Nhân Giống In Vitro Và Khảo Sát Sự Hiện Diện Của Saponin Từ Chiết Xuất Rễ Cây Sâm Bố Chính Abelmoschus Sagittifolius (Kurz) Merr.pdf

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.94 MB, 50 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

NGHIÊM THANH DIỆP

NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ KHẢO SÁT SỰ

HIỆN DIỆN CỦA SAPONIN TỪ CHIẾT XUẤT

RỄ CÂY SÂM BỐ CHÍNH ABELMOSCHUS

SAGITTIFOLIUS (KURZ) MERR.

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

NGHIÊM THANH DIỆP

NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ KHẢO SÁT SỰ

HIỆN DIỆN CỦA SAPONIN TỪ CHIẾT XUẤT

RỄ CÂY SÂM BỐ CHÍNH ABELMOSCHUS

SAGITTIFOLIUS (KURZ) MERR.

Mã số sinh viên: 1953012006 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN TRẦN ĐÔNG PHƯƠNG

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Nghiêm Thanh Diệp

Ngày sinh: 14/02/2001 Nơi sinh: Cà Mau

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học y dược Mã học viên: 1953012006

Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

Nghiêm Thanh Diệp

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Ỹ KIẾN chophépbào VL KHÓA LUẬN TÓI NGHIỆP CỦA giám

;

vrôN HƯỞNG DÂN

Giáng viên huửng dỉn: IS Nguyen i rần Dóng Phương

Học viên Ihực hiện: Nghiêm Thanh Diệp Lóp: DH19YD01

lẽn dề lai: Nhâu giông in vitro vá kháo sát sự hiện diện cua saponin lừ chiết xuat re cây Sâm bó chinh Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Mcrr

Y kién cùa giáo viên hưởng dun V* việc cho phép vinh viên dược bân vệ khóa luận trước Hội đồng:

Thành pho ỉ lồ Chi Minh, ngày ^ r tháng '^ nám j£0cf '■

Người nhận xét

Nguyễn Trần lí ơng Phương

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Lời cảm ơn

Để hoàn thành bài nghiên cứu khoa học này, xin kính gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được làm nghiên cứu ở khoa, được học tập và rèn luyện ở môi trường tốt nhất.

Đặc biệt, bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến cô TS. Nguyễn Trần Đông Phương, đã dành thời gian q báu và cơng sức của mình để tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành bài báo cáo. Đồng thời, cũng xin cảm ơn đến các anh, các bạn và các em phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào đã nhiệt tình giúp đỡ trong những khó khăn khi thực hiện đề tài.

Con xin cảm ơn Ơng, Bà, Bố, Mẹ và các em ln ủng hộ và là chỗ dựa vững chắc nhất trong suốt bốn năm đại học, để con yên tâm thực hiện ước mơ của mình.

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển ... 4

2.1.6 Thành phần hóa học và giá trị về y dược ... 4

2.2 Giới thiệu về Saponin ... 6

2.3 Giới thiệu về TDZ và than hoạt tính ... 7

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 9

3.1 Vật liệu ... 9

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu ... 9

3.1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện ... 9

3.1.3 Thiết bị dụng cụ ... 9

3.1.4 Hóa chất ... 9

3.1.5 Mơi trường ni cấy ... 10

3.1.6 Điều kiện nuôi cấy ... 10

3.2 Phương pháp nghiên cứu ... 10

3.2.1 Phương pháp thu thập, tổng hợp tài liệu ... 10

3.2.2 Phương pháp thống kê... 10

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

3.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát tác động của TDZ đến khả năng ra chồi của đoạn

thân cây Sâm bố chính. ... 10

3.2.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát tác động của TDZ đến khả năng ra chồi của lá cây Sâm bố chính. ... 11

3.2.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát tác động của than hoạt tính đến khả năng ra rễ của đoạn thân Sâm bố chính. ... 12

3.2.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát tác động của than hoạt tính đến khả năng ra rễ của lá cây Sâm bố chính. ... 12

3.2.7 Định tính saponin từ chiết xuất rễ. ... 13

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 15

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tác động của TDZ đến khả năng ra chồi của đoạn thân cây Sâm bố chính. ... 15

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tác động của TDZ đến khả năng ra chồi của lá cây Sâm bố chính. ... 17

