khuẩn (B) vỗi 1-PCL, 2-COS 1%, 3-COS 3%, 4-COS 5%, 5-COS 7%, 6-Penicillin Streptomicycin. ... 29 Hình 6. Ành vi mơ SEM Bề mặt cąa các nhóm màng (A) PCL; (B) PA; (C) PAP; (D) PAC5-1; (E) PAC5-2 và (F) PAC5-3. ... 30 Hình 7. KÁt quÁ (1) so sánh đ°éng kính sāi trung bình và (2) đå phân bá đ°éng kính sāi giāa các m¿u A-PCL, B-PA, C-PAP, D-PAC5-1, E-PAC5-2, F-PAC5-3; (3) ồ dy lỗp ph COS v (4) ồ phą bề mặt cąa COS ë 4 khoÁng théi gian 6 tiÁng, 12 tiÁng, 18 tiÁng và 24 tiÁng. ... 31 Hình 8. KÁt quÁ (A) đå dày màng PAC5-3 v (B) ồ dy lỗp ph COS ti ba vỏ trí ng¿u nhiên. BÁng kÁt quÁ cho thÃy đå dày trung bỡnh ca mng PAC5-3 v lỗp ph COS. ... 32 Hình 9. Ành hiển vi đián tÿ truyền qua (TEM) ca mng PA v biu ò phõn phỏi kớchthỗc đ°éng kính AgNPs. (Thanh tỷ lá: 200 nm, n = 50). ... 32 Hình 10. KÁt quÁ XRD cąa màng PAP, PAG và PAC5-3. ... 33 Hình 11. KÁt quÁ EDS khÁo sát sự có mặt cąa nguyên tá C, O và Ag trên bề mặt màng PA. ... 33 Hình 12. KÁt q UV-Vis khÁo sát sự có mặt cąa AgNPs ë théi điểm chÁ t¿o. ... 34 Hình 13. Phá FT-IR cąa PCL, POX, PVP, COS đái chiÁu cùng màng PPC5 và PAC5-3. ... 35 Hình 14. Góc tiÁp xúc cąa PCL, PA, PAP và PAC5-3. Các bćc nh phớa trờn mói cồt minh hóa cỏc giót nỗc trên bề mặt màng. (dā liáu = trung bình ± SD, n=5, *: p<0,05, ns: p>0,05). ... 36 Hình 15. Đặc tính c¢ hãc cąa PCL, PA, PAP, PAC5-1, PAC5-2, PAC5-3. (data = trung bình cång ± ph°¢ng sai, sá lần lặp là 3). ... 37 Hình 16. Tác đå truyn hÂi nỗc (A) v ồ hp th nỗc (B) ca 3 nhúm mng PA, PAP v PAC5-3; vỗi uncover-b mặt thống khơng phą màng (data = mean ± SD, n = 5, ns: p> 0,05, *: p< 0,05). ... 38 Hình 17. L°āng AgNPs giÁi phóng trong áng nghiám từ màng PAC5-3 trong dung dách PBS (pH=5,5). Các phần dách đ°āc lÃy sau 1, 3, 6, 12 và 24 gié và đánh l°āng bằng kỹ thuÁt ICP-MS (dā liáu = trung bình ± SD, sá lần lặp=3). ... 40 Hình 18. (A) Nßng đå phóng thích cąa COS trong vòng 24 gié và (B) đ°éng chuẩn đå hÃp thă cąa các nßng đå COS. ... 40 Hình 19. Hình Ánh (A) Các vùng ćc chÁ đ°āc hình thành bëi màng (1) penicillin-streptomycin , (2) PA và (3) PCL trên chąng S. aureus,(B) Đĩa agar trÁi dung dách chiÁt màng PCL, (C) Đĩa agar trÁi dung dách chiÁt màng PA, (D) m¿u đái chćng trÁi dung dách khuẩn nuôi t rong môi tr°éng penicillin-streptomycin . (Thanh tỷ lá: 10 mm, sá lần lặp =4). ... 41 Hình 20. Các vùng ćc chÁ đ°āc hình thành bëi màng (1) penicillin-streptomycin , (2)

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

PAC5-3 và (3) PCL trên chąng S. aureus. (Thanh tỷ lá: 10 mm, sá lần lặp =4). ... 42 Hình 21. KhÁ nng sáng (%) cąa nguyên bào sāi sau 24 gié ą ë các nßng đå khác nhau cąa dung dách chiÁt PCL, PA, PAC5-3 và màng Betaplast Silver (dā liáu = trung bình ± SD, n = 3, ns: p> 0,05, *: p< 0,05). ... 43 Hình 22. KÁt quÁ H&E cąa da thò sau khi iu trỏ 28 ngy ỏi vỗi mơ hình bßng nhißm khuẩn SA đ°āc điều trá bằng bng g¿c kháng khuẩn PAC5-3, bng g¿c th°¢ng m¿i (Betaplast Silver) v bng gc bỡnh thộng (cotton). (Thỗc o: 10 mm) ... 44 Hình 23. KÁt quÁ nhuåm H&E và MT cąa m¿u vÁt th°¢ng cÃy khuẩn SA đÃp mng PAC5-3, Betaplast silver, cotton. (Thỗc o: 100m). ... 46

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

DANH MỤC B¾NG

BÁng 1. Mơ tÁ thành phần và giÁi thích kí hiáu sÿ dăng trong q trình chÁ t¿o. ... 21 BÁng 2. Thơng sá chuẩn bá và liều chiÁu x¿ các dung dách. ... 22 BÁng 3. Phần trm nguyên tÿ, phần trm khái l°āng cąa C, O và Ag. ... 34 BÁng 4. Góc tiÁp xúc cąa các nhóm màng ë théi điểm bÃt đầu khÁo sát và sau 60s.. 36 BÁng 5. Hiáu suÃt kháng khuẩn cąa dung dách chiÁt màng PA trong 24 gié. ... 41 BÁng 6. Vùng kháng khuẩn cąa 3 nhóm màng penicillin-streptomycin , PAC5-3 và PCL. ... 42 BÁng 7. Thể hián mćc đå thu nhß vt thÂng ở nhúm gõy nhiòm khun S.A ở ngy thć 28 ë 3 nhóm đÃp màng cotton, Betaplast Silver và PAC5-3. ... 45

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AgNPs: Silver nanoparticles

PVP: Poly (N-vinyl pyrrolidone)

DMSO: Dimethyl sulfoxide

S. aureus: Staphylococcus aureus

DMEM: Dulbecco`s Modified Eagle Media PBS: Phosphate-buffered saline

UV-Vis: Ultraviolet - Visible spectroscopy SEM: Scanning electron microscopy

EDS: Energy-dispersive X-ray spectroscopy

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

TểM TT

S dng nguòn chitosan trong nỗc để táng hāp oligomer chitosan (COS) bằng cách sÿ dăng q trình oxy hóa hydrogen peroxide (H2O2) theo ph°¢ng pháp chiÁu x¿ vi sóng. KÁt quÁ cho thÃy chitosan đáa ph°¢ng cąa Viát Nam và d¿n xt COS cąa nó có hiáu suÃt tinh chÁ cao trong khi phân tÿ COS t¿o ra trãng l°āng thÃp. KÁt quÁ khÁo sát khÁ nng kháng khuẩn dòng Staphylococcus aureus (S. aureus) cho thÃy khÁ nng sÿ dăng nh° là måt ngußn vÁt liáu kháng khuẩn tự nhiên, giÁm nguy c¢ hình thành chąng kháng kháng sinh. Bên c¿nh kÁt hāp silver nanoparticles (AgNPs), giúp tng khÁ nng bÁo vá vÁt thÂng khòi tỏc nhõn nhiòm khun. ỏi tng nghiờn cu ch yu l mng 3 lỗp kt hp gia tớnh k nỗc ở lỗp ngoi v kh nng hp th nỗc ở mt trong nhộ kt hp cựng cỏc polymer a nỗc to iu kiỏn lý tởng trong thit k mng lnh thÂng trỏ bòng. Kho sỏt trờn mụ hỡnh in

vivo cho thÃy, khÁ nng lành th°¢ng t°¢ng đ°¢ng vỗi mng thÂng mi Betaplast

Silver v nhanh hÂn khi so sỏnh vỗi mng Cotton. òng thội, cho thy kh nng kinh tÁ trong sÿ dăng vÁt liáu đáa ph°¢ng để giÁm giá thành chÁ t¿o bng g¿c nh°ng v¿n có hiáu quÁ điều trá.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Dựa vào q trình chāa lành vÁt th°¢ng đ°āc mơ tÁ phía trên, bng g¿c đ°āc thiÁt kÁ để hã tr quỏ trỡnh lnh thÂng, òng thội, kt hp cỏc tỏc nhõn khỏng khun bo vỏ vt thÂng khòi q trình nhißm trùng. Từ đó, vÃn đề làm sao để kÁt hāp nhiều yÁu tá thiÁt yÁu cho quá trình bÁo vá tránh nhißm khuẩn và tng tác đå lành th°¢ng cąa bng g¿c đ°āc đặt ra. Bng g¿c a lỗp vỗi lỗp ngoi cha tỏc nhõn khỏng khun, òng thội chỏng thm nỗc to mồt lỗp mng bo vỏ cho vt thÂng bòng, mt trong ng dng nhng nghiên cću đáng chú ý gần đây cho viác ngn chặn và chāa lành vÁt bßng bëi tác nhân kháng khuẩn nh° oligomer chitosan phą trên bề mặt trong bng g¿c.

