khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen ldlr đối với một số mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân tăng cholesterol máu ở việt nam

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.37 MB, 59 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN LDLR ĐỐI VỚI

MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA BỆNH NHÂN TĂNG CHOLESTEROL MÁU Ở VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

GVHD: ThS. Trương Kim Phượng SVTH: Mai Kim Bảo Châu

MSSV: 1553010014 KHÓA: 2015 – 2019

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN LDLR ĐỐI VỚI

MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA BỆNH NHÂN TĂNG CHOLESTEROL MÁU Ở VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

Giáo viên hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm và quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua.

Con chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cha Mẹ và gia đình đã ni dưỡng, dạy bảo để con có được ngày hơm nay.

Em chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Huyền Ái Thuý, ThS. Lao Đức Thuận và ThS. Trương Kim Phượng đã hết lòng tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp.

Cuối cùng, em gửi lời cảm ơn đến ban quản lý phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh học phân tử, cũng như các anh chị và các bạn khóa luận tại Phịng đã tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ em tận tình để em có thể hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này một cách tốt nhất.

Chân Thành Cảm Ơn!

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

US MEDPED US Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức DLCN ... 5

Bảng 1.2 Tiêu chí chẩn đốn bệnh FH của Simon Broome ... 6

Bảng 1.3 Tiêu chí chẩn đốn bệnh FH của US MEDPED ... 6

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR ... 15

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ... 15

Bảng 3.1 Bộ dữ liệu cơng trình nghiên cứu đồn hệ biến trên gen LDLR ... 19

Bảng 3.2 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến trên gen LDLR và bệnh FH từ các cơng trình nghiên cứu khoa học đoàn hệ ... 22

Bảng 3.3 Kết quả phân tích tính chất đột biến một số exon gen LDLR ... 24

Bảng 3.4 Các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 4 thuộc gen LDLR ... 26

Bảng 3.5 Kết quả phân tích độ tương đồng của các bộ mồi với trình tự tham chiếu bằng cơng cụ Blastn ... 27

Bảng 3.6 Thông số vật lý của các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 4 thuộc gen LDLR ... 28

Bảng 3.7. Kết quả phân tích thơng số vật lí của bộ mồi LDLR_F5 và LDLR_R5 khuếch đại vùng trình tự exon 4 gen LDLR ……….………..28

Bảng 3.8. Thông tin mẫu bệnh phẩm ………...29

Bảng 3.9. Các biến thể/đột biến gen LDLR xuất hiện trên mẫu bệnh phẩm phân tích bằng cơng cụ CodonCode Aligner……….………..31

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 (National Institutes of Health)... 6

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất đột biến điểm trên gen LDLR ... 18

Hình 3.2 Đồ thị Forest plot biểu thị tỷ lệ đột biến gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm cao cholesterol………21

Hình 3.3 Đồ thị Funnel plot đánh giá tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu đoàn hệ khi phân tích tỷ lệ đột biến gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm cao cholesterol…...22

Hình 3.4 Kết quả sắp gióng cột trình tự gen LDLR bằng cơng cụ Blastn………...26

Hình 3. 5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi LDLR_F5 và LDLR_R5………..30

Hình 3.6. Dạng đột biến 15743insC trên mẫu 2……….………...32

Hình 3.7. Dạng đột biến 15747G>T trên mẫu 2 ( thể dị hợp)………...32

Hình3.8. Dạng đột biến 15752C>T trên mẫu 2 ( thể dị hợp)………33

Hình3.9. Dạng đột biến 15766T>A trên mẫu 2 ( thể dị hợp)………33

Hình3.10. Dạng đột biến 15775T>A trên mẫu 2 ( thể dị hợp)………..34

Hình3.11. Dạng đột biến 16044C>T trên mẫu 2 ( thể dị hợp)………..34

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

II.2.Phương pháp nghiên cứu ... 11

II.2.1.Phương pháp khai thác dữ liệu ... 11

II.2.2.Phương pháp Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) ... 12

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

II.2.3.Phương pháp khảo sát trên máy tính (In silico) ... 13

II.2.4.Khảo sát thực nghiệm ... 13

III.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 17

III.1.Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình ... 17

III.2.Khảo sát insilico xác định bộ mồi khuếch đại trình tự gen LDLR ... 25

III.2.1.Bộ dữ liệu trình tự gen LDLR ... 25

III.2.2.Bộ mồi khuếch đại trình tự exon 4 gen LDLR ... 26

III.3.Kết quả khảo sát thực nghiệm gen LDLR ... 29

III.4.Kết quả phân tích giải trình tự exon 4 gen LDLR ... 30

IV.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 34

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (Word Health Organization-WHO, 2015), bệnh tim mạch (Cardiovascular diseases-CVD) là bệnh lý gây tử vong cao nhất trên tồn cầu. Năm 2015, ước tính có 17,7 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm 31% tổng số ca tử vong toàn cầu. Trong đó có khoảng 7,4 triệu người chết do mắc bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease-CHD). Đáng chú ý là nồng độ cholesterol trong máu tăng cao có liên quan chặt chẽ với bệnh tim mạch, cụ thể hơn là quá trình

xơ vữa động mạch (Neil et al.,1999 ).

Bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia -FH) là dạng rối loạn lipid/cholesterol trong máu, do tính chất đột biến xảy ra trên một số gen mã hóa protein quan trọng trong cơ chế chuyển hóa cholesterol máu, điển hình

là gen LDLR, APOB, PCSK9 (Taranto et al., 2015). Bệnh lý cao cholesterol máu và

cụ thể bệnh lý FH là nguyên nhân gây ra bệnh tim mạch (CVD, CHD) (Genest et al., 2014). Công bố khoa học của Scriver và cộng sự (2002), Shu và cộng sự (2017)

xác định tính chất đột biến xuất hiện trải dài trên gen LDLR là nguyên nhân chính

dẫn đến bệnh lý FH. Hơn nữa, nhiều cơng trình nghiên cứu xác định các dạng đột

biến xuất hiện trên gen Low-Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (APOB) làm mất chức năng thụ thể LDL (LDLR) dẫn đến nồng độ cholesterol LDL (LDL-C) trong máu tăng (Pereira et al., 2012; Varre et al., 2008 và Durst et

cho tế bào (Hobbs et al., 1992 và Leigh et al., 2008). LDLR là thụ thể gắn với các

phối tử mạng cholesterol (Lipoprotein mật độ thấp) nhập bào vào tế bào gan (Brown et al., 1986).

Kế thừa và mong muốn hoàn thiện hướng nghiên cứu phâp tích đặc điểm phân tử trên các gen có vai trị trong sự chuyển hóa cholesterol trong máu, chúng tôi xin

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

phép được thực hiện chuyên đề Khóa luận tốt nghiệp: “KHẢO SÁT TÍNH CHẤT

ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN LDLR ĐỐI VỚI MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM

MÁU CỦA BỆNH NHÂN TĂNG CHOLESTEROL MÁU Ở VIỆT NAM”. Mục tiêu:

Khảo sát tính chất đột biến điểm xuất hiện trên gen LDLR trên bệnh nhân tăng

cholesterol máu, dựa vào phương pháp sinh học phân tử phù hợp: kỹ thuật PCR kết hợp giải tình tự.

Nội dung nghiên cứu:

1. Khai thác dữ liệu khoa học trên nguồn dữ liệu trực tuyến: PubMeb, PubMeb central (PMC) thuộc NCBI, EMBL, Google, Google Scholar,… với một số từ khóa: LDLR, Familial Hypercholesterolemia (FH),...

2. Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) khai thác chọn lọc các dữ liệu để xây dựng bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp với cơng cụ Medcalc® phiên bản 18.2.1 nhằm khảo sát sự tương quan giữa tính chất xuất hiện một số dạng

đột biến điểm trên gen LDLR đối với bệnh cao cholesterol máu có tính chất

gia đình và một số bệnh lý tim mạch trên thế giới, chủ yếu dựa vào chỉ số “Proportion” (viết tắt là PR%) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals - CIs).

3. Khảo sát thực nghiệm, ứng dụng phương pháp PCR-giải trình tự để khảo sát

tính chất xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR máu đối với một số mẫu

bệnh phẩm máu của người Việt Nam. Đồng thời, dự kiến cập nhật kết quả khảo sát trên máy tính về các bộ mồi để thiết lập/điều chỉnh quy trình PCR-

giải trình tự phù hợp với mục tiêu và nội dung nghiên cứu nêu trên.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I.1. Cholesterol và Lipoprotein

Cholesterol là chất béo hiện diện trong hệ mạch máu, các bào quan và hệ dẫn truyền

thần kinh thần kinh trong cơ thể người (Lawes et al., 2004). Sự thay đổi lượng

cholesterol trong máu liên quan đến sự không cân bằng dinh dưỡng hoặc rối loạn

yếu tố di truyền.(Lawes et al., 2004).

Lượng (nồng độ) cholesterol trong máu được biểu thị bởi đơn vị System Internationale (SI), là đơn vị đo lượng cholesterol (millimol, mmol) trên một đơn vị máu (lit, l): mg/dl hoặc mg/L. Thông thường, việc xác định nồng độ cholesterol trong máu liên quan đến bệnh lý rối loạn mỡ máu và bệnh (FH) thường dựa vào chỉ số lượng (nồng độ) cholesterol toàn phần, HDL cholesterol, LDL cholesterol và

VLDL cholesterol (Lawes et al., 2004). Trong các nghiên cứu về bệnh FH ở Hoa

Kỳ và Nhật Bản, chỉ số SI được xác định bởi đơn vị mg/dl, hệ số quy đổi như sau: 1

(mg/dl) = 0.02586 (mmol/l) (Lawes et al., 2004).

