ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG VIỆC NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CHUỐI GIÀ LÙN (MUSA CAVENDISH SP) TẠO GIỐNG CHUỐI GIÀ LÙN SẠCH BỆNH

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.19 MB, 72 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Quảng Nam, tháng 4 năm 2015

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng ai công bố trong bất kì cơng trình nào khác

Tam Kỳ, ngày 15 tháng 4 năm 2016

Sinh viên

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp, dưới sự hướng dẫn tận tình của giáo viên hướng dẫn và được phía nhà trường tạo điều kiện thuận lợi, em đã có một q trình nghiên cứu, tìm hiểu và học tập nghiêm túc để hồn thành đề tài.

Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cơ giáo hướng dẫn ThS. Hồ Thị Kim Cúc giảng viên Khoa Lí - Hóa - Sinh, Trường Đại học Quảng Nam, cùng Anh Huỳnh Hữu Thắng - Chủ nhiệm phịng Ni cấy mô của Trung tâm ứng dụng và thông tin, khoa học và công nghệ tỉnh Quảng Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em thực hiện và hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.

Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn q thầy cơ giáo bộ mơn trong khoa Khoa Lí - Hóa - Sinh, Trường Đại học Quảng Nam đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập.

Xin cảm ơn những lời động viên, khích lệ của gia đình, người thân và những lời chia sẽ, học hỏi của bạn bè đã góp phần lớn giúp tơi hồn thành tốt bài khóa luận tốt nghiệp.

Tam Kỳ, ngày 15 tháng 4 năm 2016

Sinh viên

Lê Thị Khánh Ly

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

MỤC LỤC

Phần 1. MỞ ĐẦU ... 1

1.1. Lý do chọn đề tài ... 1

1.2. Mục tiêu của đề tài ... 2

1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ... 2

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu: ... 2

1.3.2. Địa điểm nghiên cứu: ... 2

1.3.3. Thời gian nghiên cứu: ... 2

1.4. Phương pháp nghiên cứu ... 3

Phần 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ... 4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4

1.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ... 4

1.1.1. Khái niệm ... 4

1.1.2. Sơ lươ ̣c li ̣ch sử phát triển ... 4

1.1.3. Các bước chính trong nhân giống in vitro ... 7

1.1.4. Môi trường nuôi cấy ... 8

1.1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng ... 8

1.3. Giới thiệu chung về cây chuối già lùn ... 14

1.3.1. Đặc điểm sinh thái ... 14

1.3.2. Đặc điểm hình thái ... 15

1.4. Giá trị của cây chuối già lùn ... 17

1.4.1. Giá trị dinh dưỡng ... 17

1.4.2. Giá trị dược liệu ... 18

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 25

2.1. Vật liệu nghiên cứu ... 25

2.1.1. Nguyên liệu khởi đầu ... 25

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị ... 25

2.1.3. Hóa chất ... 25

2.2. Quy trình ni cấy ... 26

2.3. Phương pháp nghiên cứu ... 27

2.3.1. Phương pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy ... 27

2.3.3. Phương pháp đưa mẫu chuối vào môi trường nuôi cấy khởi động ... 30

2.3.4. Tạo mô sẹo ... 31

2.3.5. Tái sinh chồi từ mô sẹo ... 31

2.3.6. Nhân nhanh chồi ... 31

2.3.7. Tạo rễ cây ... 32

2.3.8. Chuyển cây ra vườn ươm ... 32

2.3.9. Đưa cây ra ruộng ... 32

2.4. Điều kiện nuôi cấy ... 32

2.5. Các chỉ tiêu quan sát ... 33

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 35

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

3.1. Khảo sát nồng độ cồn trong khử trùng mẫu cấy ... 35

3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA trong môi trường nuôi cấy khởi động ... 36

3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo chuối già lùn ... 41

3.3.1. Kết quả nuôi cấy mô sẹo trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng ... 43

3.3.2. Kết quả nuôi cấy mô sẹo gián tiếp từ mẫu chuối đã được nuôi cấy khởi động ... 45

3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến khả năng tạo chồi chuối . 47 Phần 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 52

3.1. Kết luận ... 52

3.2. Kiến nghị ... 52

Phần 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 53 PHỤ LỤC

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng của nhóm chuối tiêu (Cavendish) 17, 18Bảng 3.1 Kết quả sử dụng cồn để khử trùng mẫu cấy 35 Bảng 3.2 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi

của chuối

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo chuối già lùn

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA

Bảng 3.9 Kết quả theo dõi nuôi cấy nhân nhanh cụm chồi trong môi

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến mẫu cấy 35 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi cây

chuối

Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và Kinetin khả năng hình

thành mơ sẹo cây chuối

Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến khả năng tạo chồi của cây chuối

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Mẫu ít bị thâm khi khử trùng bằng cồn 70% và 90% 36

Hình 3.2 Mẫu bị thâm khi khử trùng bằng cồn 50% 36

Hình 3.11 Mơ sẹo nuôi cấy gián tiếp từ mẫu đã nuôi cấy khởi động 46

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

CT Công thức

cs Cộng sự

IAA Indol - 3- Axetic Axit

IBA 3 - Indol Butyric Axit

MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog

NAA α- Napthalen Axetic Axit

TB Trung bình

BA 6 - benzyladenin

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Lý do chọn đề tài

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những ngành khoa học-cơng nghệ đang có triển vọng hiện nay. Bằng các kỹ thuật nuôi cấy trong điều kiện vô

trùng các bộ phận tách rời của cơ thể thực vật, người ta đã nhân giống in vitro

thành công nhiều lồi cây trồng có giá trị mà trước đây các phương thức nhân giống truyền thống gặp nhiều khó khăn. Bên cạnh đó, một số kỹ thuật khác cũng đã được ứng dụng có kết quả như: ni cấy đơn bội (1n) để tạo dòng thuần chủng phục tráng giống cây trồng, dung hợp protoplast giúp mở rộng nguồn gen tạo ra nhiều lồi thực vật mang tính trạng mới hữu ích, chọn dịng biến dị soma và biến dị giao tử có khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như nóng-lạnh, phèn-mặn, khơ-hạn, sâu-bệnh…, và cuối cùng sản xuất các cây trồng sạch bệnh virus từ những cá thể nhiễm bệnh virus, thiết kế các vector biểu hiện cao và xây dựng các kỹ thuật chuyển gen hiện đại.

Song song cùng với công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật thì nhu cầu trồng trọt bằng giống cây sạch bệnh, chất lượng cao đang được người dân quan tâm hàng đầu. Xuất phát từ nhu cầu đó nên việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật cung cấp giống cây sạch bệnh cho nông dân đang trở thành xu hướng phát triển ở nhiều tỉnh thành trong cả nước.

