Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân giống in vitro một số giống lan thuốc thuộc chi hoàng thảo (dendrobium)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI





TRẦN THẾ MAI


NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
MỘT SỐ GIỐNG LAN THUỐC THUỘC CHI HOÀNG THẢO
(DENDROBIUM)


LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số: 60.42.80

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH



HÀ NỘI – 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã
ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả luận văn



Trần Thế Mai

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành bản luận văn này tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ về nhiều mặt
của các cấp lãnh ñạo, các tập thể và cá nhân.
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới PGS.TS
Nguyễn Thị Lý Anh, GS.TS Nguyễn Quang Thạch, ThS. Nguyễn Thị Sơn ñã tận
tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp ñỡ tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh ñạo và các cán bộ Viện Sinh học
Nông nghiệp ñã giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình tôi làm việc và thực hiện ñề tài
nghiên cứu của mình.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh ñạo Trường ðại học Nông nghiệp Hà
Nội, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Viện ñào tạo sau ñại học, các thầy
cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ

tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia ñình,
người thân và bạn bè ñã cổ vũ, ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện ñề tài.
Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 9 năm 2012
Tác giả luận văn



Trần Thế Mai
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình ix
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích và yêu cầu 1
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Giới thiệu về chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium 4
2.1.1 Vị trí phân bố và phân loại lan chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 4

2.1.2 ðặc ñiểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo 4
2.1.3 ðặc ñiểm sinh thái học chi Hoàng Thảo 6
2.1.4 ðặc ñiểm hình thái và giá trị sử dụng của loài Dendrobium nobile
Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. 8
2.2 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 9
2.2.1 Tính toàn năng của tế bào 9
2.2.2 Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào 9
2.2.3 Quy trình nhân giống in vitro 10
2.2.4 Một số kỹ thuật sử dụng trong nhân giống in vitro. 12
2.2.5 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy in vitro 19
2.2.6 Nghiên cứu nuôi cấy mô cây lan Hoàng Thảo trên thế giới và ở Việt
Nam 22
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 30
3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 31
3.2.1 Nội dung nghiên cứu 31
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 31
3.3 ðiều kiện thí nghiệm 40
3.4 Các chỉ tiêu theo dõi 40
3.5 Xử lý số liệu 41
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42
4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ñiều kiện nuôi cấy ñến khả năng
nhân protocorm và cụm chồi cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và
Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng. 42
4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy ñến khả năng
nhân protocorm và cụm chồi cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và

Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng. 43
4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch nuôi cấy trên hệ thống
Bioreactor Plantima ñến khả năng nhân protocorm và cụm chồi cây
lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng. 49
4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ñến khả ngăng nhân
protocorm và cụm chồi. 50
4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế ñộ chiếu sáng ñến khả năng sinh
trưởng của cây in vitro. 52
4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại ánh sáng ñến sinh trưởng của cây. 52
4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng ñến sinh trưởng của cây 57
4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của quang chu kỳ ñến sinh trưởng của cây 61
4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các kỹ thuật trồng và chăm sóc ñến khả
năng thích ứng của cây lan in vitro ngoài vườn ươm. 62
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi trồng khác nhau
ñến khả năng sinh trưởng của cây ở vườn ươm 63
4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các thời vụ trồng ñến khả năng thích
ứng của cây ở vườn ươm. 66
4.3.3 Ảnh hưởng của các dung dịch dinh dưỡng khác nhau ñến sinh
trưởng và phát triển cây lan. 68
4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch ñến sự sinh trưởng của
cây trên hệ thống khí canh 70
4.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñộ dẫn ñiện (Electrical Conductivity :
EC) trong dung dịch trên hệ thống khí canh lên sinh trưởng cây lan. 72
4.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của chu kỳ phun ñến sinh trưởng của cây. 73
4.3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật và các
chế phẩm vi sinh ñến khả năng phòng bệnh của cây. 75

5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 79
5.1 Kết luận 79
5.2 ðề nghị 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CT Công thức
CV(%) Hệ số biến ñộng (Correlation of Variants)
ðC ðối chứng
HSN Hệ số nhân
MS Murashige & Shoog, 1962
LSD
0,05
Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.5
(Least Significant Difference)
ND Nước dừa
KC Knudson C, 1965
RE Robert Ernst, 1979
THT Than hoạt tính
VW Vacin & Went, 1949
TB Trung bình
BP Bioreactor Plantima

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

4.1 Ảnh hưởng của các PTNC ñến hệ số nhân (HSN) protocorm, cụm
chồi cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng 44

4.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch ñến hệ số nhân protocorm và cụm
chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng
trên hệ thống BP sau 1 tháng 50

4.3 Ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ñến khả năng nhân protocorm
và cụm chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn
Vàngtrên hệ thống BP sau 1 tháng 51

4.4 Ảnh hưởng của loại ánh sáng ñến một số chỉ tiêu sinh lý của Hoàng
Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 55

4.5 Ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng một số chỉ tiêu sinh lý của cây
Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 59

4.6 Ảnh hưởng của quang chu kỳ ñến sinh trưởng của cây lan Hoàng
Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 61