I.2. Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH- Familial hypercholesterolaemia)

FH (Familial hypercholesterolaemia) là bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình, thuộc dạng bệnh lý rối loạn di truyền liên quan đến sự rối loạn chuyển hóa lipid trong máu. Bệnh FH đặc trưng bởi sự gia tăng nồng độ lipoprotein mật độ thấp kết hợp cholesterol (LDL-C, Low-density lipoprotein cholesterol) dẫn đến lắng đọng cholesterol trong mô và cơ quan, dẫn đến nguy cơ mắc bệnh xơ vữa động mạch và các bệnh tim mạch khác (CVDs-cardiovascular diseases)

(Brown&Goldstein, 1986; Varghese et al., 2014; Migliara et al.,2017 và Robinson

et al., 2013).

Việc chẩn đốn bệnh FH có thể giúp chẩn đoán và điều trị bệnh kịp thời nhằm làm giảm nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch và đột quỵ. Thơng thường việc chẩn đốn bệnh FH chủ yếu dựa vào chẩn đoán lâm sàng: xét nghiệm chỉ số sinh hóa máu (lượng/nồng độ cholesterol: HDL-C, LDL-C, cholesterol toàn phần,...) trong máu

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

kết hợp phân tích tiền sử gia đình và có thể được hỗ trợ bằng xét nghiệm di truyền

(Migliara et al.,2017). Bệnh FH được ghi nhận khi giá trị LDL-C thường cao hơn 190 mg/dL ở người trưởng thành và 160 mg/dL ở trẻ em (Hopkins et al., 2011).

Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) ở thể đồng hợp (Homozygous Familial Hypercholesterolemia, HoFH) và thể dị hợp (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia, HeFH). Trong đó, tần suất mắc bệnh FH đồng hợp thuộc dạng hiếm gặp, xấp xỉ 1/1.000.000 trường hợp. Tần suất mắc bệnh FH dị hợp dao

động khoảng 1/200–1/500 trường hợp (Austin et al., 2004; Nordestgaard et al., 2013; Al-Hinai et al., 2013).

Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) là 1 trong 300 căn bệnh rối loạn di truyền phổ biến tại Hoa Kỳ, đồng thời người có tiền sử gia đình mắc bệnh cao cholesterol và bệnh tim mạch có khả năng mắc bệnh FH cao hơn so với những

trường hợp khác (Hopkins et al., 2011).

Cơng trình nghiên cứu khoa học của Hopkins và cộng sự (2011) ghi nhận cần phải phân tích, kiểm tra các chỉ số về nồng độ cholesterol trong máu sớm ở đối tượng trẻ em ngay từ lúc 2 tuổi hoặc trước 20 tuổi nhằm làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và bệnh động mạch vành.

Nguyên nhân dẫn đến bệnh lý FH thường là do tính chất đột biến xảy ra chủ yếu trên một số gen mã hóa protein quan trọng trong cơ chế chuyển hóa cholesterol

máu, điển hình là gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), ApoB (Apolipoprotein B), PCSK9 (proprotein convertase subtilisin / kexin loại 9) (Hartgers et al., 2015). Trong đó, yếu tố chính gây ra bệnh lý FH là do các đột biến trên gen LDLR (Bruikman et al., 2017; Reeskamp et al., 2018).

I.2.1. Tiêu chí chuẩn đốn bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

Theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới (World Health Organization,WHO), bệnh lý FH được xác định theo tiêu chí nồng độ cholesterol ở người trưởng thành ≥ 5,0 mmol/l. Bên cạnh đó, các bộ tiêu chí được sử dụng để chẩn đoán bệnh nhân mắc bệnh FH thường

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

MEDPED của Hoa Kỳ (US Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths) (Al-Hinai

et al., 2013).

Bảng 1.1 Tiêu chí chẩn đốn bệnh FH của tổ chức DLCN

Nhóm 1: Tiểu sử gia đình

Thế hệ thứ nhất có người mắc bệnh tim mạch sớm

Thế hệ thứ nhất có nồng độ cholesterol LDL trong máu

Thế hệ thứ nhất có xuất hiện xanthoma trong gân và/hoặc

Trẻ em < 18 tuổi có nồng độ cholesterol LDL trong máu

Nhóm 2: Tiền sử lâm sàng

Bệnh nhân mắc bệnh tim mạch vành sớm

Bệnh nhân mắc bệnh mạch máu não và ngoại vi sớm

Nhóm 3: Kiểm tra thể chất

Xuất hiện xanthoma trong cung giác mạc ở người dưới

Nhóm 4: Các kết quả kiểm tra sinh hóa (Nồng độ cholesterol LDL)

Nồng độ cholesterol LDL* >8,5 mmol/L (>325 mg/dL) 6,5-8,4 mmol/L (251-325 mg/dL) 5,0-6,4 mmol/L (191-259 mg/dL) 4,0-4,9 mmol/L (155-190 mg/dL)

8 5 3 1 Nhóm 5: Xét

nghiệm di truyền phân tử (phân tích DNA)

Xuất hiện các đột biến trên các gen LDLR, ApoB hay

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Bảng 1.2 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của Simon Broome

3 Bằng chứng có xuất hiện đột biến trên gen LDLR hay các gen

khác có liên quan đến bệnh FH dựa trên DNA người bệnh. 4 Trong tiền sử gia đình có người bị nhồi máu cơ tim trước 50 tuổi

ở thế hệ thứ nhất hoặc thứ hai, hay trước 60 tuổi ở thế hệ thứ nhất 5 Trong tiền sử gia đình có người có nồng độ cholesterol tổng >7,5

mmol/L ở thế hệ thứ nhất hay thứ hai

Bảng 1.3 Tiêu chí chẩn đốn bệnh FH của US MEDPED

Hình 1. Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19

Gen LDLR (low-density lipoprotein receptor) định vị trên nhiễm sắc thể số 19 ( vị

trí 19p13.2 ), kích thước 44469 bp với 18 exon ( NCBI ).

