kiểm tra mức độ nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí escherichia coli và salmonella spp trên các mẫu thịt tươi

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.42 MB, 84 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KIỂM TRA MỨC ĐỘ NHIỄM TỔNG SỐ VI SINH

VẬT HIẾU KHÍ, Escherichia coli VÀ Salmonella spp.

TRÊN CÁC MẪU THỊT TƯƠI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD:

ThS. Nguyễn Văn Minh ThS. Trần Thị Ánh Nguyệt

SVTH:

Trương Thị Hồng Duyên

MSSV: 1253010064 Khóa: 2012 - 2016

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016.

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ThS. Nguyễn Văn Minh và ThS. Trần Thị Ánh Nguyệt đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, giúp đỡ em trong q trình thực tập và hồn thành bài báo cáo thực tập tốt nghiệp, khóa luận tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn quý Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 đã tạo mọi điều kiện để em hồn thành tốt khóa thực tập, cảm ơn tất cả các anh chị tại phòng Vi sinh – GMO đã nhiệt tình chỉ dạy em trong suốt thời gian vừa qua. Đặc biệt cảm ơn chị Phan Thị Phương, chị Đỗ Thị Phượng, chị Đinh Thị Thu Hồng, chị Nguyễn Uyên Vy, anh Nguyễn Tấn Trường đã quan tâm, giúp đỡ, chỉ dạy em trong suốt thời gian vừa qua.

Qua đây, em cũng xin được gửi lời tri ân các thầy cô trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp em được thực tập tốt nghiệp tại một nơi có uy tín và chuyên môn cao. Đặc biệt, cảm ơn ban chủ nhiệm bộ môn công nghệ sinh học cùng tất cả các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm bài đã dành thời gian xem xét bài báo cáo của em, em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ thầy, cơ để em có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm trên con đường nghiên cứu phía trước.

Cuối cùng, con xin được gửi lời cảm ơn tới ba mẹ và gia đình đã ln ln ủng hộ, động viên, quan tâm con trong suốt quá trình học tập, cảm ơn bạn bè đã luôn ở bên giúp đỡ hết mình những lúc khó khăn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Trương Thị Hồng Duyên

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

TSVSVHK: Tổng số vi sinh vật hiếu khí PCA: Plate count agar

TBX: Tryptone Bile X-Glucuronide BPW: Buffered peptone water

RVS: Rappaport-Vassilliadis with soya

MKTTn: Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin XLD: Xylose - Lysine deoxycholate agar

HE: Hektoen enteric agar h: giờ

GMO: Genetically Modified Organism

ISO: International Organization for Standardization.

E. coli: Escherichia coli

QCVN: Quy chuẩn Việt Nam

QUATEST 3: Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 PCR: Polymerase Chain Reaction

(-): Âm tính (+): Dương tính Đ: Đạt

KĐ: Không đạt

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Vi khuẩn Escherichia coli qua kính hiển vi điện tử ... 17

Hình 1.2: Vi khuẩn Salmonella qua kính hiển vi điện tử ... 19

Hình 1.3: Nguyên tắc hoạt động của PCR ... 22

Hình 3.1: TSVSVHK trên mơi trường PCA ... 54

Hình 3.2: E. coli trên mơi trường TBX. ... 56

Hình 3.3: Salmonella trên mơi trường XLD. ... 60

Hình 3.4: Kết quả thử sinh hóa Salmonella dương tính. ... 60

Hình 3.5: Salmonella trên mơi trường MKTTn ... 61

Hình 3.6: Khuẩn lạc Salmonella trên mơi trường NA. ... 61

Hình 3.7: Salmonella trên mơi trường RVS. ... 62

Hình 3.8: Salmonella trên mơi trường HE.. ... 62

Hình 3.9: Phản ứng kháng huyết thanh O của Salmonella. ... 63

Hình 3.10: Kết quả điện di Salmonella spp. trên gel agarose 2% ... 63

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Quy trình chung trong kiểm nghiệm mẫu ... 26

Sơ đồ 2.2: Kiểm tra TSVSVHK đối với mẫu thịt tươi ... 30

Sơ đồ 2.3: Kiểm nghiệm E. coli đối với mẫu thịt tươi ... 33

Sơ đồ 2.4: Kiểm nghiệm Salmonella spp. đối với mẫu thịt tươi. ... 38

Sơ đồ 2.5: Kiểm nghiệm Salmonella spp. đối với mẫu thịt tươi theo phương pháp PCR ... 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Số vụ ngộ độc thực phẩm từ năm 2011 đến 2015 ở Việt Nam ... 16

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Bảng 2.1: Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong mẫu thịt tươi. ... 27

Bảng 2.2: Bảng các chỉ tiêu vi sinh vật được quy định kiểm nghiệm đối với mẫu thịt tươi ... 28

