Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn phân lập ở Việt Nam dùng trong sản xuất phân hữu cơ đa chức năng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (62.55 MB, 192 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁTChữ viết tắt Chữ viết đây đủ

kDa (Kilo Dalton), khối lượng phân tử i |

Bp (base pair), cap bazo

dNTP Deoxynucleosid triphosphate

Taq Taq (Thermus aquaticus) polymerases

OD | (Optical density), mat độ quang

SDS Sodium dodecyl] sulphate

CMC | Cacboxymetyl- xenluloza |CMC-aza | Cacboxymetyl- xenlulaza |

TLE (thin layer chromatography), sac ky ban mong |

HPLC - (High Performance Liquid Chromatography), |

sac ký long cao áp

DMSO Dimethyl Sulfoxide

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Chương 1. TONG QUAN TÀI LIỆU...-52 222tr 4

1:1; Nim Gấu NPE của thle Vabiiwnnnnnuncumnnnnmnmncamancmenmmnnee 4

Jedads XI PsooơastragiuostlstNGGNGIAUGIPGĐSNHHSWNRIANNIRNSNẩiuttiriairiiioaGtishij@NGHSSGHGINSRGGMGWGNNGSENH +

Í:1:5, PROUD cuniumnmamnnmmmmnscn men 4

LoL SR all sas nnganadedeandittietsgrtooigigi50001ã56180059008442iu5613340614553854E404EIREAGEDIIGSG1ESHHDENGS 4

1,2. Các loại pan DO iisscsscavescansscesscsccssceccccasaveccsasescnccsanwerensexeeecsoxesonces 4

Lats POR OD nner 4Dice FARE PIN KG ssunmaeeedasreorditassuiBysisuiureetoeesessatareisevessadEieEgursssssrBekrisivgxeZSnslEsnrsfksrEt 5

1.2.3. Phân sinh học ... -- << <1 1111111222111 1T nọ KH kt 6

1.3. Vai trò của vi sinh vật trong quá trình phân huỷ

các hợp chất trong tu nhÏÊñn... << 5< << < S 1.1. v.v. g1 01.00 71.3,1.Tam quan trọng của photphat đổi với CRY TONE seessneaeesiiaeaeaenanne 7

1,3,3, Xeriluloza và enzym thuỷ phần xenlUOfieeeeseaieeesiiavenaaaeieaianassanias 121.3.5. Tinh bot W@enzyarvthuy phân CAB ĐỒ deeeoiareiaeoeeeoaeieeendeetdirocedlkevgergteosrodk 18

1.3.4. Dac điểm chung của vi khuẩn lactic và vai trò của chúng

trong sẵn US RAN BỒN geaeeaeesenderrarensoerapidetseesgtdbsnnsbkdkkisiooksspgenticgesiruturatoifk 300008 25

1.3.5. Nhiữog;chết điều hoà sinh tướng ThỰC Vũ boeeeaaiiriiiaarnrienanaereasrrneene 29

15.7. Tinh Bink nehién cứu ong AUC ceeeoeeieeeeieeieirieninieieraroaisiedekigsne 39

Chương 2. NGUYÊN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP...---ccce. 4I

BL, VÌ MÌNH VẬT...ee=sesesseescessacesssskisaanaisiS4ãdSG8/596506853W18W89598W910ã6068S08136ã88433865Ä50ãA8488 4I

Hà Nội - 2005

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

TH 0 0 eeeeesseeessesesenssertrdvervoolgiiveGESEGESSGENGEIOGIESSGESSSI 4I2/4, Mi THỐNG ee 42

Bede NT PNA By ueeaaeaieebadegdatiibitdiatieig64i601610566184855014438138Ấ48444554601445ã08586ã328884 44

2.5.1. Xác định chuyển hoá photphat theo Molipdat amon [20]...--- 5-5: 44

2.5.2. Phân lập vi khuẩn lactic [922]...- -:-¿- +25: S222 S2 S22 S2*2ESE£E£zE££zE£zzzzzxzzccxcxz 45

2.5.3. Đặc điểm. sinh lý, sinh hoá của các chủng nghiên cứu [127]... 46

2.5.4. Định lượng đường theo Micro-Bertrand [ IOO]...‹‹--- ---<++s+++<<<ssss2 46

2.5.5. Định lượng axit lactic theo Therner [ II Š]... ¿5 55s + s***+++>*vvee>ess 47

2-10, ĐINH [HH DNETRETIOXH ..0.c0cncerennsairnnannenvndewnnviaintesndenvndana ceasinndensbediatiaeservinaianwceneed 47

2.5.7. Định lượng protein theo Bradford [18, 19] ... -¿ 5c s 555 s+*+s#£+ee<zsss+ 48

2.5.8. Xác định axit diaminopimelic của vi khuẩn [ I I8}]...----+-2<5s<5s5s<+: 49

2.5.9. Xác định hoạt tính amyÌaZa... - -- G1 11111 111 v1 1g 1 11 1802 x6 50

2.5.10. Nghiên cứu đặc tính và độ bền của proteaza [95] ...---:c----<--<-<-<- D3

2.5.11. Các phương pháp sinh học phân tử ...- ¿c2 52232332 * + £+e£+ezvcss 54

2.5.12. Xác định IAA (indole - 3 - acetic - acid) [44, 45, 62] ...--- ----‹‹-s- 59

Chương 3. KET QUA VÀ THẢO LUẬN...--2--+°E+e++2E22+z+eee 61

3.1. Vi khuẩn chuyển hoá photphat...ccsssssscscsssssssssesesesssssssecsesesesceescseseeesee 613.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn chuyển hoá photphat... --- 5-5 2 25552 61

3.1.2. Tuyển chon các chủng vi khuẩn có kha năng chuyển hố photphat... 62

3.1.3. Đặc điểm hình thai, sinh lý và sinh hoá của 2 chủng H2 và H5... 63

3.1.4. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi

đến kha nang chuyển hố photphat khó tan của 2 chủng H2 và H5... 683.1.5. Chuyển hố các hợp chất photphat vơ cơ khó tan của 2 chủng H2 và H5... 72

3.2. Vi khuẩn có khả nang sinh tổng hợp aimaz:...- 5-5-5 << sssss<s<sese 803.2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn có khả nang sinh tổng hợp amylaza...- 80

3.2.2. Kết qua nhận biết amylaza bang sac ký ban mỏng...--: ¿5+5 5¿ 81

3.2.3. Lua chon nhiệt độ thích hợp cho 11 chủng đã được tuyển chọn... 823.2.4. Dac điểm hình thai,sinh lý. sinh hố của 2 chủng H3 va H4... 833.2.5. Dac diém hinh thai, sinh ly, sinh hoa

của chung vi khuẩn M51 có hoạt tính xenlulaza...--- ¿+ 55252552 ssss+s+zsss+2 96

3.3. Dac tinh proteaza ngoại bao ở 2 chung H3 và H4... < «<< 106

Ha Noi - 2005

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

3.3.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính proteaza ở 2 chủng H3 và H4... 1063.3.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại hoá trị hai

den hoạt tinh enzym của 2 ching Hồ và HÀ sua eaaaeeaaaaaaaauddaeao-yZýŸsec 107

3.3.3. Xác dink thành phân protean bang Gen Ai ssccscasssssincrsienaciasnncensaweners 108

3.3.4. Anh hưởng của EDTA va PMSF lên hoạt tính của proteaza

trong dịch ni ở 2 chủng H3 và H4...-- - ¿(5c 3221323333 svscrrerreees 108

3.3.5. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính proteaza

của 2 chủng H3 và H4 sau khi bị ức chế bởi ElDTA...---+5- «5+ x<+x<++ 109

3.3.6. Độ bền nhiệt của proteaza ở 2 chủng H3 và H4...- --- ¿+ ++++<ss5+2 110

3.4. Tuyển chon các chung vi khuẩn sinh axit lactic và bacterioxin cao... 111

3.4.1. Lua chọn các chủng vi khuẩn có khả nang sinh axit lactic cao... 1123.4.2. Dac điểm hình thái. sinh ly, sinh hoá của 2 chủng L24 va La... 113

3.4.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi đến kha nang sinh axit lactic

và sinh bacterioxin của 2 chủng L24 và La...-- -- ¿+55 32s +22 £zvvezx2 119

3.5. Dac điểm và tuyển chon vi khuẩn Azotobacter va Rhizobium

có kha nang sinh chất kích thích sinh trưởng thực vat TAA ... 130

3.5.1. Tuyển chọn chủng Azotobacter và Rhizobium sinh IAA

sau 42 giờ nuôi bằng phương pháp sac ký bản mỏng ...---- --: ¿+ +5-s52 130

3.5.2. Dac điểm hình thái. sinh ly, sinh hoá của 2 chủng HA4 và Rh... 132

3.6. Động thái sinh trưởng, pH và tổng hop IAA

trung nuôi cấy lắc của chúng Bt scicncansccnmannncnmmnnamnammmnnennan 138

3.6.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng

về tng hợp TAA của chúng Bissau 139

3.6.2. Anh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến sinh trưởng

và tong hợp IAA của chủng Rh... ¿+ ¿525233 232v 2E£EEEESEEEErErkrxrvrrrrrrrrsrrer 140

3.6.3. Anh hưởng của nguồn axit amin đến sinh trưởng

và tong hợp TAA của chủng Rh... . -- + - St 2S tt SE nnHHHnHHnHd, I4I

3.6.4. Anh hưởng của vitamin đến sinh trưởng và tong hop IAA của chủng Rh.... 142

3.6.5. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sinh trưởng

tũ:tơng hưu AF 0 chính TE car «eo «es=eeeecscosbskotbkdtdtiegi6siodiE4a3258 1agGgi0uGiudzgS0L.80 143

3.7. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi đến tong hop IAA của 2 chủng