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

LDLR là gen mã hóa cho thụ thể lipoprotein mật độ thấp (LDLR), là một dạng

glycoprotein xuyên màng, thường hiện diện trên bề mặt tế bào gen. Thụ thể lipoprotein mật độ thấp (LDLR) tham gia vào quá trình nhập bào (endocytosis), đóng vai trị quan trọng trong q trình chuyển hóa cholesterol. Protein LDLR tương tác, hình thành phức hợp với lipoprotein mật độ thấp kết hợp cholesterol (LDL-C) trong quá trình vận chuyển cholesterol từ máu vào tế bào giúp điều hòa

lượng cholesterol trong máu (Brown and Goldstein,1986; Leigh et al., 2008; Beisiegel et al., 1991). Các đột biến trong gen LDLR dẫn đến sự khiếm khuyết của

thụ thể LDL, gây nên sự dư thừa cholesterol trong máu, là nguyên nhân chính dẫn

đến bệnh FH (Hopkins et al., 2011; Shu et al., 2017; Hobbs et al., 1992 ).

Theo cơng trình nghiên cứu của Hobbs và cộng sự (1992) xét theo tính chất và vị trí

của các đột biến xuất hiện trên gen LDLR, các dạng đột biến được chia thành 5 loại

như sau:

Loại 1: Đột biến dẫn đến không biểu hiện protein LDLR.

Loại 2: Đột biến dẫn đến sai hỏng cấu trúc protein LDLR trong quá trình vận

chuyển LDL-C từ mạng lưới nội chất đến bề mặt tế bào.

Loại 3: Đột biến dẫ đến cản trở tương tác đặc hiệu của thụ thể LDLR với APOB.

Loại 4: Đột biến dẫn đến cản trở sự tương tác giữa protein LDLR và LDL-C.

Loại 5: Đột biến dẫn đến rối loại quá trình tái thiết lập thụ thể LDLR trên bề mặt tế bào.

Protein LDLR được cấu tạo bởi 843 amino acid, gồm các vùng "domain" chức năng

tương ứng với các vùng trình tự trên gen LDLR (Marais et al., 2004):

- Exon 1 mã hóa peptide tín hiệu: 21 amino acid.

- Exon 2-6 mã hóa vùng amino acid gắn phối tử: 40 amino acid. - Exon 7-14 mã hóa yếu tố vùng tăng trưởng biểu bì: 400 amino acid.

- Exon 15 mã hóa chuỗi peptide tương tác với chuỗi carbohydrate O: 58 amino acid.

- Exon 16 và exon 17 (41 bp) mã hóa vùng amino acid gắn với thụ thể LDLR.: 22 amino acid.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

- Vùng trình tự cịn lại exon 17 và exon 18 mã hóa vùng tế bào chất: 50 amino acid.

I.4. Tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh cao cholesterol trong máu có

tính gia đình

Cơng trình nghiên cứu của Brown và Goldstein (1973, 1974 và 1986) cho thấy

nguyên nhân dẫn đến bệnh lý FH thường do đột biến trên gen LDLR, chủ yếu là các đột biến điểm trên các exon thuộc gen LDLR gây ra làm mất chức năng hoặc khiếm

khuyết thụ thể LDL trên bề mặt tế bào. Có khoảng hơn 95% trường hợp mắc bệnh

FH là do các dạng đột biến trên gen LDLR (Benn et al., 2016) với hơn 1700 dạng đột biến (Leigh et al., 2016) . Theo cơng trình nghiên cứu của Usifo và cộng sự

(2018), Sun và cộng sự (2018) cho thấy việc sàng lọc, xác định các dạng đột biến

điểm trên gen LDLR góp phần làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch liên quan đến

bệnh FH.

Cơng trình nghiên cứu của Jiang và cộng sự (2015) ghi nhận có hơn 74 cơng trình nghiên cứu đặc điểm lâm sàng về bệnh FH có liên quan đến đột biến điểm trên gen

LDLR. Các cơng trình nghiên cứu này chứng minh bệnh FH rất phổ biến tại Trung

Quốc, nhưng tỷ lệ chẩn đoán và điều trị bệnh FH còn thấp, do sự thiếu hiểu biết của các bác sĩ và người dân cũng như chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu về bệnh FH

(Jiang et al., 2015 ). Cơng trình nghiên cứu của Jihyun và cộng sự (2004) ghi nhận có khoảng 64% bệnh nhân mắc bệnh FH ở Hàn Quốc do đột biến trên gen LDLR

gây ra.