4.7 Ảnh hưởng của phương thức nuôi trồng ñến sinh trưởng cây trên hệ
thống khí canh cây Hoàng Thảo Thạch Hộc sau 1 tháng 63

4.8 Ảnh hưởng của phương thức nuôi trồng ñến sinh trưởng cây trên hệ
thống khí canh cây Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 1 tháng 64

4.9 Ảnh hưởng của các thời vụ trồng ñến sinh trưởng của cây trên hệ
thống khí canh cây Hoàng Thảo Thạch Hộc sau 1 tháng 66

4.10 Ảnh hưởng của các thời vụ trồng ñến sinh trưởng của cây trên hệ
thống khí canh cây Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 1 tháng 67

4.11 Ảnh hưởng của các dung dịch dinh dưỡng ñến sinh trưởng của cây
trên hệ thống khí canh cây Hoàng Thảo Thạch Hộc sau 3 tháng 69

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

viii

4.12 Ảnh hưởng của các dung dịch dinh dưỡng ñến sinh trưởng của cây
trên hệ thống khí canh cây Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 3
tháng 69

4.13 Ảnh hưởng của nồng ñộ EC ñến sinh trưởng cây lan Hoàng Thảo
Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng trên hệ thống khí canh
sau 3 tháng 72

4.14 Ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ñến sinh trưởng của cây lan
Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng trên hệ
thống khí canh sau 3 tháng 74

4.15 Ảnh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật và chế phẩm vi sinh vật
ñến khả năng phòng bệnh của cây trồng trên giá thể sau 2 tháng 78



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ix

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

3.1 ðồ thị quang phổ ánh sáng của các hệ thống chiếu sáng nghiên cứu 34
3.2 Sơ ñồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng ñến sinh
trưởng của 02 loài lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo
Ngọc Vạn Vàng 35
3.3 Sơ ñồ hệ thống khí canh- Viện Sinh học Nông nghiệp – ðHNN HN 37

4.1 Prtocorm (a), cụm chồi (b) cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và cụm
chồi (c) cây lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng trên các
hệ thống bình nuôi cấy trao ñổi khí không hoàn toàn (ðC), không
trao ñổi khí (CT2) và trao ñổi khí hoàn toàn CT3). 46

4.2 Prtocorm(a), cụm chồi(b) cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và cụm
chồi(b) cây lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng trên các
hệ thống bình thoáng khí hoàn toàn nuôi cấy có nền môi trường ñặc
(CT3), lỏng tĩnh (CT4) và lỏng lắc (CT5). 47

4.3 Prtocorm (a), cụm chồi (b) cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và cụm
chồi (c) cây lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 1 tháng trên hệ
thống bipreactor Plantima (BP) 47
4.4 Quang phổ ánh sáng ñèn LED 53
4.5 Quang phổ ánh sáng ñèn T8 – ñỏ 54
4.6 Quang phổ ánh sáng ñèn T8-Deluxe 54
4.7 Quang phổ ánh sáng ñèn T10 54
4.8 Cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc(a) và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng
(b) in vitro sinh trưởng trong các ñiều kiện bóng sáng khác nhau sau
2 tháng 56

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

x

4.9 ðồ thị biểu diễnchiều cao (a) và số lá (b) của cây Hoàng Thảo
Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng dưới tác dụng của các
loại bóng sáng sau 2 tháng 57

4.10 Cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc(a) và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng
(b) in vitro sinh trưởng trong các cường ñộ chiếu sáng khác nhau 59

4.11 ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng cường ñộ ánh sáng ñến chiều cao (a) và
số lá (b) của cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn
Vàng sau 2 tháng. 60

4.12 Cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc (a) và cây lan Hoàng Thảo Ngọc
Vạn Vàng (b) ở các chu kỳ chiếu sáng khác nhau 62
4.13 Cây Hoàng Thảo Thạch Hộc Trên cá hệ thống sau 1 tháng 64
4.14 Cây Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng trên các hệ thống sau 1 tháng 65

4.15 Cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc(A) và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng
(B) khí canh trồng với các loại dung dịch dinh dưỡng khác nhau 70

4.16 Ảnh hưởng của pH ñến một số chỉ tiêu sinh lý cây lan Hoàng Thảo
Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng khí canh với các ñộ pH
sau 3 tháng 71

4.17 Rễ cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc (A) và cây lan Hoàng Thảo
Ngọc Vạn Vàng (B) trên hệ thống khí canh có thời gian nghỉ phun
tốt nhất ở 4 h/ lần và phun 2 phút/ lần sau 3 tháng 75