Azotobacter chroococcum HA4 va Sinorhizobium xin jiangensis Rh... 144

3.7.1. Anh hưởng của pH đến sinh tổng hop IAA của 2 chủng HA4 va Rh... 146

3.7.2. Anh hưởng của Na;Mo, đến sinh trưởng va tổng hop IAA của chủng HA4 148

Hà Nội - 2005

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà3.8. Bước dau nghiên cứu sử dụng hôn hợp vi khuẩn

eG plat Kile Oe Ch Re wane menue 149

38.1, Động học của q trình đ phần Vi SiN sscssccsssssscccssscscsssssssesvecssnmmsecancenerseeans 150

3.8.2. Anh hưởng của một số yếu tố môi trường đến kha nang ủ phân... 152

3.5.3. Qui trỉnh:ủ phần bốn hữn cơ a ChỨc HẴN ceeeaeeeaeddodoodrdeddrdaadren 156

3.8.4. Tham do anh huong của hỗn hợp bón phân vi sinh vat

lên sinh trưởng và phát triển của cây trỒng...-- ¿+ 25+ s+s+zs+xszszxzvxexzrsrxres 158

KET 8) ... 162

DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN... 164

TÀI LIEU THAM KHẢO...--222°c2cveeecEvreerrtrreerrvrrerrrrrrrrrrrie 165

PHỤ LỤC

Hà Nội - 2005

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

DANH MỤC CÁC BANG

Bảng 3.1. Số chủng vi khuẩn chuyển hoá photphat phân lập từ các mẫu đất... 62

Bảng 3.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hố photphat...63

Bang 3.3. Đặc điểm hính thái khuẩn lạc và tế bào của 2 chủng H2 và H5... 64

Bảng 3.4. Đặc điểm sinh ly, sinh hoá của 2 chủng H2 và H5...---- 65

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp amylaza... 82

Bảng 3.6. Đặc điểm hink Thái của 7 chủng H3 và HÃ scsscccsssgcacsacmneccermseacenwnssnvanes 84Bang 3.7. Đặc điểm sinh ly, sinh hoá của 2 chủng H3 va H4... 86

Bảng 3.8. Anh hưởng của Ca** lên độ bền nhiệt của amylaza

cuỗ 2 chủng Hỗ và HÀ aeeaaeeoaaaanraaodbodtidttttoibtlsidaSGAIĐSDIEIAREIGIRSISISS8G1640208108 90

Bang 3.9. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nhân giống

tiến sinh tổng bhơpenzym của 2 chững Hồ và WA wuwsmenmnseanmnvonnmmnnasenen 95Bảng 310. Dae điểm hình thái của chine MỸ laseeoanaadaanoasdiaioiadearoionsaiaon 97Bảng 3.11. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng M5I... 98

Bang 3.12. Kết quả các bước tinh sạch CMC-aza của chủng MŠI... 103

Bang 3.13. Khả nang phân giải tinh bột, xylan va pectin của chủng M5I... 105

Bang 3.14. Kiểm tra khả nang sinh axit của các chủng phân lập được... 112

Bang 3.15. Đặc điểm hình thái của 2 chủng L24 và Lúa...--- 55c ccsss s52 114Bang 3.16. Kha nang đồng hoá đường của 2 chung L24 va La... .- 115Bang 3.17. Kha nang sinh axit lactic va bacterioxin

của 2 chủng L24 va La trên các môi trường khác nhau...--- --- +5: 119

Bảng 3.18. Anh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng

và tổng hợp IAA của chủng ÂÌi... - (5 5c S523 233 3E 1 3 1xx xu 139

Bảng 3.19. Anh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến sinh trưởng

và tổng hop IAA của chủng /ji... G1 S352 2 2121232323311 11111111 xrkrkrki 140

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nguồn axit amin đến sinh trưởng

và tổng hợp IAA của chủng ÏRh...-- 5: S522 *EEEEEE2E£EEEEEEEEvrkrkrkrkrrrrrreeo 141

Bảng 3.21. Anh hưởng của vitamin đến sinh trưởng

và tổng hợp IAA của chủng RRh...--- + +2 +2E22 22225232 S SE SEzErErrrkrkrkekree 142

Bảng 3.22. Ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng đến sinh trưởng

và tổng hop IAA của chủng #ji...- ¿55:52 322221232125 SE EEEEEErkrkrkrkrrrrrsre 143

Hà Nội - 2005

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Bang 3.23. Biến động số lượng vi sinh vật trong đống ủ phân vi sinh... .. 151

Bang 3.24. Anh hưởng của nhiệt độ va độ ẩm lên su phân giải co rác

othe Inet SOG scanner 153

Bang 3.25. Ảnh hưởng của việc duy trì độ ẩm và tần số đảo tron đống

trong qua trình đ lên hiệu quá phân giải cơ CIAL osaaeoaaaeaaỷaedatdrodibioiddidiooode 154

Bảng 3.26. Ảnh hưởng của phan vi sinh đến sinh trưởng và phát triển của cây lạc 158

Bảng 3.27. Ảnh hưởng của phân vi sinh lên sinh trưởng

va phêtiiriển của các loại rau thông ThƯỜNG seoeeeenonniinaneinnaeraesnnidsessosse 160

Hà Nội - 2005

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử xenluloza [ Í 3] ...--.--- ---- --- 555 -<-<5<<<Ă<50<552556 13

Hình 1.2. Chuỗi các đơn phân hydroxyetyl xenluloza [23] ... --- 13

Hinh 1.3. Cấu trúc của tỉnh bột (51) siessecvsssvescscrcssscsvrssensverernenensnssnennnenasensansseneoneenes 18Hình 1.4. Cấu trúc mach amyloza [§2]...--.-.--- Ăn nhe 19Hình 1.5. Cấu trúc mach amylopectin...:.s.ccccsecscsssessessssssscstccsseneessesesersossoneees 20Hình 1.6. Mơ hình cấu trúc của œ-amylaza [82]...scseceresressssscerssssessennenenesoes 20Hình 1.7. Mơ hình cấu trúc bậc IT của œ-amaza... --- --- 5-5 S‡seieeeeeerer 21

Hình 1.8. Mơ hình cấu trúc bac III cua g-amylasa (BZ) ceeeeeeeeeees=ssee 21Hình 1.9. Mơ hình cấu trúc bậc IT của B-amylaza [58§]...--- --- 32

Hinh 1.10. M6 tình cấu trúc phần từ của baclerloxin...-<-Ÿ-ẰSSSSeeeiieee 26

Hink Lt 1, Cu trúc của IAA uc ngedereeddardeadioenepoiosdeosernnsisiiiedaandiggsiapsvsoseek 29

Hieh LT. Cù chế vinh tổng hop AAmnannnasnennenuncmmmmnnmmunmncmena 30Hình 1.13. Cơ chế tổng hop IAA từ triptophan [42] ...---- --- ---<<<< 31

Hình 1.14. Chu trình nitơ trong sinh quyỂn ...-¿- ¿+ + 555252 s+xsvs+s+zsvsesexsez 32

Hình 1.15. Nốt san của cây họ đậu [79, 91, 11O]...«-~.<c<<xcee-eee.--.. DO

[0/1/87883/0011090011.07907 77 ... 45

Hình 2.2. Đường chuẩn protein theo phương pháp Bradford... -.- --:-- 49

Hình 2.3. Đường chuẩn IAA (indole - 3 axetic - aXiẲ)... ---<<c<<s<c<-cS2 60

Hình 3.I. Khả năng chuyển hoá photphat của vi khuẩn trên mơi trường Gerretsen .61

Hinh 3.2. Hình dạng té bao chủng Hỗ (% 7 SÙaaeaeeeedaa¿a.ddeaaadaiỹia-yŸỷya-aaersyen 64

Fink 3.5. Hhih dang 6 Bào chute Hỗ Bá T S00) xeeeeivsennseeneseiseneennanrrors 64

Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR của 2 chủng H2 và HŠ

trên gel polyacrylamit S%, ge] nhườm DAE seeaeeeaaaaaddodddddddiddoauddadaoddaasn 66

Hinh 3.5. Cay pha hé dua trén phan tich rADN 16S

của 2 chủng H2 va HS va các lồi có quan hệ gần... --- ¿+ +-++x+x+cs+sc: 67

Hình 3 6. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng

và chuyển hoá photphat của chủng H2 ...-- - - 5 5+5 5+Sz++S+x+t+++zx+xzx+z+szez+z 68Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng

và chuyển hoá photphat của chủng H5 ...-- + - 5+ 5+Sv+v+x+x+xvxvxexvzvsvzxeseei 69

Hà Nội - 2005

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng

và chuyển hoá photphat của chủng H2 ...---S- 1222122222210. 120 70

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng

và chuyển hoá photphat của chủng H5 ...--- Ác Hé, 70

Hình 3.10. Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl

đến:thuyển ted phốiphatLobs chủng HỖ a.cssssaccssmrcaecmonsennwonmcamocamemnegerovavcinns 7I

Hình 3.11. Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl

đến chuyến hơi phoípbmtcủa chũng FG naeaaaaaaaaadtdauodorndiditingebiniddordbbreeg 72

Hình 3.12. Chuyển hố photphat vơ co Ca,(PO,), của chủng H2... 73

Hình 3.13. Chuyển hố photphat vơ cơ Ca;(PO,); của chủng HŠ... . 73

Hình 3.14. Chuyển hố photphat vơ cơ FePO, của chủng H2 ... --- 74

Hình 3.15. Chuyển hố photphat vơ cơ FePO, của chủng H5 ... . --- 74

Hình 3.16. Sự thay đổi pH sau 144 giờ ni của 2 chủng H2 va HŠ... 75

Hình 3.17. Sự chuyển hoá apatit của chủng H2 theo thời gian... -.--- -- 76

Hình 3.18. Sự chuyển hố apatit của chủng H5 theo thời gian... --- 76

Hình 3.19. Sự thay đổi pH ban đầu của 2 chủng H2 và H5 sau 144 giờ... 77

Hình 3.20. Chuyển hố photphorit của chủng H2 theo thời gian...--- 78

Hình 3.21. Chuyển hố photphorit của chủng H5 theo thời gian... ---- 78

Hình 3.22. Sự thay đổi pH của mơi trường chứa photphorit sau 144 giờ... 79

Hình 3.23. Kha năng tổng hợp amylaza của 11 chủng vi khuẩn... -- 81

Hình 3.24. Kết quả sac ky ban mong của 11 chủng vi khuẩn... 5-5-5: 81Hình 3.25. Hoạt tính amylaza trên môi trường thạch chứa tinh bột 0.1% ở 40°C...83