Staphylococcus aureus (S.aureus) là dòng khuẩn gram âm có mặt trên các bề mặt da. Mặc dù vÁt thÂng viờm nhiòm cc bồ hay món tớnh c gõy ra bởi nhiu lý do, thỡ vt thÂng nhiòm trựng bëi chąng S.aureus đ°āc xem nh° là måt trong nhāng trộng hp phỏ bin nht.Viỏc nhiòm trựng vt thÂng khin vÁt th°¢ng chÁm lành, màng sinh hãc (biofilm) hình thành trong quỏ trỡnh viờm nhiòm khin vt thÂng chm lnh và trë nên ngày måt nặng h¢n[1]. Viác điều trá cỏc vt thÂng nhiòm khun S.aureus dn trở

nờn phc t¿p vì đåc lực sinh ra từ vi khuần và dịng kháng kháng sinh. Sÿ dăng các ngn tự nhiên có khÁ nng kháng khuẩn có thể giÁm thiểu nguy c¢ kháng kháng sinh cąa viác l¿m dăng kháng sinh trong điều trá vÁt th°¢ng.

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1.VÁn đề nghiên cāu

VÁt th°¢ng có thể đ°āc đánh nghĩa là sự gián đo¿n sÃp xÁp sinh lý cąa các tÁ bào da và rái lo¿n chćc nng cąa nó trong viác kÁt nái v bo vỏ cỏc mụ v cÂ quan bờn dỗi. Nó có thể là ngun nhân chính do vơ tình ct, rỏch, try xỗc, ỏp lc, nhiỏt ồ quỏ cao, hóa chÃt và dịng đián, hoặc thć phát sau can thiáp ph¿u thuÁt hoặc bánh (ví dă: tiểu đ°éng, loét hoc ung th biu mụ). Cỏc tỏn thÂng bao gòm cỏc cp ồ nh nh hởng n lỗp biu bỡ n ồ dy mồt phn (nh hởng n c lỗp biu bỡ v cỏc phn ca lỗp h bỡ) v ồ dy ton bồ (bao gòm c m dỗi da và x°¢ng) [2].

Chāa lành vÁt th°¢ng là måt q trình sinh lý trong c¢ thể, trong đó c¢ thể sáng sÿa chāa các tán th°¢ng mơ, khơi phăc tính tồn vẹn về mặt giÁi ph¿u và lÃy l¿i chćc nng cąa các bå phÁn bá th°¢ng. Måt vÁt th°¢ng có thể đ°āc đóng l¿i hoặc để tự chāa lành theo c¢ chÁ tự nhiên trong c¢ thể, q trình chāa lành xÁy ra thông qua måt lo¿t các sự kián chßng chéo và bá Ánh h°ëng bëi måt sá yÁu tá bên trong và bên ngoài [3].

Chitin là polysaccharid phá biÁn thć hai trong tự nhiên sau cellulose. Q trình deacetyl hóa måt phần chitin thúc đẩy quá trình thu đ°āc chitosan và sự khác biát giāa chúng là ë nhóm acetyl. Chitin bao gßm chą yÁu đ¢n vá cąa N-acetyl-D-gluamine (GlcNAc), trong khi chitosan bao gòm ch yu D-gluamine (GlcN). Cỏc Ân vá c¢ bÁn hình thành cÃu trúc chitin và chitosan liên kÁt vỗi nhau bởi liờn kờt -(14) glycosidic[4]. Chitosan l mồt oligomer vỗi liờn kt ³-(1➔4)-linked D-glucosamine có thể đ°āc điều chÁ từ q trình deacetyl hóa và thąy phân chitin, th°éng đ°āc tìm thÃy chą u trong bå x°¢ng ngồi cąa đång vÁt giáp xỏc v cụn trựng, ngoi vi khun, giỗi nm v nÃm.

Nghiên cću gần đây chß ra rằng chitosan nh° là polymer sinh hãc có tính t°¢ng hāp sinh hãc cao, có khÁ nng phân hąy sinh hãc và khơng gây đåc tÁ bào. Đánh giá tính chÃt cąa oligomer chitosan chą yÁu dựa vào khái l°āng phân tÿ và đå deacetyl hóa, liên qua đÁn tỷ lá giāa GlcNAc và GlcN. Hầu hÁt các sÁn phẩm chitosan trên thá trộng cú khỏi lng phõn t t 50-2000 kDa, vỗi đå deacetyl từ 80-90%. Dựa vào khái l°āng phân tÿ, chitosan có thể đ°āc nhóm thành 3 nhóm chính: khái l°āng phân tÿ thÃp (<100 kDa), khái l°āng phân tÿ trung bình (100–1000 kDa), và khái l°āng phân tÿ cao (>1000 kDa) [4]. Tuy nhiờn, chitosan khụng tan trong nỗc giỗi hn kh nng ng dng ca nú. T ú, nhiu nghiờn cu tng kh nng hũa tan trong nỗc cąa chitosan bằng cách thay đái cÃu trúc hoặc t¿o ra các d¿n xuÃt cąa chitosan. Chitosan oligomer (COM) còn đ°āc gãi là chitooligomer hoặc chitosan oligosaccharide, đ°āc đánh nghĩa l chitosan cú mc ồ trựng hp dỗi 20 v tróng lng phõn t trung bỡnh dỗi 3900 Da (thộng là 0,2–3,0 kDa).

C¢ chÁ kháng khuẩn cąa oligomer chitosan v¿n còn ch°a rõ. Tuy nhiên, nhiều giÁ thuyÁt rằng bÁn cht khỏng khun tÂng t chitosan, trong ú polycation dỗi pH 6,5 là måt yÁu tá quyÁt đánh. Đián tích dÂng trong chuói tÂng tỏc vỗi cỏc thnh phn tớch đián âm trong màng tÁ bào vi sinh vÁt, làm thay đái tính chÃt rào cÁn cąa chúng và do đó ngn cÁn sự xâm nhÁp cąa các chÃt dinh d°ÿng hoặc gây rị rß các chÃt bên trong tÁ bào. Do các đián tích d°¢ng cąa nó, chitosan cũng cú th tÂng tỏc vỗi phn õm ca mng t bào, điều này có thể d¿n đÁn sự tái tá chćc và më các protein liên kÁt chặt ch¿, giÁi thích đặc tính tng c°éng thẩm thÃu cąa nó [5]. Hai c¢ chÁ chính đã đ°āc báo cáo trong tài liáu để giÁi thích các ho¿t đång kháng khuẩn và kháng nÃm cąa chitosan. Trong

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

c¢ chÁ đầu tiên đ°āc đề xt, chitosan tích đián dÂng cú th tÂng tỏc vỗi cỏc nhúm tớch iỏn âm trên bề mặt tÁ bào và do đó làm thay đái tính thÃm cąa nó. Điều này s¿ ngn cÁn các vÁt liáu thiÁt yÁu xâm nhÁp vào tÁ bào và d¿n đÁn rị rß các chÃt hịa tan cÂ bn ra khòi t bo. CÂ ch th hai liờn quan n s liờn kt ca chitosan vỗi DNA cąa tÁ bào (v¿n thơng qua các nhóm amin đ°āc proton hóa), điều này s¿ d¿n đÁn sự ćc chÁ quá trình táng hāp RNA cąa vi sinh vÁt. Trên thực tÁ, đặc tính kháng khuẩn cąa chitosan có thể là kÁt quÁ cąa sự kÁt hāp cąa cÁ hai c¢ chÁ. Thách thćc chính cąa nghiên cću này là đánh giá đ°āc đå an toàn và khÁ nng hã trā lành th°¢ng cąa COS. Do thành phần chính chą yÁu đ°āc làm từ PCL, måt lo¿i polyester thiÁu các nhóm chćc nng ho¿t đång, màng PCL-Ag có bề mặt k nỗc, khụng th tÂng tỏc vỗi cỏc thnh phn ph a nỗc v mt vt lý hoc húa hóc. Để khÃc phăc vÃn đề này, poloxamer 407 (POX) đ°āc chãn làm 8chÃt keo9 để kÁt hāp màng PCL tích hp AgNPs vỗi lỗp ph COS-PVP. L polyme triblock cú khỏi k nỗc trung tõm ca polypropylen glycol v hai khỏi a nỗc khỏi polyethylene glycol, POX cú th kt nỏi vỗi c PCL v COS-PVP cựng lỳc v gi chúng nh° måt khái tháng nhÃt. Sau đó, dung dách COS-PVP c ph lờn lỗp trung gian thu c sn phm mng a lỗp. Vỗi lỗp k nỗc cú thnh phn AgNPs giỳp bo vỏ vt thÂng khòi bỏ nhißm khuẩn và các các nhân nhißm khuẩn từ bên ngoi, òng thội lỗp trong cựng cho phộp thm hỳt tát và sÿ dăng COS nh° måt hāp chÃt tự nhiên lành tính có khÁ nng hã trā lành th°¢ng nh°ng đßng théi cũng là tác nhân kháng khuẩn giúp bo vỏ vt thÂng khòi s nhiòm trựng trong quỏ trình lành th°¢ng. Từ đó, giÁ thiÁt giúp vÁt th°¢ng lnh nhanh v gim nguy cÂ viờm nhiòm c t ra trong luÁn vn này.