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1

1. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Lan từ lâu ñã ñược biết ñến như là loại hoa cao cấp có vẻ ñẹp quyến rũ và có
giá trị thẩm mĩ cao cho mọi người yêu và chơi hoa. Bên cạnh giá trị thẩm mĩ, lan
còn có nhiều công dụng như: Dùng làm thực phẩm (giống orchis), rau xanh (giống
anoetochilus), trà lan (loài jumellea fragrans), hương liệu vanillin (vannila
plannifolia) và ñặc biệt lan còn ñược dùng làm dược liệu.
Tác dụng của các loại thuốc từ lan ñã ñược biết ñến từ rất lâu. Chúng ñã
ñược mô tả trong các sách nói về cây thuốc của Hải Thượng Lãn Ông, cây thuốc
lưu truyền trong dân gian Việt Nam và cả sách cây thuốc trên thế giới. Trong ñó,
chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có nhiều loài ñược sử dụng làm dược liệu.
Một số tác dụng của các loài này như: dưỡng âm, dùng nhiều trong trường hợp

bị sốt, cơ thể thiếu nước, chữa một số bệnh như: mắt kém, ñau xương khớp…,
khi dùng cần phối hợp với một số thuốc khác mới có hiệu quả cao. Hầu hết lan
Hoàng Thảo ñược sử dụng làm thuốc ñều ñang mọc hoang dại tự nhiên trong
rừng và ñang ñược người dân khai thác một cách triệt ñể dẫn ñến có nguy cơ
tuyệt chủng. Chính vì vậy việc bảo tồn và phát triển các loài này là việc làm cấp
thiết hiện nay.
ðể bảo tồn và phát triển các giống lan nói chung và lan dược liệu nói riêng
cần phải có số lượng lớn cây giống có chất lượng cao. Muốn ñáp ứng ñược nhu cầu
về cây giống nêu trên thì việc nhân giống lan bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào là
ñiều bắt buộc phải thực hiện. Trong nhiều năm qua, Viện Sinh học Nông nghiệp –
ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tiến hành nghiên cứu và hoàn thiện ñược quy trình
nhân giống in vitro cho nhiều loại lan thương mại như: Hồ ñiệp, Vanda, Vũ nữ,
Catlayea …và cả một số giống lan Hoàng Thảo cắt cành. ðặc biệt, trong 2 năm gần
ñây Viện ñã thành công trong nhân giống in vitro một số loài lan dược liệu bản ñịa
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2

thuộc chi Hoàng Thảo. Tuy nhiên trong quá trình nhân giống còn một số hạn chế
như hệ số nhân và tốc ñộ tăng trưởng in vitro chưa cao, tỷ lệ sống và sinh trưởng
sau giai ñoạn nuôi cấy in vitro vẫn còn thấp.
Hiện nay, trong nhân giống in vitro một số biện pháp nuôi cấy mới như sử
dụng hệ thống bioreactor, nuôi cấy lỏng lắc, nuôi cấy quang tự dưỡng không
ñường … ñã ñược áp dụng và thu ñược kết quả khả quan ñối với một số loại cây ….
Bên cạnh ñó, trong giai ñoạn ex vitro các kỹ thuật trồng trọt không cần ñất
như thủy canh, khí canh cũng ñã ñược áp dụng ñể giảm thiểu tỷ lệ chết và tăng
cường sự sinh trưởng của các cây cấy mô ở vườn ươm …. Viện Sinh học Nông
nghiệp ñã thành công trên cây khoai tây, cà chua, cẩm chướng, cúc và nhiều loại
cây trồng khác.
Với mục ñích hoàn thiện quy trình nhân giống áp dụng phương pháp công

nghệ mới nhằm làm giảm chi phí sản xuất và khắc phục sự thụ ñộng trong sản
xuất cây giống hiện nay. Chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu cải
tiến quy trình nhân giống in vitro một số giống lan thuốc thuộc chi Hoàng
Thảo (Dendrobium)”
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1 Mục ñích
Hoàn thiện ñược quy trình nhân giống in vitro nâng cao hệ số nhân và
chất lượng cây giống cho 02 loài lan dược liệu thuộc chi Hoàng Thảo
1.2.2 Yêu cầu
- Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy lỏng lắc ñến khả
năng nhân nhanh protocorm và chồi in vitro
- Xác ñịnh ñược hưởng của phương pháp nuôi cấy thoáng khí ñến khả
năng nhân nhanh protocorm và chồi in vitro
- Xác ñịnh ñược chế ñộ chiếu sáng thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của
cây.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3

- Xác ñịnh ñược kỹ thuật ra cây ñạt hiệu quả cao nhất về tỷ lệ sống và
sinh trưởng của cây in vitro ở vườn ươm
- ðề xuất quy trình nhân giống in vitro ñã ñược cải tiến với hệ số nhân
cao hơn, chất lượng cây giống tốt hơn.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- ðề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về khả năng nhân giống in
vitro và khả năng nuôi cây con trong vườn ươm của một số loài lan dược
liệu thuộc chi Hoàng Thảo (Dendrobium)
- Các kết quả thu ñược sẽ làm cơ sở cho việc nghiên cứu và giảng dạy ñối
với cây lan dược liệu Hoàng Thảo (Dendrobium)