Hình 3.26. Hoạt tính amylaza trên mơi trường thạch chứa tinh bột 0. 1% ở 37°C....83

Hình 3.27. Hoạt tính amylaza ở 25°C của các chủng DII, M17, M21. B16

tí6đ.i ii tring thạch chữa tình DGt Oe neaeeeaueeanddtaoveraedorootieogltvvniegesgssse 83

Hình 3.28. Hình dạng tế bào chủng H3 (x 7 500)...- s5 522cc 85

Hình 3.29. Hình dạng tế bào chủng H4 (x 43 000) ...- --- 2c c55cccccccĂ2 85

Hình 3.30. Điện di đồ. trên gel polyacrylamit 5% san phẩm PCR

của 2 chủng H3 và H4, gel nhuộm bac ... .---- + + 252222222 S* 223222 + czxzcrxe 86

Hinh 3.31. Cay pha hé dua trén phan tich trinh tu rADN 16S

của 2 ching H3 và H4 và các loài cố quan hệ GAN wissersssisssscersencmoninaasareccsseanes 87

Hình 3.32. Anh hưởng của các nguồn glycozit đến sinh tổng hop amylaza

của 2 chủng H3 và H4"óc... -é

Hà Nội - 2005

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

Hình 3.33. Điện di đồ enzym trên gel polyacrylamit của 2 chủng H3 và H4.

ge) nhướm Latta eaaeeaaradrdrdabiiasiaaknasrissioyoiiedkeardaplltsssssseereuxsaisi6 94804068 5016110. 91

Hình 3.34. Anh huong của nhiệt độ tới hoạt tinh amylaza của chủng H3... 92

Hình 3.35. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính amylaza của chủng H4... 92Hình 3.36. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sinh trưởng

và tổng hợp amylaza của chủng H3...--- ¿+2 ¿552222 S2 S+E+t+txeereerrrrrerrrrrrerree 93

Hình 3.37. Anh hưởng của pH ban đầu tới sinh trưởng ... . -.--- 94

Hình 3.38. Hình dạng tế bào của chủng M51 (x 1 000)...ciei.e 97

Hình 3.39. Điện di đồ sản phẩm PCR của chủng MSI trên gel polyacrylamit 1% ..99

Hình 3.40. Cây phả hệ dựa trên phân tích trình tự rADN 16S

cua. Chúng M51 và cất 108i có gưag HỆ BAN d.ccccccs2+ddqdqtiieiantgdiiitofiasvsgan000 100

Hình 3.41. Phố lọc gel dịch chiết chế phẩm CMC-aza

qua cột loc gel Sephadex G-2Š...- --- G22 3t. ng ng ng ưưn 101

Hình 3.42. Sắc ky đô chế phẩm CMC-aza qua sắc ký trao đổi ion (DEAE)... 102

Hình 3.43. Sắc ký trao đổi ion dịch nuôi ching M51

tiến CCE DEAE Ser Ak, TT ăeereeerreenseedeeersroroesavsrsEsvaiSeeriEfBsgggNye 103

Hình 3.44. Hoạt tính CMC-aza của chung MST trên môi trường thạch chứa CMC

05% sau khi đã được tinh sach qua HPLC x cccssccccisssvesccersnorsnassseresscensivsesaveaesss 104

Hình 3.45. Điện di đồ gel polyacrylamit 7%. Enzym CMC - aza của chung M51

sau khi t4i sắc ky qua cột CIS của bệ thống APLC. sicessscsssencesscssenvscsacocsumssncsnesiaee 104

Hình 3.46. Anh hưởng của pH lên hoạt độ proteaza ở 2 chủng H3 và H4... 106

Hinh 3.47. Anh huong cua ion kim loai hoa tri hai dén

Hat Hn OLtaes. 02 cli0n6 HG HH eaeaaeaaaonaaaaoeaoarsuoaoataeroaanogsg 107

Hình 3.48. Điện di proteaza trên gel polyacrylamit 10% có SDS va gelatin 0.1% . 108Hình 3.49. Điện di proteaza trên gel polyacrylamit có SDS và gelatin 0,1% ... 109

Hình 3.50. Xác định độ bên nhiệt của proteaza của 2 chủng H3 va H4... 110

Hình 3.51. Tuyền chọn vi khuẩn lactic dựa trên khả nang tao vịng trong suốt

))1/380171/1180 41/70 ... III

Hình 3.52. Kha năng sinh axit lactic của 16 chủng lactic đã tuyển chọn... I2

Hình 3.53. Hình dạng tế bào của chủng L24 (x 7 500) ...---+ 55555555552 114Hình 3.54. Hình dang tế bao của chủng La (x I 000)... eeceeeseesseeseeeseeeees 114Hình 3.55. Kết quả xác định DAP - isomer của 2 chủng La và L24

trên sắc ký bản MON ... - -- ¿+ 6 S13 t 319 S 339151531 11251 151 11H ng nh ưyc 116

Ha Noi - 2005

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Hình 3.56. Điện di đồ. trên gel polyacrylamit 5% sản phẩm PCR

của 2 chủng La và L24, gel nhuộm bạc ... 2226 117

Hình 3.57. Cây pha hé dựa trên phân tích trình tự rADN 16S

của 2 chủng La và L24 và các lồi có quan hệ gần...-. - --- :-+-++-+-++ 118

Hình 3.58. Ảnh hưởng của mơi trường ni đến khả nang sinh axit... . 120

Hình 3.59. Su kháng Shigella flexneri của 2 chủng L24 và La... 121

Hình 3.60. Động thái sinh trưởng va tổng hop bacterioxin của chung L24... 121

Hình 3.61. Động thái sinh trưởng va tổng hợp bacterioxin của chung La... 122

Hình 3.62. Sinh trưởng và tổng hợp bacterioxin của chủng L24... 123

Hình 3.63. Sinh trưởng và tổng hợp bacterioxin của chủng La... eect 124

Hình 3.64. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng và tổng hợp

bactelosin của CHẴNG LỒN caaaandgtatinuadtsaatdotoitdicUo00860313646(0380665183883030801000010 125

Hình 3.65. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng

vã tổng hop bactalouein của CRẲN LA suaaaeedadddtiiriaiiaoodiraitbteiin98161614364648100166868 125

Hình 3.66. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vơ cơ đến sinh trưởng

vã tổng hợp bacterioxin của chÚng TỒÃ aeaeeeaednodeiidgnioalistsdseosgeossasstae 127

Hình 3.67. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vơ cơ đến sinh trưởng

vũ lơng hợp bacterioxin của CHỦnG LA sesnussscasceneenmassienccmmmemenrennprexeens 127Hình 3.68. Điện di đồ gel polyacrylamit 15%, gel nhuộm bạc... ---- 129

Hình 3.69. Tuyển chon các chủng vi khuẩn có khả nang sinh IAA ... 130

Hình 3.70. Xác định IAA của các chủng HA4 và Rh bang sac ký ban mỏng... 131

Hình 3.71. Dinh hấp phụ IAA của chủng HA4 trên biểu đồ HPLC... 132

Hình 3.72. Hình hấp phụ [A Acủa chủng Rh trên biểu đồ HPLC ... 132

Hinh 3.77. Hình thai kiuiẨn lạc của chùng HA 4 sssscsesssnievesnmmmenereereanoeneseavens 134

Hình 3.74. Hình dạng tế bào của chủng HA4 (x1 000)...--.«c~-<<<<<<2 134

Hinh 375. Hình thải khuẩn ne của chúng BH uaaeeaaeeeaeeeedeeeaaranaeeeeese 134

Hình 3.76. Hình dạng tế bao của chung Rh (x7 500)...---c5 525cc 134

Hình 3.77. Điện di đồ trên gel agaro 10% sản phẩm PCR

eta 2 chững HAI vi RY agggadgaioauboaidg 01681010100 6010124G3AEG00003380008661594X.y488n 135

Hình 3.78. Cây phả hệ dựa trên phân tích trình tự rADN 16S

của chủng HA4 và các lồi có quan hệ gần ... --- ¿+5 55x52 +2 xxx s2 136

Hình 3.79. Cây phả hệ dựa trên phân tích trình tự rADN 16S

của chung Rh và các lồi có quan hệ gần ...--- ¿+2 +52 22 SxszxszEcvexesxss 137

Hà Nội - 2005

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

Hình 3.80. Biến động của sinh trưởng và hàm lượng IAA của chủng Rh... 138Hình 3.81. Biến động của pH ban đầu va anh hưởng cua triptophan tới chung Rh 138

Hình 3.82. Định lượng IAA và nitơ tổng số của 2 chủng HA4 và Rh sau 42 giờ... 145Hình 3.83. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến tổng hop IAA của chủng HA4... 147Hình 3.84. Anh hưởng của pH ban đầu đến tổng hợp IAA của ching Rh... 147

Hình 3.85. Ảnh hưởng của nồng độ Na;MoO, đến sinh trưởng

va tổng hop TAA. của chủng HÀ đoneeeeeaeeeeeneicieiiiiiiisiiaanenassssrioniseossgoesesve 148

Hình 3.86. Qui trình b phân hữu cơ da chức nang ...:00....senesersossssssserssevensaes 156

Hình 3.87. Cây lạc sinh trưởng sau 2 tháng bón phan vi sinh... ---- 159

Hình 3.88. Cây lạc sinh trưởng sau 2 tháng bón phân khơng có vi khuẩn NC... 159

Hình 3.89. Su hình thành cu, rễ và nốt san của cây lac

sau 2 tháng bón phân khơng có vi khuẩn NC...-- 6+5 + Sssssresrerrrrree 159

Hình 3.90. Sự hình thành cu và nốt san cua cây lạc sau 2 thang bón phân vi sinh. 159