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tác động của than hoạt tính đến khả năng ra rễ của đoạn thân cây Sâm bố chính... 18

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát tác động của than hoạt tính đến khả năng ra rễ của lá cây Sâm bố chính. ... 20

4.5 Thử nghiệm saponin trong chiết xuất rễ Sâm bố chính ... 22

4.5.1 Thử nghiệm dựa trên tính chất tạo bọt ... 22

4.5.2 Thử nghiệm saponin bằng thuốc thử ... 24

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Cây Sâm bố chính Abelmoschus sagittifolius ... 2

Hình 2.2 Cấu trúc cơ bản của saponin: (a) sapogenin triterpenoid, (b) sapogenin steroid ... 7

Hình 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến sự tạo chồi Sâm bố chính từ đoạn thân sau 30 ngày ni cấy ... 16

Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến sự tạo chồi Sâm bố chính từ lá sau 30 ngày ni cấy ... 18

Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến sự tạo rễ Sâm bố chính từ đoạn thân sau 30 ngày ni cấy ... 19

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến sự tạo rễ Sâm bố chính từ lá sau 30 ngày ni cấy ... 22

Hình 4.5 Cột bọt sau 15 phút (A) và 30 phút (B) ... 23

Hình 4.6 Nhũ tương... 23

Hình 4.7 Hai lớp phân cách ở phản ứng Liebermann-Burchard. ... 24

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo chồi cây Sâm bố chính ... 13 Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến khả năng tạo rễ cây Sâm bố chính ... 13 Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ TDZ đến chồi Sâm bố chính sau 30 ngày ni cấy từ đoạn thân ... 15 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến rễ Sâm bố chính sau 30 ngày nuôi cấy từ đoạn thân ... 18 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến rễ Sâm bố chính sau 30 ngày ni cấy từ đoạn thân ... 20 Bảng 4.4 Độ bền của lớp bọt ... 22 Bảng 4.5 Định tính saponin bằng phản ứng hóa học ... 24

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Sâm bố chính cịn gọi là nhân sâm Phú n, là lồi cây thân thảo có tên khoa học

Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr. thuộc họ Bông (Malvaceae) phân bố nhiều

nơi trên thế giới. Ở các nước châu Á, loài cây này thường được sử dụng để làm thuốc. Ví dụ như ở Trung Quốc, người ta sử dụng rễ và lá để chữa ho lao, táo bón, suy nhược thần kinh, sưng đau của mụn nhọt, chóng mặt, đau bụng và đau dạ dày. Ở Việt Nam, Sâm bố chính cũng có lịch sử sử dụng làm thuốc lâu đời. Trước đây, Hải Thượng Lãn Ơng dùng rễ Sâm bố chính phối hợp với các thuốc khác để chữa bệnh ho, sốt nóng, gầy mịn. Theo y học cổ truyền, Sâm bố chính dùng để bồi bổ khí huyết, suy nhược cơ thể, kém ăn, kém ngủ, suy nhược thần kinh. Nghiên cứu của Phan Văn Đệ và Trần Công Luận (2001) cho thấy Sâm bố chính có thành phần hóa học chính là saponin triterpen, chất nhầy, coumarin, flavonoid, đường khử, acid amin và acid hữu cơ. Nguyễn Thị Thu Hương và cs (2005), nghiên cứu dược lý chỉ ra rằng saponin triterpen trong củ Sâm bố chính là nhóm hợp chất có tác dụng quyết định dược tính điển hình của lồi cây này. Nhiều nghiên cứu cho thấy saponin là nhóm hợp chất tiềm năng cho việc sản xuất thuốc có nguồn gốc tự nhiên vì chúng có tác dụng trong kháng ung thư, có thể hỗ trợ chống lại bệnh thối hóa thần kinh và bệnh tim mạch (Zhong et al., 2022).