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
ðề xuất ñược quy trình nhân giống in vitro và nuôi trồng cây con ngoài
vườn ươm cho một số loài lan dược liệu thuộc chi Hoàng Thảo (Dendrobium)
ñang có nguy cơ tuyệt chủng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium
2.1.1. Vị trí phân bố và phân loại lan chi Hoàng Thảo (Dendrobium)
Các ñại diện của chi Hoàng Thảo (Dendrobium) chủ yếu sống phụ sinh
trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên ñá, thường
ở nơi ẩm, thường mọc ở ñộ cao 500 – 1500m so với mực nước biển, nhưng có
khi gặp chúng mọc ở ñộ cao 200m hoặc tới 2000m.
Theo Dương ðức Huyến (2007) xây dựng hệ thống phân loại lan Hoàng
Thảo ở Việt Nam chủ yếu dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985) thành 15
sectio: Grastidium (Blume) J. J. Smith - Trúc lan (Thế giới có 100 – 120 loài,
Việt Nam có 3 loài); Conostalix Kraenzl (Thế giới có 14 loài, Việt Nam có 3
loài); Formonsae (Benth. & Hook. F.) Hook.f. (Thế giới có 30 – 35 loài, Việt
Nam có 10 loài); Dendrobium – Hoàng Thảo (Thế giới có 300 loài, Việt Nam có
30 loài); Breviflores Hook. f. (Thế giới có 18 loài, Việt Nam có 8 loài);
Distichophyllum Hook. F. (Thế giới có 15 loài, Việt Nam có 3 loài);
Superbientia Kraenzl.( Thế giới có 13 loài, Việt Nam có 1 loài); Pedilonum
(Blume) (Thế giới có 160 – 180 loài, Việt Nam có 3 loài); Stachyobium Lindl
(Thế giới có 40 –50 loài, Việt Nam có 6 loài); Chrysotoxae Kraenzl (Thế giới có
10 loài, Việt Nam có 6 loài); Bolbidium Lindl. Ex Lindl (Thế giới có 7- 8 loài,
Việt Nam có 3 loài); Crumenatae Pfitz (Thế giới có 40 –50 loài, Việt Nam có 8
loài); Strongyle Lindl (Thế giới có 20 loài, Việt Nam có 2 loài); Aporum (Blume)

Lindl. (Thế giới có 40 loài, Việt Nam có 12 loài); Oxystophyllum (Blume) Miq.
(Thế giới có 25 loài, Việt Nam có 1 loài)
2.1.2. ðặc ñiểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo
Thân: Chi lan Hoàng Thảo thuộc nhóm ña thân (sympodial) với nhiều giả
hành. ðây là nhóm bao gồm các cây tăng trưởng liên tục nhưng có chu kỳ nghỉ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5

sau những mùa sinh trưởng. Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa ñầy dịch
nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ ñể tránh
sự mất nước do sức nóng của mặt trời. ða số các củ giả hành có màu xanh nên
nó ñã cùng với lá làm nhiệm vụ quang hợp (Trần Hợp, 2000).
Thân của các ñại diện chi Hoàng Thảo ñều phân ñốt, hình trụ, hình con suốt,
hình chùy, hình trứng…có chiều dài thay ñổi từ 2-3cm ñến 120 cm hoặc ñôi khi
hơn, kích thước phổ biến là 20-50cm. Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu
dục, ñôi khi hình 4 cạnh nhưng ñược gọi chung theo kích thước ngang này là
chiều dày, thay ñổi từ 0,3-1,5cm nhưng ña số hay gặp là khoảng 0,5-1cm. Thân có
thể mảnh, ñôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên (Dương ðức Huyến, 2007)
Rễ: Sự ña dạng về hình thái và cấu trúc rễ ñã làm cho chi lan Hoàng Thảo
phù hợp với ñiều kiện sống như khi sống trong ñất thì rễ mập, thân rễ bò dài
(Trần Hợp, 2000). Rễ của các ñại diện chi Hoàng Thảo là rễ khí sinh, mảnh,
hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể
hoặc buông thõng xuống.
Lá: ða số lá có dạng lưng-bụng bình thường, ñôi khi gặp vài ñại diện có
lá hình trụ. Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình cung. Lá thường
hình mác, bầu dục, ñôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi lá hình thoi dài,
hình nêm. ðỉnh lá nhọn hoặc tù, rất nhiều trường hợp lá xẻ 2 thùy nhọn, tù hoặc
là tròn lệch nhau. Chiều dài của lá thay ñổi từ 1-19 cm và chiều rộng từ 0,3-
3,5cm. Lá hình trụ thường có bề dày (từ 0,2-0,4cm) (Dương ðức Huyến, 2007)

Cụm hoa: Cụm hoa chùm thường nhiều hoa, ñôi khi ít hoa hoặc ñơn ñộc.
Cụm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có cụm hoa ñẹp có giá trị làm
cảnh (Dương ðức Huyến, 2007).
Hoa: Hoa lưỡng tính, ñối xứng hai bên. Màu sắc hoa ña dạng, sặc sỡ. Hoa
ña số các loài có hương thơm, Bao hoa chia 2 vòng. Vòng ngoài gồm 1 lá ñài
giữa và 2 lá ñài bên. Vòng trong gồm có 2 cánh hoa và một cánh môi (Dương
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6