1.2.Tình hình nghiên cāu

Nhiều nghiên cću gần đây cho thÃy tính khÁ thi sÿ dăng mng chitosan cha lnh cỏc vt thÂng bòng. Cỏc vÁt th°¢ng có khÁ nng lành tự nhiên, nh°ng có nhāng ng°éi bá rái lo¿n d¿n đÁn giÁm khÁ nng tự chāa lành vÁt th°¢ng, chẳng h¿n nh° bánh nhân tiểu đ°éng có thể phát triển thành mãn tính, vÁt thÂng khụng lnh khin bỏnh nhõn au ỗn v chỏu đựng trong théi gian dài [5]. Trong nhāng tr°éng hāp nh° vÁy, cần có théi gian điều trá dài, điều này cũng s¿ làm tng chi phí liên quan đÁn chm sóc y tÁ tiên tiÁn. Do đó, trãng tâm là các chÃt trá liáu tự nhiên có thể đẩy nhanh quỏ trỡnh cha lnh vt thÂng v òng thội cú th dò dng tip cn vỗi ngội dõn giỳp giÁm chi phí điều trá, và chitosan d°éng nh° đáp ćng tÃt cÁ các điều kián này. Chitosan đẩy nhanh q trình chāa lành vÁt th°¢ng bằng cách kích thích các tÁ bào viêm, đ¿i thực bào và nguyên bào sāi, do đó thúc đẩy giai đo¿n viêm. Bằng cách ny, giai on viờm diòn ra nhanh hÂn v gim nhanh, giai on tng sinh bt u sỗm hÂn trong quỏ trỡnh cha lnh vt thÂng5. Mng chitosan vỗi oleic acid v glycerol 1% ó c chun bỏ trỗc ú. Các màng chitosan này có hình thái

phù hāp và c s dng nghiờn cu in vivo vỗi chuồt Wistarđ cho thÃy màng chitosan

đ°āc cÃy ghép t°¢ng thích sinh hãc và có khÁ nng hÃp thă sinh hãc giúp mơ khße m¿nh. Từ kÁt q khÁo sát này, màng chitosan có thể cho phép sÿ dăng chúng để chāa lành vÁt th°¢ng [6].

Trong måt nghiên cću khác cho thÃy, kÁt hāp giāa màng polysulfone(PSF) và chitosan cho thÃy tng khÁ nng kháng khuẩn, trong đó màng PSF- chćng minh khÁ nng kháng khuẩn khoÁng 105 cells/ml trong vịng 18 gié, các c¢ chÁ có thể bao gßm phá vÿ thành tÁ bào vi khuẩn và màng tÁ bào, thÁi ra måt l°āng nhß cation kim loi st, tÂng tỏc vỗi cỏc mc tiờu nồi bo và lÃng đãng trên vi khuẩn[7].

C¢ chÁ có thể giÁi thích cho khÁ nng kháng khuẩn bao gßm viác phá vÿ thành tÁ bào vi khuẩn và màng sinh cht, cỏc tÂng tỏc vỗi cỏc mc tiờu gn ngoi bề mặt màng và phá hąy tÁ bào vi khuẩn.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Vi khuẩn th°éng đ°āc chia làm 2 nhóm chính: vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram d°¢ng dựa theo kÁt quÁ nhuåm gram. Thành tÁ bo ca vi khun gram õm gòm lỗp ngoi l mng t bo v thnh peptidoglycan. Lỗp ngoi bo gòm 2 Ân lỗp khụng cõn xng. Lỗp bờn trong chß bao gßm phospholipid, trong khi lỗp ngoi bao gòm phospholipid và lipopolysaccharide. Bề mặt cąa vi khuẩn gram âm đ°āc tích đián âm do các nhúm phosphate v pyrophosphates ca lipopolysaccharides ở lỗp ngoi. Thnh t bo ca vi khun gram dÂng bao gòm peptidoglycan và teichoic acids (Hình 1). Bề mặt cąa vi khuẩn gram d°¢ng đ°āc tích đián âm do các nhóm carboxyl và phosphate cąa teichoic acids.

Hknh 1. Cơ chế kháng khuẩn của COS dựa vào cơ chế kháng khuẩn của chitosan.

Khi COS đ°āc hòa tan trong dung dách nỗc cú tớnh acid, cỏc nhúm NH2- c proton húa thành cation -NH3C[8]. GiÁ thiÁt phù hāp nhÃt cho khÁ nng kháng khuẩn là các nhóm polycationic (-NH3C) tự nhiên vì có sự có mặt cąa gác amine từ nhóm glutamine. Tính chÃt quan trãng này giÁ thích cho khÁ nng bám vào nhāng thành phần mang đián tích âm trên bề mặt cąa vi khuẩn. Viác bám dính này cho phép kích ho¿t nh°ng thay đái trên bề mặt tÁ bào d¿n đÁn sự rị rß tÁ bào chÃt d¿n đÁn sự chÁt tÁ bào[9], teichoic acid và lipopolysaccharide trong vi khuẩn gram âm cho phép chitosan bám vào và phá hąy bề mặt tÁ bào vi khuẩn, t¿o ra c¢ chÁ diát khuẩn.

Perinelli và đßng nghiáp đặt giÁ thiÁt rằng chitosan bám vào DNA cąa vi khuẩn d¿n đÁn ćc chÁ quá trình phiên mã cąa mRNA cũng nh° l tÂng tỏc vỗi b mt t bo. Je v Kim (2006) đề xuÃt måt giÁ thiÁt rằng c¢ chÁ kháng khuẩn cąa chitosan là bám lên màng tÁ bào và phá hąy từ đó thay đái chćc nng màng tÁ bào d¿n đÁn sự vÿ màng tÁ bào[10]. Trong måt nghiên cću khÁo sát Ánh h°ëng cąa khái l°āng trung bỡnh ca chitosan (90-300 kDa) ỏi vỗi kh nng diỏt khun ca nhúm khun gram õm trờn cỏ nỗc ngãt cho thÃy: ë nßng đå 0.8% (w/v) cąa chitosan là điều kián cần và đą cąa cho ćc chÁ sự phát triển cąa areomonas hydrophila, khÁo sát t°¢ng t°, cho thÃy 0.4% chitosan là điều kián cần để ćc chÁ sự phát triển cąa flavobacterium columnare và edwardsiella ictaluri. GiÁ thuyÁt đặt ra rằng sự có mặt cąa các nhúm mang iỏn tớch õm v b mt k nỗc cąa vi khuẩn là nguyên nhân d¿n đÁn sự t°¢ng tác ćc chÁ vi khuẩn cąa chitosan [11]. Måt nghiên cću khác cąa Chung và cång sự (2014) chß ra rằng nhóm khuẩn thể hián các nhóm mang

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

đián tích âm trên bề mặt s¿ liên kt tỏt hÂn vỗi cỏc polycationic ca chitosan [12]. Trong sá các mơ hình màng lành th°¢ng khác nhau, màng chitosan đã đ°āc phát triển thành bng g¿c cho chÃn th°¢ng và/hoặc vÁt th°¢ng mãn tính do đặc tính cầm máu, ho¿t đång kháng khuẩn và phÁn ćng cháng viêm [13],[14].Khi vÁt th°¢ng xÁy ra, tiểu cầu s¿ đ°āc kích ho¿t và tÁp hāp l¿i t¿i vá trí vÁt th°¢ng để cầm máu nh° là c¢ chÁ để chāa lành vÁt th°¢ng, đ°āc gãi là giai đo¿n cầm máu. ê điều kián vÁt th°¢ng điển hình (pH < 7), màng dựa trên chitosan có khÁ nng hÃp thă måt lng lỗn dỏch tit vt thÂng v t mng sn sát và/hoặc hydrogel có đặc tính bám dính m¿nh vào mơ bá tán th°¢ng để cầm máu[15]. Trong måt nghiên cću lâm sàng, g¿c chitosan đã đ°āc sÿ dăng làm chÃt cầm máu trên 75 bánh nhân bá chÃn th°¢ng[16]. KÁt quÁ cho thÃy théi gian lành vÁt th°¢ng trung bỡnh tÂng Âng vỗi thội gian bng vt thÂng thÂng m¿i, hã trā dā liáu mô hãc in vivo về khÁ nng cąa chitosan trong viác t¿o ra huyÁt khái ë bề mặt vÁt th°¢ng và thúc đẩy q trình đơng máu thơng qua kích ho¿t tiểu cầu.

Måt nh°āc im lỗn lm hn ch viỏc ng dng rồng rói chitosan l nú khụng hũa tan trong dung dỏch nỗc. Điều này là do các liên kÁt hydro ngoài phân tÿ t¿o thành cÃu trúc tinh thể. Tuy nhiên, nó hịa tan trong dung dách axit ë đå pH khơng lỗn hÂn 6. Axit acetic l axit c s dng phá biÁn nhÃt cho măc đích này. Các biÁn đái hóa hãc cąa chitosan là lựa chãn thay thÁ để cÁi thián các đặc tính đ°āc ćng dăng trong lĩnh vực rång h¢n. Các nhóm chćc nng quan trãng nhÃt có khÁ nng biÁn đái chitosan là nhóm amine (–NH2). chitosan oligosaccharide đ°āc xem nh° là måt giÁi pháp để giā nhóm amine nh°ng đßng théi có khÁ nng hịa tan trong nỗc.