Cây chuối là cây ăn quả và cây lương thực phổ biến ở vùng nhiệt đới. Đồng thời, chuối cũng là loại cây ưa thế của vùng nhiệt đới khi chúng được thâm canh theo quy mô công nghiệp, nhằm mục tiêu xuất khẩu đến thị trường các nước ôn đới không trồng được chuối. Ở nước ta có rất nhiều nhóm chuối ngon, nhưng

nhóm có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế nhất là nhóm chuối tiêu (Cavendish), lồi có giá trị nhất trong nhóm này phải kể đến chuối già lùn (Musa Cavendish

sp). Nhưng hiện nay giống chuối già lùn này đang bị thoái hóa trầm trọng do

nhiễm một số bệnh virus như: đùn ngọn, cụp lá, vàng lá,... kết hợp với nhân giống theo phương thức tách chồi truyền thống làm cho số lượng chuối bị nhiễm ngày càng tăng. Trước tình trạng thối hóa của chuối già lùn như hiện nay việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô này trong nhân giống là cần thiết.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Chuối nhân giống theo phương pháp tách chồi truyền thống thấy rõ các nhược điểm: cây con tách ra sẽ sinh trưởng kém, phát triển chậm, các cây không đồng đều, lâu cho thu hoạch, không tập trung. Đồng thời việc vận chuyển cây giống là một vấn đề hết sức khó khăn do cồng kềnh, tốn thời gian nhưng số lượng cho một lần vận chuyển rất ít. Với phương pháp ni cấy mơ các nhược điểm trên hồn tồn được khắc phục: cây ra hoa đồng nhất, buồng chuối trổ đồng đều, chất lượng đồng hạng, thu hoạch đồng loạt, đặc biệt cây chuối con hoàn toàn sạch bệnh, cây sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh, thời gian được rút ngắn, tạo ra một lượng giống lớn cho quy mô xuất khẩu, vận chuyển cây giống dễ dàng.

Xuất phát từ các lí do trên tơi chọn đề tài: “Ứng dụng công nghệ nuôi

cấy mô tế bào thực vật trong việc nhân giống in vitro cây chuối già lùn

(Musa Cavendish sp) tạo giống chuối già lùn sạch bệnh” nhằm cải tạo giống

chuối già lùn tại xã Duy Phước, Duy Xuyên, Quảng Nam.

1.2. Mục tiêu của đề tài

- Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ cồn trong khử trùng mẫu chuối. - Khảo sát tìm ra mơi trường thích hợp cho ni cấy khởi động, tạo mô

sẹo, tạo và nhân nhanh cụm chồi, tạo cây in vitro hồn chỉnh.

- Nghiên cứu quy trình tạo mô sẹo từ mẫu chuối trực tiếp và từ mẫu đã được nuôi trong môi trường nhân tạo một thời gian.

- Nghiên cứu giá thể và điều kiện thích hợp đưa chuối ra vườn ươm.

1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu:

Cây chuối già lùn (Musa Cavendish sp) tại xã Duy Phước, huyện Duy

Xuyên, Tỉnh Quảng Nam. 1.3.2. Địa điểm nghiên cứu:

Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng tỉnh Quảng Nam

1.3.3. Thời gian nghiên cứu:

Đề tài được nghiên cứu từ tháng 11/2015 – 4/2016

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

1.4. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thực nghiệm: các thí nghiệm được tiến hành tại trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng tỉnh Quảng Nam.

- Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu tài liệu, sách, báo, internet… - Phương pháp thống kê và xử lí số liệu.

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Phần 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm

Kỹ thuâ ̣t nuôi cấy mô tế bào thực vâ ̣t mô tả các phương pháp nuôi cấy các

bô ̣ phâ ̣n thực vâ ̣t (tế bào đơn, mô, cơ quan…) trong điều kiê ̣n vô trùng.

 Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc - Dựa vào tính tồn năng của tế bào.

- Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa.  Ý nghĩa

- Nhân nhanh giống cây trồng. - Bảo quản nguồn gen.

- Ta ̣o cây sa ̣ch bê ̣nh.

- Sản xuất các hoa ̣t chất sinh ho ̣c. - Mang tı́nh công nghiê ̣p.

1.1.2. Sơ lươ ̣c li ̣ch sử phát triển

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển. Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính tồn năng của tế bào. Có thể thấy sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác. Các giai đoạn chính của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [1, 3, 7, 8]:

- 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kı́nh hiển vi và đưa ra khái niê ̣m tế bào.

- 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. - 1898: Haberlandt là người đầu tiên đề xuất ra lý thuyết về tính tồn năng của tế bào, ơng cũng là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm. Ông đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn năng của tế bào.

Theo ơng: “Mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó”. Vì vậy, khi gặp

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hồn chỉnh. Haberlandt đã ni cấy mơ cây một lá mầm nhưng chưa thành công.

- 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài ho ̣ cải.

- Đến năm 1922, Robbins và Kotte đã thành cơng trong ni cấy đầu rễ cây hịa thảo kéo dài 12 ngày trong môi trường lỏng gồm có muối khống, glucose.

- 1934: White (Mỹ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua với môi trường lỏng chứa muối khống, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó ít lâu White đã chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6), axit nicotinic. Cùng năm, Gautheret thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ mô tượng tầng của cây Salic apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã phân chia liên tục trong môi trường Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride.

- 1937: Went và Thimann đã phát hiện ra chất sinh trưởng thực vật đầu tiên là axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào và hình thành rễ.

- 1938: Gautheret đã thành cơng trong việc duy trì sự sinh trưởng với thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch bằng cách cấy chuyển đều đặn 6 tuần/lần.

- 1941: Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà. Trong thời gian này, nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành cơng như: α-napthyl axetic axit (NAA), và 2,4-Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D). Nhiều tác giả đã nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy.

- 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hố chất điều hồ sinh trưởng và phát sinh cơ quan.

- 1952: Morel và Martin thực hiê ̣n vi ghép in vitro thành công.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

- 1954: Skoog đã phát hiện ra Kinetin (6 furfuryl-amino-purin) là chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi. Sau này người ta cũng tìm thấy Zeatin tách từ mầm ngơ có hoạt tính tương tự Kinetin. Cả 2 chất này đều thuộc nhóm Cytokinin.

- 1960: Bergman đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên một bước mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật. Cũng năm 1960, Cooking đã dùng men cellulase để phân hủy cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào trần (protoplast).

- 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vâ ̣t. - 1964: Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược.