Hình 3.91. Sự sinh trưởng và phát triển của bap cải sau | tháng bón phân vi sinh. I6]

Hình 3.92. Sự sinh trưởng và phát triển của bắp cải

sau 1 tháng bon phân Không cd vi Khuẩn NC ueeeeeeeaeernroeenaaodenenasnasnrsse 161

Hình 3. 93. Su sinh trưởng và phát triển của cai xanh sau 2 tuần bón

THÂN WỈ SH ngungaataoaudxacGtngi00000110038)860186407020406/600136003048366Gk6066843109889449/05000488NG 161

Hình 3.94. Sự sinh trưởng va phát triển của cây cải xanh

sai 5 adn hẳn phần khơng có ví KhUIẨN Ces ssssscsccsccsicncassanearsianansiedsanomenveanvansecianes 161

Hình 3.95.Su sinh trưởng và ra quả của cây ớt xanh sau | tháng bón phân vi sinh 161

Hình 3.96. Sự sinh trưởng và ra quả của cây ớt xanh

sau | tháng bón phân khơng có vi khuẩn NC...- 2 2 252 s+s+s+zSzSz£zxzxzzszsx2 161

Ha Noi - 2005

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

MỞ ĐẦU

Sau nhiều thập ky sử dung 6 ạt phân bón và thuốc hố học như một biện pháp

then chốt trong thâm canh tăng năng suất cây trồng ở Việt Nam. bên cạnh nhữngthành tựu xuất sac thu được. Nông nghiệp Việt Nam dang phải đối mat với những

vấn đề nóng bỏng của ơ nhiễm mơi trường. thối hố đất đai. với u câu bức bách

của sự phát triển một nền nông nghiệp bền vững. Người ta đang bàn đến tác hại của

“tam đại gia”: Sulfat amon, sulfat kali, super photphat đang hình thành những “dong

suối” axit sulfuric trong đất trồng trọt gây chua hoá. chai đất.

Người ta đang nói đến sự dư thừa NO; trong sản phẩm rau hoa quả gây hại

cho sức khoẻ con người. nói đến sự “phú dưỡng” của nước ao hồ gây hại cho thuỷ

sản. Trong bối cảnh ấy. việc sử dụng các giải pháp dinh dưỡng hữu cơ sinh học màbản chất chủ yếu của nó là sử dụng hiệu quả các vi sinh vật trong canh tác nông

nghiệp đang trở thành vấn đề thời sự và là xu hướng mới cho sự phát triển một nền

nông nghiệp bền vững. an tồn cho Việt Nam.

Phân bón vi sinh làm tăng độ màu mỡ của đất, tăng khả năng hấp thu các

chất dinh dưỡng. nước của cây ở những vùng đất bạc màu do đó giúp cây sinh

trưởng tốt hơn. Các vị sinh vật có trong phân bón sinh học cịn tiết một số chất kích

thích sinh trưởng, chất hóa học chống nam, cũng như làm tang sự nay mam của hạt

và sự sinh trưởng của rễ.

Việc sử dụng phân bón vi sinh sẽ làm tăng giàu đất một cách có hiệu quả và

đỡ tốn kém hơn việc sử dụng các loại phân hóa học. những loại có thể gây hại cho

môi trường và làm cạn kiệt các nguồn năng lượng không thể tái tạo. Nhiều nghiên

cứu đã tập trung chọn lọc các vi sinh vật có ích gọi là “vi sinh vật hữu hiệu”, gồm

hỗn hợp vi sinh vật, sống cộng sinh với nhau như trong tự nhiên. bao gồm các vi

sinh vật chuyển hóa photphat khó tan (chuyển hóa thức an khó tiêu thành dễ tiêu). vi

khuẩn phân giải chất hữu cơ. vi khuẩn lactic sinh bacterioxin kháng vi sinh vật gâybệnh và các vi khuẩn có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật. Chúng

hỗ trợ nhau phát triển và phát huy tác dụng nhiều mat phục vụ cho việc thúc day

sinh trưởng của cây, xử lý mùi hôi.

Hà Nội - 2005

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Phân bón vi sinh làm tăng độ mâu mỡ của đất, tăng khả năng hấp thụ cácchất dinh dưỡng và nước của cây ở những vùng đất bạc màu do đó giúp cây sinh

trưởng tốt. Các vi sinh vật có trong phân bón sinh học cịn tiết một số chất kích thích

sinh trưởng. chất hố học chống nấm. cũng như làm tăng sự nay mam của hạt và sự

sinh trưởng của rễ. Việc sử dụng phân bón vi sinh sẽ làm tang giàu đất một cách có

hiệu quả và đỡ tốn kém hơn việc sử dụng các loại phân hoá học. những loại có thể

gày hại cho mơi trường và làm cạn kiệt các nguồn năng lượng khơng thể tái tạo.

Vì vậy việc nghiên cứu. tuyển chọn vi sinh vật có hoạt tính cao. với các chức

năng khác nhau cùng lý lịch cụ thể để làm phân bón cho cây trồng là rất cần thiết.

nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, an toàn và bền vững. Đây là phươnghướng rất quan trọng để giảm bớt tác hại của các chất hố học giảm thiểu ơ nhiễm

mơi trường và giảm giá thành sản phẩm do phải chỉ phí quá nhiều ngoại tệ nhậpkhẩu thuốc hố học.

Với mong muốn góp phần trong công nghệ sản xuất chế pham phân hữu cơ vi

sinh đa chức năng và hồn thiện hơn, chúng tơi đã tiến hành đề tài ” Nghién cứu

đặc điểm sinh hoc của một số chủng vi khuan phan lap ở Việt Nam, dùng trong

sản xuất phân bón hữu cơ đa chức năng”.

A. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

I. Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có các hoạt tính sinh họcbao gồm: chuyển hóa photphat khó tan: phân giải tỉnh bột và xenluloza: sinh axit

lactic và bacterioxin; tạo thành chất kích thích sinh trưởng thực vat.

2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng đã tuyển chọn để sản xuấtchế phẩm dùng làm phân bón hữu cơ vi sinh cho các hộ nông dân.

3. Phát hiện và lưu giữ các nguồn gen vi sinh vật quý cho Bảo tàng giống

B. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

1. Phân lập. tuyển chọn các vi khuẩn hữu ích có hoạt tính sinh học cao và phùhợp trong việc làm chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh.

Ha Noi - 2005

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

2. Nghiên cứu đặc điểm phân loại của từng chủng đã được tuyển chọn bang

phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử.

3. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp của từng nhóm vi khuẩn đã được

lựa chọn.

4. Sử dụng các nhóm vi khuẩn đã nghiên cứu để sản xuất chế phẩm dùng

trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh đa chức năng.

C. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

I. Đã phân lập và xác định được 4 nhóm vi khuẩn có hoạt tính sinh học cầnthiết dùng sản xuất chế phẩm phân bón hữu cơ đa chức năng.

2. Đã nghiên cứu đây đủ tính chất và định tên đến lồi các nhóm vi khuẩn theo

phương pháp sinh học phân tử dựa trên phân tích trình tự rADN 16S.

3. Chọn được 4 nhóm vi khuẩn có thể dùng tạo nguồn phân bón hữu cơ đa

chức năng, đáp ứng đầy đủ yêu cầu cấp thiết hiện nay là xây dựng một nền nơng

nghiệp sạch. an tồn và bền vững.

4. Lần đầu tiên chế phẩm phân bón hữu cơ này được nghiên cứu một cách đây đủ

và có ý nghĩa thiết thực cho việc chuyển hóa chất thải trong tự nhiên thành nguồn phân bón

hữu cơ đa chức năng hy vọng sẽ làm tăng năng suất cây trồng và góp phân làm giảm áp lực

phân hóa học nhập ngoại.

Hà Nội - 2005

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. NHU CẦU NPK CỦA THỰC VẬT

1.1.1. Nitơ

Cây xanh cần nitơ để tổng hợp các protein (các enzym). chlorophin...Chúng

có thể được vận chuyển trong cây ngay sau khi được hấp thụ. Thực vật cần chúng

với một lượng như là nhân tố đa lượng có số lượng lớn thứ 4 sau C, O, H, trong các

nguyên tố thiết yếu và số lượng cao nhất trong các nguyên tố ở đất. Vì vậy nó là

nguyên tố đa lượng số 1. Trước khi động vật và thực vật có thể sử dụng nito thì nitơ

phân tử (N;) trước hết phải được cố định hoặc biến đổi thành dạng có thể được sử

dụng [24].

1.1.2. Photpho

Tất cả các thực vật, sinh vật đều cần photpho để tạo màng tế bào và axit

nucleic. Chúng có thể được vận chuyển trong cây ngay sau khi được hấp thụ.

Photpho được đưa đi kháp nơi trong cây. Thực vật cần chúng với một lượng ~ 0.3%

trọng lượng khô. Photpho là một nguyên tố đa lượng. Ngoài axit nucleic,

photphoprotein, photphotlipit, chúng cịn có trong nhiều coenzym như ADP, ATP,VDP, CDP, CTP, NAD, NADP, một số vitamin như tiamin. biotin...[20].

1.1.3. Kali

Thực vật cần kali, kali là ion kim loại không thể thiếu cho hoạt động của

mình. Chúng có thể được vận chuyển trong cây ngay sau khi được hấp thụ. chỉ tồn

tại ở dang tu do, thực vật cần chúng với một lượng ~0.8%. trọng lượng khô của cây.là một nguyên tố đa lượng. Các nguyên tố này có trong đất, đá phong hố. khống

sét Chúng tuần hồn theo chu trình đá, phong hố và thấm lọc theo khơng gian và

thời gian, luôn luôn tồn tại ở dạng K* [20].