Bờn cnh chitosan, cỏc ht nano bc (AgNPs) đã cho thÃy hiáu quÁ trong ho¿t đång kháng khuẩn và viác cung cÃp các h¿t nano này ë d¿ng bào chÁ rÃn sÿ dng si PEO/chitosan hũa tan trong nỗc giỳp cÁi thián h¢n nāa khÁ nng kháng khuẩn. Viác kÁt hāp các h¿t nano b¿c vào sāi quay đián th°éng l mồt quỏ trỡnh gòm hai bỗc vỗi viỏc s dăng các hóa chÃt đåc h¿i làm chÃt khÿ và để cÁi thián sự phân tán trong dung dách polymer. Cỏc nghiờn cu ó chng minh quy trỡnh mồt bỗc để sÁn xuÃt sāi Ag-PEO/chitosan từ chiÁu x¿ tia cực tím cąa dung dách quay đián b¿c nitrat (AgNO3)[17]. Các ht nano Ag cú kớch thỗc trung bỡnh 3.5 0.6 nm đ°āc phân tích bằng kính hiển vi đián tÿ truyền qua đ°āc phân tán đßng nhÃt trong sāi PEO/chitosan (đ°éng kính ~ 250 nm đÁn 350 nm) cũng nh° trên bề mặt sāi. Đå bền kéo trung bình cąa sāi Ag-PEO/chitosan dao đång từ 5.50 ± 0,19 MPa đÁn 7.54 ± 0.74 MPa, tùy thuåc vào nßng đå AgNO3 trong dung dách[18]. Ngồi ra, sự giÁi phóng ion Ag trong áng nghiám cho thÃy tác đå giÁi phóng nhanh về nßng đå ion Ag lúc 10 gié, sau đó giÁi phóng chÁm và cuái cùng đ¿t đÁn tr¿ng thái án đánh ë 72 gié. Ho¿t tính kháng khuẩn đ°āc thực hián

trên S.aureus gram d°¢ng và E. coli gram âm bằng ph°¢ng pháp trÁi đĩa th¿ch. KÁt quÁ

cho thÃy vùng ćc chÁ tng gÃp 1.9 lần và 3.4 lần từ sāi Ag-PEO/chitosan trên S. aures

và E. coli so vỗi si PEO/chitosan. Nhng si ny c ỏnh giá bằng các thÿ nghiám

về đåc tính tÁ bào bằng cách sÿ dăng tÁ bào nåi mô chÁu cąa lān và kÁt quÁ cho thÃy khÁ nng sáng sót cąa tÁ bào là trên 90% sau 24 gié nuôi cÃy. Nghiên cću này khơng chß cung cÃp quy trình mồt bỗc trong viỏc kt hp cỏc ht nano Ag vào sāi chitosan mà còn đề xuÃt nhiều lo¿i tác nhõn húa hóc v sinh hóc tÂng thớch vỗi si PEO/chitosan. Từ các nghiên cću đã khÁo sát, cho thÃy viác kÁt hāp giāa 2 tác nhân kháng khuẩn COS và AgNPs cho phép đặt giÁ thuyÁt về viác sự kÁt hāp này làm tng khÁ nng kháng khuẩn, đặt biát các kÁt quÁ từ liáu tham khÁo cho thÃy tiềm nng trong viác hã trā lành th°¢ng.

Do khÁ nng chÁ t¿o màng cąa chitosan kém, do không tan trong nỗc nờn dung

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

dỏch polymer pha trån cąa chitosan và các copolymer khác th°éng đ°āc điều chÁ để sÁn xuÃt sāi chitosan gây mÃt théi gian và quá trình phćc t¿p. Viác lựa chãn lo¿i chitosan đóng vai trị chính trong viác xác đánh các đặc tính cąa sāi do tỷ lá pha trån thể tích cąa polymer và do đó, có thể làm giÁm khÁ nng t°¢ng thích sinh hãc (đåc h¿i) và đå án đánh (phân hąy sinh hãc) cąa sāi. Để khÃc phc vn ny, mồt dn xut a nỗc ca chitosan, oligomer chitosan (COS) đã đ°āc sÿ dăng để cÁi thiỏn kh nng trồn ln vỗi copolyme (tc l PVP), l mồt polymer hũa tan trong nỗc cú c tớnh t¿o màng. Trong luÁn vn này, nghiên cću giÁi phóng in vitro từ sāi phą COS-PVP. Các thÿ nghiám về khÁ nng sáng sót in vitro sÿ dăng tÁ bào L929 và đánh giá trên mơ hình cht in vivo về tỷ lá đóng vÁt th°¢ng cho thÃy dián tích vÁt th°¢ng . Cơng trình này đề xt sự kÁt hāp cąa nano b¿c (AgNPs) và đái t°āng khÁo sát dựa trên dịng vi khuẩn S.aureus.

Sÿ dăng ph°¢ng pháp phun kéo sāi đián tr°éng là måt ph°¢ng pháp đ¢n giÁn, linh ho¿t để sÁn xt sāi có đ°éng kính từ vài micromet đÁn nanomet [19]. Nguyên lý cąa ph°¢ng pháp phun kéo sāi đián tr°éng là sÿ dăng đián tr°éng m¿nh (ví dă: 1 ~ 4 kV/cm) để hút cỏc si rn t dung dỏch polymer. Trỗc khi ch to, dung dỏch polymer c chun bỏ vỗi cỏc c tớnh dung dỏch thớch hp (vớ d: ồ nhỗt, ồ d¿n đián, sćc cng bề mặt và đå bay h¢i cąa dung mơi). Trong q trình chÁ t¿o, đián tr°éng ćng dăng cần phÁi v°āt qua sćc cng bề mặt cąa dung dách polymer (hình nón Taylor), n¢i t¿o ra các chuãi sāi mán và theo sau là sự bay hÂi dung mụi trỗc khi h xuỏng bồ thu si. SÁn phẩm thu đ°āc là måt tÃm thÁm sāi mán và dày đặc, ë d¿ng cÃu trúc sāi không dát hoc c cn chònh tÂng ng bng cỏch s dng bå thu sāi cá đánh. Nhiều ng°éi đã xem xét Ánh h°ëng cąa các thông sá quay đián lên cÃu trỳc si thu c vỗi mc ớch tỏi u húa các điều kián quay đián [20]-[21].

CHƯƠNG 2: ĐÞI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CĀU

Poly (¸-caprolactone) (PCL, Mn 80,000), poloxamer 407, và dimethyl sulfoxide (DMSO), poly (N-vinyl pyrrolidone) (PVP) đ°āc mua từ Sigma-Aldrich Co. Ltd., Dorset Gillingham, UK. Silver nitrate (AgNO3, ≥ 99%), acetone (AC, CH3COCH3, 99.5%), hydrogen peroxide (H2O2) 30% (v/v), và ethanol (C2H5OH) đ°āc mua bëi Xilong Chemical Co., Ltd. (China). Low vicosity chitosan vỗi khỏi lng phân tÿ khoÁng 270 kDa đ°āc mua từ Vietnam Food JSC, Vietnam. Mueller Hinton Broth (M391-500G) đ°āc mua từ Hi-Media (India). The pathogen, such as Staphylococcus

aureus (S. aureus, ATCC 25913) đ°āc cung cÃp bëi the Marine Laboratory, International University-HCM Vietnam National University (Vietnam). Mouse fibroblast L929 cell line đ°āc rã đông và nuôi cÃy trong dulbecco`s modified eagle media (DMEM, Gibco, USA) bá sung 10% fetal bovine serum (Gibco, USA) và 1% penicillin-streptomycin (Gibco, USA). TÃt cÁ các hóa chÃt đều đ¿t tiêu chuẩn phân tích và đ°āc sÿ dăng trực tiÁp mà khơng cần tinh chÁ thêm.

Ph°¢ng pháp chuẩn bá đ°āc mơ phßng và thay đái dựa theo ph°¢ng cąa Vinh và cång sự [22], [23]. Båt chitosan đ°āc pha ë ba nßng đå (1%, 3%, 5% v 7%) vỗi 6% H2O2 ở 30oC trong 10 phút. Hãn hāp (HH) sau đó đ°āc đặt vào lị vi sóng ë mćc 400W trong vịng 3 phút, sau đó để h¿ nhiát ë nhiát đå phịng. Ethanol 99% sau ú c thờm vo HH vỗi t lá 3:1 (ethanol: HH). Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R-300 lo¿i bß dung mơi thừa thu đ°āc cặn ta. Phn cn ta thu c, c loi bò nỗc bằng

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

máy đông khô (LABCONCO) thu đ°āc oligomer chitosan d¿ng båt.

2.2.2.Độ đề acetyl của oligomer chitosan

Phá 1H-NMR cąa đ°āc đo bằng cách sÿ dăng 1H-NMR ë tr¿ng thái lßng (400 MHz, · tính bằng ppm, Bruker Avance-400 MHz FT-NMR (Bruker Corp, Billerica, MA, USA). Các m¿u chitosan đã đ°āc hòa tan trong DMSO/DCl2 v c lóc trỗc khi o NMR. Sau ú, đå deacetyl hóa cąa đ°āc tính tốn dựa trên ph°¢ng trình sau:

�㔷�㔷(%) = (1 213 �㔴2

16 �㔴1

) �㕋100

trong đó A1 là giá trá tích phân proton cąa các vá trí C2–C6 trên vịng đ°éng, là dián tích trung bình đo đ°āc trong khng · 3–6 ppm, và A2 là giá trá tích phân proton cąa ba proton N-acetyl cąa N-acetyl glutamide ë khoÁng · 2 ppm.

Khái l°āng phân tÿ cąa oligomer chitosan và chitosan đ°āc đo bằng Gel Permeation Chromatography (GPC) (Shimadzu/LC-10ADvp, Kyoto, Japan) vỗi refractive index detector RID-10A. Hỏ thỏng s dng nỗc lm pha ồng. Tt cÁ các m¿u đều hòa tan ë 1,5 mg/mL trong 0,3 M acetic acid và 0,2 M sodium acetate, m¿u sau ú c lóc trỗc khi o GPC vỗi tỏc ồ dũng 0,8 mL/ phỳt ở 40oC vỗi th tớch mu l 20 àL. Chun EasiVial PEO/PEG vỗi khỏi lng phân tÿ từ 1,42 đÁn 1220 kDa đã đ°āc sÿ dăng để hiáu chuẩn OHpak SB-804 HQ columns (dimension 8 mm × 300 mm).