- Bourgin và Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơn bội từ bao phấn thuốc lá, mở ra nhiều triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bội vào công tác giống và nghiên cứu di truyền.

- 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis.

- 1971: Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống Xanthi.

- 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas. - 1977: Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây. - 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trı̀nh chuyển gen vào tế bào trần. - 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp. Mitsui. 0Petrochemicals.

- 1985: Cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố.

- 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen. - 1994: Là năm đánh dấu cây cà chua đầu tiên (cà chua Flav’rSav’r) có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kì. Cùng năm 1994, giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản xuất đại trà tại Na Uy.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Đến nay, đã có hàng trăm lồi cây được nuôi cấy mô thành công với nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao phấn… Đặc biệt, nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã được tạo ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) [7].

1.1.3. Các bước chính trong nhân giống in vitro [7], [5]

Theo George (1993) quá trình nhân giống vơ tính in vitro bao gồm các

bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (cây

cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện mơi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng khi tra đưa mẫu

vào nuôi cấy in vitro.

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỉ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỉ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng và phát triển tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển tốt của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh chồi hoa và sau đó là đoạn thân, mảnh lá.

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thơng qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phơi vơ tính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được mơi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, mơi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (Auxin/Cytokinin < 1: thì kích thích tạo chồi), mơi trường có nhiều Auxin sẽ kích thích tạo mơ sẹo (Auxin/Cytokinin > 1: kích thích tạo mơ sẹo). Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16h chiếu sáng/ngày,

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

cường độ ánh sáng 2000-3000lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy khác nhau địi hỏi chế độ ni cấy khác nhau.

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ Auxin. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung Auxin.

Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm

Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau:

- Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá. - Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt.

- Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp.

1.1.4. Môi trường nuôi cấy [2]

 Thành phần môi trường nuôi cấy gồm các thành phần cơ bản sau: - Muối khoáng đa lượng

- Muối khoáng vi lượng - Vitamin

- Nguồn cacbon

- Chất điều hòa sinh trưởng

- Ngồi ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, ...) và agar.

 Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loa ̣i: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop.

- Mơi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg. - Mơi trường giàu dinh dưỡng: MS.

1.1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng [2] 1.1.5.1. Auxin

Auxin là nhóm chất điều hịa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật. IAA là auxin tự nhiên có trong mơ thực vật, còn NAA, IBA,

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn. Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non khác của cây.

 Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu.

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy.

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. - Đặc tính của auxin.

 Vai trị của các chất thuộc nhóm auxin: - Kích thích phân chia và kéo dài tế bào.

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. - Kích thích sự phân hố của các mơ dẫn.

- Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus).

- Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp). - Tạo phôi soma (2,4-D).

1.1.5.2. Cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là BAP, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng.

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống ni cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách.

Cytokinin có mặt trong mơ phân sinh đỉnh rễ, quả non.  Chức năng chủ yếu của các cytokinin:

- Kích thích phân chia tế bào.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

- Tạo và nhân callus.

- Kích thích phát sinh chồi trong ni cấy mơ.

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh. - Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào.

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài. - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao).

- Ức chế sự hình thành rễ. - Ức chế sự kéo dài chồi.

- Ức chế quá trình già (hố vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục. - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá.

1.2. Giới thiệu chung về cây chuối 1.2.1. Tên khoa học [23]

Loài (species) : Musa sp

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

kiểu gen AAB ở Châu Phi và cả ở Ấn Độ là một phần do sự thích nghi về khí hậu song chủ yếu là nhu cầu cấp bách về lương thực ở những nước này. Đến thế kỷ thứ X do ảnh hưởng của nền văn minh Ả Rập, mối quan hệ giữa các nước này được mở rộng, thời kỳ này chuối là mặt hàng được trao đổi mạnh nhất trên thương trường cả ở những nước xa như Trung Quốc (Davidson, 1974) [13].

Người ta cho rằng, chuối được di trồng đến Châu Mỹ nhờ người Bồ Đào Nha từ thế kỷ 14, và sau đó phát triển mạnh vào năm 1607 (Kenvegent, 1935) [15]. Trong thời gian gần đây sự thu thập nguồn gen và phổ biến các giống chuối có chất lượng ngày một lan rộng, hơn nữa chuối đã được đưa ra thị trường làm mặt hàng xuất khẩu chính, điều này đã gây ra sự chú ý đầu tư của các nhà khoa học về năng suất và chất lượng của các giống chuối ngày nay. Chuối đã được phát triển rộng khắp trên thế giới, khơng chỉ nó quan trọng do việc xuất khẩu mà cịn ở sự đa dạng về hình dáng và chủng loại [14].

Như vậy, chuối trồng đã có 1 quá trình phát triển lịch sử lâu dài, đầu tiên là những cây hoang dại rải rác ở New Ghinea, sau đó được thuần hóa và lan rộng, nhờ dân chúng và các nhà thám hiểm, các cuộc chinh chiến. Ở Châu Á chuối đã xuất hiện từ 4000 năm trước công nguyên. Chính vì vậy, có thể nói chuối có nguồn gốc từ Châu Á, điều này không những thể hiện ở sự phát triển mạnh của chuối ăn tươi và chuối ăn luộc do thích hợp khí hậu mà còn ở sự đa dạng các chủng loại chuối: ở Philippin có 80 lồi, Malaysia 32 lồi, New Ghinea 54 loài, Ấn Độ 57 loại … [13].

1.2.3. Phân loại

1.2.3.1. Phân loại theo tên gọi thường [23]

Theo cách gọi thông thường chuối được chia thành các nhóm sau:

- Nhóm chuối tiêu (Cavendish): Nhóm này có 3 giống là tiêu lùn, tiêu

nhỏ, tiêu cao. Năng suất quả từ trung bình đến rất cao; phẩm chất thơm ngon, thích hợp cho xuất khẩu quả tươi, thích hợp với vùng có khí hậu mùa đơng lạnh. Giống chuối tiêu ở Miền Bắc bình quân đạt 13-14kg/buồng, năng suất trung bình đạt 12-15 tấn/ha.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

- Nhóm chuối tây (chối sứ, chuối xiêm): gồm các giống chuối tây hồng,

tây phấn, tây sứ, được trồng phổ biến ở nhiều nơi, cây cao sinh trưởng khoẻ, khơng kén đất, chịu hạn nóng và khả năng chịu hạn song dễ bị héo rụi (vàng lá Panama), quả to, mập, ngọt đậm và kém thơm hơn so với giống khác. Buồng nặng 15-20 kg.