Hiện nay sự khai thác quá mức do nhu cầu sử dụng và lợi ích kinh tế của Sâm bố chính tăng lên, đồng thời môi trường sống tự nhiên bị thu hẹp và tỷ lệ nảy mầm thấp dẫn đến số lượng Sâm bố chính trong tự nhiên đang suy giảm. Vì vậy, cần tạo ra một số lượng lớn nguồn giống để phục vụ cho việc gieo trồng với quy mơ lớn. Từ

đó, đề tài “Nhân giống in vitro và khảo sát sự hiện diện của saponin từ chiết xuất rễ

cây Sâm bố chính Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr.” được thực hiện nhằm khảo sát các điều kiện môi trường nuôi cấy tốt nhất cho việc vi nhân giống cây Sâm bố chính từ các loại mẫu cấy khác nhau như đoạn thân và lá in vitro. Bên cạnh đó, các thí nghiệm sinh hóa cũng được tiến hành nhằm định tính sự hiện diện của saponin trong dịch chiết rễ Sâm bố chính in vitro.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

2.1 Đặc điểm sinh học

2.1.1 Họ Bông (Malvaceae)

Họ Bơng có danh pháp khoa học là Malvaceae, trên thế giới có 111 chi và có khoảng 1800 lồi, phân bố từ vùng nhiệt đới đến vùng ôn đới trên khắp thế giới. Ở Việt Nam có 17 chi, với 60 loài, 1 phân loài và 6 thứ, phân bố trong cả nước. Chủ yếu bao gồm Đậu bắp (Abelmoschus esculentus), Vông vang (Abelmoschus

moschatus), Sâm bố chính (Abelmoschus sagittifolius), Dâm bụt (Hibiscus

syriacus), Ké hoa đào (Urena lobata), Thục quỳ (Alcea rosea), Bông vải

(Gossypium arboreum). Họ Bông là một họ có ý nghĩa quan trọng về mặt kinh tế và khoa học với các loài cây cung cấp sợi tự nhiên, làm thực phẩm, làm cảnh, cung cấp gỗ và làm thuốc. Trong đó, Bơng vải là lồi cây quan trọng nhất trong họ với sản lượng sản xuất hơn 20 triệu tấn và sản lượng tiêu thụ cũng đạt hơn 20 triệu tấn hằng năm. Quả cây Đậu bắp và hạt cây Ca cao được sử dụng là thực phẩm. Một số lồi có hoa đẹp được trồng làm cảnh như Phù dung, Dâm bụt. Ngoài ra, Cối xay và Sâm bố chính có tác dụng chữa bệnh được sử dụng trong các thuốc Đơng y.

2.1.2 Vị trí phân loại và phân bố

Sâm bố chính Abelmoschus sagittifolius

Giới: Plantae

Ngành: Streptophyta

Lớp: Magnoliopsida Bộ: Malvales

Họ: Malvaceae Chi: Abelmoschus

Loài: Abelmoschus sagittifolius

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Trên thế giới, cây Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr. phân bố ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới từ Châu Á đến Châu Đại Dương gồm Campuchia, Trung Nam Trung Quốc, Đông Nam Trung Quốc, đảo Hải Nam, Ấn Độ, Jawa, Lào, Malaya, Mianmar, New Guinea, Philippines, Queensland, Thái Lan, Việt Nam và Đông Bắc Châu Đại Dương. Mọc ở những khu vực có độ cao khoảng 450 m so với mặt nước biển.

Ở Việt Nam, Sâm bố chính thường mọc hoang dại ở vùng núi các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh và một vài địa phương thuộc Quảng Bình, Hịa Bình và Tây Bắc. Ngày nay, Sâm bố chính đã được trồng nhiều nơi trên đất nước ta.

2.1.3 Nguồn gốc

Từ xa xưa, Sâm bố chính đã xuất hiện thơng qua các sử sách như sách Phủ biên tạp lục của Lê Quý Đôn, Đại Nam nhất thống chí, Đại Nam dư địa chí ước biên và Thanh Chương huyện chí. Đặc biệt, trong sách Đại Nam dư địa chí ước

biên viết: Sâm Thổ Hào hàng năm được cung tiến vua cùng với các loại sản vật khác (Nguyễn Thị Minh Tú và cs, 2022).

2.1.4 Đặc điểm hình thái

+ Thân

Cây thân thảo, sống lâu năm, mọc đứng một cách yếu ớt, có khi dựa vào những cây xung quanh, cao chừng 1 m (Đỗ Tất Lợi, 2004). Thân cành có thể mọc đứng, cũng có khi bị lan tỏa ra mặt đất, cành hình trụ, khơng có lông. Số lượng cành cấp 1, cấp 2 nhiều.