2.1.2. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của Oligomer Chitosan

Trong thí nghiám khÁo sát tính kháng khuẩn, ph°¢ng pháp khch tán th¿ch đ°āc áp dăng để xác đánh khÁ nng kháng khuẩn lên dũng vi khun cú kh nng gõy nhiòm

Bỗc 1: Chuẩn bá:

- Chuẩn bá m¿u: M¿u đái chćng (kháng sinh penicillin-streptomycin ) và m¿u cần kiểm tra (1%, 3% và 5%, 7%).

- Chuẩn bá vi khuẩn :

Dịng vi khuẩn trā đơng gßm S. aureus đ°āc đ°a vào tą ą 37 °C khoÁng 2 phút, sau đó

lÁp tćc cho vào 20 ml dung dách Mueller Hinton và ą ë 37 °C trong vòng 24 gié. Sau đó, dung dách này đ°āc cÃy lên đĩa th¿ch Mueller Hinton và ą 37 °C trong vòng 24 gié để cho vi khuẩn mãc thành từng căm khuẩn l¿c và đ°āc trā trong tą mát 4 °C tái đa 1 tháng. TiÁp theo, lÃy 1 căm khuẩn l¿c trên đĩa th¿ch cho vào áng nghiám có chća 20 ml môi tr°éng Miller Hinton ą 37 °C. Sau 24 gié, dung dách có vi khuẩn phát triển s¿ đ°āc pha loóng xuỏng nòng ồ tÂng Âng 108 CFU/ml (Theo tiờu chuẩn Mc Farland, đå đăc cąa dung dách vi khuẩn ở bỗc súng 625 nm trong khong 0,08-0,1 ng vỗi nòng ồ 108 CFU/ml).

Bỗc 2: Thc nghiỏm:

- Tri dung dách vi khuẩn lên bề mặt đĩa th¿ch: 150 µl dung dách vi khuẩn (108

CFU/ml) trÁi lên đĩa th¿ch Mueller Hinton .Để khô các mặt cąa đĩa th¿ch trỗc khi t mu giy lóc thm ở cỏc nòng đå (1%, 3%, 5%, và 7%).

- Đặt các m¿u đ°āc chuẩn bá sẵn lên đĩa th¿ch (3 m¿u đ°āc đặt lên 1 đĩa th¿ch) và ą 37 °C trong vũng 24 giộ.

Bỗc 3: Thu v phõn tớch d liáu:

- Sau 24 gié, các đĩa th¿ch đ°āc lÃy ra khòi t v tin hnh o kớch thỗc vũng khỏng khun (dựng thỗc o t mt sau ca đĩa và không đ°āc më nÃp) cąa các chąng

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

vi khuẩn.

- Chăp l¿i các hình bằng máy Canon EOS75.

- Ành vòng kháng khuẩn s¿ đ°āc xÿ lý bằng phần mềm ImageJ để phân tích v tớnh toỏn kớch thỗc vũng khỏng khun.

Bỗc 4: Lặp l¿i thí nghiám và tháng kê dā liáu, các thí nghiám đ°āc lặp l¿i 3 lần.

2.2.1. Quy trình chế tạo màng

Hknh 2. Mơ tÁ quy trknh chế t¿o màng ba lớp PAC.

BÁng 1. Mô tÁ thành phần và giÁi thích kí hiệu sử dụng trong quỏ trknh ch to.

Mng PCL cha PCL-Ag- 0,02%

Lỗp mng chò cú

Mng 2 lỗp vỗi lỗp trờn l PA, lỗp dỗi l PCL-POX

Mng 3 lỗp vỗi 2 lỗp mng PA-PAP, sau ú c ph lỗp PVP-COS b mt

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Mng 3 lỗp PAC ph COS kho

Mng PA v PP đ°āc chÁ t¿o bằng ph°¢ng pháp phun kéo sāi đián trộng, cỏc bỗc chun bỏ nh sau c mụ t ë Hình 3: 45 mL dung dách AgNPs-PCL đ°āc phun đßng théi bằng ba áng tiêm nằm ngang ë đián áp 15 kV và tác đå dòng 2,5 mL/h vào xi lanh quay ë khoÁng cách 10 cm. Các thông sỏ quay iỏn tỏi u ó c xỏc ỏnh trỗc để đáp ćng tiêu chí sāi đßng nhÃt, khơng h¿t và hiáu suÃt thu gom cao nhÃt. Sau đó, 45 mL dung dách PCL-POX tiÁp tăc đ°āc sÿ dăng cho lỗp mng th 2 ở cựng iu kiỏn ch to.

2.2.2. Chuẩn bị màng PCL-Ag (PA)

Chuẩn bá dung dách Ag 10% (w/v): đ°āc pha từ muái b¿c nitrate trong dung mụi dimethyl sulfoxide (DMSO) theo cỏc bỗc nh sau:

+ Bỗc 1: Hũa tan 1g muỏi AgNO3 hon ton trong 10 ml dung dỏch DMSO.

+ Bỗc 2: Khuy từ hãn hāp ë nhiát đå 40 °C trong 2 tiÁng để thu đ°āc dung dách đßng nhÃt trong suát.

+ Bỗc 3: Dung dỏch c y cht v bãc kín bằng giÃy thiÁc để tránh sự bay h¢i cąa dung môi cũng nh° tác đång cąa ánh sáng.

Chun bỏ dung dỏch PCL-Ag-gamma () 0,02% (w/v):

Bỗc 1: 2 L dung dách 12% PCL đ°āc chuẩn bá bằng cách hịa tan hồn tồn 240 g PCL trong 2 L dung môi acetone (AC) và khuÃy từ ë nhiát đå 50 °C đÁn khi tan hoàn toàn. Dung dách 12% PCL-AC s¿ đ°āc chia ra 2 phần bằng nhau v th tớch (1000 ml). Bỗc 2: Cỏc th tớch dung dách Ag 10% (w/w) s¿ đ°āc thêm vào từng phn dung dỏch 12%PCL-AC thu c nòng ồ tÂng ćng (BÁng 2).

BÁng 2. Thông số chuẩn bị và liều chiếu x¿ các dung dịch.

Thể tích dung dách Ag 10%

(ml)

Thể tích dung dách 12%PCL-AC

(ml)

Liều chiu x (kGy) PCL-Ag- 0,02%

+ Bỗc 3: Dung dỏch PCL-Ag-γ 0,02% (w/w) (PA) đ°āc bÁo quÁn trong các lã thąy tinh đÁy chặt và bãc trong màng nhôm để tránh sự bay h¢i cąa dung mơi cũng nh° tránh bá ánh sáng khÿ các ion b¿c.

Dung dách PCL-POX (PP) thu đ°āc bằng cách hòa tan båt polixamer 407 (POX)

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

trong dung dách PCL 12% (w/v) (ë tỷ lá POX: PCL là 1:12 (w/w)). Tip theo, 15 mL PCL-POX c quay iỏn to lỗp 2 trờn mng PCL-Ag 0,02% (w/w) vỗi cỏc thụng sỏ t°¢ng tự.

2.2.4. Pha chế dung dịch COS-PVP

Dung dách đ°āc chuẩn bá theo ph°¢ng pháp đã đ°āc mơ tÁ. Đầu tiên, båt COS 5% c ngõm hon ton nỗc ct. Dung dỏch chća 6% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP) thu đ°āc bằng cách hòa tan 36 g PVP trong 600 ml trong dung dách COS ë nhiát đå phòng trong 30 phút. PVP đ°āc thêm vào dung dách đ°āc để tng tính thÃm cąa trên bề mặt màng.

Đầu tiên, màng PAP đ°āc chuẩn bỏ ở dng ming vuụng cú kớch thỗc 10 x 10 cm2. Sau đó, dung dách COS-PVP đ°āc trÁi đều trờn khay ng dung dỏch kớch thỗc 1,2 x 1,2 m2. Cùng lúc 12 màng PAP đ°āc nhúng vào và khÁo sát ë các khoÁng théi gian khác nhau (6 tiÁng, 12 tiÁng, 18 tiÁng và 24 tiÁng). Sau đó, màng đ°āc đặt vào tą sÃy ë 50 °C cho n khi mng khụ hon ton trỗc khi thờm mồt lỗp dung dỏch ph khỏc. Quỏ trỡnh nhỳng mng vo đ°āc lặp l¿i liên tăc cho đÁn khi dung dách phą đều bề mặt. Sá l°āng nhúng s¿ đ°āc khÁo sát bằng ph°¢ng pháp chăp kính hiển vi đián tÿ quét (SEM). Cuái cùng, màng đ°āc khÿ trùng bằng ethylene oxide (EO) và đ°āc bÁo quÁn trong túi kín tái màu ë nhiát đå phịng cho các thí nghiám sau này.

2.3.1. Khảo sát và đánh giá hình thái bề mặt sản phẩm màng bằng thiết bị SEM

Các màng PA, PAP và PAG (1 x 1 cm2) đ°āc phą vàng (JEOL Smart Coater, NhÁt BÁn) trong 60 giây trỗc khi quan sỏt hỡnh thỏi b mt. Sau ú, mỏy SEM (JSM-IT100, JEOL, Japan) vỗi iỏn ỏp gia tỏc 10 kV đ°āc sÿ dăng để đánh giá bề mặt ca mng. ộng kớnh si v kớch thỗc ló ca màng đ°āc phân tích bằng phần mềm ImageJ (NIH, Hoa Kỳ). TEM đ°āc áp dăng để chăp Ánh AgNPs đ°āc tớch hp vỗi si PCL v ộng kớnh ca AgNPs đ°āc tính bằng ImageJ.