Bảng 2.3: Nồng độ các thành phần phản ứng PCR phát hiện Salmonella spp. ... 40

Bảng 2.4: Chương trình nhiệt trên máy PCR...40

Bảng 3.1: Kết quả kiểm nghiệm TSVSVHK trên các mẫu thịt heo tươi ... 44

Bảng 3.2: Kết quả kiểm nghiệm E. coli trên các mẫu thịt heo tươi ... 38

Bảng 3.3: Kết quả kiểm nghiệm Salmonella spp. trên các mẫu thịt heo tươi ... 47

Bảng 3.4: Kết quả kiểm nghiệm TSVSVHK trên các mẫu thịt bò tươi ... 49

Bảng 3.5: Kết quả kiểm nghiệm E. coli trên các mẫu thịt bò tươi ... 50

Bảng 3.6: Kết quả kiểm nghiệm Salmonella spp. trên các mẫu thịt bò tươi ... 52

Bảng 3.7: Kết quả kiểm nghiệm TSVSVHK trên các mẫu thịt gà tươi ... 53

Bảng 3.8: Kết quả kiểm nghiệm E. coli trên các mẫu thịt gà tươi ... 55

Bảng 3.9: Kết quả kiểm nghiệm Salmonella spp. trên các mẫu thịt gà tươi theo phương pháp PCR ... 57

Bảng 3.10: Kết quả kiểm nghiệm Salmonella spp. trên các mẫu thịt gà tươi theo phương pháp truyền thống ( thử sinh hóa) ... 58

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu TSVSVHK đối với các mẫu thịt heo tươi ... 45

Biểu đồ 3.2: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu E. coli đối với các mẫu thịt heo tươi ... 46

Biểu đồ 3.3: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu Salmonella spp. đối với các mẫu thịt heo tươi ... 47

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

Biểu đồ 3.4: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu TSVSVHK đối với các mẫu thịt bò tươi ... 49 Biểu đồ 3.5: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu E. coli đối với

các mẫu thịt bò tươi ... 51 Biểu đồ 3.6: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu Salmonella

spp. đối với các mẫu thịt bò tươi ... 52 Biểu đồ 3.7: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu TSVSVHK đối

với các mẫu thịt gà tươi ... 54 Biểu đồ 3.8: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu E. coli đối với

các mẫu thịt gà tươi ... 55 Biểu đồ 3.9: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu Salmonella

spp. đối với các mẫu thịt gà tươi ... 58 Biểu đồ 3.10: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % không đạt về các chỉ tiêu vi sinh giữa các

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 9

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 11

1. TỔNG QUAN VỀ TRUNG TÂM KỸ THUẬT 3... 12

1.1. Giới thiệu chung ... 12

2.2. Tổng quan về tổng số vi sinh vật hiếu khí ... 16

2.3. Tổng quan về Escherichia coli ... 17

2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Escherichia coli ... 17

2.3.2. Điều kiện nuôi cấy... 17

2.3.3. Môi trường ni cấy ... 17

2.3.4. Tính chất sinh hóa. ... 18

2.3.5. Kháng nguyên và độc tố ... 18

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

1.1. Mẫu kiểm nghiệm ... 24

1.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ... 24

1.4.2. Môi trường (xem chi tiết phần phụ lục) ... 25

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 26

2.1. Quy trình kiểm tra chung ... 26

2.2. Phương pháp phân tích vi sinh vật ... 27

2.2.1. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí ... 28

2.2.2. Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm đĩa ... 30

2.2.3. Định tính Salmonella spp ... 33

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

2.2.3.1. Chuẩn bị dịch nuôi cấy ban đầu cho bước tăng sinh ... 33

2.2.4. Định tính Salmonella spp. theo phương pháp PCR ... 39

2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu, tiền tăng sinh và tăng sinh chọn lọc... 39

2.2.4.2. Chuẩn bị DNA khuôn ...39

2.2.4.3. Sàng lọc bằng phương pháp PCR ...39

2.2.4.4. Trình tự mồi ...40

2.2.4.5. Điện di trên gel agarose ...40

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 44

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống con người ngày càng được nâng cao thì nhu cầu dinh dưỡng trong bữa ăn hàng ngày được cải thiện và vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm cũng được quan tâm nhiều hơn. Trên thị trường, thực phẩm có mặt ngày càng đa dạng để đáp ứng nhu cầu thiết yếu của xã hội. Tuy nhiên, không phải loại thực phẩm nào cũng đảm bảo chất lượng và hợp vệ sinh, sử dụng những loại thực phẩm này là một trong những nguyên nhân dẫn đến các vụ ngộ độc thực phẩm.

Thịt là một trong những thực phẩm đem lại giá trị dinh dưỡng cao không thể thiếu trong những bữa ăn hàng ngày của người dân Việt Nam.Theo số liệu tính tốn của Sở Cơng thương ước tính sản phẩm Theo số liệu tính tốn của Sở Cơng thương ước tính sản phẩm thịt gia súc gia cầm đã sử dụng của Hà Nội năm 2013 là 272.000 tấn (745,2 tấn/ ngày), trong đó thịt lợn là 179.652 tấn (492,2 tấn/ ngày), dự tính năm 2015 là 314.000 tấn (tăng 13% so với năm 2013) (872,2 tấn/ ngày), trong đó thịt lợn là 205.970 tấn (572,1 tấn/ ngày), thịt trâu bò là 36.011 tấn (100 tấn/ ngày), thịt gia cầm là 72.021 tấn (200,1 tấn/ ngày) [27]. Để đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ lớn trên thị trường, các cơ sở sản xuất, chế biến tự phát, nhỏ lẻ bày bán tràn lan ra đời mỗi ngày mà khơng có giấy phép sản xuất, điều này dẫn đến tình trạng mất kiểm sốt an tồn, thịt đến tay người tiêu dùng không đạt chất lượng [28]. Hơn nữa, thịt chứa nhiều chất dinh dưỡng là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật có hại sinh sống và phát triển, nếu sử dụng phải những loại thịt này sẽ dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm làm ảnh hưởng tới sức khỏe và tính mạng người tiêu dùng.