+ Hoa

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Hoa màu đỏ hoặc hồng mọc đơn độc ở kẽ lá, cuống hoa dài từ 5 - 8 cm, có lơng cứng. Đài phụ có từ 7 - 10 bản, dài 12 - 14 mm, có nhiều lơng, ở ngọn có vài răng nhỏ. Đài chính có 5 bản dính nhau bị khứa rách, cao 15 - 20 mm. Tràng hoa 5 cánh hình nêm, đều, xếp rời, kích thước 5 - 6 cm, rộng 3 - 4 cm. Bộ nhị có các chỉ nhị dính với nhau hồn tồn tạo thành bó có hình trụ, dài 13 - 15 mm. Bộ nhụy có 5 lá nỗn dính với nhau tạo thành bầu trên, dài 18 - 20 mm, có 1 vịi nhụy và 5 đầu nhụy. Bầu 5 ơ, đính nỗn ở trung trụ. Phía ngồi bầu có nhiều lơng che phủ (Đỗ Tất Lợi, 2004).

+ Quả

Quả hình quả trứng nhọn, dài gấp 3 lần đài, có khía dọc, quả nang, khi quả chín thì các lớp vỏ quả khô lại và mở ra bằng đường nứt theo khía dọc thành 5 mảnh vỏ, hai mặt đều có nhiều lơng hình sao. Quả chín có màu đen nhạt. Hạt hình thận, dài từ 2 - 3 mm, có lơng tơ, lúc xanh có màu xanh nhạt, khi chín có màu nâu đen, mặt ngồi có các đường vân tạo thành những gợn hay những ụ màu vàng (Đỗ Tất Lợi, 2004).

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Sâm Bố chính là cây ưa sáng, ưa ẩm, thích hợp với đất nhiều mùn, tơi xốp, có lớp đất mặt sâu, thoát nước, nhiều ánh sáng ở miền núi, trung du và đồng bằng, sinh trưởng phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm. Hạt nảy mầm tự nhiên vào khoảng tháng 2 - 3 năm sau. Củ Sâm Bố chính thường được thu vào tháng 12 đến tháng 1 khi cây bắt đầu tàn lụi.

2.1.6 Thành phần hóa học và giá trị về y dược

De-Li Chen et al. (2018), từ lâu sâm bố chính đã được sử dụng như là thuốc cổ truyền dân tộc và là một loại thực phẩm ở đảo Hải Nam và các nước Đông Nam Á. Được người Li và người Hmong coi là “Nhân sâm của núi Wu Zhi” và dùng để chữa một số loại bệnh như ho, ho lao, táo bón, suy nhược thần kinh, sưng đau của mụn nhọt, chóng mặt, đau bụng và đau dạ dày. Từ thân củ Sâm bố chính (Abelmoschus

sagittifolius) đã phân lập được hợp chất sesquiterpenoid bao gồm trihydroxycalamenene 3-O-β-d-glucoside (1), N-(p-trans-coumaroyl)-N-methyl tyramine (2), Cleomiscosin A (3), 9,12,13-trihydroxy-10,15-heptadecadienoic acid

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

2β,7,3-(4), Cytochalasin B (5), Marmesinin (6) and N-(p-trans-coumaroyl) tyramine (7), có tác dụng gây độc tế bào chống lại dòng tế bào ung thư HepG2 và Hela.

Trước đây, Hải Thượng Lãn Ông dùng rễ Sâm bố chính phối hợp với các thuốc khác để chữa bệnh ho, sốt nóng, gầy cịm và dùng cho người háo nước. Theo Đỗ Tất Lợi, Sâm bố chính có chất nhầy khoảng 35 - 40%, chứa nhiều tinh bột. Được dùng làm thuốc chữa ho, viêm phế quản, viêm đường tiểu tiện, làm thuốc súc miệng và đắp lên mụn nhọt. Nghiên cứu của Trần Công Luận và cs (2001) Sâm Bố chính có thành phần hóa học chính là saponin triterpen, chất nhầy, coumarin, flavonoid, đường khử, acid amin và acid hữu cơ. Trong số này thì saponin triterpen là nhóm chất có dược tính quan trọng của cây Sâm bố chính. Saponin cũng là một nhóm hợp chất thứ cấp quan trọng được tìm thấy ở họ Nhân sâm có nhiều cây dược liệu giá trị cao như sâm Cao Ly (Panax ginseng) và sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis).