ðức Huyến, 2007).
Quả: Quả nang thường hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt
nằm xen lẫn những sợi lông mảnh. Khi quả già, gặp trời ẩm sợi này sẽ hút nước
và trương lên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài. Hạt rất nhỏ, hầu như
không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa
ñầy không khí dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió. (Dương ðức
Huyến, 2007)
2.1.3. ðặc ñiểm sinh thái học chi Hoàng Thảo
Nhiệt ñộ: Nhiệt ñộ ảnh hưởng nhiều ñến sự tăng trưởng phát triển của lan
Dendrobium thông qua con ñường quang hợp và hoạt ñộng trao ñổi chất. Nhiệt
ñộ thích hợp cây quang hợp tốt, khả năng tích luỹ chất khô cao nên sinh trưởng
và phát triển của cây tốt. Ngược lại nếu nhiệt ñộ quá cao hoặc thấp sẽ ảnh hưởng
xấu ñến sinh trưởng và phát triển của lan. Lan Hoàng Thảo thuộc loại cây ưa
nóng, sinh trưởng tốt ở nhiệt ñộ 24-33
0
C. Dưới 12
0
C và trên 37
0
C ñều làm chậm

và ảnh hưởng lớn ñến sự ra hoa của cây.
Trong thực tế sản xuất tại miền Bắc có mùa ñông lạnh và mùa hè nóng thì
cần hạn chế tác ñộng xấu của nhiệt ñộ bằng cách vào mùa ñông thì che phủ
nilon quanh nhà trồng lan hoặc thắp ñiện còn mùa hè che lưới phản quang, có
hệ thống phun tưới thích hợp và tạo ñiều kiện thông thoáng trong nhà lan sẽ ñem
lại hiệu quả rõ rệt (Nguyễn Thị Kim Lý. 2009)
Ẩm ñộ: ðộ ẩm thích hợp giúp cho cây ñược phát triển nhanh hơn hoa
tươi và lâu tàn. Dendrobium cũng như ña số các giống lan khác chỉ phát triển tốt
trong ñiều kiện không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần ñộ ẩm
khoảng từ 40-60%, vào ban ñêm ñộ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển
tốt hơn. Loại giá thể quá ẩm và úng sẽ là ñiều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của
giống Dendrobium vì có thể bị thối toàn bộ rễ và biểu hiện là các cây con mọc
từ phần ngọn của thân (Bùi Thị Thu Hiền, 2009).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7

Ánh sáng: Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong ñiều kiện ánh
sáng trực tiếp hay khuếch tán. Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là
70%, vì thế giàn che với ñộ che sáng 30% dưới ñất và 40% ở trên cao với cường
ñộ ánh sáng từ 15.000-30.000 lux rất thích hợp cho sự phát triển của
Dendrobium.
Mùa hè của miền Bắc cường ñộ ánh sáng mạnh, nhu cầu ánh sáng của lan
Hoàng Thảo khoảng 70-80% ánh sáng trực tiếp. Trong ñiều kiện râm mát cây
thường yếu, mọng nước, rất dễ nhiễm bệnh. Về mùa ñông cường ñộ ánh sáng
yếu và thời gian chiếu sáng ngắn, ñể lan Hoàng Thảo sinh trưởng và phát triển
tốt và ra hoa ñược thì cần bổ sung ánh sáng bằng cách thắp ñiện cho vườn lan
(Bùi Thị Hiền, 2009).
Dinh dưỡng: Lan Hoàng Thảo yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất ñịnh
ñể sinh trưởng và phát triển. Tuy không ñòi hỏi số lượng lớn nhưng phải ñầy ñủ

các thành phần dinh dưỡng N, P, K và các nguyên tố trung, vi lượng. Tuỳ từng
giai ñoạn sinh trưởng mà nhu cầu ñối với các thành phần dinh dưỡng có khác
nhau (ðào Thanh Vân, ðặng Thị Tố Nga, 2008)
Giá thể: Giá thể của Dendrobium cần chậu phải thật thoáng và không úng
nước. Tuy nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân,
các loài thuộc giống Dendrobium cần giá thể hơi ẩm chút ít nhưng không ñược
làm thối căn hành. Vì thế một số loài Dendrobium có thể phát triển trên các giá
thể là xơ dừa hay cả quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể. Tuy
nhiên nếu giá thể là xơ dừa phải hạn chế số lần tưới nước, nếu chậu là quả dừa
nguyên phải cưa phần ñáy, nếu không cây bị thối vì quá ẩm. Cũng có thể trồng
cây lan Dendrobium với căn hành cách ñáy chậu khoảng 3cm, rồi rải thật thoáng
xung quanh căn hành là một số rễ lục bình giặt sạch. Với cách trồng này thì kích
thước chậu và cây phải thật tương xứng. Tuy nhiên, giá thể than và gạch nung
vẫn tỏ ra hiệu quả nhất ñối với các loài Dendrobium
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8