2.3.2. Đánh giá tính chất hóa học của màng PAC

CÃu trúc hóa hãc cąa màng đ°āc thể hián qua phá hßng ngo¿i biÁn đái Fourier IR, Spectrum GX, PerkinElmer Inc., Hoa Kỳ) sá sóng 4000 – 400 cm-1.

(FT-Các màng đ°āc kiểm tra sự hián dián cąa pha tinh thể Ag trên màng bằng phÂng phỏp nhiòu x tia X (XRD, D8 Advance, Brucker) ở bc x Cu K, bỗc nhy 0,02 ồ, thội gian 0,5 giây t¿i Trung tâm Nghiên cću VÁt liáu CÃu trúc Nano và Phân tÿ.

Biểu đß phân bá kớch thỗc c v t d liỏu ly c đánh giá tính đßng nhÃt cąa AgNPs táng hāp. EDS đ°āc sÿ dăng để đo tỷ lá nguyên tá Ag trên bề mặt màng. Ph°¢ng pháp đo phá hÃp thă phân tÿ UV-Vis đ°āc áp dăng để đánh giá s¢ bå sự t¿o thành cąa nano Ag cũng nh° sự òng u v phÂng diỏn kớch thỗc ca chỳng.

2.3.3. Khảo sát và đánh giá tính kỵ và ưa nước của màng PAC

KhoÁng 10 µL nỗc ct c nhò lờn bề mặt màng PA, PAP và PAC5-3 bằng micropipette. Sự thay đái hình dng giót nỗc trong thội gian th nghiỏm c ghi l¿i bëi bå góc tiÁp xúc bao gßm máy Ánh DSLR (Canon) và há tháng bá đÿ. Góc tiÁp xúc cąa hình Ánh đ°āc ghi l¿i đ°āc phân tích bằng phần mềm ImageJ (NIH, Hoa Kỳ).

2.3.4. Khảo sát và đánh giá tính chất cơ lý của màng PAC

M¿u màng PA và PAP và PAC5-3 đ°āc cÃt thành cỏc hỡnh ch nht vỗi kớch thỗc 3 cm x 1 cm. Sÿ dăng SEM đo đå dày cąa các màng. Các m¿u sau đó đ°āc mang đi đo đå bền kéo đćt, đå biÁn d¿ng đćt và lÁp giÁn đß ćng suÃt kéo giãn (TA.XTplus, Stable Micro System, UK). Thí nghiám đ°āc lặp l¿i 5 lần cho mãi m¿u.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

2.3.5. Khảo sát và đánh giá khả năng hấp thụ nước và thoát hơi nước (MVTR) của màng PAC

Thÿ nghiám đ°āc thực hián thą công dựa trên tiêu chuẩn thÿ nghiám BS EN 13726– 1:2002[24].

Kh nng hp th nỗc ca mng c tin hnh theo chun BS EN 13726-1:2002. + Bỗc 1: Chuẩn bá dung dách thÿ: Dung dách thÿ chća 142 mmol ion Na v 2,5 mmol ion Ca dỗi dng muái clorua. Dung dách này có thành phần ion giáng vỗi dỏch cÂ th ngội hoc dỏch t vt thÂng. Că thể, hòa tan 8,298 g muái NaCl và 0,368 g muỏi CaCl2.2H2O vo 1 lớt nỗc.

+ Bỗc 2: t cỏc mng PA, PAP v PAC5-3 kớch thỗc 5 cm x 5 cm trong a Petri. + Bỗc 3: Cho mồt lng nỗc m 37o C tÂng ng 40 ln khỏi lng mu vo a Petri. + Bỗc 4: Đặt đĩa petri vào tą ą Ãm ë 37 oC v gi trong 30 phỳt.

+ Bỗc 5: Dựng nhớp kẹp chặt 1 góc màng và lÃc m¿nh ngÁp trong dung dách trong 30 giây rßi cân khái l°āng cąa mng.

+ Bỗc 6: Kt qu tớnh toỏn da vo khỏi lng nỗc hp th trờn 100 cm2 hoc khỏi lng ca mng. Lp li thớ nghiỏm vỗi sỏ lng màng táng cång là 10 lần cho 1 m¿u. KhÁ nng hp th nỗc ca cỏc mu c tớnh theo phÂng trỡnh sau:

+ Bỗc 2: Cõn khỏi lng hỏ o gòm bỡnh cha, mng v nỗc (W1, g) + Bỗc 3: t hỏ o vo t m 37 oC

+ Bỗc 4: Sau 18 n 24 giộ (T), cân l¿i khái l°āng cąa há đo (W2, g) + Bỗc 5: Tỏc ồ thoỏt hÂi nỗc qua mng c tính theo cơng thćc sau:

MVTR= (W1 - W2) x 1000 x 24/T (g/m2/24 giộ)

+ Bỗc 6: Lp li thớ nghiỏm vỗi sỏ lng mng tỏng cồng l 5 lần cho 1 m¿u.

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

2.1.1. Khảo sát và đánh giá tốc độ phóng thích nano Ag của màng theo thời gian

Các m¿u hình vng 1x1 cm2 cąa màng PA, PAP và PAC5-3 đ°āc chuẩn bá và đặt lên bề mặt dung dách PBS (20 mL, pH = 5,5), vỗi lỗp nn PA hỗng lờn trờn. Sau đó, các lã chća m¿u đ°āc ą ë 37 °C. Các phần dách chiÁt đ°āc lÃy sau 1, 3, 6, 12 và 24 gié trong khi måt l°āng dung dỏch ỏm mỗi tÂng Âng c thờm vo hỏ thỏng để duy trì thể tích khơng đái. Nßng đå b¿c trong các m¿u chÃt lßng đ°āc phân tích bằng ICP-MS, NexION 2000, Perkin Elmer, USA.

2.1.2. Khảo sát và đánh giá tốc độ phóng thích của COS

Thí nghiám nßng đå phóng thích đ°āc tiÁn hành bằng cách ngâm màng PAC5-3 (6 × 6 cm2) trong 20 mL dung dách muái đám photphat (PBS) 0,1 M pH = 5,5 ą ë 37 °C. T¿i các théi điểm nhÃt đánh, môi tr°éng đ°āc rút ra và đo đå hÃp thă hunh quang ở bỗc súng kớch thớch 420 nm v bỗc súng phỏt x 460 nm bng cỏch s dng u óc vi bn (Varioskan, ThermoScientific, USA) vỗi PBS lm m¿u đái chiÁu. Nßng đå phóng thích cąa COS đã đ°āc tính tốn và thể hián bằng đß thá.

2.1.3. Khảo sát và đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng PAC

Ph°¢ng pháp AATCC 100 (Antimicrobial Fabric Test) [25]: là ph°¢ng pháp xét nghiám kháng khuẩn đánh l°āng đ°āc sÿ dăng để phát hián ho¿t tính ćc chÁ vi khuẩn trên vÁt liáu màng.

Các bỗc thc nghiỏm nh sau: - Bỗc 1: Chun bỏ

Chuẩn bá m¿u: M¿u đái chćng (màng PCL) và m¿u cần kiểm tra (màng PA) đ°āc cÃt thành các hình trịn có đ°éng kính 4,8 cm.

Chuẩn bá vi khuẩn:

Dịng vi khuẩn trā đơng gßm S. aureus đ°āc đ°a vào tą ą 37 °C khoÁng 2 phút, sau

đó cho vào 20 mL dung dách Mueller Hinton, ą ë 37 °C trong vịng 24 gié, sau đó 150 µL huyền phù vi khuẩn cÃy lên đĩa th¿ch và ą 37 °C trong vòng 24 gié để cho vi khuẩn mãc thành từng căm khuẩn l¿c, que cÃy lÃy 1 khuẩn l¿c trên đĩa th¿ch cho vào 20 mL môi tr°éng lßng, ą 37 °C. Sau 24 gié, dung dách có vi khuẩn phát triển s¿ đ°āc pha lỗng xng nòng ồ tÂng Âng 108 CFU/ml.

- Bỗc 2: Thc nghiám

Vi khuẩn đ°āc pha loãng xuáng mÁt đå 105 CFU/ml và đem ą trong tą 37 °C trong 2 giộ trỗc khi thớ nghiỏm, 1 mL dung dỏch vi khuẩn đ°āc thêm vào 2 bình tam giác có chća m¿u PA và 1 bình tam giác có chća m¿u đái chćng PCL. Sau đó đ°āc chuyển sang mơi tr°éng nuôi cÃy vi khuẩn vô trùng, ą trong máy lÃc ë nhiát đå phòng trong 24 gié. Sau khi ą, lÃy 100 µL dung dách m¿u trÁi trên agar, ą 37 oC trong vòng 24 gié, đÁm sá l°āng khuẩn l¿c trong đĩa nuôi cÃy từ dách chiÁt chća m¿u ỏi chng PCL (A) v mu PA (B).

- Bỗc 3: Thu và phân tích dā liáu

R% =A − B A ý 100 Trong đó:

R%: Hiáu suÃt kháng khuẩn cąa màng

A: Sá khuẩn l¿c trong đĩa nuôi cÃy từ dách chiÁt từ m¿u control (PCL) B: Sá khuẩn l¿c trong đĩa nuôi cÃy từ dách chiÁt từ m¿u PA

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Các thí nghiám lÁp l¿i 3 lần, dā liáu đ°āc đ°āc trình bày d¿ng hình Ánh và hiáu suÃt kháng khuẩn.