Nghiên cứu của Đào Thị Vui (2007) nhận diện được 5 hợp chất trong dịch chiết methanol của rễ Sâm Bố chính. Đồng thời, nghiên cứu này cũng cho thấy cao chiết Sâm Bố chính có tác dụng bảo vệ dạ dày trên mơ hình gây loét bằng thắt môn vị bên cạnh các tác dụng khác như an thần, giảm đau, giảm co thắt cơ trơn và tăng cường thể lực.

Theo Võ Văn Chi (2012), bộ phận sử dụng của Sâm bố chính chủ yếu là toàn bộ phần củ rễ. Rễ củ thu hoạch sơ chế phơi hay sấy khô kết hợp với ý dĩ, hoài sơn, đương quy, mật ong dùng để bổ khí huyết. Ngồi ra rễ Sâm bố chính có thể nấu thành cao kết hợp với sữa, cao ban long dùng cho người sức khỏe suy nhược, gầy yếu, khơ khát, táo bón... Rễ Sâm bố chính giã nhỏ nấu với gạo nếp chữa bệnh bạch đới.

Trong Dược điển Việt Nam V (2018) có nêu một số tiêu chí về củ nhân sâm Phú Yên (Sâm bố chính) như sau: độ ẩm < 13%, tro tồn phần < 12%, tro không tan trong acid hydroclorid < 7%, tạp chất <1% và dược liệu phải chứa khơng ít hơn 25% chất chiết được bằng ethanol 25% (thuốc thử) tính theo dược liệu khơ kiệt.

Đinh Ngọc Thức et al. (2021) đã phân lập được 4 hợp chất bao gồm

5,12-epoxy-9-hydroxy-7- megastigmen-3-on, bombaxon, 3-O-β-Dglucopyranosylbombaxon và 2β,7,3-trihydroxycalamenen 3-O-β-D-glucoside từ rễ của cây Sâm bố chính (Abelmoschus sagittifolius). Nghiên cứu tiếp theo, trên phần thân và ngọn của Sâm

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

bố chính ở xã Vĩnh Hưng, huyện Vĩnh Lộc, tỉnh Thanh Hóa đã phân lập được sáu hợp chất gồm sitostenone, friedelin, vomifoliol, vanilic acid, ketopinoresinol and daucosterol. Trong đó, hợp chất sitostenone, friedelin, vanilic acid và ketopinoresinol lần đầu tiên được phân lập từ loài cây này (Đinh Ngọc Thức et al., 2022). Một nghiên cứu khác của nhóm nghiên cứu Đinh Ngọc Thức et al. (2022) cơng bố trên tạp chí ACS Omega lần đầu tiên phân lập thành công hợp chất sesquiterpenoid compound abelsaginol (AS), một hợp chất chống oxy hóa, từ cây Sâm bố chính.

2.2 Giới thiệu về Saponin

Saponin có nguồn gốc từ tiếng Latin “sapo” có nghĩa là “có tính tạo bọt như xà phòng” (Zhong et al., 2022). Theo Irma Podolak et al. (2010), Saponin là chất chuyển hóa thứ cấp có bản chất glycosidic phân bố rộng rãi ở các lồi thực vật bậc cao nhưng cũng được tìm thấy trong một số loài động vật, như động vật không xương sống ở biển. Được cấu tạo gồm một gốc đường ưa nước và một genin kỵ nước (hay cịn gọi là sapogenin hoặc aglycone). Saponin có thể có từ một đến ba chuỗi đường mạch thẳng hoặc nhánh, thường bao gồm D-glucose, L-rhamnose, D-galactose, D-glucuronic acid, L-arabinose, D-xylose hoặc D-fucose. Chuỗi đường có thể chứa từ một đến một số gốc monosaccharide, và thường được gắn ở C-3. Aglycone có thể có cấu trúc steroid hoặc triterpenoid và đựa vào đây chia saponin thành hai loại chính gồm sapogenin steroid và sapogenin triterpenoid. Các sapogenin steroid (27C) có cấu trúc khung spirostane 6 vòng hoặc furostane 5 vòng, trong tự nhiên ít phổ biến hơn