2.1.4. ðặc ñiểm hình thái và giá trị sử dụng của loài Dendrobium nobile
Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl.
ðặc ñiểm hình thái
Loài Dendrobium nobile Lindl. Có tên Việt Nam là Hoàng Thảo Thạch
Hộc,Kẹp thảo, Hoàng Thảo Cẳng gà, Hoàng Thảo Dẹp, Kim Hoàng Thảo Thạch Hộc,
Phi ñiệp kép, Co vàng sào (Thái). Cây thảo phụ sinh. Thân mọc ñứng, cao 30 – 60 cm,
hơi dẹt, có rãnh dọc, chia nhiều ñốt gần sít nhau, phía ngọn dày hơn. Lá không cuống,
mọc thành hai dãy, thuôn dẹp, dài 8 – 12 cm, rộng 2 – 2,5 cm, gốc thót lại, ñầu tù tròn,
gân chính 9 – 11, hai mặt nhẵn. Cụm hoa mọc kẽ những lá ñã rụng thành chùm thưa;
hoa to, 2 – 4 cái, màu hồng; lá ñài 3, thuôn hep; cánh hoa 3 mọc xen kẽ, rộng hơn lá
ñài, cánh môi cuộn hình phễu, ñầu nhọn, mép uốn lượn, họng có ñốm màu tím sẫm; lá
ñài và cánh hoa dài bằng nhau, cột thấp, phần phụ vòi vượt hơn phần phụ lưng, bao

phấn có nắp. Quả dài, hình thoi. Mùa hoa tháng 3 - 4; mùa quả tháng 5 – 6.
Loài Denñrobium chrysanthum Lindl. Có tên Việt Nam là Hoàng Thảo
Ngọc Vạn Vàng, Thúc hoa thạch. Cây thảo phụ sinh, có thân ñứng cao 20-
145cm, dày 1-1,7cm, có khi thõng xuống, lóng dài 3cm. Lá có phiến thon nhọn,
dài ñến 13-19cm, rộng 3-4,5cm, Hoa 2-6 xuất hiện một lượt với lá, cuống và bầu
dài ñến 5cm; phiến hoa vàng da cam, dài 2,5cm, môi rộng, mép có rìa mịn, có 2
ñốm tía ở họng
Giá trị sử dụng
* Cây ñược dùng làm cảnh vì hoa to, ñẹp.
* Các bộ phận của cây ñược sử dụng làm thuốc:
Theo dược ñiển Trung Quốc 1997 (bản in tiếng Anh) dùng nhiều loài làm
Hoàng Thảo Thạch Hộc như D.Loddigesii Rolfe, D.fimbriatum Hook.,
D.chrysanthum Wall.ex Lind., D.nobile Lindl. Hoàng Thảo Thạch Hộc chứa
alcaloid sesquiterpen, dendrobine (alcaloid chính), nobilin, dendroxin, dendramin,
dendrin, 8-hydroxydendroxin, 3-hydroxy- 2-oxodendrobine, 6-hydroxydendroxin.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9

Hàm lượng dendrobine ở cây trồng là 0,58% (ở thân) và 0,6% (lá) và ở cây hoang
dại là 3,2% (ở thân), 0,8% (lá), và 0,08% (rễ). (ðỗ Huy Bích và cs, 2004). Ngoài
ra còn có một số alcaloid bậc 4 như N-methyldendrobinium iodid, N-isopentenyl
dendrobinium bromid, dendrobine N-oxyd, N-isopentennyl dendroxinium clorid
và N-isopenyl-6hydroxy dendroxinium clorid. Phần trên mặt ñất của cây chứa 2
dẫn chất pheantren là 4,7-dihydroxy-2- methoxy-9, 10-dihydrophenanthren và
denbinobin. Hai chất này ñộc ñối với tế bào (ðỗ Huy Bích và cs, 2004).
Cây ñược dùng chữa bệnh sốt nóng, khô cổ, ho, ñau rát họng, khát nước
thuộc chứng âm hư,nóng trong, chữa ñau lưng, chân tay nhức mỏi, làm thuốc bổ
ngũ tạng, chữ hư lao, ra mồ hôi trộm, nam giới thiểu năng sinh dục, di tinh ñau
dạ dày ợ chua, sau khi khỏi bệnh bị hư nhược, gầy yếu, kém ăn.

Trong y học cổ truyền Trung Quốc Hoàng Thảo Thạch Hộc ñược coi là
có tác dụng giúp ích cho dạ dày, làm tăng tiết dịch dưỡng âm trừ nhiệt, thuốc bổ
và tăng sức lực toàn thân, chữa liệt dương, khát nước do âm hư hoặc suy giảm
dịch cơ thể, ăm không ngon, buồn nôn, suy nhược cơ thể sau khi bệnh nặng, thị
lực giảm (ðỗ Huy Bích và cs, 2004)
Thu hái vào tháng 6 – 10, loại bỏ gốc rễ, lá, rửa sạch ñất cát, ñem ñồ qua
hơi nước rồi phơi hoặc sấy khô. (Thực hành dược khoa, 1972)
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Haberlandt (1902), lần ñầu tiên ñã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của
một cơ thể sinh vật ña bào ñều có khả năng tiềm tàng ñể phát triển thành một cá
thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý
luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho ñến nay con người ñã
hoàn toàn chứng minh ñược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ
một tế bào riêng rẽ.
2.2.2. Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều
cơ quan chức năng khác nhau, ñược hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau.
Tuy nhiên tất cả các loại tế bào ñó ñều bắt nguồn từ một tế bào ñầu tiên (tế bào
hợp tử). Ở giai ñoạn ñầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế
bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau ñó từ các tế
bào phôi sinh này chúng tiếp tục ñược biến ñổi thành các tế bào chuyên hóa ñặc
hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Tuy nhiên, khi tế bào ñã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên
hóa riêng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia. Trong trường hợp
cần thiết, ở ñiều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và