KhÁ nng kháng khuẩn cąa PAC5 đ°āc chÁ t¿o đã đ°āc đánh giá bằng cách sÿ dăng thÿ nghiám ćc chÁ vùng vÁi kháng khuẩn (AATCC 147) kiểm tra trên chąng S. aureus

[26].

Trỗc cỏc thớ nghiỏm, cm khun ca từng chąng đ°āc lÃy từ đĩa th¿ch gác, đặt vào áng 5 mL MHB và nuôi cÃy ë 37 °C trong 24 gié. Sau đó, huyền phù vi khuẩn cąa từng chąng đ°āc chuẩn bá bằng kỹ thuÁt pha loãng t mt ồ quang ở bỗc súng 620 nm OD620 = 0,08-0,1 (bằng 0,5 chuẩn McFarland, xÃp xß 1-2x108 CFU/mL).

Đå nh¿y cąa vi sinh vÁt cąa từng m¿u đái vỗi chng vi khun c th ó c nghiờn cu tách biát trên đĩa petri Mueller-Hinton agar (MHA). Tóm l¿i, 150 µL huyền phù vi khuẩn đã pha lỗng đ°āc đ°a vào và trÁi đều trên bề mặt MHA. Sau đó, các màng hình vng 1x1 cm2 cąa mãi m¿u đ°āc đặt trên đĩa MHA và ą trong 24 gié. Vùng ćc chÁ vi khuẩn xung quanh các m¿u đ°āc đo.

2.1.4. Khảo sát và đánh giá độc tính tế bào của màng

Đåc tính gây đåc tÁ bào cąa dách chiÁt từ màng PA, PAP và PAC đ°āc đánh giá trên các tÁ bào L929 bằng xét nghiám Resazurin tuõn th cỏc hỗng dn ca ISO 10993[27]. u tiờn, cỏc t bo c nuụi vỗi mt ồ 1x105 tÁ bào/mL và nuôi cÃy trong 24 gié. TiÁp theo, các dách chiÁt đ°āc chuẩn bá bằng cách ngâm các mu cú kớch thỗc 6 cm2

trờn 1 mL mụi tr°éng và ą trong 24 gié ë 37 °C. ChiÁt xt 100% và đå pha lỗng 50% cąa nó đ°āc thêm vào các giÁng nhân tÁ bào và nuôi cÃy trong 24 gié. Sau đó, các dung dách chiÁt đ°āc lo¿i bß và mơi tr°éng ni cÃy có Resazurin (0,02 mg/mL) đ°āc thêm vào từng giÁng và ą thêm 4 gié. Sự phát huỳnh quang cąa các dung dách đ°āc kớch thớch ở bỗc súng 530 nm v tớn hiỏu phỏt ra c o ở bỗc súng 590 nm bng đầu đãc vi bÁn (VarioskanTM, Thermo Scientific, USA). Tín hiáu cąa các tÁ bào ch°a đ°āc xÿ lý đ°āc nuôi cÃy trong môi tr°éng nuôi cÃy 100% đ°āc coi là khÁ nng sáng 100%.

2.2.1. Theo dõi và đánh giá tác dụng điều trị của màng PAC quy mơ phịng thí nghiệm

Mơ hình bßng trên thß đ°āc thực hián dựa theo các tài liáu tham khÁo sau [28]. - Dung dách vi khuẩn đ°āc chuẩn bá bằng cách cÃy vi khuẩn vào dung dách Mueller Hinton và nuôi trong tą ą ë 37 oC. MÁt đå vi khuẩn trong dung dách đ°āc xác đánh bằng ph°¢ng pháp o mt ồ quang hóc (OD) ở bỗc súng 620 nm. Sau đó dung dách s¿ đ°āc pha lỗng nhiều lần, mÁt đå vi khuẩn trong dung dách đ¿t khoÁng 108 CFU/mL. Dòng vi khuẩn đ°āc sÿ dăng để đánh giá là Staphylococcus aureus (khuẩn tă cầu vàng).

- Quy trình t¿o bßng đ°āc tiÁn hành nh° đã mơ tÁ. Sau khi hồn thành cơng viác t¿o bßng, 100 μL dung dách vi khuẩn s¿ đ°āc cho vào vÁt th°¢ng. Sau đó các vÁt th°¢ng s¿ đ°āc bng l¿i bằng g¿c th°éng. Thß s¿ đ°āc quan sát các dÃu hiáu bên ngồi:

Dißn biÁn tồn thân: Tình tr¿ng n ng, phõn v nỗc tiu, tróng lng v tỡnh trng nhiòm đåc, nhißm khuẩn, sát.

Dißn biÁn t¿i chã: Hình Ánh, kớch thỗc v nhng thay ỏi ca vt thÂng c chăp bằng máy Ánh mãi 0, 7, 15, 21, 30 ngày cho đÁn khi lÃy m¿u.

Tình tr¿ng dách xuÃt tit, dỏch m vt thÂng. - Theo dừi thò trong 28 ngày

2.2.2. Đánh giá khả năng h̀ trợ lành thương màng PAC

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

- Sau 28 ngày, m¿u da t¿i vùng vÁt th°¢ng đ°āc thu ho¿ch để tiÁn hành đánh giá khÁ nng bÁo vá chỏng nhiòm khun v cha lnh vt thÂng.

- Mụ sau khi thu ho¿ch đ°āc bÁo quÁn trong dung dách formaldehyde 10%. Sau đó mơ đ°āc đúc khái parafin và đ°āc cÃt thành từng lát mßng để nhuåm bằng H&E (Hematoxylin và Eosin), và MT (Masson Trichrome). Ph°¢ng pháp nhuåm giúp đánh giá mćc đå tái to mụ mỗi, quỏ trỡnh hỡnh thnh collagen, s nhiòm trựng (nu cú).

D liỏu c biu thỏ dỗi dng trung bình ± đå lách chuẩn (SD). Phân tích tháng kê dā liáu thu đ°āc đ°āc thực hián bằng phân tích ANOVA. Khi p <0,05, kÁt quÁ đ°āc coi là có ý nghĩa tháng kê. TÃt cÁ các thÿ nghiám đ°āc lặp l¿i ba lần .

CHƯƠNG 3: KẾT QU¾ VÀ TH¾O LUẬN

3.1.1.Độ đề acetyl (DA) của oligomer chitosan

Để đánh giá chính xác tính chÃt cąa oligomer chitosan, đå đề acetyl là måt trong nhāng tính chÃt đầu tiên cần đánh giá. Mćc đå đề acetyl Ánh h°ëng đÁn các tính chÃt vÁt lý, sinh hãc và hóa hãc cąa COS táng hāp đ°āc. Mćc đå đề acetyl xác đánh các nhóm amino tự do tiÁp xúc do lo¿i bß các nhóm acetyl khßi chi phân tÿ chitin [29].

Phá 1H-NMR cąa các m¿u đ°āc thể hián trong Hình 3 và các giá trá DA tính tốn c liỏt kờ trong cụng thc bờn dỗi. Tớn hiỏu cąa proton H-1³ cąa các đ¢n vá GlcNAc khơng rõ ràng do các đān vá này có DA thÃp, Sự xt hián tín hiáu cąa proton H-1³ cąa các đ¢n vá GlcNAc (Ac) ë khoÁng 5,13 ppm.. Tuy nhiên, måt sá khác biát đã đ°āc quan sát thÃy. Tín hiáu cąa proton H-1³ cąa đ¢n vá GlcN(D), proton H-1 cąa các gác bên trong và proton H-2 cąa đ¢n vá GlcN (D) đã đ°āc chuyển sang tr°éng cao.

Do đó, kÁt luÁn rằng sự dách chuyển tr°éng cao cąa các tín hiáu này trong phá có liên quan đÁn sự gia tng DA có thể do sự tách H khòi cỏc nhúm amino ca Ân vỏ GlcN, dn n sự khÿ amine.

Hknh 3. Kết quÁ H-NMR của COS.

Cơng thćc tính đå deacetyl hóa cąa COS:

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

�㔷�㔷(%) = (1 213 �㔴2

16 �㔴1

) �㕋100 = 89%

Mćc đå đề acetyl 70–85% là mćc đå đề acetyl trung bình cąa chitosan, có thể hịa tan måt phần trong nỗc. Cuỏi cựng, 8595% l mc ồ acetyl cao cąa chitosan, có khÁ nng hịa tan tát trong nỗc, v 95100% c gói l mc ồ acetyl cực cao cąa chitosan, rÃt khó đ¿t đ°āc [30]. Dựa trên kÁt quÁ thu đ°āc, nghiên cću chÁ t¿o thành cụng COS vỗi ồ acetyl (DA) t 89%, COS cú kh nng hũa tan tỏt trong nỗc.

Khỏi l°āng phân tÿ COS đ°āc xác đánh dựa vào đ°éng chuẩn PEO/PEG (Hình 4); đ°éng chuẩn PEO/PEG đ°āc dựng dựa trên 3 m¿u chuẩn (xanh, vàng, đß), đ°éng chuẩn đ°āc dựng dựa trên 12 điểm xây dựng da trờn 3 mu chun cú dng:

ỵ = 2887,48 + 6,77 × 0,19�㕥

Trong đó: y là khái l°āng phân tÿ (Da) đ°āc tính tốn dựa và théi gian l°u x (phút). Từ cơng thćc ta tính đ°āc khái l°āng phân tÿ cąa COS. Fernandes và đßng nghiáp bỏo cỏo rng vỗi khỏi lng phõn t <5 kDa cho thy kt qu khỏng khun tỏt hÂn so vỗi cú khỏi lng phõn t lỗn [18]. Kt qu ca Fernandes cho kt qu tÂng òng vỗi Kulikov v òng nghiỏp, kt qu ny cho thy vỗi khỏi lng phõn tÿ 2,89 kDa, nằm trong khoÁng khái l°āng phân tÿ cho kÁt quÁ kháng khuẩn tát.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Hknh 5. Kết quÁ khÁo sát nồng độ kháng khuẩn của COS bằng phương pháp đĩa th¿ch (A) và đường kính trung bknh của vịng kháng khuẩn (B) với 1-PCL, 2-COS 1%, 3-COS 3%, 4-COS 5%, 5-COS 7%, 6-Penicillin Streptomicycin.