Cơng trình nghiên cứu của Futema và cộng sự (2011) tại Mỹ cho thấy đột biết xuất

hiện trên gen LDLR là 14 trong 48 mẫu bệnh phẩm cao cholesterol chiếm khoảng

29,2 %. Cũng trong cơng trình nghiên cứu của Futema và cộng sự (2014) nghiên cứu đặc điểm lâm sàng của bệnh FH đã ghi nhận được 25 dạng đột biến trong đó có

23 dạng đột biến trên gen LDLR và 2 dạng đột biến trên gen APOB.

Cơng trình nghiên cứu của Santo và cộng sự (2014) phân tích tính chất đột biến

điểm trên gen LDLR trong tổng số 156 bệnh nhân mắc bệnh FH dị hợp tử ở Brazil.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Kết quả phân tích cho thấy có 40 trường hợp mang đột biến thuộc gen LDLR liên

quan đến bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình.

I.5. Phương pháp phân tích tính chất đột biến trên gen LDLR

Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing) là một phương pháp phổ biến và thường được ứng dụng trong các nghiên cứu khoa học phân tích đặc điểm phân tử bệnh FH, điển hình là cơng trinh nghiên cứu khoa học của Lombardi và cộng sự (1995,2000), Webb và cộng sự (1996), Bochmann và cộng sự (2001), Yu và cộng sự (2002), Chater và cộng sự (2006), Yang và cộng sự (2007), Romano

và cộng sự (2010), Vaca và cộng sự (2011), Futema và cộng sự (2012), Fan và cộng sự (2015), Du và cộng sự (2016), Xiang và cộng sự (2017),...Phương pháp PCR kết

hợp giải trình tự được ghi nhận là phương pháp chuẩn vàng trong phân tích đặc điểm trình tự nucleotide trên gen hoặc bộ gen mục tiêu nhằm phát hiện các đột biến và nêu ra bản chất của đột biến này-nguyên nhân chủ yếu dẫn đến một số bệnh di

truyền, tiêu biểu là bệnh FH (Jensen et al., 1996).

I.6. Phương pháp phân tích tổng hợp

Theo McShane và Bưckenholt (2017), phân tích tổng hợp (Meta-analysis) là cơng cụ nghiên cứu thực chứng, dựa vào các phương pháp thống kê nhằm phản ánh tính chất đặc trưng hoặc độ biến thiên giá trị của biến số đối với độ tin cậy cao với trường hợp khảo sát có sự khác biệt về giá trị của biến số ở kết quả thuộc các cơng trình nghiên cứu khoa học khác nhau.

Tuy nhiên, trong q trình thực hiện phân tích tổng hợp cần phải kiểm chứng/phản ánh tính thiên vị về dữ liệu phân tích, do đó cần phải thu thập và trích xuất dữ liệu một cách có hệ thống (Systematic reviews- SR) và kiểm chứng tính thiên vị thơng

qua thuật tốn dựng đồ thị Funnel plot (Rodseth et al.,2016).

Các tiêu chí để thu thập dữ liệu một cách có hệ thống (Rodseth et al., 2016):

- Xác định rõ vấn đề cần nghiên cứu (vì sao cần phải tiến hành nghiên này). - Xác định tổng quan và phương pháp cần dùng để đạt được mục tiêu nghiên cứu. - Nêu ra được những ưu, khuyết điểm trong quá trình khai thác bộ dữ liệu nghiên

cứu.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Các bước cơ bản trong thực hiện phân tích tổng hợp:

- Đặt ra câu hỏi cho nghiên cứu của mình (loại nghiên cứu: đoàn hệ-ca chứng, phương pháp,...).

- Khai thác bộ dữ liệu trên các hệ thống: Google, Google Scholar, NCBI,... - Đọc tiêu đề và tóm tắt nội dung nghiên cứu chính của bộ dữ liệu.

- Chọn bộ dữ liệu phù hợp cho nghiên cứu của mình.

- Xác định tính bất đồng nhất cho bộ dữ liệu, dựa vào chỉ số I2 (Index of Heterogeneity I2) dựa vào thuật tốn Chi bình phương (Thorlund et al., 2012):

Tính bất đồng nhất thấp: 0% <I2 < 40%. Tính bất đồng nhất vừa: 30% <I2

< 60%. Tính bất đồng nhất cao: 50% <I2 < 90%. Tính bất đồng nhất rất cao: I2 > 75%.

- Xác định tính chất đặc trưng hoặc độ biến thiên giá trị của biến số theo mức độ ảnh hưởng (mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên: Random effects model; mơ hình ảnh hưởng bất biến: Fixed-effects models) của bộ dữ liệu chủ yếu dựa vào chỉ số tỷ suất chênh (Odds radio-OR), chỉ số nguy cơ (Relative Risk-RR), chỉ số tỷ lệ/tần suất (Proportion, %) và thuật toán dựng đồ thị “Forest plot”.