phân chia mạnh mẽ. Quá trình ñó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự
phân hoá tế bào.
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá,
phân hóa gen. Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể, có một số
gen ñược hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) ñể cho ra tính trạng mới, còn một
số gen khác lại bị ñình chỉ hoạt ñộng và tính trạng ñó cũng biến mất. Mặt khác một
số gen vẫn tiếp tục hoạt ñộng ñể duy trì các tính trạng ñã có (Hoàng Minh Tấn,
Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Quang Sáng, 2006) ñiều này xảy ra theo một
chương trình ñã ñược mã hoá trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến
quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn ñược hài hòa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế
bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của
khối mô sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
2.2.3. Quy trình nhân giống in vitro
Theo Georger (1993) quá trình nhân giống in vitro bao gồm các bước sau:
* Chọn lọc và chuẩn bi cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc các cây mẹ. các cây
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11

này cần phải sạch bệnh, ñặc biệt là bệnh virut. Việc trồng các cây mẹ trong ñiều
kiện thích hợp với chế ñộ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy
mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ nhiễm, tăng khae năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy.
* Nuôi cấy khởi ñộng:
Là giai ñoạn khử trùng ñưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai ñoạn này cần
ñảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh
trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn ñúng loại mô, ñúng giai ñoạn phát triển của
cây. Quan trọng nhất là ñỉnh chồi ngọn, ñỉnh chồi nách và sau ñó là các ñỉnh
chồi hoa và cuối cùng là ñoạn thân, mảnh lá…

* Nhân nhanh:
Là giai ñoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lượng thông qua các con ñường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất ñịnh và tạo
phôi vô tính.
Vấn ñề là phải xác ñịnh ñược môi trường và ñiều kiện ngoại cảnh thích
hợp ñể có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều
cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế ñộ nuôi cấy thường là 25-27
0
C và 16h
chiếu sáng/ngày, cường ñộ ánh sáng 2000-4000 lux. Tuy nhiên ñối với mỗi loại
ñối tượng nuôi cấy ñòi hỏi có chế ñộ nuôi cấy khác nhau.
* Tạo cây hoàn chỉnh
ðể tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang
môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường ñược bổ sung một lượng auxin. Một
số loại chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh
giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng.
* Thích ứng cây in vitro ngoài ñiều kiện tự nhiên
ðể ñưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần ñảm bảo một số yêu cầu
- Cây trong ống nghiệm ñã ñạt ñược những tiêu chuẩn hình thái nhất ñịnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12

(số lá, số rễ, chiều cao cây )
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
- Phải chủ ñộng ñiều chỉnh ñược ẩm ñộ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng
như chế ñộ dinh dưỡng phù hợp.
2.2.4. Một số kỹ thuật sử dụng trong nhân giống in vitro.
Khái niệm : Nuôi cấy mô tế bào thực vật là kỹ thuật cho phép nuôi cấy dễ

dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo
thích hợp ñể tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.
Trong các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ñang áp dụng hiện nay trên thế giới và
Việt nam thì phải kể ñến kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật trên môi trường cứng (có sử
dụng agar) ; Nuôi cấy mô trên môi trường lỏng (lỏng tĩnh, lỏng lắc có sử dụng máy
lắc, bioreactor cso cánh khuấy ) ; Nuôi cấy mô ngập chìm ngắt quãng (thiết bị có bộ
phận phun, sục khí tạo áp suất ñẩy dung dịch dinh dưỡng ñến khoang nuôi mẫu cấy).
ðối với mỗi kỹ thuật này thường có những ñặc tính riêng :
a. Hệ thống nuôi cấy mô môi trường rắn : Là hệ thống nuôi cấy in
vitro sử dụng giá thể chứa chất dinh dưỡng ñể giữ cho cây ñứng vững ñồng thời
cung cấp chất dinh dưỡng cho cây.
Khái niệm về giá thể. Giá thể là một loại hay một hỗn hợp vật liệu ñược
sử dụng làm vật nâng ñỡ, là chỗ cho rễ bám vào trong suốt quá trình sinh trưởng
và phát triển. Vật liệu làm giá thể phải chắc chắn và ổn ñịnh trong các ñiều kiện
khác nhau, chịu ñược hấp vô trùng mà không bị biến tính, trơ với các chất trong
môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, vật làm giá thể phải sạch và không ñược chứa
các chất lạ do thành phần của môi trường dinh dưỡng là xác ñịnh và cần kiểm
soát ñược trong từng trường hợp nuôi cấy. Chất tạo ñông thông dụng nhất là
agar. Agar là một polysaccharide chiết xuất từ rong biển. Agar ñược sử dụng
như một tác nhân tạo ñông trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô in vitro.
Agar là loại giá thể sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13