Từ kÁt q khÁo sát ë Hình 5, ph°¢ng pháp khuch tán đĩa th¿ch, có thể thÃy nßng đå COS ë nßng đå 1% và 3% khơng đą khÁ nng t¿o vịng kháng. Đßng théi, ë nßng đå 7%, khÁ nng kháng cąa COS không cho thÃy sự khác biát gia khi so sỏnh ộng kớnh khỏng khun vỗi mu COS ë nßng đå 5%. Từ kÁt quÁ khÁo sát này, nßng đå COS 5% đ°āc chãn làm dung dách nhúng cho quá trình phą màng tiÁp theo.

3.2.1. Hình thái của màng

Màng PCL đ°āc sÿ dăng nh° màng đái chćng để khÁo sát bề mặt và ộng kớnh si so vỗi mng PCL-Ag 0,02% (PA), mng PCL-Ag-POX (POX) và 3 màng đ°āc phą COS ë 3 mác théi gian 12 gié, 18 gié v 24 giộ ng vỗi PCL-Ag-COS 5-1 (PAC5-1), PCL-Ag-COS 5-2 (PAC5-2) và PCL-Ag-COS 5-3 (PAC5-3);

Hình SEM (Hình 6) cho thÃy hình thái bề mặt cąa PCL(A), PA (B), PAP (C), 1 (D), PAC5-2 (E), PAC5-3 (F). TÃt cÁ các m¿u đều cho thÃy các sāi khơng có h¿t, mỏn v khụng thng hng vỗi ồ òng nht tÂng đái cao về đ°éng kính sāi. Hình B cho thÃy bëi vì nano b¿c đã đ°āc tích hāp vào sāi PCL, nờn ộng kớnh si nhò hÂn do ồ dn đián từ các h¿t nano b¿c nh°ng khơng có thay đái rõ ràng nào về cÃu trúc bề mặt màng so sỏnh vỗi mng PCL.

PAC5-ộng kớnh si ca PCL (Hỡnh 6-A) cú kớch thỗc t 3-10 àm, vỗi ộng kính trung bình là 5,38 ± 1,87 µm; Nhìn chung, kớch thỗc ộng kớnh si trung bỡnh gim dn khi nano b¿c (AgNPs) đ°āc tích hāp; viác tích hāp nano b¿c trong sāi PCL giúp tng mÁt đå đián tích cąa dung dách. Thêm vào đó, sự có mặt cąa AgNPs trong dung dách PCL làm xáo trån sự sÃp xÁp cąa chuãi polymer và do đó làm giÁm ồ nhỗt ca dung dỏch. T ú, dung dỏch PCL/AgNPs cú ồ nhỗt thp hÂn v ồ dn iỏn tỏt hÂn khi so sỏnh vỗi dung dỏch PCL[31] kt qu l ộng kớnh si nhò hÂn do s gión nở cąa tia polyme đián tng lên trong quá trình quay đián. Hián t°āng này đ°āc xem nh° là hián t°āng phá biÁn cąa dung dách polymer , khi mà dung dỏch cú ồ nhỗt thp v ồ dn iỏn cao s dn n ộng kớnh si nhò hÂn [32]. ờ lỗp th 2, b mt mng PCL-POX (PP) to thnh mng 2 lỗp PCL-Ag-POX (PAP) cho thy trung bỡnh ộng kớnh si lỗn hÂn so vỗi mng PA, tuy nhiờn viỏc kt hp POX tng ồ nhỗt ca dung dỏch [33].

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Hknh 6. Ành vi mô SEM Bề mặt của các nhóm màng (A) PCL; (B) PA; (C) PAP; (D) PAC5-1; (E) PAC5-2 và (F) PAC5-3.

Sāi PCL/poloxamer cho thÃy bề mặt sāi mán và cÃu trúc thÁm sāi đßng nhÃt khơng có khut tÁt, t°¢ng tự nh° các sāi từ nhóm kiểm soát PCL, viác kÁt hāp poloxamer vào sāi PCL đã d¿n đÁn viác giÁm đ°éng kính sāi trung bình, quỏ trỡnh kộo gión v lm mòng si tỏt hÂn [34].

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

T¿i théi điểm khÁo sát 24 gié, cho thÃy đå phą trên bề mặt trên 90% ë vá trí khÁo sát. KhÁo sát mái t°¢ng quan giāa đå phą bề mặt và đå dày cąa lỗp ph cho thy thội gian tỏi u cho quỏ trình phą là 24 gié. Đßng théi, viác phą COS lm tng kớch thỗc ộng kớnh si trung bỡnh. Sau quá trình khÁo sát, PAC5-3 đ°āc lựa chãn cho các nghiên cću tiÁp theo.

Hknh 7. Kết quÁ (1) so sánh đường kính sợi trung bknh và (2) độ phân bố đường kính

lớp phủ COS và (4) độ phủ bề mặt của COS ở 4 khoÁng thời gian 6 tiếng, 12 tiếng, 18 tiếng và 24 tiếng.

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

Hknh 8. Kết quÁ (A) độ dày màng PAC5-3 và (B) độ dày lớp phủ COS t¿i ba vị trí ngẫu nhiên. BÁng kết quÁ cho thấy độ dày trung bknh của màng PAC5-3 và lớp phủ COS.

KÁt quÁ khÁo sát và đo đå dày màng màng phần mềm Image J cho thÃy Hình 8, sau 12 gié ngâm màng thì bề mặt phą trên dián tích 50 µm x 50 µm t¿i 10 vá trí khÁo sát thÃy rằng đå phą đ¿t trên 50 %. Nhộ s kt hp cỏc polymer a nỗc l POX và PVP, giúp cho COS khơng chß phą trên bề mt mng m cũn thm vo lỗp th 2 PP, do ú lng COS lỗn khi gii phúng ra khßi màng đą thực hián khÁ nng kháng khuẩn. Hình cho thÃy l°āng COS thÃm vào màng đ¿t gần 40% b dy.

POX c s dng ở lỗp th 2 cąa màng. Khái polypropylene glycol thu hút bề mặt k nỗc ca mng PA (w/w) trong khi hai khỏi a nỗc ca polyetylen glycol liờn kt vỗi nhúm -OH hoc -NH. Kt qu l hai lỗp PA v COS c gi vỗi nhau bng lỗp PP trung gian. Ta thÃy rằng các sāi PP bao phą bề mặt PA. Sau quỏ trỡnh ph, cú 2 lỗp tỏch biỏt trong 1 tÃm màng. Khi quan sát hình cÃt ngang, khơng cú du hiỏu tỏch lỗp gia tng lỗp. òng thội cũng cho thÃy måt phần cąa dung dách COS đã c hp th sõu vo lỗp PP.

Hknh 9. Ành hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của màng PA và biểu đồ phân phối kích

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

thước đường kính AgNPs. (Thanh tỷ lệ: 200 nm, n = 50).

Ành vi mơ (Kính hiển vi đián t truyn qua) TEM cho thy xu hỗng v kớch thỗc ht Ag. Kớch thỗc trung bỡnh ca cỏc AgNPs là 26.8 ± 8.7 nm, từ biểu đß phân phái kớch thỗc ộng kớnh AgNPs t 5 nm n 55 nm. Từ tài liáu tham khÁo, Yaohua Dong và cång sự đã chćng minh AgNPs đ°éng kính 10 ± 5 nm có thể ćc chÁ hồn tồn vi khuẩn ở nòng ồ c ch tỏi thiu thp hÂn (1.0 g/ml), trong khi kớch thỗc ht khong 90 5 nm có thể ćc chÁ vi khuẩn ë nßng đå cao h¢n (11.5 μg/ml) [35].

3.2.2. Đánh giá tính chất hóa học của màng

Phân tích XRD đã đ°āc thực hián để xác minh cÃu trúc tinh thể nano cąa các h¿t nano b¿c. Hình 10 cho thÃy giÁn đß XRD cąa các m¿u PA cho thÃy ba đßnh ë các góc 2θ là 38,13 °, 44,26 °, 64,5 °. Các giá trá này cho thÃy cho các mặt phẳng t°¢ng ćng (111), (200), (220) t°¢ng ćng vỗi cỏc pha kt tinh ca nano bc [36].

KÁt quÁ này måt lần nāa khẳng đánh sự có mặt các h¿t nano b¿c trong màng PCL bằng kỹ thuÁt chiÁu x¿ gamma. Các nhißu nền trong các m¿u XRD phÁn ánh hành vi vơ đánh hình cąa ma trÁn PCL.

Hknh 11. Kết quÁ EDS khÁo sát sự có mặt của nguyên tố C, O và Ag trên bề mặt màng PA.

</div>

(Luận Văn Thạc Sĩ Hoá Hữu Cơ) Chế Tạo Và Nghiên Cứu Độ An Toàn Và Khả Năng Hỗ Trợ Lành Thương Của Tấm Màng Đa Lớp Pcl-Ag-Cos Trên Mô Hình Động Vật Định Hướng Ứng Dụng Trong Băng Gạc Vết Thương

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về