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

axit, chang hạn như axit sunfuric, axit clohydric có xu hướng tăng độ axit của dat,

làm giảm các quần thể vi sinh vật có ích. gây trở ngại cho sinh trưởng cây trồng. Các

loại phân bón có chứa nito, chúng được sản xuất bảng các q trình cơng nghiệp

trong đó nitơ khí quyển (N;) được chuyển hóa thành phân bón có amoniäc (NH;) và

nitrat (NO). Q trình này địi hỏi một lượng lớn nang lượng bởi vì việc chuyển hóa

cần áp suất và nhiệt độ rất cao. Cây khơng thể hấp thu nitơ khí quyền một cách trực

tiếp nhung có thể hấp thu amoniäc và nitrat (hai hợp chất có khả năng tan tốt trongnước) khi chúng được bổ sung vào đất dưới dạng phân bón [86].

Các loại phân bón có chứa photphat, chúng được sản xuất từ đá có chứaphotphat nhờ các q trình cơng nghiệp có liên quan đến việc xử lý với các axit

mạnh. Đá có photphat hay photphat thơ được tìm thấy tại các mỏ khoáng tự nhiên tại

nhiều khu vực khác nhau trên thế giới (các mỏ lớn nhất được biết đến là ở Maroc,

Nga và Mỹ). Quá trình xử lý axit sẽ chuyển photphat thô (dạng không tan trongnước và không được hấp thu trực tiếp bởi rễ cây) thành một dạng được gọi là

“superphotphat” mà đa phan trong đó có khả nang tan trong nước và được hấp thu

trực tiếp bởi rễ cây. Tuy nhiên, nếu sử dụng liên tục phân bón hố học có thể tiêu

diệt các vi khuẩn cố định đạm này. Hơn nữa. phân hố học có tác động đến chất

lượng quả của cây chẳng han, cây có xu hướng tao quả chứa lượng vitamin C thấp.

Đặc biệt là nếu dùng mãi phân hoá học đất dân dân bị bạc màu và trở nên trai cứng

1.2.2. Phan hitu co

Phân hữu co, chang hạn như phan gia súc, gia cầm giữ vai trị quan trong

trong q trình tạo độ phì cho dat, tăng chất hữu cơ cho dat, cải thiện cấu trúc của

đất vì chúng khơng những tham gia vào q trình hình thành đất. mà cịn khống

hóa các chất hữu cơ của xác thực, động vật hình thành mùn (humus) [6]. Tonkova

[123] cho rang vai trò của vi sinh vật trong việc hình thành chất mùn được xác định

qua định nghĩa chất mun sau: “Chất mun tự nhiên bao gồm 3 axit chính là: Ulmic,

humic và apocrenic. Chúng thường xuyên được sinh ra do 3 kiểu phân giải các chất

hữu cơ trong tự nhiên: axit ulmic (axit nâu) theo kiểu phân giải ky khí: axit humic

Ha Noi - 2005

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

(axit đen) theo kiểu hiếu khí và axit apocrenic (axit không màu) do nấm phân giải

các chất hữu cơ”. Cũng như quá trình tao độ phì nhiêu cho đất. các oxit-axit trong

quá trình phân giải hydratcacbon tổ hợp với các protein và axit amin tạo thành mùn

dưới sự tham gia trực tiếp của vi sinh vật. Trong các axit mùn hình thành qua phângiải chất hữu cơ thực vật như xenluloza thì axit humic hình thành qua quá trình lên

men hiếu khí có giá trị tạo độ phì cho đất cao nhất.

1.2.3. Phân sinh học

Cho đến nay vẫn còn nhiều tranh cãi về ý nghĩa của từ ủ phân. Tuy nhiên.

người ta cũng đã đi đến thống nhất một định nghĩa: ủ phân là phản ứng nhờ các vị

sinh vật làm khoáng hoá các chất hữu cơ thành mùn ở điều kiện tối ưu. Thời gian ủ

không những phụ thuộc vào vòng đời sinh học của vi sinh vật trong đống u, mà còn

phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và trạng thái di truyền của vi sinh vat [125].

Trong tự nhiên các chất hữu cơ chuyển hoá nhờ vi sinh vật qua hàng loạt các bước

một cách tự phát phụ thuộc vào thành phần của chất hữu cơ và yếu tố môi trường.

Quần thể vi sinh vật trong tự nhiên. đóng vai trị đặc biệt quan trọng trong q trình

ủ phân sinh học. trong đó vi khuẩn là nhóm quan trọng nhất, vì chúng vừa có thể sử

dụng rộng rãi các hợp chất hữu cơ trực tiếp, vừa có số lượng lớn hơn các nhóm vị

sinh vật khác [43, 44]. Hầu hết các loại phân bón sinh học là bổ sung nguồn nito cho

đất. Việc này có thể thong qua q trình cố định nitơ sinh học (BNF). Trên tồn thé

giới, ước tính mỗi năm có khoảng 175 triệu tấn nitơ được bo sung vào đất bằng quá

trình cố định nito sinh học. Thuật ngữ bio có nghĩa là sinh hoc, do vay phan bón

sinh học giống như là các vi sinh vật sống được bổ sung vào đất. Những loại phân

bón sinh học này là các sản phẩm bao gồm các loại vi sinh vật có ích đã được chọn

loc, những vi sinh vật này đã được biết đến là kích thích sự sinh trưởng của câythông qua việc cung cấp chất dinh dưỡng cho cây. Các vị sinh vật đất được sử dụng

trong các loại phân bón vi sinh bao gồm: các vi sinh vật có khả năng phân giải

photphat, Mycorrhizae, Azospirillum, Azotobacter, Rhizobium, Sesbania. tao lục tảo

lam và Azolla. Bay giờ ta thử tìm hiểu kỹ về các nhóm vi sinh vật này để hiểu rõ

chức năng của chúng trong các loại phân bón sinh học.

Hà Nội - 2005

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

1.3. VAI TRỊ CỦA VI SINH VẬT TRONG Q TRÌNH PHÂN HUỶ CÁC

HỢP CHẤT TRONG TỰ NHIÊN

Trong tự nhiên, vi sinh vật giữ vai trò hết sức quan trong trong các chu trìnhvật chất, chúng tham gia vào quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ thành các chất

mùn mà cây trồng có thể sử dụng được. Hệ vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú

bao gồm nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau, ở đây chúng tôi chỉ đề cập các vi sinhvật có khả nang phân huỷ các các hợp chất phổ biến là: Photphat, xenluloza. tinh bột

Và protein.

1.3.1.Tâm quan trọng của photphat đối với cây trông

Photphat là một ngun tố có vai trị quan trọng trong q trình trao đối chất

của thực vật. Tất cả các quá trình trao đổi chất và tích luy đường. protéin, chất béo

đều có sự tham gia tích cực của photphat đặc biệt là trong quá trình hình thành tế

bào, màng tế bào chất. Cây muốn tăng trưởng nhanh. hình thành tế bào mới phảiđược cung cấp day đủ photphat. Nếu trong đất chi có nito mà khơng có đủ photphat

thì cây trồng cũng không thể phát triển tốt được [24]. Tác dụng của photphat đối với

cây trồng rõ nhất vào thời kì cây non, lúc bộ rễ cịn yếu và cây trồng có nhu cầu lớn

về nucléoprotéin để hình thành tế bào mới. Khi cây trưởng thành. photphat có kha

năng làm rút ngắn thời gian sinh trưởng. Riêng cây ho Dau photphat kích thích su

tăng số lượng nốt sân và tăng khả năng cố định nitơ của các vi khuẩn cộng sinh [25].

Photphat có tác dụng làm cho cứng cây, bộ rễ phát triển mạnh. ra nhiều hoa.hoa đỡ bị rung, qua day chắc, hàm lượng vitamin trong qua và trong hat tăng.

Photphat giúp cho việc hình thành Phytin sớm làm cho hạt mau chín. Vì vậy bón

photphat đây đủ có thể rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây, đặc biệt là ở các cây

họ Đậu [24]. Photphat di chuyển dễ dàng trong các mơ thực vật, có thể di chuyển từ

bộ phận già sang các bộ phận non hơn. Việc di chuyển bất thường của photphat từ

các bộ phận này sang các bộ phận khác xảy ra khi trong đất thiếu photphat [49].

Khi thiếu photphat sự hình thành tế bào mới bị chậm. chồi và rễ sinh trưởng chậm.cây yếu, ít phân cành, thân cây mảnh. lá cứng, màu xám. phiến lá bé đi. lá có màu

xanh luc ban, khơng sáng [59]. Do thiếu photphat mà trong lá hình thành sac tố

Hà Nội - 2005

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

antoxianin làm cho lá có màu ửng đỏ. màu tia huyết dụ hoặc mau đồng xin, lá rụngsớm hon, chồi nách có thể chết hoặc chuyển sang dạng tiềm sinh. Đối với cây có

quả thì việc hình thành hoa và quả bị giảm sút rõ rệt. Đối với cây ăn quả lâu năm.

nếu thiếu photphat thì mầm non, lá và hoa có thể bị chậm phát triển vào mùa xuân,

mô tế bào ở mép lá bị chết và tạo ra ranh giới rõ tệt với các mơ tế bào cịn sống.

Triệu chứng đó thường bát đầu xuất hiện từ lá dưới rồi lan dân lên các lá phía trên

[3]. Khi thiếu photphat nitơ được cây hút sẽ tích luỹ lại trong lá ở dạng nitơ vô cơ và

không chuyển được sang dang protéin.

Đó chính là mơi trường dinh dưỡng thuận lợi cho việc phát triển của nhiều

loại nấm bệnh [49]. Tuy nhiên việc xác định cây thiếu photphat theo hình dạng bên

ngồi thường rất khó. Hơn nữa nó chỉ xuất hiện khi cây thiếu photphat nghiêm

trọng. Do đó cần phải thường xuyên theo dõi sinh trưởng của cây, phản ứng của

dung dịch đất, lượng chứa photphat dễ tiêu trong đất để có biện pháp bón phân

photphat một cách kip thời [4, 121]. Như vậy photphat là một trong những thành

phần không thể thiếu được của cây trồng.