Theo Bộ Y tế, trong 10 tháng đầu năm 2015 cả nước ghi nhận 150 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 4.077 người mắc và 21 người tử vong. Nguyên nhân ban đầu của các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật, độc tố tự nhiên và hóa chất, cịn lại là chưa xác định được nguyên nhân gây ngộ độc [23]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2015, số ca tử vong do vi khuẩn Salmonella gây nên là 52.000, số ca tử vong do vi khuẩn E. coli là 37.000 [24].

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, nhằm đánh giá mức độ đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm trong sản phẩm và bản thân tơi có một sự quan tâm đặc biệt đến

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

tình trạng vệ sinh trong thực phẩm hiện nay, với niềm đam mê, mong muốn được học hỏi, thực hiện và trải nghiệm các phương pháp, kỹ năng trong thực tế. Đồng thời, được sự đồng ý của khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh và sự cho phép của Ban lãnh đạo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo

lường Chất lượng 3, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Kiểm tra mức độ nhiễm

tổng số vi sinh vật hiếu khí, Escherichia coli và Salmonella spp. trên các mẫu thịt tươi” dựa trên QCVN 8-3:2012/BYT.

- Mục tiêu tổng quát

Kiểm tra mức độ nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí, Escherichia coli và

Salmonella spp. trên các mẫu thịt tươi được thu tại các chợ tỉnh Đồng Nai từ 22/02/2016 đến 29/04/2016.

- Nội dung thực hiện

Tìm hiểu về tổng số vi sinh vật hiếu khí, Escherichia coli và phương pháp định lượng, Salmonella spp. và phương pháp định tính.

Khảo sát tỉ lệ nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí, Escherichia coli và

Salmonella spp. trên các mẫu thịt tươi được thu tại các chợ tỉnh Đồng Nai từ 22/02/2016 đến 29/04/2016.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

1. TỔNG QUAN VỀ TRUNG TÂM KỸ THUẬT TIÊU CHUẨN ĐO LƯỜNG CHẤT LƯỢNG 3 (QUATEST 3)

1.1

Giới thiệu chung

QUATEST 3 là tổ chức khoa học công nghệ thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng – Bộ Khoa học và Công nghệ, được thành lập từ tháng 5 năm 1975 trên cơ sở Viện Định chuẩn Quốc gia trước đây.

QUATEST 3 có đội ngũ chuyên viên, kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu và có nhiều kinh nghiệm, hệ thống phịng thí nghiệm với trang thiết bị hiện đại theo chuẩn mực quốc tế.

QUATEST 3 áp dụng hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu chuẩn ISO 9001 cho hoạt động điều hành, hoạt động tư vấn đào tạo và Trang thiết bị thí nghiêm, lĩnh vực thí nghiệm được cơng nhận phù hợp với tiêu chuẩn ISO/IEC 17025, lĩnh vực giám định hàng hóa được cơng nhận phù hợp với ISO/IEC 17020, lĩnh vực chứng nhận sản phẩm được công nhận phù hợp với ISO/IEC Guide 65 và lĩnh vực cung cấp dịch vụ thử nghiệm thành thạo theo ISO/IEC 17043.

Qua hơn 35 năm hoạt động, QUATEST 3 đã được biết đến như một đơn vị hàng đầu tại Việt Nam trong lĩnh vực cung cấp dịch vụ kỹ thuật về tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng và đánh giá sự phù hợp.

Với nỗ lực nâng cao năng lực kỹ thuật của các phòng thử nghiệm để được thừa nhận quốc tế và khu vực. Phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO của QUATEST 3 được các nước ASEAN chọn là phòng thử nghiệm đối chứng ( ASEAN Reference Laboratory – ARL) theo chương trình EC – ASEAN và Phòng thử nghiệm Điện được các nước ASEAN thừa nhận kết quả thử nghiệm đối với các sản phẩm điện gia dụng theo thoả thuận thừa nhận lẫn nhau trong lĩnh vực thử nghiệm điện và điện tử (ASEAN EE MRA).

QUATEST 3 đang triển khai chương trình mở rộng sự thừa nhận của khu vực và quốc tế cho các lĩnh vực thử nghiệm khác [22].

1.2 Địa chỉ liên lạc

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

‐ Kiểm tra, giám định và thẩm định kỹ thuật về chất lượng, vệ sinh, an toàn của sản phẩm, hàng hóa, vật liệu, cấu kiện cơng trình.

‐ Thử nghiệm vật liệu, sản phẩm, hàng hóa.