Chuối sứ không kén đất, chịu được hạn, úng, đất xấu và chịu rét khá hơn chuối tiêu. Do đó, chuối sứ thường được trồng ở các vùng trung du, miền núi. Khả năng bảo quản, vận chuyển kém.

- Nhóm chuối bom (bôm): được trồng phổ biến ở Đông Nam Bộ, trọng

lượng buồng thấp, chỉ đạt từ 6-8 kg/buồng. Thời gian sinh trưởng ngắn nên hệ số sản xuất cao (5 buồng trong 20 tháng/gốc) có thể trồng ở mật độ cao 1200-1500 cây/ha nên năng suất có thể đạt 25-40 tấn/ha. Quả được dùng làm ăn tươi, chuối sấy.

- Nhóm chuối ngự: Bao gồm chuối ngự tiến, chuối ngự mắn. Cây cao

2,5-3 m, cho quả nhỏ, màu vỏ sáng đẹp, thịt quả chắc, vị thơm đặc biệt, tuy nhiên năng suất thấp. Cây chuối ngự cao khoảng 2,5-3m, lá xanh mát. Khác với chuối ngự trâu, quả to, ăn nhạt, chuối ngự thóc (hay cịn gọi là chuối ngự mít) là loại được tiến vua. Cây chuối ngự mít thấp, trái nhỏ, cuống thanh, vỏ mỏng màu vàng óng, thịt trái mịn, bên ngoài màu vàng nhạt, trong ruột màu vàng sậm, mùi vị thơm và ngọt hơn cả chuối tiêu lùn.

- Nhóm chuối ngốp: Bao gồm giống ngốp cao, ngốp thấp. Là nhóm có

chiều cao cây từ 3-5 m. Cây sinh trưởng khoẻ, chịu bóng, ít sâu bệnh, chịu hạn khá, thích hợp với vùng đồi. Quả tương đối lớn, vỏ dày, nâu đen khi chín, thịt quả nhão, hơi chua.

- Nhóm chuối hột: Bao gồm chuối hột rừng và chuối hột trồng.

+ Chuối hột rừng Musa balbisiana nhị bội (là loài chuối nhị bội có kiểu

gen BB), lồi này mọc hoang trong rừng được khai thác làm thuốc.

+ Chuối hột trồng Musa balbisiana tam bội (là lồi tam bội có kiểu gen

BBB), loài này được trồng chủ yếu dùng thân và bắp chuối để làm rau, quả to khi

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

chín ăn được, chủ yếu để ngâm rượu thuốc (rượu chuối hột). Hạt của loài này được bán ở dạng nguyên hạt hoặc xay thành bột để làm thuốc.

- Nhóm chuối làm cây cảnh: Có rất nhiều loài từ đơn bội đến đa bội.

Loài phổ biến nhất là chuối trăm nải (nhóm ABB).

Ngồi ra cịn các giống chuối mắn, chuối lá, nhưng các giống chuối này có diện tích trồng ít vì giá trị kinh tế thấp.

1.2.3.2. Phân loại dựa theo gen

Trước đây theo Linne chuối được chia thành các nhóm [4]:

Musa sapentum L : trái chín ngọt, ăn tươi.

Musa paradiaca L : khi chín phải nấu mới ăn được.

Musacavendish, Musa nana : chuối già lùn.

Từ năm 1948, Cheesman đã phân biệt 2 nguồn gốc chính của chuối trồng

trọt là: M.acuminita colla và M.balbisiana colla. Trong họ phụ Musoidae có 2 giống Enset và Musa [4].

Từ năm 1995, Simmonds và Shepherd đã dựa vào số điểm đánh giá 15 đặc điểm ngoại hình của chuối để quy định mức độ lai của các giống chuối trồng

trọt đối với 2 dòng Acuminita và Balbisiana, trong gen đều có gen A và B [4].

Vakili và Simmon đã phân loại các giống chuối trồng ở Việt Nam trên cơ sở di truyền như sau:

Nhóm AA: gồm chuối Cau, chuối Tiêu, chuối Ba thơm... Nhóm nhị bội

AA có một bất lợi là quả bé, năng suất thấp [4].

Nhóm AAA: gồm nhiều giống trong đó có chuối Già Cui, Già hương, Già

lùn, chuối Laba, Bà hương, chuối Cơm, sau này một số giống của Đài Loan được

đưa vào Việt Nam ni cấy mơ. Nhóm chuối Già lùn (Musa cavendish) thường

dùng xuất khẩu quả tươi [4].

Nhóm AAB: có các giống chuối như chuối Lá, chuối Bom... Chuối Bom

được trồng khá nhiều ở tỉnh Đồng Nai, thích hợp cho việc làm chuối sấy [4].

Nhóm ABB: các giống chuối sứ được nhiều người Việt Nam ưa chuộng. Nhóm BB: có nhóm chuối hột mà phần lớn dùng làm rau ăn sống và dùng

làm thuốc [4].

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

1.3. Giới thiệu chung về cây chuối già lùn 1.3.1. Đặc điểm sinh thái [8]

Cây chuối sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện:

Nhiệt độ: chuối sinh trưởng bình thường ở nhiệt độ 15.5-350C. Dưới 150C và trên 350C hoạt động sinh trưởng của cây bị giảm nhanh. Nhiệt độ bình qn thích hợp của chuối là 24-250C. Chuối sợ lạnh, nhiệt độ xuống dưới 100C kéo dài, cây ngừng sinh trưởng, năng suất và phẩm chất trái kém, đặc biệt mả quả xấu. Ở 50C lá bắt đầu bị ảnh hưởng, nếu kéo dài lá bị khơ héo, nhiệt độ xuống đến 00C thì vườn chuối sẽ bị hại nhiều, nhất là chuối tiêu.

Ở Việt Nam khơng có hoặc rất ít những nơi có nhiệt độ thấp có thể làm chuối chết. Tuy nhiên ở miền Bắc về mùa rét, khi có sương giá có thể làm cho chuối vàng lá hoặc chết nếu là chuối mới trồng. Ở những nơi có nhiệt độ quá cao trên 400C thì một số giống chuối như chuối tiêu sẽ khó chín vàng, chóng nhão. Hơn nữa, nhiệt và ẩm cao thì trái to, vỏ dày, khơng có mùi thơm.

Ánh sáng: trong thời gian sinh trưởng nếu có trên 60% số ngày nắng thì

cây chuối sinh trưởng bình thường. Thiếu ánh sáng thì lá phát triển chậm, quang hợp kém. Ánh sáng quá mạnh làm giảm tuổi thọ của lá, rám cuống buồng làm cho chất lượng chuối kém. Chuối tây chịu nắng hơn chuối tiêu. Trong vườn chuối tiêu, các tàu lá che phủ lên nhau thì sinh trưởng mới tốt. Lượng ánh sáng ở điều kiện nước ta cũng cho phép cây chuối sinh trưởng và phát triển tốt.