Cây phải được cung cấp day đủ photphat mới có được năng suất cao. Một số

nghiên cứu cho thấy thiếu photphat ở cây trồng có tác hại nhiều hơn thiếu nitơ [3].

Sự thiếu photphat ảnh hưởng rất lớn đến các chỉ tiêu hình thành năng suất . Đối vớilúa các chỉ tiêu năng suất đều giảm nếu thiếu photphat hoặc nitơ nhưng nếu thiếu

photphat sự giảm sút rõ rệt hơn. Năng suất chỉ còn 10,70% nếu thiếu photphat va

41,61% nếu thiếu nitơ so với cây trồng có day đủ hai chất dinh dưỡng này [79].

Photphat có khả năng điều hoà sự thay đổi đột ngột pH của mơi trường. Trong dịch

tế bào có sự chuyển dịch của các ion H;PO,~, HPO,”. Tuy theo phản ứng của dịch tếbào sự chuyển biến của các ion photphat sẽ xảy ra khác nhau :

HPO,” ST HO = H;PO,” +OHTMH,PO,” = H;PO,” + H*

Vì vay photphat có khả nang điều chỉnh pH. Nhờ bón photphat sức chốngchịu của cây đối với pH khơng thích hợp của mơi trường được tăng cường (Nói cách

khác photphat phần nào có tác dụng giải độc cho cây trồng) [106].

Hà Nội - 2005

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

1.3.1.1. Nguồn gốc của photphat trong tự nhiên

Photphat tồn tại trong đất từ các khoáng chất chứa photphat như apatit,

photphorit hoặc từ các xác hữu cơ. Photphat trong đất ở dưới 2 dạng chính: photphat

vơ cơ và photphat hữu cơ. Trong đó photphat vơ cơ chiếm ưu thế ở nhiều loại đất.

Cây rất khó sử dụng photphat hữu cơ, chỉ khi nào vi sinh vật chun hố thành dạng

photphat vơ cơ dé tiêu thì cây mới sử dụng được [108, 111]. Các loại chất hữu co

chứa photphat trong đất gồm các axit nucleic, nucleoprotein.v..v.. song chúng chỉ

chiếm một phần nhỏ tổng lượng photphat trong đất.

Photphat vô cơ trong đất tồn tại dưới 2 dạng chính:

- Dạng photphat khơng tan : Chiém phan chính. hau như khơng tan trong

nước. Thực vat khong sử dung được photphat ở dạng này. Do là các apatit[Ca;F(PO,);] và các muối photphát của kim loại ở đất chua (axit) FePO,, AIPO,.

nH;O. AIPO,, photphat của kim loại kiềm thổ trong đất trung tính hoặc kiểm thường

là Ca,(PO,) và Al,(PO,). Ngồi ra cịn có photphat ở trong các chất hữu cơ (axit

nucleic, photphorit. v..V).

- Photphat tan trong nước thường gặp là KH;PO,. Na,HPO,, K;HPO,.

Ca(HPO,);, Mg(HPO,);. Thực vat sử dụng photphat ở dạng này là tốt nhất. Nhưng

hàm lượng của chúng trong đất lại rất thấp va không ổn định [126]. Vì lượngphotphat dé tiêu trong đất ít (thường chỉ chiếm 0,1-1% so với photphat tổng số) cây

trồng thường bị thiếu photphat. Hiện tượng này thấy rõ ở đất chua (đất chua có chứa

nhiều AI, Fe di động thường làm cố định photphat). Việc bón vơi cho đất chua làm

tăng lượng photphat dễ tiêu. Ở đất kiềm và trung tính lượng photphat dễ tiêu nhiều

hơn so với ở đất chua photphat khó di chuyển trong nước do các muối Ca và muối

AI làm kết tủa photphat. Vì vậy bón photphat cần phải bón gần ré thì cây mới hấp

thụ được với hiệu suất cao [106, 108].

1.3.1.2. Ảnh hưởng của photphat đối với cây trồng

Cây trồng lấy photphat trong đất khoảng 30- 80 kg/ha. Khi bón. photphat hồ

tan vào đất, có thể bị biến đối thành dạng khơng tan. Lượng photphat tổng số trong

đất khoảng 0.02%. Đất bạc màu ở miền Bác nước ta có lượng photphat tổng số

Hà Nội - 2005

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

khoảng 0,005- 0,16%, trong đó lượng photphat dễ tiêu rất thấp. Bon phan phốt pho

là một biện pháp cải tạo đất và nâng cao độ phì nhiêu của đất. Tuy loại phân

photphat, lượng bón, hồn cảnh khí hậu, đất đai và cây trong mà hiệu lực của phân

photphat kéo dài qua những thời gian rất khác nhau. Lượng phân photphat trung

bình (50-80 kg P;O./ha) thường có hiệu lực qua 2-3 vụ. Loại phan photphat càng dé

tiêu thì hiệu lực tồn tại càng thấp. Nếu là photphat khó tiêu và liêu lượng lớn thì

hiệu lực có thể kéo dài hơn chục năm. Đa số ruộng lúa ở miền Bác nước ta bón phân

photphat đều có hiệu lực rõ và kéo dài qua nhiều vụ. Tác dụng của phân photphat

thể hiện mạnh ở những chân ruộng lúa lâu đời độc canh và thấp nhất ở những chất

đất phù sa mới [31, 49, 119].

1.3.1.3. Vi sinh vat trong quá trình chuyển hố photphat trong dat

Sự chuyển hố photphat trong tự nhiên xảy ra nhờ các q trình hố học và

sinh học, mà chủ yếu là các quá trình sinh học, trong đó vi sinh vật đóng vai trị

quan trong. Các vi sinh vật đất liên quan đến nhiều hoạt động sống trong đất. Ví dụ

sự chuyển hố photphat do vi sinh vật tiết ra axit hữu cơ. sự khoáng hố các hợp chất

photphat hữu cơ nhờ đó mà photphat hữu cơ biến thành dạng vơ cơ. sự đồng hố

photphat hữu cơ được liên kết thành nguyên liệu để xây dựng nên tế bao vi sinh vat.

Để xác định kha năng chuyển hoá của photphat. người ta thường sử dụng mơi trường

đặc chứa đường va có muối photphat khó tan (thường là Ca;(PO,);. do đó làm tan

photphat mà xung quanh khuẩn lạc sẽ hình thành những vịng trong suốt) [20. 25].

Vi sinh vật đất tham gia tích cực vào các hoạt động liên quan đến các phan ứng tao

nên vòng tuần hoàn photphat trong tự nhiên [3]. Như vậy. sự chuyển hoá photphattrong tự nhiên xảy ra dưới tác dụng của các quá trình sinh học và vi sinh vật học

nhưng chủ yếu van là quá trình vi sinh vật học. Quần thể vi sinh vật tham gia vào

quá trình chuyển hố photphat thơng qua các q trình sau đây [20. 24. 25]:

- Sự huy động khoáng hoá dị dưỡng các thành phan hữu cơ của H;PO,.

- Huy động photphat hữu cơ nhờ những vi sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng.

tích luỹ photphat ở mức thấp.

- Hồ tan AIPO,, FePO,, Ca,(PO,), bằng axit hữu co

Hà Nội - 2005

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Nhiều vi khuẩn phân giải xác thực vật và phân hữu cơ làm xuất hiện trong đất

những muối khoáng (trong đó có photphat) cần thiết cho cây trồng. Ostwall [49,

100] cho rằng vi khuẩn sinh H;S có thể phan ứng với FePO, và ortophotphat. Axithumic và axit fulvic tạo thành nhờ vi sinh vật phân huỷ xác thực vat sẽ kết hợp với

Ca, Fe, Al trong phức hệ của photphat để giải phóng orthophotphat. Photphat tích

luỹ ở thực vật được cố định tạm thời, khi tế bào chết nó trở thành nguồn photphat

hữu cơ được giải phóng dần vào đất và cung cấp trở lại cho thực vật nhờ các vi sinh

vật trong đất. Vi sinh vật trong đất tiết ra enzym và các axit có thể hồ tan các hợp

chất photphat hữu cơ. Các hợp chất photphat hữu cơ được khống hố thành dạng vơ

cơ và được vi sinh vật đồng hoá để rồi tham gia vào quá trình sinh trưởng và phát

triển của cây trồng. Cây trồng sử dụng photphat từ các nguồn photphat vô cơ dễ tan

do vi sinh vật phân giải ra từ xác động thực vật. Thông thường lượng photphat trong

đất không đủ cung cấp cho nhu cầu của cây trồng, nhất là đối với những cây cần

năng suất cao. Bón phân photphat và nâng cao độ hoà tan của photphat là một trong

những khâu kỹ thuật quan trọng của canh tác nông nghiệp. Trong đất có nhiều

photphat ở dạng hữu cơ hoặc vơ cơ khơng hồ tan nên cây trơng khơng sử dụng trực

tiếp được. Số photphat này phải thông qua sự phân giải nhờ vi sinh vật mới có thể

chuyển thành các dạng photphat hoà tan để cho cây hấp thu. Nhưng cường độ tác

dụng của các loại vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Một số loại vi khuẩn,

nấm sợi có hoạt tính cao, có thể tiến hành vơ cơ hố mạnh mẽ các hợp chất photphat

khó tan [25, 111]. Lee [87] đã phân lập được từ đất chủng vi khuẩn có khả năng vơ

cơ hố hợp chất photphat hữu co va được đặt tên là Bacillus megaterium

var.phosphaticum có kha năng phân giải nucleoprotein và loxitin mạnh. Sau đó

nhiều tác giả đã bổ sung thêm nhiều loại vi sinh vật khác có thể tiến hành q trình

khống hố hữu cơ, q trình này có thể được khái qt hố theo sơ đồ sau:

I- Nucleoprotein —* Axit nucleic — H,PO,

2- Loxitin —» Glixerophotphat —» H,PO,

1.3.1.4. Vi sinh vat chuyển hoá photphat ở vùng ré

Giữa vi sinh vật đất và hệ rẻ thực vật có mối quan hệ mật thiết. Những chat

do rê tiết ra và những mô tế bào tách rời ra khỏi cây là thức ăn tốt cho vi sinh vật. Vị

Hà Nội - 2005

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

sinh vật sống ở vùng rễ tiết ra các chất cung cấp cho thực vật [105]. Như vậy quan

thể vi sinh vật phát triển tốt hay không là thông qua ảnh hưởng của các chất tiết từ

bộ rễ và ngược lại cây sinh trưởng phát triển thuận lợi lại nhờ hoạt động sống cua visinh vật [107]. Khi có các chất tiết của rễ thì sự khống hố ngoại bào sẽ xảy ra

dưới tác dụng của photphataza (có nguồn gốc thực vật hoặc vi sinh vật).