‐ Kiểm định, hiệu chuẩn và đánh giá phương tiện đo.

‐ Chứng nhận sự phù hợp của sản phẩm với tiêu chuẩn và qui chuẩn kỹ thuật, chứng nhận rau, quả và chè an toàn phù hợp với VietGAP.

‐ Kiểm định và đánh giá an tồn cơng nghiệp.

‐ Khảo sát, quan trắc, phân tích, đánh giá thực trạng và tác động môi trường. ‐ Khảo sát, đánh giá các điều kiện kỹ thuật, thực trạng công nghệ, chuyển giao

công nghệ.

‐ Đào tạo và tư vấn năng suất chất lượng, ứng dụng kỹ thuật mã số - mã vạch. ‐ Đào tạo nghiệp vụ, chuyên môn và kỹ thuật về tiêu chuẩn đo lường chất

lượng.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

‐ Nghiên cứu, chế tạo và cung cấp các chuẩn đo lường, mẫu chuẩn và các phương tiện đo. Trang bị và cung cấp dịch vụ bảo trì, bảo dưỡng và sửa chữa các phương tiện đo lường, thử nghiệm, thiết bị kỹ thuật.

‐ Tiếp nhận đăng ký và tư vấn ứng dụng mã số, mã vạch.

‐ Cung cấp thông tin, tiêu chuẩn và các tài liệu liên quan đến tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng [22].

1.4 Các lĩnh vực hoạt động của Trung Tâm

‐ Dịch vụ thử nghiệm. ‐ Dịch vụ đo lường. ‐ Dịch vụ giám định. ‐ Kiểm tra.

‐ Chứng nhận. ‐ Dịch vụ tư vấn.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Các thiết bị để thử nghiệp thực phẩm biến đổi gen như PCR Real Time, máy ly tâm lạnh, máy điện di ngang, thiết bị nhân gen, tủ lắc ổn nhiệt, hệ thống giải trình tự gen, hệ thống ELISA… [22].

1.6 Chính sách chất lượng

QUATEST 3 cam kết ln làm hài lòng khách hàng khi cung cấp các dịch vụ kỹ thuật tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng theo nguyên tắc: [22]

‐ Chính xác ‐ Khách quan ‐ Kịp thời ‐ Hiệu quả

Ngộ độc tích luỹ: là trạng thái mà cơ thể nhiễm độc với liều lượng thấp, chưa gây ra triệu chứng liền mà phải trải qua một thời gian dài chất độc tích luỹ trong cơ thể làm biến đổi các quá trình sinh lý, sinh hố lâu dài rồi mới gây ra triệu chứng [19].

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

2.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm

Theo báo cáo hằng năm của Bộ Y tế Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta từ năm 2011 đến 2015 diễn biến phức tạp, trung bình mỗi năm có 167 vụ ngộ độc xảy ra, số người mắc là 5.109 người gây ra 31 ca tử vong.

Bảng 1.1: Số vụ ngộ độc thực phẩm từ năm 2011 đến 2015 ở Việt Nam [23,29].

(Vụ)

Số người mắc (Người)

Số người chết (Người)

2.2 Tổng quan về tổng số vi sinh vật hiếu khí

Vi khuẩn hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxy tự do, tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm [10].

Vi khuẩn hiếu khí thường có mặt nhiều trong thực phẩm, sữa, nước uống,... tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong thực phẩm càng nhiều cho thấy thực phẩm đó càng bị nhiễm bẩn, có thể gây nguy hiểm cho người dùng và thực phẩm đó hư hỏng càng nhanh. Đặc biệt vi khuẩn được chú ý kiểm tra trên thịt tươi và các sản

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

phẩm thịt do nó dễ nhiễm từ môi trường vào thịt trong quá trình giết mổ, vận chuyển và bày bán [8].

2.3 Tổng quan về Escherichia coli

Hình 1.1: Vi khuẩn Escherichia coli qua kính hiển vi điện tử [26].

2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Escherichia coli

E. coli là trực khuẩn hình gậy, ngắn, kích thước 2 - 3 × 0.6 μm. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, có khi xếp thành hình chuỗi ngắn [6].

Là trực khuẩn Gram âm, khơng sinh bào tử. Trực khuẩn có thể có vỏ, có lơng, di động (một số chủng khơng di động) [2].

2.3.2 Điều kiện nuôi cấy

E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở nhệt độ 5 - 40°C, nhiệt độ thích hợp là 37°C.

Khoảng pH thích hợp là từ 7,2 - 7,4 và có thể phát triển được ở pH 5 - 8 [5].

2.3.3 Môi trường nuôi cấy

Trên môi trường TBX: khuẩn lạc điển hình có màu xanh lơ. Trên mơi trường EMB: khuẩn lạc có màu tím đen và có ánh kim. Trên mơi trường Endo: khuẩn lạc có màu đỏ.

Trên mơi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy 37°C trong 24 h, vi khuẩn E.

coli phát triển rất nhanh, mơi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

đáy, đơi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, mơi trường có mùi phân thối (phản ứng Indol dương tính).

Trên mơi trường thạch thường: vi khuẩn phát triển, sau 24 h tạo thành những khuẩn lạc tròn trơn nhẵn, đường kính 2 - 3 mm, màu xanh nhạt.