Nước: hàm lượng nước trong các bộ phận cây chuối rất cao, trong thân già

92.4%, trong rễ 96%, trong lá 82.6% và trong quả 96%. Độ bốc hơi của lá rất lớn, dưới ánh nắng mặt trời, sức tiêu hao nước của chuối từ 40-50 mg/dm2/phút. Với giống chuối tiêu lùn, cần từ 15-20 lít nước/ngày tuỳ theo trời râm hay trời nắng. Chú ý vào mùa đông ở nước ta thường khơ hanh, ít mưa nên cần có biện pháp tưới ẩm để cung cấp đủ nước cho chuối.

Đất: cây chuối thích hợp với đất đồi, đất ruộng, đất phù sa, đất bãi, có độ

pH từ 4,5-7,5. Rễ chuối thuộc loại rễ chùm, mềm gặp đá sỏi chùn lại, rễ không đâm thẳng mà ngoằn ngoèo, tốn sức, cho nên đất trồng chuối phải có kết cấu đất thuần khơng có sỏi đá, tầng đất sét gần mặt đất.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Phân bón: rễ chuối sinh trưởng liên tục, do đó cần phải chú ý bón phân

cho chuối. Ngồi nguồn phân hữu cơ như phân chuồng, ủ thêm rơm rạ cần phải bón thêm phân hóa học. Các loại khống chất trong phân bón có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của cây chuối.

1.3.2. Đặc điểm hình thái [23]

Chuối già lùn (Musa Cavendish sp) có những đặc điểm chung của Chi chuối (Musa) là những loài thực vật một lá mầm, có hoa, thuộc loại cây thân

thảo khổng lồ.

- Thân: Thân chuối có hai phần:

+ Thân thật: cịn được gọi là củ chuối, có hình trịn dẹt và ngăn, khi phát

triển đầy đủ có thể rộng 30cm. Phần bên ngồi xung quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng trịn. Ở đáy mỗi bẹ lá đều có một chồi mầm nhưng chỉ các chồi ở phần giữa củ là phát triển được, có khuynh hướng mọc trồi dần lên. Các sẹo lá mọc rất gần nhau làm thành khoảng cách rất ngắn. Củ chuối sống lâu năm, là cơ quan chủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng, đồng thời là nơi để rễ, lá, mầm và cuống hoa mọc ra. Do đó củ chuối to mập là cơ sở đảm bảo cho cây sinh trưởng nhanh, năng suất cao. Xung quanh củ chuối có nhiều mầm ngủ, sau này sẽ phát triển thành cây con.

+ Thân giả: Mặc dù nhìn bề ngồi các lồi chuối có thân bụi mọc cao

nhưng thân chuối thật ra là thân giả do các bẹ lá tạo thành. Các bẹ lá cuốn sát nhau tạo thành một khối hình trụ dẻo dai, gồm những khối sợi và những ô rỗng mọng nước. Thân cây chuối cao từ 3-6 m.

- Rễ: rễ chùm, có 2 loại, rễ ngang và rễ thẳng.

+ Rễ ngang: mọc xung quanh củ chuối và phân bố ở lớp đất mặt từ 0-30

cm, phần nhiều tập trung ở độ sâu 0,15cm, bề ngang rộng tới 2-3 cm loại rễ này sinh trưởng khỏe, phân bố rộng, đó là loại rễ quan trọng nhất để hút nước và dinh dưỡng nuôi cây.

+ Rễ thẳng: mọc ở phía dưới củ chuối, ăn sâu 1-1,5cm, tác dụng chủ yếu

giữ cây đứng vững. Rễ chuối chứa nhiều nước, giòn, mềm, yếu, dễ gãy, sức chịu hạn, chịu úng đều kém so với nhiều loại cây ăn trái khác.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

- Lá

Khi mầm chuối mới mọc lên thì bắt đầu mọc ra những lá vảy (khơng có thân lá) có tác dụng bảo vệ mầm chuối. Tiếp đó mọc ra loại lá dài và hẹp gọi là “lá kiếm”. Về sau mọc ra những lá to bình thường gọi là lá thật. Đến khi mầm hoa phân hóa thì mọc ra một lá chót nhỏ, ngắn có tác dụng che chở buồng chuối.

Lá được sắp xếp theo vịng xoắn và gồm có ba phần:

+ Bẹ lá: Mọc từ thân chính dưới mặt đất, các bẹ lá cuộn chặt vào nhau tạo

nên thân giả. Bẹ lá có nhiều chất xơ và các lỗ rỗng, xốp, mọng nước. Tiết diện của bẹ lá hình vành khăn mỏng, 2 bề mặt của bẹ lá nhẳn bóng. Chiều dài của mỗi bẹ lá quyết định chiều cao của thân chính khi lá đã phát triển.

+ Cuống lá: Từ phần cuối của bẹ cho đến phiến lá, dày khoảng 20-40 cm. + Phiến lá: Phiến lá đơn, to, rộng, dài 1-2 m, rộng 0.3-0.6 m, có cuốn lá

chạy dọc đến chóp lá. Phiến lá dễ bị rách do gió giơng, phiến lá được dùng để lót, gói thực phẩm, gói bánh…

- Hoa chuối: cây chuối con sau khi mọc (hoặc sau khi trồng) 8-10 tháng bắt

đầu hình thành mầm hoa, sau đó khoảng 1 tháng bắt đầu trổ buồng. Hoa chuối thuộc loại hoa chùm gồm 3 loại: hoa cái, hoa lưỡng tính và hoa đực.

+ Hoa cái: tập trung ở phía gốc cuống buồng, phần này dài nhất (50-100

cm). Loại hoa này nở ra trước tiên, nhị cái phát triển, nhị đực thối hóa. Chỉ có hoa cái là phát triển thành trái được. Do đó, khi trồng, chọn lọc cây giống tốt, chăm bón kịp thời để hình thành nhiều hoa cái là nhân tố quan trọng bảo đảm năng suất cao.

+ Hoa lưỡng tính: nằm ở phần giữa bắp chuối, loại hoa này không nhiều

lắm, về sau sẽ rụng và khơng hình thành trái được.

+ Hoa đực: nằm ở phía đầu bắp chuối, nhị cái thối hóa, nhị đực phát

triển, dài bằng nhị cái. Loại hoa đực khơng thể hình thành trái được sau này sẽ khô đi và rụng dần.