- Thông thường, trong trường hợp chỉ số I2<50% với giá trị P≥0,1: phân tích tổng hợp được xác định theo mô hình phân tích ảnh hưởng bất biến (Fixed-effects model); ngược lại, chỉ số I2>50% với giá trị P<0,1: phân tích tổng hợp được xác định theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model). - Xây dựng đồ thị “Forest plot” và kiểm chứng tính tính thiên vị của bộ dữ liệu

thông qua đồ thị “Funnel plot”.

- Có thể tiến hành phân tích tổng hợp chuyên sâu dựa trên các phân hạng (Subgroup). Sau đó tiến hành kiểm tra và xuất kết quả phân tích tổng hợp.

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. Vật liệu

II.1.1. Các công cụ trực tuyến và Tin Sinh học

- NCBI (

- LOVD ( - BLAST ( - Oligo analyzer IDT phiên bản 3.1

( - Google Scholar (

- GeneCards ( - Annhyb phiên bản 4.946

- BioEdit phiên bản 7.0.4 - Medcalc® phiên bản 18.2.1 - Choromas Lite phiên bản 2.01 - CodonCode Aligner phiên bản 8.0.2

II.1.2. Bộ mẫu bệnh phẩm

Chúng tôi thu thập mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) của các bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng với biểu hiện tăng cholesterol trong máu được cung cấp tại một số bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh.

II.2. Phương pháp nghiên cứu

II.2.1. Phương pháp khai thác dữ liệu

Khai thác dữ liệu khoa học trên nguồn dữ liệu trực tuyến: PubMeb, PubMeb central (PMC) thuộc NCBI, EMBL, Google, Google Scholar,….

Khai thác dữ liệu khoa học với một số từ khóa: LDLR, Familial

Hypercholesterolemia (FH),... Trích xuất dữ liệu: `

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

- Tình hình mắc bệnh lý tăng cholesterol máu có tính chất gia đình, bệnh lý ADH (Autosomal Dominant Hypercholemia), bệnh tim mạch,... trên thế giới và ở Việt Nam.

- Thông tin về phương pháp sinh học phân tử (PCR kết hợp phương pháp giải

trình tự, PCR… ) phù hợp để xác định đột biến điểm gen LDLR trên từng

quần thể người bệnh tăng cholestreol máu có tính chất gia đình trên thế giới và ở Việt Nam.

Tổng hợp, chọn lọc thông tin và tỉ lệ của từng dạng đột biến đểm nổi trội thuộc gen

LDLR xuất hiện trên nhóm người mắc bệnh FH/người mắc bệnh ADH, tim mạch

bằng công cụ thống kê phù hợp.

II.2.2. Phương pháp Phân tích tổng hợp (Meta-analysis)

Khai thác chọn lọc các dữ liệu để xây dựng bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp gồm có:

- Số lượng trường hợp mắc bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình: có

hoặc không mang đột biến trên gen LDLR.

- Số lượng trường hợp mắc một số bệnh lý về tim mạch, bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành,... có hoặc không biểu hiện cao cholesterol máu, có

hoặc khơng mang đột biến trên gen LDLR.

- Tỷ lệ dạng đột biến trên gen LDLR xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh FH,

bệnh nhân mắc bệnh tim mạch.

- Thông tin về phương pháp sinh học phân tử phù hợp để xác định các dạng

đột biến xuất hiện trên gen LDLR.

Phân tích tổng hợp được thực hiện với cơng cụ Medcalc® phiên bản 18.2.1 nhằm

khảo sát sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và nguy cơ mắc bệnh

tăng cholesterol máu có tính chất gia đình, chủ yếu dựa vào chỉ số “Proportion” (viết tắt là PR%) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals - CIs) phản ánh tỷ

lệ/tần suất xuất hiện đột biến trên gen LDLR trong bộ mẫu bệnh phẩm có chỉ số

cholesterol cao trong máu.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

II.2.3. Phương pháp khảo sát trên máy tính (In silico)

Chúng tơi tiến hành khảo sát trên máy tính (In silico) nhằm xác định bộ mồi phù hợp

với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự đẻ xác định các dạng đột biến điểm nổi trội

trên gen LDLR, tiến trình thực hiện gồm có:

- Thu thập bộ dữ liệu trình tự nucleotide của gen LDLR trên cơ sở dữ liệu

GenBank (NCBI).

- Thu thập bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự

nhằm xác định các đột biến điểm nổi trội trên gen LDLR được mô tả trong

một số cơng trình nghiên cứu khoa học trên thế giới và ở Việt Nam.

- Xác định các thơng số vật lí của bộ mồi bằng cơng cụ OligoAnalyzer IDT ( và Annhyb phiên bản 4.946, tập trung phân tích chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy, % GC, năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp tóc, Self – dimer, Hetero – dimer), tham khảo một số tiêu chí thiết kế mồi cho phương pháp PCR trong tài liệu Giáo trình Ứng dụng tin học trong Cơng nghệ sinh học (Lê Huyền Ái Thúy, 2016).

- Kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi bằng công cụ BLAST trên NCBI (

II.2.4. Khảo sát thực nghiệm

Thiết bị và hoá chất: Thiết bị:

- Bể ổn nhiệt - Máy ly tâm lạnh - Tủ thao tác - Tủ lạnh - Máy vortex

- Máy đo quang phổ - Máy PCR

Hóa chất:

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

- Phenol - Chloroform

- Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% - NaCl 0,45M

- Tris HCl 10mM (pH = 8,2)

- Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1M (pH = 8) - Ammonium acetate (NH4OAc) 5M

- Ethanol 100% - Ethanol 70%

- Proteinase K (18,5 mg/ml) - Master mix 2X

- Bộ mồi

Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến điểm nổi trội trên vùng exon 4 gen

LDLR và khả năng mắc bệnh/không mắc bệnh tăng cholesterol máu có tính gia

đình trên người Việt Nam, gồm một số nội dung thực nghiệm:

- Tách chiết DNA bộ gen của bộ mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) bằng phương pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi, 1987):

- Thu nhận 50μl mẫu bệnh phẩm vào một eppendorf (1,5 ml).

- Bổ sung 500µl dung dịch ly giải, gồm có NaCl 0,45M, Tris HCl 10mM (pH=8,2), EDTA 1M (pH=8), SDS 10%.

- Bổ sung 5μl proteinase K (20 mg/ml), trộn đều. Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 1 giờ.

- Bổ sung một thể tích dung dịch Phenol: Chloroform (tỉ lệ 1:1), trộn đều. Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/phút trong 3 phút và thu dịch nổi. - Bổ sung một thể tích Chloroform tương đương với thể tích mẫu. Ly tâm ở

nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/ phút trong 3 phút và thu dịch nổi.

- Bổ sung 0,25 lần thể tích Amonium Acetate 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối (trữ lạnh). Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC và thu tủa.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

- Bổ sung một thể tích Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vịng/phút trong 5 phút ở 4o

Chú thích:

C: giá trị nồng độ DNA (μg/ml)

A260: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm A280: độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm d: độ pha loãng (thường từ 30-50 lần)

- Phương pháp PCR:

Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 4

gen LDLR bằng cặp mồi LDLR_F5 – LDLR_R5 tham khảo nghiên cứu của

Chater và công sự (2006). Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được thể hiện ở bảng 2.1 và 2.2.

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

- Chuẩn bị khuôn gel và đun gel tan.

- Rót gel vào khn, chờ gel đơng, rút lược.

- Hòa trộn mẫu DNA với dung dịch nạp mẫu có sẵn chất nhuộm DNA (GelRed).

- Nạp mẫu vào giếng, thực hiện điện di ở hiệu điện thế 70 Volt.

- Đọc kết quả bằng thiết bị đọc gel (GEL DOC XR) và xác định kích thước của các mẫu DNA với thang chuẩn (50 bp)

- Giải trình tự:

Chúng tơi tiến hành gửi giải trình tự đối với các sản phẩm PCR cho kích thước dự kiến 443 bp. Sau đó, chúng tơi thực hiện phân tích các kết quả giải trình tự với trình tự tham chiếu: NC_000019.10 (11.089.362 – 11.133.830 là vùng trình tự gen

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

III.1. Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp tính chất đột biến trên

gen LDLR và bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

III.1.1. Khai thác dữ liệu

Dựa vào cơ sở dữ liệu trực tuyến của NCBI, Google, Google Scholar,… và cập nhật đến 5/2019, chúng tôi thu thập được 192 công trình nghiên cứu khoa học thuộc

hướng nghiên cứu về tính chất đột biến điểm trên gen LDLR và bệnh tăng

cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) trên thế giới. Từ đó, chúng tơi xác định tiêu chí trích xuất dữ liệu cho phân tích tổng hợp như nội dung II.2.2.

- Vấn đề cần nghiên cứu: tính chất đột biến điểm trên gen LDLR ở những bệnh

nhân bệnh tăng cholesterol máu.

- Thông tin nghiên cứu: phương pháp nghiên cứu, tính chất đột biến điểm trên

gen LDLR, quần thể người bệnh, các thông tin bệnh học của bệnh lý cao

cholesterol máu, số lượng cụ thể của bộ mẫu có tính chất đột biến điểm trên

gen LDLR,...