Trên môi trường Macconkey: sau khi nuôi cấy 24 h ở 37°C, hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen (do lên men đường lactose sản sinh axit), xung quanh có vùng mờ sương (do lên men đường lactoza, sinh hơi).

Trên môi trường thạch Brilliant Green: sau 24 h ni cấy ở 37°C, khuẩn lạc có màu vàng chanh.

Trên môi trường thạch máu: sau 24 h nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn E. coli hình

thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn màu sáng, kích thước từ 1 - 2 mm. Khuẩn lạc có thể dung huyết hoặc không dung huyết tùy vào chủng.

Trên môi trường thạch Deoxycholate citrat: vi khuẩn E. coli không mọc do

không sử dụng được nguồn cacbon từ citrat [15].

2.3.5 Kháng nguyên và độc tố

Kháng nguyên: E. coli có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K, 50 yếu tố H và

được chia thành rất nhiều tuýp huyết thanh khác nhau.

E. coli được chia thành 5 nhóm chủ yếu:

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

ETEC (Enterotoxingenic E.coli): E. coli sinh độc tố ruột. EAEC (Enteroaggregative E. coli): E. coli kết tập ở ruột.

EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E.coli gây xuất huyết ruột. EIEC (Enteroinvarive E. Coli): E. coli xâm lấn niêm mạc ruột. EPEC (enteropathogenic E. Coli): E. coli gây bệnh đường ruột [1,7].

2.3.6 Khả năng gây bệnh

E. coli gây bệnh tiêu chảy theo phân ra ngồi và có thể gây thành dịch. Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác [1].

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Trên môi trường thạch TSI: phần thạch nghiêng có màu đỏ, phần đáy ống nghiệm có màu vàng, có hoặc khơng có H2S, vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch có khi đẩy thạch khỏi đáy ống nghiệm.

Trên mơi trường Endo: khuẩn lạc có màu vàng.

Trên mơi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay khơng có

tâm đen. Một số dịng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần

Trên mơi trường BPLS: khuẩn lạc có màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển màu đỏ.

Trên mơi trường SS: xuất hiện khóm trắng có tâm đen.

Trên mơi trường BGA: khuẩn lạc nhỏ có màu hồng nhạt, trịn, bóng, tâm hơi khơ, đường kính khuẩn lạc từ 1 - 4 mm [8,10,20].

2.4.3 Đặc tính sinh hóa

Salmonella cho kết quả các phản ứng: ‐ TSI: đỏ/ vàng, có hay khơng có H2S. ‐ Indol (-)

‐ VP (-) ‐ LDC (+) ‐ Urea (-)

‐ β-galactosidase (-)

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Salmonella lên men đường glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, khơng phân giải ure, khơng có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S.

Salmonella có khả năng tạo ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá O, H, Vi [10].

2.4.4 Khả năng gây bệnh

Salmonella chủ yếu gây bệnh thương hàn ở người. Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột. Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận [1,6].

- Bước 2: ( bắt cặp ) trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 °C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.

- Bước 3: ( kéo dài ) nhiệt độ được tăng lên 72 °C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: là số bản sao của chuỗi mã hóa. n: là số chu kỳ.

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao [18].

Hình 1.3: Nguyên tắc hoạt động của PCR [30]

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

1. VẬT LIỆU

1.1 Mẫu kiểm nghiệm

Số lượng mẫu: 60 mẫu.

Mẫu được ký hiệu H1 đến H20 là mẫu thịt heo tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016.

Mẫu được ký hiệu B1 đến B20 là mẫu thịt bò tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016.

Mẫu được ký hiệu G1 đến G20 là mẫu thịt gà tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016.

Loại mẫu: thịt heo tươi, thịt bò tươi, thịt gà tươi.

1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: Phịng thí nghiệm vi sinh – GMO trung tâm Quatest 3, số 7, đường số 1, khu cơng nghiệp Biên Hồ 1, Đồng Nai.

Thời gian thực hiện: từ 22/02/2016 đến 29/04/2016

1.1.2 Thiết bị

‐ Tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy vô khuẩn. ‐ Nồi hấp tiệt trùng.

‐ Buồng UV ‐ Lò viba

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

‐ Cân

‐ Máy vortex ‐ Máy ly tâm ‐ Máy PCR ‐ Buồng điện di

1.4 Hố chất và mơi trường

1.4.1 Hố chất và thuốc thử

‐ Cồn ‐ Nước cất

‐ Nước muối sinh lý ‐ ONPG

‐ Thuốc thử Kowacs ‐ KOH 40%

‐ Creatine ‐ α-naphtol

‐ Anti – O serum ‐ Anti – Vi serum ‐ Anti – H serum ‐ TAE

1.4.2 Môi trường (xem chi tiết phần phụ lục)

‐ Plate count agar

‐ Tryptone Bile X-Glucuronide (TBX) ‐ Xylose - Lysine deoxycholate agar (XLD) ‐ Hektoen enteric agar (HE)

‐ Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin (MKTTn) ‐ Triple sugar iron agar (TSI)

‐ Urea broth

‐ Dung dịch đệm phosphate ‐ MR-VP medium (Clark-Lubs)

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

‐ Buffered peptone water (BPW)

‐ L-Lysine decarboxylase (LDC) medium

‐ Rappaport-Vassilliadis with soya (RVS broth). ‐ Tryptone/ Tryptophan medium.