Chuối phát hoa mọc từ đỉnh của thân chính (lõi chuối) ở ngọn gọi là “bắp chuối”, khi phát hoa nở và kết quả gọi là “buồng chuối”. Trong mỗi lá đài hoa sắp thành hai hàng tạo để sau này tạo thành “nải chuối”.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

- Quả

Quả chuối được hình thành từ các hoa lưỡng tính ở phần gốc của phát hoa. Bên trong mỗi lá đài có một nải chuối được xếp thành hai hàng, mỗi nải chuối có từ 10-30 quả. Trọng lượng mỗi quả từ 100-300g. Trong phần thịt ăn được của

của các loài Chuối Cavendish có khoảng 75% là nước và 25% chất khơ.

- Hạt: Chuối già lùn (Musa Cavendish sp) là chuối khơng có hạt.

1.4. Giá trị của cây chuối già lùn 1.4.1. Giá trị dinh dưỡng [22]

Thành phần dinh dưỡng của quả chuối ăn tươi (banana) nhóm

Cavendish

Theo phân tích của Bộ Nơng Nghiệp Mỹ (USDA) thành phần dinh dưỡng

trong 100 gam phần ăn được của quả chuối nhóm Cavendish (chuối tiêu) được

xuất khẩu chính trên thị trường thế giới như sau:

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của nhóm chuối tiêu (Cavendish) Chuối ăn tươi nhóm Cavendish (chuối tiêu)

Giá trị dinh dưỡng trên 100 g quả chín

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Florua 2.2 mg Liên kết đến cơ sở dữ liệu Bộ Nông Nghiệp Mỹ USDA Tỷ lệ % được khuyến nghị của Mỹ cho người lớn. Nguồn: USDA Cơ sở dữ liệu dinh dưỡng

Chuối là loại thực phẩm quan trọng giàu tinh bột và nhiều chất dinh dưỡng không kém các loại thực phẩm khác. Đây cũng là nguồn nguyên liệu rẻ nhất cung cấp cho con người thực phẩm ăn hằng ngày, thực phẩm đóng gói, bánh kẹo, hương liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm.... Chuối già lùn là chuối buồng dài, quả thon, hình dáng đẹp, khi chín có màu vàng tươi, thịt quả có màu vàng sánh, dẻo, ngọt, có mùi thơm đặc trưng [22]. Vì vậy, chuối già lùn được xem là thực phẩm rau quả tươi được ưa chuộng hiện nay.

1.4.2. Giá trị dược liệu

Theo phân tích khoa học về thành phần dinh dưỡng của chuối chín bao gồm nhiều chất đạm, chất bột, chất xơ, sinh tố và khống chất. Đặc biệt chuối có hàm lượng kali rất cao và chứa cả 10 loại aminoaxit thiết yếu của cơ thể [22]. Vì vậy, chuối có một số tác dụng y học sau:

- Chuối có tác dụng làm hạ huyết áp cao, chữa táo bón và ngăn ngừa ung thư ruột già.

- Chuối là nguồn bổ sung năng lượng hoàn hảo cho các hoạt động sống của cơ thể.

- Chuối xanh chữa bệnh loét dạ dày, tá tràng.

- Chuối có vị ngọt, tính bình, có tác dụng nhuận phế, giải khát, thanh nhiệt, giải độc...

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

- So với nhiều cây trồng khác, toàn bộ sản phẩm của cây chuối có thể sử dụng làm lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, thuốc nhuộm, công nghệ chế biến thực phẩm, làm rượu, làm mứt…

- So với các loại rau quả khác, chuối có chu kì kinh tế khá ngắn, mức đầu tư không cao, kỹ thuật không phức tạp.

- Thị trường tiêu thụ trong nước và ngồi nước cịn đang mở rộng. Theo tính tốn kinh tế thì 1 ha trồng chuối đem lại giá trị sản phẩm bằng 3.8 ha trồng lúa hoặc 10 ha trồng lạc hoặc 6 ha trồng ớt [22].

Hiện nay trên thế giới có ít nhất 107 quốc gia trồng chuối với nhiều mục đích khác nhau: chủ yếu dùng làm trái cây, kế đến là dùng để lấy sợi, sản xuất rượu chuối và làm cây cảnh [22].

1.5. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp ni cấy mơ

1.5.1. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới.

Chuối là đối tượng cây ăn quả có hình thức sinh sản vơ tính với phương thức nhân giống truyền thống là sử dụng chồi nách làm giống trồng những thế hệ kế tiếp. Vì vậy, sử dụng kỹ thuật ni cấy mơ tế bào nhân giống chuối đã được nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu tại nhiều nước trên thế giới như Malayxia, Australia, Pháp, Trung Quốc… và đã góp một phần đáng kể phục vụ ngành sản xuất chuối xuất khẩu.

Theo Reuveni O (1986), kỹ thuật nuôi cấy in vitro chuối có một số ưu

điểm sau (dẫn theo Hoàng Nghĩa Nhạc) [2]:

- Nhân được số lượng lớn giống từ cây ban đầu đã xác định tính trạng. - Chất lượng cây giống hoàn toàn sạch bệnh, tránh được những sâu hại lây nhiễm qua nguồn đất (tuyến trùng). Vì vậy, tiết kiệm được chi phí hóa chất cho xử lý đất.

- Cây ni cấy mơ có thể trồng một vụ với mức độ thâm canh cao, thời gian sinh trưởng ngắn, có thể điều khiển được thời gian thu hoạch.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

- Tỷ lệ cây sống cao trên điều kiện đồng ruộng (>98%), khả năng sinh trưởng nhanh hơn cây có nguồn gốc từ chồi nách.

- Cây giống in vitro phát triển đồng đều, ra hoa đồng loạt và thời gian thu

hoạch ngắn.

- So với cây giống từ chồi nách, cây ni cấy mơ có giá thành rẻ, dễ vận chuyển, dễ nhân giống.

- Tiện lợi cho việc trao đổi nguồn gen quốc tế.

Theo Viện Nghiên cứu Chuối Quốc tế đặt tại Đài Loan thì nhân giống chuối bằng nuôi cấy mô gồm 4 giai đoạn sau: giai đoạn ban đầu nuôi cấy, giai đoạn nhân nhanh, giai đoạn ra rễ và giai đoạn chuyển cây ra nhà kính [17].

Rodriguez-Enriquez và cộng sự (1987) cho biết từ một chồi chuối ban đầu qua cấy chuyển liên tiếp có thể sinh sản và duy trì được 3 năm trong ống nghiệm [18].