Chúng tôi chọn lọc bộ dữ liệu để thực hiện phân tích tổng hợp, bao gồm 38 cơng trình nghiên cứu khoa học thuộc hướng nghiên cứu đồn hệ (Cohort) về tính chất

đột biến điểm trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

(FH) trên thế giới. Trong q trình phân tích, chúng tôi tập trung xác định chỉ số

(Proportion-PR%) phản ánh tỷ lệ/tần suất tính chất đột biến điểm trên gen LDLR và

bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình trên tổng số 8315 mẫu bệnh phẩm bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Hình 3.1 và bảng 3.1)

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất

đột biến điểm trên gen LDLR

Tổng số cơng trình nghiên cứu tổng quan

(n = 25)

Tổng cơng trình nghiên cứu khơng đáp ứng theo tiêu chí (Khơng cơng bố tỷ lệ đột biến)

(n = 14)

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Bảng 3.1 Bộ dữ liệu cơng trình nghiên cứu đồn hệ đột biến trên gen LDLR

Cơng trình nghiên cứu

Quốc gia

Châu lục Phương pháp

Bệnh FH

Cỡ mẫu

Số mẫu đột biến

ArulJothi, 2018 Ấn độ Châu Á Phương pháp khác 70 20 López, 2018 Colombia Châu Âu PCR giải trình tự 24 5 Durst, 2017 Israel Châu Á PCR giải trình tự 67 16 Gabčová, 2017 Slovakia Châu Âu PCR giải trình tự 292 75 Xiang,2017 Trung Quốc Châu Á Phương pháp khác 219 158 Du, 2016 Trung Quốc Châu Á PCR giải trình tự 11 11 Pandey, 2016 Anh Châu Âu Phương pháp khác 12 5 Wintjens, 2016 Pháp Châu Âu Phương pháp khác 116 91 Fan, 2015 Trung Quốc Châu Á PCR giải trình tự 20 13 Sharifi, 2015 Ba Lan Châu Âu Phương pháp khác 161 57 Han, 2015 Hàn Quốc Châu Á PCR giải trình tự 161 57 Mollaki, 2014 Hy Lạp Châu Âu PCR giải trình tự 561 299 Jannes, 2014 Brazil Châu Mỹ Phương pháp khác 248 125 Pecin ,2012 Croatia Châu Âu PCR giải trình tự 8 6 Tychi, 2012 Cộng hoà Séc Châu Âu PCR giải trình tự 2239 535 Diakou, 2011 Hy Lạp Châu Âu PCR giải trình tự 254 169 Futema, 2011 Mỹ Châu Mỹ PCR giải trình tự 48 14 Vaca, 2011 Mexico Châu Âu Phương pháp khác 62 24 Romano, 2010 Ý Châu Âu PCR giải trình tự 56 43 Yang, 2007 Đài Loan Châu Á PCR giải trình tự 30 14 Azian, 2006 Malaysia Châu Á Phương pháp khác 39 4 Chater, 2006 Ma-rốc Châu Phi PCR giải trình tự 24 19 Charng, 2006 Đài Loan Châu Á PCR giải trình tự 24 19 Tosi, 2006 Anh Châu Âu Phương pháp khác 200 177 Dedoussis, 2004 Đức Châu Âu Phương pháp khác 200 69 Mozas, 2004 Tây Ban Nha Châu Âu Phương pháp khác 476 329 El Messal, 2003 Ma-rốc Châu Phi PCR giải trình tự 8 8 Yu, 2002 Nhật Bản Châu Á PCR giải trình tự 200 125 Salazar, 2002 Brazil Châu Mỹ Phương pháp khác 35 22 Bochmann, 2001 Đức Châu Â PCR giải trình tự 31 19 García, 2001 Tây Ban Nha Châu Âu Phương pháp khác 113 83 Nauck, 2001 Đức Châu Âu Phương pháp khác 100 56 Lombardi, 2000 Ba Lan Châu Âu PCR giải trình tự 1223 358 Haddad, 1999 Utah Châu Mỹ Phương pháp khác 47 19 Leren, 1997 Na Uy Châu Âu PCR giải trình tự 742 476 Webb, 1996 Anh Châu Âu PCR giải trình tự 15 15 Lombardi, 1995 Hà Lan Châu Âu PCR giải trình tự 32 28 Maruyama, 1995 Nhật Bản Châu Á Phương pháp khác 120 38

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

III.1.2. Phân tích tổng hợp

Xét về tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu, chỉ số I2

= 97,74% (P < 0,0001) thể hiện rõ

tính bất đồng nhất về tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR trong 38 cơng

trình nghiên cứu khoa học nêu trên. Do đó, chỉ số Proportion được xác định theo mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model-R), kết quả thể hiện ở Hình 3.2, và Bảng 3.2. Chúng tôi ghi nhận chỉ số Proportion xấp xỉ 52,474 (95%CI: 44,738-60,151) theo mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên, kết quả này phản ánh tỷ lệ

xuất hiện tính chất đột biến trên gen LDLR ở các bệnh nhân FH là 52,474%.

Đồng thời, chúng tôi xuất đồ thị Funnel plot để biểu thị tính chất thiên vị của bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp. Kết quả này thể hiện ở hình 3.3.

Song song đó, tính chất bất đồng nhất của bộ dữ liệu có thể phụ thuộc vào yếu tố phương pháp phân tích đột biến, quần thể người bệnh. Vì vậy, chúng tôi xác định chỉ số Proportion theo một số phân hạng: phương pháp, chủng tộc, loại bệnh, phả

hệ, tính chất đột biến trên exon 4 thuộc gen LDLR để phản ánh chi tiết hơn sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol máu có tính

chất gia đình.

</div>