Photphat tái tạo lại được huy động nhanh chóng dưới những điều kiện thích

hop. Mot số vi sinh vật vùng ré như: Bacillus pulvifaciens, Azotobacter

chroococcum, Agrobacterium spp.. một số nấm sợi va xa khuẩn có thể chuyển hoá

các hợp chất photphat như : Ca,(PO,), và apatit, photphatrit, fenspat. Ngoài ra vi

sinh vật san sinh axit xitric. axit lactic, axit axetic đều xúc tiến việc chuyển hoá

Ca,(PO,), [112]. Gaur [54, 55] cho rang vùng rễ và rễ cây là một hệ thống vi sinhthái hỗn hợp chứa nhiều loại vi sinh vật. Khu hệ vi sinh vat trong vùng rẻ khác với

khu hệ vi sinh vật ngoài vùng rễ về thành phân loài và số lượng. Mối tương quan

giữa các loài vi khuẩn trong vùng rễ phụ thuộc vào từng loại cây khác nhau. Số

lượng vi sinh vật vùng rễ được quyết định bởi chất lượng và số lượng các chất được

tiết ra từ rễ của từng loại cây trồng. Q trình phong hố các chất ở vùng rễ của ngô.

thông. sồi non. v..v..bị ảnh hưởng bởi sự nhiễm nấm và các vi khuẩn chuyển hoá

photphat: Enterobacter aerogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium sp..

v..v..[54]. Ảnh hưởng của vi sinh vật trong vùng rễ còn phụ thuộc vào điều kiện

sinh trưởng phát triển của thực vật. Sinh trưởng của ngô chịu ảnh hưởng của vi

khuẩn chuyển hố photphat, cịn vi nấm trong vùng rẻ chỉ làm tang sự sinh trưởng

của rễ. Khi vi khuẩn chuyển hoá photphat được bổ sung vào vùng rễ của cây thì sự

phát triển của thực vật được cải thiện [25]. Subba [55, 119] cho rằng sự dinh dưỡng

của cây nói chung phụ thuộc vào thành phan của khu hệ vi sinh vật trong vùng rễ

của cây đó.

1.3.2. Xenluloza và enzym phân giải xenluloza

1.3.2.1. Xenluloza

Xenluloza là thành phan chủ yếu của thành tế bào thực vật. chúng liên kết

chặt chẽ với các polisacharit khác như hemi-xenluloza, pectin và lignin tạo thành

Hà Nội - 2005

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

những phức hợp bền vững. Hàm lượng xenluloza trong xác thực vật thường thay đổi

trong khoảng 50 - 80%, trong giấy là 61%, trong trấu là 31%, bã mía 46% (tính theo

180° so với phân tử trước.

lớn hon hoặc bang 5 lần.

Phan tử xenluloza có cấu trúc khơng đồng nhất, thường có hai vùng xen kế:

e Vùng kết tinh có trật tự cao và bền vững với các tác động bên ngồi.

e Vùng vơ định hình có cấu trúc khơng chặt chế do đó kém bền vững hơn.

Vùng vơ định hình có thể hấp thụ nước và trưong lên do vậy dễ bị enzym tấn

cơng. Trong khi đó ở vùng kết tinh, mạng lưới liên kết hydro ngăn can sự trương

này, các dung môi hữu cơ, các dung dịch axit hay kiềm lỗng cũng khơng có tác

dụng, các enzym chỉ có thể tác dụng lên bề mặt của các sợi [35, 40]. Xenluloza là

hợp chất phức tạp và bền vững không tan trong nước và trong nhiều dung môi hữu

cơ, không bị các dung dịch axit và kiểm loãng tác dụng, chỉ bị thuỷ phân khi đun

Hà Nội - 2005

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

nóng với axit hoặc kiểm. Do liên kết glycozit không bền với axit. xenluloza dê bịthuỷ phân bởi axit thành các sản phẩm thuỷ phân khơng hồ tan. có độ bền cơ họckém hơn. Xenluloza tự nhiên khi bị thuỷ phân hoàn toàn sẽ cho sản phẩm cuối cùng

là D-glucoza. Dung dịch kiềm làm trương phông mạch xenluloza và hoà tan một

phần các xenluloza phân tử nhỏ. Trong khi đó ở điều kiện bình thường (pH trungtính và nhiệt độ thường) một số vi sinh vật có thể thuỷ phân xenluloza thành đường

1.3.2.2. Enzym phân giải xenluloza

Xenlulaza là một phức hệ các enzym. Những enzym này hoạt động cùng

nhau để thuỷ phân xenluloza. Xenlulaza tồn tại rộng rãi và có mặt trong nhiều nhóm

vi sinh vật như có ở nhiều lồi vi nấm. vi khuẩn và xạ khuẩn. Có ít nhất hai bước

trong phân hủy xenluloza do vi sinh vật. Tiến hành với bước 1: Tiền thuỷ phan

(prohydrolytic). Trong bước này một enzym (C1) sé làm trương (swell) hoặc hydrat

hoá các mạch glucoza khan. Bước thứ hai sử dụng các enzym thủy phân (Cx) và betaglucosidaza (xenlobiaza). Gilbert [57] đã nghiên cứu rộng về phức enzym của

xenluloza. Phức này chuyển hố xenluloza tinh thể. vơ định hình thành glucoza.

Những đặc tính chủ yếu của phức xenlulaza là:

1) Hệ thống có tính đa xúc tác (multienzymatic).

2) Ít nhất có ba thành phan enzym đều khác nhau về mat vật lý và hố học.

3) Cả ba thành phần giữ vai trị thiết yếu trong thuỷ phân xenluloza thành

glucoza. Thí nghiệm về hoạt tính xenlulaza có sử dụng một phương phápnhằm xác định tác động của xenlulaza lên xenluloza dang vi tinh thé

(microcrystalline) liên quan đến việc hình thành glucoza. Glucoza sau khi

giải phóng được xác định trong một hệ thống loại: 6-photphat ở bước sóng 340nm.

Hexokinaza/glucoza-Trong những năm gần đây về xenlulaza ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của

chúng đã được một số tác giả tong kết khá chỉ tiết [63, 96]. Đây là phức hệ thống

phân loại enzym thuỷ phân xenluloza tạo ra các loại đường có thể đi qua thành tế

Ha Noi - 2005

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

bào vi sinh vật. Ở một số vi sinh vật, enzym oxy hoá khử và enzym phân giải

protein cũng tham gia vào quá trình trên. Nhiều tác giả cho rằng phức hệ xenluloza

bao gồm 3 enzym chủ yếu sau đây [34, 94, 96, 98]:

- Endo-1,4-glucanaza (hay CMC-aza, Cx, EC 3.2.1.4) tác động lên chuỗixenluloza một cách tuỳ tiện và phân huỷ liên kết B-1.4-glycozit giải phóng

xenlobioza và glucoza, thuỷ phân CMC hoặc xenluloza trương phồng theo kiểu tuỳ

tiện. làm giảm nhanh chiều đài chuỗi và tăng chậm các nhóm khử. enzym tác dụng

lên xenlodextrin. Enzym này hoạt động mạnh ở vùng vơ định hình nhưng lại hoạt

động yếu ở vùng kết tỉnh và không phân giải được xenluloza.

- Exo-l,4-gluconaza (hay xenlobiohydrolaza, Cl, EC 3.2.1.91) giải phóng

xenlobioza hoặc glucoza từ đầu khong khử của xenluloza, tac dụng yếu lên CMC

nhưng tác dụng rất mạnh lên xenluloza vơ định hình hoặc xenluloza đã bị phân giải

một phần. Tác dụng lên xenluloza kết tinh khong rõ nhưng khi có mặt

endoglucanaza thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.

- B-1,4-glucozidaza (hay xenlobiaza, EC 3.2.1.21) thuy phân xenlobioza và

các xenlodextrin khác hoa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tinh cao trên

xenlobiaza, cịn ở xenlodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi

tăng lên. Tuy theo vi trí mà B-glucozidaza được coi là nội bao, ngoại bào hoặc liên

kết với thành tế bào. Chức nang của j-glucozidaza có lẽ là điều chỉnh sự tích luỹ các

chất cảm ứng của xenlulaza. Mỗi enzym thành phần lại có thể gồm một vài izozim

khác nhau về trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện và hàm lượng polisaccarit liên

kết. Người ta cho rằng tính đa hình của xenluloza là nhằm phù hợp với cấu trúc phức

tap của mạch phân tử xenluloza, g6m nhiều vùng có hoạt tính thuỷ phân khác nhau.

Tuỳ thuộc vào lồi vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy. tỷ lệ các enzym thành phần

trong phức hệ xenlulaza và hiệu lực phân giải xenluloza của xenlulaza là khác nhau

[99. 120]. nhưng để phân giải hồn tồn xenluloza tự nhiên cần có sự tác dụng hiệpđồng của cả ba thành phần trong phức hệ xenlulaza. Quá trình tổng hợp xenlulaza

chịu sự điều khiển của bộ máy di truyền và các quá trình sinh hoá do các chất cảm

ứng. sự kiểm chế của các chất trao đối trung gian và các sản phẩm cuối cùng.