Weathers và cộng sự (1988) đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô chuối cải tiến trong hệ phun mù. Các mô hoặc tế bào chuối nuôi cấy được đặt trên giấy lọc bằng vật liệu trơ sinh học, vô trùng và được phun dung dịch dinh dưỡng qua hệ thống phun mù để vừa điều chỉnh độ ẩm vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây. Kết quả cho thấy, chuối non mọc tốt hơn, các mô hoặc tế bào chuối tái sinh cao hơn 4-6 tuần, số lượng chồi lớn hơn 3-20 lần, chu kỳ nhân ngắn hơn 20-50% và chất lượng cây tốt hơn so với đối chứng (nghiên cứu trên môi trường agar thường) [15].

Năm 1991, trường Đại học Quảng Tây (Trung Quốc) đã giới thiệu kỹ thuật đưa cây chuối nuôi cấy mô ra vườn ươm như sau: khi cây trong ống nghiệm cao 8-10cm, phơi ống nghiệm 2 ngày dưới ánh sáng tự nhiên, mỗi ngày 10 giờ, sau đó lấy ra rửa sạch rễ đem trồng trong bầu đất có đục lỗ kích thước 12-14×11-13 cm. Thành phần hỗn hợp trong bầu là đất bùn khô đập nhỏ + cát + đất tro của cỏ rác (tỷ lệ 3:1:1). Môi trường trồng tốt nhất là trong nhà có che Polyetylen, mỗi ngày tưới 3-6 lần để duy trì độ ẩm đạt 80%, cần chú ý tránh mưa to và ánh sáng quá mạnh. Khi cây đạt 5-8 lá thì trồng ra ruộng sản xuất [12].

Theo Kawit-Wanichkul và cộng sự (1993) cho rằng môi trường tốt nhất để nhân giống chuối nuôi cấy mô là môi trường MS có bổ sung 15% nước dừa,

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

1g/lít than hoạt tính và 10mg/lít BAP, pH 5,6 và nồng độ agar là 0,5%. Mô phân sinh chuối sẽ phát triển thành cây con trong 2 tháng. Và ông cũng cho rằng hỗn hợp bụi xơ dừa + cát + phân + compost + đất (tỉ lệ 1:1:1:0,5:0,5) là môi trường tốt nhất cho cây chuối nuôi cấy mô bén rễ, cứng cây, các tác giả cũng kết luận thời gian để vườn ươm tốt nhất là 7 tuần, nếu để quá lâu khi đưa cây ra ngoài đồng ruộng cây sẽ mọc chậm [15].

Hiện nay, Đài Loan đã áp dụng các phương pháp nuôi cấy mô tế bào để nhân nhanh các giống chuối với quy mơ lớn và cịn giúp cho việc duy trì và bảo quản các giống chuối rất thuận lợi. Ngoài Đài Loan, chuối nuôi cấy mô cũng được phát triển mạnh ở Úc, Philippines, Costarica…

1.5.2. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam

Các nghiên cứu về nhân giống chuối trước đây chỉ chú trọng các biện pháp kỹ thuật nhân bằng củ và tách chồi. Những kỹ thuật này hiện còn được áp dụng khá phổ biến ở nhiều vùng miền và nhất là quy mô sản xuất nhỏ.

Kỹ thuật nhân giống vơ tính chuối bằng phương pháp in vitro ở nước ta

cũng thu được một số kết quả sau:

Quy trình nhân giống chuối in vitro đầu tiên ở nước ta do tác giả Nguyễn

Văn Uyển đề xuất năm 1985 [10], bao gồm 6 cơng đoạn chính sau: đưa mẫu vào ni cấy, tạo và nhân nhanh chồi chuối, tạo rễ cây, ươm chuối trong vườn ươm, bầu chuối và trồng ra ruộng sản xuất.

Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự (1993) đã đưa ra quy trình nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô bao gồm 5 công đoạn chính sau: đưa mẫu vào ni cấy→tạo và nhân nhanh chồi chuối→tạo rễ cây→ươm chuối trong vườn ươm→bầu chuối và trồng ra sản xuất. Và cũng cho biết cây chuối nuôi cấy mô ở vườn ươm 60-70 ngày (luống ươm 30-40 ngày và bầu đất 30 ngày) thì được xuất vườn, khi đó cây cao 30-40cm [5].

Đỗ Năng Vịnh và cộng sự (1994) cho biết, tỷ lệ tái sinh phụ thuộc vào giống chuối, các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy và dao động từ 68.42 – 92.31%. Hệ số của chuối tiêu cao nhất khi bổ sung BAP từ 7-9 mg/lít. Nước dừa

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

khơng biểu hiện ảnh hưởng đến chuối tiêu nhưng có ảnh hưởng tốt tới hệ số nhân của chuối rừng ở lượng 10% khi có mặt BAP với lượng 7 mg/lít [6]. Tác giả Đỗ Năng Vịnh (1996) cịn cho biết mơi trường MS chứa thiamin HCL 2 mg/lít, nước dừa 10% và BAP 5 mg/lít là thích hợp nhất. Thời gian cấy chuyển chồi tối ưu là 4 tuần, mật độ 5 cụm chồi/bình (mỗi cụm 2-3 chồi) sẽ cho hệ số nhân từ 2.5-3.0 lần/tháng [6].

Theo Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn và Hoàng Thị Nga (1995)

cho biết hồn tồn có thể sử dụng phương pháp in vitro để nhân nhanh cây chuối,

vật liệu nuôi cấy tốt nhất cho mục đích nhân nhanh là các mơ chồi đỉnh và chuối có thể sử dụng kỹ thuật bóc bẹ khơng cần khử trùng, mơi trường thích hợp cho quá trình khởi động phát sinh chồi ban đầu là môi trường MS + (5-7) ppm BA, môi trường nhân nhanh tương tự như môi trường khởi động nhưng sau nhiều lần cấy chuyển cần giảm hàm lượng BA thậm chí tới 0 ppm và có thể bổ sung nước dừa là 10%. Cịn mơi trường ra rễ tốt nhất là MS + 0,2g/lít than hoạt tính và cũng

nhận xét rằng việc đưa cây chuối in vitro ra vườn ươm vụ hè thu là hoàn toàn

thuận lợi, tỷ lệ sống đạt 100% trên cả 3 giá thể nghiên cứu là: cát, đất thịt nhẹ, đất + cát + phân chuồng [7].