‐ Nutrient agar (NA)

2.1 Quy trình kiểm tra chung

⮚ Lưu trữ và bảo quản mẫu

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Mẫu thịt tươi nếu chưa được phân tích thì lưu giữ ở 0°C đến 20°C, phân tích mẫu sau khơng q 24 h.

Đối với các mẫu sau khi phân tích cũng cần lưu giữ ở nhiệt độ như trên.

2.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật

Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm (QCVN 8-3:2012/BYT) ngày 01 tháng 03 năm 2012 của Bộ trưởng Bộ Y tế, thịt tươi được kiểm tra theo tiêu chuẩn sau:

Bảng 2.1: Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong mẫu thịt tươi [11].

TSVSVHK ISO 4833 – 1: 2013

E. coli TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001)

Salmonella spp.

TCVN 4829:2005 Sửa đổi lần 1 : 2008 (ISO 6579 : 2002 AMENDMENT 1: 2007),

QTTN/KT3 069 : 2013 QTTN/KT3 069 : 2013

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Bảng 2.2: Bảng các chỉ tiêu vi sinh vật được quy định kiểm nghiệm đối với thịt tươi [11].

Tên chỉ tiêu

Kế hoạch lấy mẫu

Giới hạn tối đa cho phép

(CFU/mL) Phân loại chỉ tiêu

TSVSVHK 5 2 5×105 5×106 B

n: số đơn vị mẫu được lấy từ lô hàng cần kiểm tra.

c: số đơn vị mẫu tối đa có kết quả nằm giữa m và M, tổng số mẫu có kết quả nằm giữa m và M vượt quá c là không đạt.

m: là mức giới hạn mà các kết quả không vượt quá mức này là đạt, nếu các kết quả vượt q mức này thì có thể đạt hoặc không đạt.

M: là mức giới hạn tối đa mà không mẫu nào được phép vượt quá. Chỉ tiêu loại A: bắt buộc phải thử nghiệm để đánh giá hợp quy. KPH: không phát hiện.

2.2.1 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa theo ISO 4833 – 1: 2013

2.2.1.1 Chuẩn bị dung dịch ban đầu và pha loãng

Cân x (g) mẫu và bổ sung 9x mL dung dịch đệm photphate, đem đồng nhất. Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân đến nồng độ mong muốn từ mẫu ban đầu [3].

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

‐ Sử dụng ít nhất 2 dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp để cấy vào đĩa petri sao cho thu được số khuẩn lạc từ 10 đến 300 trên mỗi đĩa.

‐ Rót khoảng từ (12 – 15) mL môi trường PCA ở (44 - 47)oC đã đun chảy vào mỗi đĩa petri. Thời gian từ lúc chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi đổ môi trường không quá 45 phút.

‐ Trộn mẫu bằng cách xoay đĩa và đặt đĩa lên mặt phẳng ngang để đông tự nhiên.

‐ Để tránh khuẩn lạc mọc lan đổ thêm một lớp 4 mL PCA lên bề mặt môi trường đã cấy mẫu.

‐ Lật úp các đĩa và đặt vào tủ ấm ở ( 30 ± 1 )oC / (72 ± 3) h [3].

2.2.2.2 Kết quả

Chỉ đếm các đĩa có khuẩn lạc từ 15 – 300 khuẩn lạc.

Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ, nếu ít hơn một phần tư đĩa mọc dày lan rộng thì đếm số khuẩn lạc trên phần đĩa cịn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa. Nếu quá một phần tư mọc dày lan rộng thì bỏ đĩa đó và

khơng đếm.

Tính tổng số vi sinh vật có trong 1 g (hay 1 mL) mẫu (X) theo công thức:

= ∑

× × ( + 0,1 ), CFU/g (һоặс mL) ‐ Trong đó:

X: tổng số vi khuẩn hiếu khí, số khuẩn lạc/g (mL).

∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa. n1: số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất.

n2: số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai. d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất. V: thể tích cấy trên mỗi đĩa.

Nếu tất cả các đĩa khơng có khuẩn lạc nào mọc, X< 1/d CFU/g (mL) [3].

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Kiểm nghiệm tổng số vi sinh vật hiếu khí được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.2: Kiểm tra TSVSVHK đối với mẫu thịt tươi

2.2.2 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm đĩa theo TCVN 7924-2:2008 2.2.2.3 Chuẩn bị dung dịch ban đầu và pha loãng

Cân x (g) mẫu, bổ sung 9x mL dung dịch đệm photphate, đem đồng nhất. Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân đến nồng độ mong muốn từ mẫu ban đầu [15].

Thực hiện ở các độ pha loãng tiếp theo (nếu cần) Ủ đĩa ở ( 30 ± 1 )oC / (72 ± 3) h.