- Chất tạo gel biến môi trường dinh dưỡng thành một hệ kín, hạn chế khả
năng di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do ñó mẫu cấy chỉ hấp thụ ñược
một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó nhất. Hơn nữa, những chất ñộc do chính
thực vật tiết ra bị tích lũy xung quanh mẫu cấy và ức chế trở lại sự sinh trưởng
và phát triển của thực vật (thường gặp nhất là hiện tượng tích tụ phenol gây chết

mẫu).
- Chất dinh dưỡng ñược bổ sung cùng với agar trước khi hấp, kết quả là
các cấu tử dinh dưỡng phân bố ñều khắp các lỗ, trong khi mô cấy chỉ sử dụng
ñược một lượng nhỏ chất dinh dưỡng ở phạm vi hẹp quanh mẫu nên hệ số hấp
thu chất dinh dưỡng của mẫu cấy trong môi trường thạch thấp. Khi cây sử dụng
hết chất dinh dưỡng xung quanh, cây khó có thể hấp thu phần dinh dưỡng phân
bố ở những vị trí xa mẫu, do vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu bị
giảm sút.
- Môi trường bán rắn chỉ sử dụng ñược một lần, không cho phép thay ñổi
thành phần môi trường cho những giai ñoạn phát triển khác nhau của thực vật vi
nhân giống, ñòi hỏi mẫu cấy phải ñược cấy chuyền liên tục.
- Khi ñặt mẫu vào môi trường thạch, mẫu sẽ phát triển không ñồng ñều do
có những vị trí trên mẫu không ñược tiếp xúc với môi trường
b. Hệ thống nuôi cấy mô trên môi trường lỏng
* Hệ thống nuôi cấy in vitro sử dụng môi trường lỏng tĩnh : Nuôi cấy
lỏng là một cách thức lý tưởng cho mục tiêu giảm chi phí và tự ñộng
hóa vi nhân giống thực vật. Nuôi cấy lỏng cung cấp ñiều kiện nuôi cấy ñồng
nhất hơn, môi trường có thể thay mới mà không cần phải chuyển mẫu sang bình
chứa khác, có thể thực hiện khử trùng bằng vi lọc và việc cọ rửa chai lọ sau khi
nuôi cấy cũng ñơn giản hơn. So với việc nuôi cấy trên thạch, nuôi cấy lỏng cho
phép sử dụng những loại bình nuôi cấy dung tích lớn từ ñó giảm ñược số lần cấy
chuyền. Mô của một số loài thực vật biểu hiện tốt hơn trên môi trường lỏng so
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14

với trên môi trường ñặc, chẳng hạn như chồi cây ñào (Prunus persica), phôi
soma lúa mì (Triticum aestivum), và phôi soma cây bông (Gossypium
hirsutum). Nuôi cấy lỏng thực ra ñã có từ rất lâu ñời. Trong thời kỳ ñầu,
Haberlandt ñã tiến hành nuôi cấy mô lá của các cây ñơn tử diệp bằng môi trường

lỏng. Việc nghiên cứu nồng ñộ khoáng và các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
cũng ñược thực hiện với môi trường lỏng. Tuy nhiên, môi trường lỏng ñược sử
dụng trong thời kỳ này ñơn giản chỉ là môi trường lỏng tĩnh. Hệ thống nuôi cấy
lỏng có nhiều lợi ñiểm không thể phủ nhận:
- Môi trường nuôi cấy lỏng có ñộ ñồng nhất cao do các chất tinh dưỡng
khuếch tán ñều trong dung môi lỏng, tạo ñiều kiện ñể mẫu cấy sử dụng triệt ñể
chất dinh dưỡng sẵn có. Hơn nữa, toàn bộ bề mặt mẫu ñược tiếp xúc trực tiếp
với môi trường nên việc hấp thu chất dinh dưỡng hiệu quả hơn, cây sinh trưởng
tốt hơn, thời gian nuôi cấy có thể ñược rút ngắn.
- Nuôi cấy lỏng cho phép kiểm soát các thông số hóa lý một cách chủ
ñộng, ñây là một ñiều kiện cần có ñể thực hiện tự ñộng hóa. Do vậy, nuôi cấy
lỏng rất phù hợp khi triển khai ra quy mô công nghiệp.
- Chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm thấp hơn so với nuôi cấy bán rắn,
tiết kiệm ñược thời gian và lao ñộng. Bên cạnh những mặt mạnh, việc nuôi cấy
lỏng cũng vấp phải nhiều khó khăn, nhất là khả năng thoáng khí kém, hiện
tượng thủy tinh thể và ñòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp. Một vấn ñề lớn thường
gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng ñó là sự nhiễm vi sinh vật. Nấm mốc, vi
khuẩn và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên
nhân gây mất nguồn mẫu thực vật chủ yếu trong các phòng thí nghiệm thương
mại. Vì là môi trường lỏng nên sự nhiễm vi sinh vật sẽ là rất nhanh và nghiêm
trọng hơn cả so với các loại môi trường khác. Sự gây nhiễm có thể xuất phát từ
các giai ñoạn thao tác chuẩn bị và ñiều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí
nghiệm, ñể hạn chế nguy cơ bị nhiễm, người ta thường tạo một không gian vô