và thường được tìm thấy ở lớp Liliopsida trong các chi của các họ như Liliaceae, Dioscoreaceae, Agavaceae. Trong khi đó, sapogenin triterpenoid (30C), có cấu trúc đa dạng, hệ thống 5 vịng cơ bản, phân bố rộng và điển hình hơn trong tự nhiên ở các lớp Magnoliopsida. Sự hiện diện trong sapogenin đa vịng của các nhóm thế khác nhau, chẳng hạn như hydroxyl, hydroxymethyls, carboxyls và nhóm acyl, cũng như sự khác biệt về thành phần, liên kết và số lượng chuỗi đường tạo nên sự đa dạng về cấu trúc đáng kể của saponin và cũng như hoạt tính sinh học đa dạng.

Từ xa xưa các loại cây giàu saponin như trong sâm Cao Ly (Panax ginseng) và cam thảo (Glycyrrhiza glabra) đã được sử dụng phổ biến để làm thuốc trong Đơng y. Saponin có nhiều hoạt tính dược lý bao gồm long đờm, chống viêm, bảo vệ mạch

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

máu, hạ cholesterol trong máu, điều hòa miễn dịch, hạ đường huyết, chống nấm, chống kí sinh trùng và nhiều cơng dụng khác. Khơng chỉ có vai trị làm thuốc mà saponin cịn đóng góp trong ngành cơng nghệ thực phẩm và mỹ phẩm, sử dụng làm chất nhũ hóa và tạo ngọt. Một ứng dụng quan trọng khác của saponin là được sử dụng làm chất bổ trợ trong sản xuất vắc xin. Các sapogenin steroid từ nhiều năm nay đã đóng vai trị là ngun liệu thơ quan trọng về kinh tế cho ngành dược phẩm trong việc sản xuất các hormone steroid (Irma Podolak et al., 2010).

Hình 2.2 Cấu trúc cơ bản của saponin: (a) sapogenin steroid, (b) sapogenin triterpenoid (Nguồn: El Aziz MMA et al., 2019)

2.3 Giới thiệu về TDZ và than hoạt tính

Thidiazuron (TDZ) là một chất điều hồ tăng trưởng thực vật có nguồn gốc tổng hợp hóa học (Guo et al., 2011). Ban đầu, TDZ được liệt vào nhóm hormone cytokinin, nhưng sau đó được chứng minh là có tác dụng sinh học khơng hồn tồn giống với một nhóm hormone thực vật nào vì TDZ có chức năng tương tự như một loại auxin

ở một số loài thực vật (Erland et al., 2020). TDZ được báo cáo lần đầu tiên vào năm

1976 và được sản xuất bởi tập đoàn Schering của Đức để làm rụng lá của cây bông vải (Gossypium hirsutum). Đầu những năm 80, TDZ được ứng dụng vào ni cấy mơ thực vật giúp ích cho các nghiên cứu phát sinh hình thái và đặc điểm sinh lý của thực vật. Sau đó, hợp chất này được ứng dụng nhiều trong nuôi cấy in vitro để kích thích nảy mầm của hạt, q trình tạo và nhân chồi, sự tăng trưởng và phát triển của lá mầm, tạo mơ sẹo, hình thành phơi soma, chồi nách và ra hoa trong ống nghiệm (Guo et al., 2011).

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Về mặt cấu trúc, than hoạt tính (activated charcoal) có mạng lưới ổn định của những lỗ trống với diện tích bề mặt bên trong lớn nên có thể hấp phụ các vật chất (substances) khác nhau (Thomas, 2008). Than hoạt tính thường sử dụng trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật nhằm cải thiện sự tăng trưởng và phát triển của các mẫu này (Thomas, 2008). Nguyên nhân chủ yếu là do sự hấp phụ các chất ức chế sự tăng trưởng thực vật, làm giảm quá trình tiết dịch phenolic và sự tích tụ các chất gây hóa nâu, cân bằng pH mức tối ưu, tạo môi trường tối ưu, có thể mơ phỏng điều kiện của

đất.. Đóng một vai trò quan trọng trong nhân giống in vitro, sự nảy mầm của hạt, hình

thành phơi soma, ni cấy bao phấn, nuôi cấy nguyên bào, tạo rễ, kéo dài thân, hình thành củ (Thomas, 2008).