Đọc kết quả Mẫu ban đầu

Pha loãng mẫu đến các nồng độ cần thiết 10-1

, 10-2, 10-3,... Đồng nhất mẫu

1 mL 1 mL

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

‐ Rót khoảng từ (12 – 15) mL mơi trường TBX đã đun chảy để vừa nguội đến khoảng 44 - 47oC vào mỗi đĩa petri. Thời gian giữa q trình cấy mẫu và đổ mơi trường khơng q 15 phút.

‐ Trộn đều mẫu với môi trường bằng cách xoay đĩa và đặt đĩa lên mặt phẳng ngang để đơng đặc hồn tồn.

‐ Lật ngược đĩa đã cấy mẫu và ủ đĩa petri ở 44oC / (18 -24) h [15].

2.2.2.5 Kết quả a. Trường hợp 1

‐ Trong trường hợp có từ (15 -150) khuẩn lạc đặc trưng. ΣC

X =  , CFU / mL ( hoặc g) V.( n1+0,1 n2).d

Trong đó:

X: tổng số E. coli dương tính β- glucuronidase.

ΣC: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ở hai nồng độ liên tiếp. n1: số đĩa đếm ở độ pha loãng thứ nhất.

n2: số đĩa đếm ở độ pha loãng thứ hai.

d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng đầu tiên để đếm khuẩn lạc. V: thể tích cấy (1 mL).

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc đặc trưng trên hai đĩa ở huyền phù ban đầu nhỏ hơn 15 CFU, kết quả được tính như sau:

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc màu xanh và không đặc trưng trên 2 đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) > 300 CFU và có khuẩn lạc xanh rõ rệt và nếu trên 2 đĩa ở nồng độ tiếp theo (d2) có số khuẩn lạc <300 CFU mà khơng có khuẩn lạc màu xanh được đếm thì kết quả được tính như sau:

dXd < <

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng trên 2 đĩa ở nồng độ pha lỗng đầu tiên (d1) >300 CFU và khơng có khuẩn lạc xanh rõ rệt và nếu trên 2 đĩa ở nồng độ tiếp theo (d2) có số khuẩn lạc < 300 CFU mà khơng có khuẩn lạc màu xanh được đếm thì kết quả được tính như sau:

dX <

‐ Nếu số khuẩn lạc đặc trưng đếm được ở tất cả các độ pha loãng đều lớn hơn 150 màu xanh thì kết quả được tính như sau:

X > 150/d Trong đó: d là độ pha lỗng cuối cùng

‐ Trong trường hợp chỉ có 2 đĩa ở độ pha loãng thấp nhất ( nồng độ cao nhất) chứa nhỏ hơn 150 khuẩn lạc đặc trưng, tính kết quả theo cơng thức:

+ Nếu số khuẩn lạc trên mỗi đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) nằm trong khoảng từ 150 đến 167 ( khoảng trên giới hạn tin cậy của 150) tính theo công thức:

= ∑

× ( + 0,1 ) × , CFU/mL (һоặс g)

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

+ Nếu số khuẩn lạc trên mỗi đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) cao hơn 167 (khoảng trên giới hạn tin cậy của 150) thì lưu ý chỉ đếm khuẩn lạc ở độ pha loãng d2 và tính kết quả theo cơng thức: [15]

X= Σ

. . , số khuẩn lạc / mL ( hoặc g) Kiểm nghiệm E. coli được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.3: Kiểm nghiệm E. coli đối với mẫu thịt tươi

2.2.3 Định tính Salmonella spp. theo ISO 6579 : 2002 amendment 1: 2007

Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương, hiện diện chung với một số lượng lớn các loại vi khuẩn thuộc họ Enterobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh

và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella [8].

2.2.3.1 Chuẩn bị dịch ni cấy ban đầu cho bước tăng sinh

Rót khoảng 12 – 15 mL TBX lắc đều, để nguội tự nhiên.

Đọc kết quả Mẫu ban đầu Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu đến các nồng độ cần thiết 10-1

, 10-2, 10-3,...

1 mL 1 mL

Thực hiện ở các nồng độ pha loãng tiếp theo (nếu cần) Lật ngược đĩa đã cấy mẫu và ủ đĩa petri ở 44°C /(18 - 24) h.

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Cân 25 g mẫu thịt đã đồng nhất cho vào bao nilon vô trùng và bổ sung 225 mL môi trường BPW cho vào tủ ấm ủ ở (37 ± 1)oC / (18 ± 2) h [12].

2.2.3.2 Tăng sinh chọn lọc

Dùng pipet vô trùng hút 0,1 mL canh trùng cho vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường RVS broth, ủ ở (41,5 ± 1)oC / (24 ± 3) h đồng thời hút 1 mL canh trùng cho vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường MKTTn broth.

Các khuẩn lạc Salmonella spp. đặc trưng trên môi trường:

Trên XLD: Salmonella cho khuẩn lạc có hoặc khơng có tâm đen, có quầng

trong sáng hoặc hơi đỏ ( nếu lên men lactose (+) khuẩn lạc sẽ có màu vàng).

Trên HE: Khuẩn lạc có màu xanh dương đến xanh lá, có hoặc khơng có tâm [12].