Theo Đỗ Văn Vịnh và cộng sự (1996), cây chuối nuôi cấy mô cần đưa ra luống giâm gồm 3 lớp: lớp dưới là đất dày 5cm, lớp giữa là phân chuồng ải trộn với đất cát pha tỷ lệ 1:1 dày 7cm, lớp trên cùng là cát vàng 5-7cm; mật độ giâm là 300-400 cây/m2; thời gian ở luống giâm là 30 ngày. Sau đó, chuối được đưa ra bầu đất có kích thước 7-10 x 10-15cm, thời gian ở bầu đất từ 45-60 ngày, mùa đơng rét có thể để lâu hơn. Như vậy, tổng thời gian ở vườn ươm là 2.5-3 tháng hoặc lâu hơn nữa. Cũng có thể đưa thẳng cây non ra bầu đất khơng cần qua luống giâm. Đất đóng bầu có thành phần: phân hữu cơ vi sinh + cát + đất phù sa hoặc đất pha cát (tỷ lệ 1:1:1) là tốt nhất [2].

Theo Phạm Kim Thu và Đặng Thị Vân (1997), từ nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất cây giống chuối bằng phương pháp ni cấy mô, tác giả kết luận môi trường nuôi cấy là MS (1962) có bổ sung 1 ppm Thiamin HCl đã làm tăng khả năng tái sinh chồi chuối, nền giá thể ra cây cho tỷ lệ sống cao nhất là

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

1/3 đất + 1/3 phân hữu cơ + 1/3 cát đen và thời vụ ra cây thích hợp từ tháng 4 đến tháng 10. Ứng dụng kết quả này đã sản xuất được hàng triệu cây giống cung cấp cho các tỉnh phía Bắc (Nam Định, Thái Bình, …) [3].

Trước đây, trong quá trình sản xuất nông nghiệp hầu hết các hoạt động đều gắn liền với sự tồn tại của đất trồng. Đất trở thành một nhân tố quan trọng hợp thành môi trường đồng thời trong nhiều trường hợp lại là nhân tố quyết định, sự tồn tại, phát triển hay hủy diệt các nhân tố khác của mơi trường [14]. Thơng thường đất có dung trọng và tỷ trọng thấp thì có độ xốp cao và trong những đất đó thường giàu ơxy nên rễ cây sinh trưởng tốt, hút được nhiều nước và dưỡng chất cung cấp cho sự sinh trưởng phát triển của phần cây trên mặt đất. Ngược lại, cây sẽ sinh trưởng kém nếu trong đất có độ xốp thấp do bộ rễ bị thiếu ôxy, thường những loại đất này có dung trọng và tỷ trọng cao.

Cùng với sự phát triển của các hệ thống canh tác con người ngày càng sáng tạo ra các giá thể phù hợp với từng loại hệ thống, từng loại cây trồng. Giá thể là một trong những loại môi trường sinh sống của bộ rễ, là kho chứa các chất dinh dưỡng và nước cung cấp cho cây trong quá trình hoạt động sống.

Theo Trần Kông Tấu (1993), tỷ trọng đất tỷ lệ nghịch với hàm lượng mùn trong đất [2]. Mùn là thành phần tiền thân của các axit hữu cơ và có vai trị giữ dinh dưỡng trong đất, nên sự sinh trưởng phát triển của cây cũng tỷ lệ nghịch với tỷ trọng. Theo nghiên cứu của Nguyễn Khắc Thái Sơn (2001), tỷ trọng của các giá thể đất, cát gấp gần 3 lần so với giá thể than trấu. Trong giá thể than trấu hàm lượng mùn rất cao đạt tới 7% (trước khi thí nghiệm) và hơn 8% (sau khi thí nghiệm), cịn ở phù sa sơng Cầu chỉ có 1.02% mùn [11].

Độ xốp của giá thể tỷ lệ thuận với lượng ôxy trong đất, hàm lượng ôxy trong đất lại tỷ lệ nghịch với sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng. Giá thể là than trấu có độ xốp cao sẽ là điều kiện thuận lợi cho rễ cây sinh trưởng mạnh. Từ đó sẽ hút được nhiều dinh dưỡng cung cấp cho sự sinh trưởng phát triển của cơ thể [11].

Các nhà khoa học cho biết mỗi cây trồng có thể chịu đựng được trong một khoảng pH nhất định và một vùng pH tối thích, nhưng những vườn ươm chuối

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

tốt thường có pH từ 6,0-7.5. Theo Nguyễn Khắc Thái Sơn thì giá thể than trấu có pH = 7.0, sau khi trồng chuối pH = 6.4, độ pH này là rất thích hợp với trồng chuối [11].

Thời gian gần đây, quy trình nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi

cấy in vitro đã được chuyển giao tới nhiều cơ sở sản xuất và trong quá trình sản

xuất hàng hóa, một số vấn đề đã nảy sinh và công tác nghiên cứu chuyển sang một hướng mới đó là khắc phục những hạn chế của quy trình nhân giống và sử

dụng quy trình phục vụ cơng tác chọn tạo giống.

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu khởi đầu

- Củ chuối mới thu hoạch từ cây 6 tháng tuổi hoặc các cây con sinh ra từ gốc cây chuối mẹ 2-3 tháng tuổi lấy tại thôn Hà Nhuận, Duy Phước, Duy Xuyên, Quảng Nam.

- Mô cấy là phần đỉnh sinh trưởng của củ chuối có kích thước 1-2 cm2, cao 0.5-0.8 cm, trong mơ cấy có nhiều chồi nách tiềm ẩn (chồi bên).

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị

- Phòng chuẩn bi ̣ môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung di ̣ch me ̣. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ la ̣nh, bếp điê ̣n, cân điện tử, cân phân tı́ch, ống đong, pipet, máy đo pH,…

- Phòng cấy vô trùng gồm tủ cấy, đèn UV, các du ̣ng cu ̣ đã hấp vô trùng... - Phòng la ̣nh nuôi cấy gồm kê ̣ sắt, đèn chiếu sáng, nhiê ̣t kế, máy điều hòa... - Các du ̣ng cu ̣ gồm đèn cồn, đı̃a peptri, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiê ̣m vô trùng loa ̣i 250 ml, 500 ml, bình tam giác 250ml, giấy vơ trùng, dây thun,…

2.1.3. Hóa chất

- Hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy gồm các thành phần cơ bản sau: + Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

+ Các vitamin + Các aminoaxit

+ Nguồn cacbon: một số các loại đường + Các chất điều hòa sinh trưởng

+ Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khơ,…

- Các loại hóa chất dùng để rửa và khử trùng trong quá trình nuôi cấy: + Cồn 700.

+ Nước cất, nước cất vô trùng.

+ Dung dịch khử trùng: nước javen, dd HgCl2, dd Ca(OCl)2… + Dung dịch xà phịng lỗng.

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

2.2. Quy trình ni cấy

Các bước trong quy trình nhân giống chuối được thể hiện ở sơ đồ sau: Chọn mẫu

Đưa mẫu chuối vào môi trường nuôi cấy