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

3.1 Vật liệu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây sâm bố chính được ni cấy in vitro từ hạt trong Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh.

3.1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm Công nghệ Tế bào Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

Thời gian: 3 tháng (từ tháng 2 năm 2023 đến tháng 5 năm 2023).

3.1.3 Thiết bị dụng cụ

Găng tay, khẩu trang y tế.

Bút lông dầu, băng keo giấy, kéo cắt giấy, thước đo. Cân phân tích, cân kỹ thuật.

Máy lọc nước một lần. Tủ lạnh, tủ sấy, tủ cấy. Lị vi sóng, nồi hấp vô trùng.

Kẹp, đĩa petri, becher, erlen, ống nghiệm, chày và cối nghiền mẫu. Máy đo pH.

Máy điều hòa, nhiệt kế, đèn chiếu sáng. Đèn cồn.

Bình cấy.

3.1.4 Hóa chất

Acetic anhydride Chloroform TDZ

Than hoạt tính Dầu olive

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

3.1.5 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường Murashige and Skoog (MS) bổ sung sucrose 30 g/L, agar 10 g/L và chất điều hịa tăng trưởng thực vật TDZ và than hoạt tính (nồng độ thay đổi theo thiết kế và mục đích thí nghiệm, sẽ được trình bày chi tiết phía sau).

3.1.6 Điều kiện ni cấy

Nhiệt độ phịng ni: 25 ± 2 oC Độ ẩm: 70 ± 5 %

Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux pH môi trường nuôi cấy: 5,7 – 5,8

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp thu thập, tổng hợp tài liệu

Các nghiên cứu liên quan đã được công bố ở Việt Nam và quốc tế được tìm và thu thập thơng qua các nền tảng như Google và Pubmed-NCBI.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, 3 mẫu trong một bình thủy tinh 500 mL.

Thời gian theo dõi: 30 ngày.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng chồi/mẫu.

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo chồi của đoạn thân cây Sâm bố chính

Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/L)

T 0,01 0,01 T 0,03 0,03 T 0,05 0,05 T 0,07 0,07

3.2.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát tác động của TDZ đến khả năng ra chồi của lá cây Sâm bố chính.

Mục đích thí nghiệm: Đánh giá khả năng ra chồi trong môi trường MS bổ sung TDZ nồng độ 0,01 mg – 0,1 mg/L.

Mơ tả thí nghiệm: Lá cây Sâm bố chính từ cây in vitro được cấy sang môi trường MS bổ sung TDZ ở các nồng độ khác nhau và 30 g/L sucrose, 10 g/L agar, pH 5,5-5,7.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, 3 mẫu trong một bình thủy tinh 500 mL.

Thời gian theo dõi: 30 ngày.

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng chồi/mẫu.

Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến khả năng tạo chồi của lá Sâm bố chính

Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/L)

T 0,01 0,01 T 0,03 0,03 T 0,05 0,05 T 0,07 0,07 T 0,09 0,09 T 0,10 0,10

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

3.2.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát tác động của than hoạt tính đến khả năng ra rễ của đoạn thân Sâm bố chính.

Mục đích thí nghiệm: Đánh giá khả năng phát triển rễ trong môi trường MS bổ sung than hoạt tính nồng độ 1,5 g – 4,5 g/L.

Mơ tả thí nghiệm: Đoạn thân Sâm bố chính từ cây in vitro được cấy sang môi trường MS bổ sung than hoạt tính ở các nồng độ khác nhau và 30 g/L sucrose, 10 g/L agar, pH 5,5-5,7.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, 3 mẫu trong một bình thủy tinh 500 mL.

Thời gian theo dõi: 30 ngày.

Chỉ tiêu đánh giá: số rễ/mẫu, chiều dài rễ.

Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của đoạn thân cây Sâm bố chính

Nghiệm thức Nồng độ Than hoạt tính (g/L)

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, 3 mẫu trong một bình thủy tinh 500 mL.

Thời gian theo dõi: 30 ngày.

Chỉ tiêu đánh giá: số rễ/mẫu, chiều dài rễ.

</div>