2.2.3.4 Chọn khuẩn lạc để khẳng định

Chọn các khuẩn lạc điển hình từ mỗi mơi trường phân lập, sử dụng que cấy trịn cấy ria trên đĩa môi trường NA, ủ các đĩa ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h sao cho thu được các khuẩn lạc rời.

Dùng các khuẩn lạc này tiến hành thử khẳng định sinh hóa và huyết thanh.

Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm sinh hóa: TSI ( đỏ/vàng, có

hoặc khơng có H2S ), urea (-), LDC (+), β-galactosidase (-), VP (-), Indole (-) [12].

2.2.3.5 Khẳng định sinh hóa a. Trên TSI

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ từ NA lên môi trường TSI agar (cấy ria phần nghiêng và cấy đâm ở phần đáy).

Ủ các ống ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h.

Trên TSI, 90% Salmonella cho:

Phản ứng kiềm ở phần nghiêng (màu đỏ): lactose và sucrose âm tính.

Phản ứng acid ở phần đáy (màu vàng): glucose dương tính, sinh hơi (khoảng 90%), có hoặc khơng có H2S [12].

b. Trên Urea agar

Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ từ NA vào phần nghiêng ống urea agar. Ủ ống ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h.

Phản ứng (+): môi trường chuyển màu sang màu hồng tươi. Phản ứng (-): không làm đổi màu môi trường [12].

c. Trên L-Lysine decarboxylation medium (LDC)

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ NA vào môi trường L-Lysine decarboxylation medium.

- Sử dụng đĩa giấy O.N.P.G

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Cấy 1 vòng sinh khối vi khuẩn lấy từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường NA vào ống nghiệm chứa 0,5 mL nước cất.

Cho đĩa giấy O.N.P.G vào ống nghiệm.

Đọc kết quả sau khi ủ ở 37oC / 1h trong bể điều nhiệt. Phản ứng (+): mơi trường có màu vàng.

Phản ứng (-): mơi trường không đổi màu [12].

Phản ứng (-): môi trường khơng có màu đỏ hồng.

Phản ứng (+): mơi trường có màu đỏ hồng trong 15 phút [12].

f. Phản ứng indol

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường tryptone hoặc tryptophane.

Ủ ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h. Nhỏ 1 mL thuốc thử Kovacs.

Phản ứng (-): môi trường có vịng màu vàng trên bề mặt. Phản ứng (+): mơi trường có vịng màu đỏ trên bề mặt [12].

g. Phản ứng kháng huyết thanh.

⮚ Loại trừ chủng tự ngưng kết.

Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên bề mặt của 1 phiến kính.

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Hịa vào đó 1 vịng sinh khối vi khuẩn tạo thành 1 địch đục và đồng nhất. Lắc phiến kính trong (30-60) giây.

⮚ Kiểm tra O-antigens:

Nhỏ 1 giọt anti-O serum lên bề mặt của 1 phiến kính. Hịa vào đó 1 vịng sinh khối vi khuẩn khơng tự ngưng kết. Lắc phiến kính trong (30 - 60) giây.

Phản ứng dương tính khi xuất hiện sự vón cục ở phiến kính [12].

⮚ Kiểm tra Vi-antigens:

Nhỏ 1 giọt anti-Vi serum lên bề mặt của 1 phiến kính. Hịa vào đó 1 vịng sinh khối vi khuẩn khơng tự ngưng kết. Lắc phiến kính trong (30 - 60) giây.

Phản ứng dương tính khi xuất hiện sự vón cục [12].

⮚ Kiểm tra H-antigens:

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ, không tự ngưng kết lên môi trường semi-solid NA. Ủ ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h.

Nhỏ 1 giọt anti-H serum lên bề mặt của 1 phiến kính. Hịa vào đó 1 vịng sinh khối vi khuẩn.

Lắc phiến kính trong (30 - 60) giây.

Phản ứng dương tính khi xuất hiện sự vón cục [12].

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

2.2.3.6 Đọc kết quả

Mẫu được xem là nhiễm Salmonella khi có phản ứng sinh hóa và phản ứng

huyết thanh phù hợp với Phụ lục 2 [12].

Kiểm nghiệm Salmonella spp. được tóm tắt theo sơ đồ sau:

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

Trên KIA/ TSI: đỏ/ vàng, có/ khơng có H2S, sinh hơi/ khơng sinh hơi.

Urea: (-); LDC: (+); β –galactosidase: (-); VP: (-); Indol: (-). Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh: O, H, Vi. Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính trên 25 g mẫu.

Cấy phân lập khuẩn lạc đơn trên 2 đĩa môi trường XLD và HE.

Lật ngược các đĩa và ủ ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h.

Chuyển 1 mL canh trùng cho vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường MKTTn broth, ủ ở (37 ± 1) oC / (24 ± 3) h.

Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang NA. Ủ ở (37 ± 1) oC / (24 ± 3) h.

Chuyển 0,1 mL canh trùng sau ủ sang ống nghiệm chứa 10 mL môi trường RVS, ủ ở 41,5 ± 1) oC / (24 ± 3) h.

Mẫu ban đầu

Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 mL môi trường BPW, ủ ở (37 ± 1) oC / (18 ± 2) h.

</div>