Ha Noi - 2005

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Nhiều tác giả kháng định xenlulaza là enzym cảm ứng và chất cảm ứng tốt

nhất là xenluloza, lactoza. Nhưng một số tác giả khác lại đưa ra bảng chứng cho

rằng xenlulaza là enzym cấu trúc, có thể tổng hợp xenlulaza trên mơi trường khơng

có xenluloza hay chất cảm ứng khác [27]. Tuy nhiên trong thực tế vi sinh vật tổng

hợp xenlulaza mạnh nhất trên mơi trường có hàm lượng xenluloza hay chất cảm ứng

thích hợp. Vì vậy có thể coi sự tổng hợp xenlulaza là có tính cảm ứng khơng chặtchẽ vì xenluloza là cơ chất không tan, phân tử lớn, bản thân không thể thâm nhập

vào tế bao để gây ra các phản ứng sinh hố. Theo Gilbert [57] xenluloza khơng phải

là chất cảm ứng trực tiếp mà khi ở ngồi mơi trường chúng bị thuỷ phân bởi mộtlượng nhỏ enzym cấu trúc thành xenlobioza. chất này có thể thấm vào tế bào qua

màng và được coi là chất cảm ứng sinh lý, nhưng nếu nồng độ xenlobioza cao thì sẽ

kìm hãm tổng hợp xenlulaza. Vì vậy để thu được nguồn enzym cao người ta thường

sử dụng các co chat không dé thuỷ phân như: bã mia, rom ra, giấy loại [63]. Hoặc có

thể ni kết hợp với các vi sinh vật đồng hoá tốt xenluloza. Trong tự nhiên, vi sinh

vật giữ vai trị hết sức quan trọng trong các chu trình vật chất, chúng tham gia vào

quá trình phân huỷ biến các chất thải thành các chất vô hại. Hệ thống vi sinh vậttrong tự nhiên rất phong phú và có khả năng rất lớn trong việc phân giải các chất

hữu cơ, trong đó vai trị hàng đầu thuộc về các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp

các enzym thuỷ phân ngoại bào [75, 96]. Tuy theo nguồn nước thải mà thành phan

hữu cơ của chúng có thể khác nhau. Tuy nhiên ở đây chúng tôi chỉ đề cập đến vai

trò của vi sinh vật đối với sự phân huỷ các thành phan cơ bản là: Xenluloza. tinh bột

Và protein.

1.3.2.3. Vi sinh vat phan giải xenluloza

Trong tự nhiên khu hệ vi sinh vật có khả nang phân giải xenluloza vơ cùng

phong phú, bao gồm vi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn.

1.3.2.3.1. Xa khuẩn

Xa khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt. tế bao kích thước nhỏ như vi khuẩn

nhưng đặc trưng bởi sự phân nhánh. đa số sống trong đất, Gram dương và hiếu khí.

Dựa vào đặc điểm về nhiệt độ sinh trưởng. người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng:

Hà Nội - 2005

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

- __ Xa khuẩn ưa ấm: phát triển tốt ở nhiệt độ 25-37°C

- __ Xa khuẩn ưa nhiệt: phát triển tốt ở nhiệt độ 45-70°C

Xa khuẩn có mặt quanh năm trong tất cả các loại đất. Số lượng xạ khuẩn phụ

thuộc vào loại đất và tính chất của đất. Xenlulaza của xạ khuẩn là enzym ngoại bào.Meinke [96, 98] trong khi phân lập min rác thấy xạ khuẩn có mat trong tất cả các

mẫu ở các mùa trong năm.

1.3.2.3.2. Vi khuẩn

Từ thế ky 19 các nhà khoa hoc đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vậtki khí có kha nang phân giải xenluloza. Những năm đầu thế ky 20 người ta phân lập

được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân

giải xenluloza, niêm vi khuẩn là quan trọng nhất. chúng thường có hình que nhỏ. hơi

uốn cong, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém. chủ yếu ở các chỉ

Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận được năng lượng

khi oxy hố các sản phẩm của q trình phân giải xenluloza thành CO, và H,O.

Ngồi ra cịn thấy các lồi thuộc chi Cellvibrio cũng có khả nang phân huỷ

xenluloza. Trong điều kiện ky khí, các lồi vi khuẩn ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc

giống Clostridium .... tiến hành phân giải xenluloza. Chúng phát triển yếu trên môi

trường chứa đường đơn [13]. Khi phân giải xenluloza thành glucoza và xenlobioza,

chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon cũng thường

kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ, CO; và H; [15, 16]. Ngồi ra cịn có lồi

Cellulomonas, Bacillus cũng có khả năng phân giải xenluloza rất mạnh. Gyxhitz

[47, 63, 67] nghiên cứu thấy endogluconaza trong phức hệ enzym xenlulaza ở

Pseudomonas fluorescens gồm hai enzym ngoại bào và một enzym liên kết tế bao

còn ở Cellulomonas fimi tạo thành 10 endogluconaza. Bacillus subtilis tổng hợp

một endogluconaza giống ở nấm .

1.3.2.3.3. Nấm sơi

Nấm sợi phân giải xenluloza mạnh hơn vì chúng tiết vào mơi trường lượng

enzym ngoại bào nhiều hơn vi khuẩn. Vi khuẩn tiết vào môi trường phức hệ

Hà Nội - 2005

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

xenlulaza khơng hồn chỉnh chỉ thuỷ phân được cơ chất đã cải tiến như giấy lọc vàCMC. Cịn nấm tiết hệ xenlulaza hồn chỉnh nên có thể thuỷ phân xenluloza hồn

tồn, các nấm được nghiên cứu là: Trichoderma reesei, T.viride, Fusarium solanH,

Penicillium pinophinum, Phanerochate chrysosporium, Sporotricum pulverulentum

va Sclerotium rolfs 2 [7, 41, 56, 63, 72, 74].

Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzym bền

nhiệt hơn; chúng sinh trưởng và phân giải nhanh xenluloza nhưng hoạt tínhxenlulaza của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất xenlulaza

mạnh mẽ ở pH = 3.5-6.6.

1.3.3. Tỉnh bột và enzym thuỷ phân tỉnh bột

1.3.3.1. Cấu trúc của tinh bột

Tinh bột là nguồn dự trữ và cung cấp năng lượng rất quan trọng của sinh vat.

Nó là hợp chất phổ biến trong tự nhiên. Tinh bột được tích luy chủ yếu trong các

loại hat, đặc biệt là các hat hoà thảo va các loại củ [3, 8]. Dù có nguồn gốc khác

nhau nhưng tinh bột đều được tạo thành từ hai thành phan là amyloza và

amylopectin với tỷ lệ đặc thù cho từng loài sinh vật. Ca hai thành phan này đều

được cấu tạo từ các đơn vị a-D-glucoza qua liên kết 1-4 va 1-6 glycozit [7, 17]. Tinh

bột khơng hồ tan trong nước lạnh nhưng bi hồ hố khi đun nóng đến 60-80°C. Dưới

tác dụng của enzym hoặc axit mạnh các liên kết glycozit bị phá huỷ va tinh bột bị

thuỷ phân. Sự thuỷ phân xảy ra ở hai mức độ là dịch hoá và đường hoá.

Sản phẩm chủ yếu của dịch hoá tinh

bột là các polyglucoza tương ứng (dextrin),

cịn sản phẩm của đường hố là glucoza

hoặc maltoza. Tinh bột tồn tại dưới dạng

các hạt có kích thước 0.002 - 0,12mm. Hat

tinh bột lúa mỳ có kích thước nhỏ hơn hạt

tinh bột khoai tây. Hat tinh bột lúa my, lúa

mạch có cấu tạo đơn giản. Hình ï.3. Cấu trúc của tinh bột [51]

Ha Noi - 2005

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

_— ————— —

Tinh bột ngơ lúa có cấu tạo phức tạp hon, gồm nhiều hạt nhỏ. Tinh bột là

polysaccarit được cấu tạo bởi các monosaccarit gồm hai thành phan là amylopectin

và amyloza cả hai thành phần này đều được tạo từ œ-D-glucoza. nhưng vị trí liên kếtcác đơn vị glucoza là khác nhau nên tính chất lý hoá và cấu tạo của hai loại cấu tử

này khác nhau. Tỷ lệ % giữa hai loại này không như nhau ở các loại tỉnh bột khác

nhau, amyloza thường chiếm tỷ lệ 13-37% cịn amylopectin chiếm 63-87% [70].

Amyloza có cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh khoảng 300-1000 gốc glucoza

kết hợp với nhau qua liên kết a-1,4 glycozit dai xoắn theo kiểu lị xo. Mỗi xoan có 6gốc glucoza, trọng lượng phan tử là 100000-300000kDa. Cấu trúc xoan được giữ

vững nhờ liên kết hydro giữa các nhóm OH tự do. Bên trong xoăn có thé kết hợp các

nguyên tử khác, vi du: Amylaza tao màu xanh lam khi kết hợp với iot.

Nếu dun nóng liên kết hydro bị cat

đứt, chuỗi amyloza duỗi thẳng do đó iot LMU-ldjom

bị tach ra khỏi amyloza, dung dich mất

màu xanh [71, 76, 82]. Amyloza được kết

tinh bang alcohol butylic. Amyloza không

tan trong nước lạnh mà dé tan trong nước LV

ấm tạo nên dung dich có độ nhớt không %

cao và không bền khi nhiệt độ hạ thấp

[81, 87]. Hình 1.4. Cấu trúc mạch amyloza [82]

Các dung dich đậm đặc của amyloza nhanh chóng tạo nên dang gel vỏ định

hình cứng rắn hoặc co giãn, sau đó tạo thành tinh thể và kết tủa khơng thuận nghịch.

Amyloza có xu hướng kết tinh vì nó có cấu tao đơn giản, không cong kênh về mat

lập thể. Tốc độ thoái hoá phụ thuộc vào pH, nồng độ. trọng lượng phân tử và sự có

mặt của các ion. Amylopectin được cấu tạo bởi các gốc glucoza liên kết với nhau

bang cả kiên kết œ-1.4 glycozit và œ-1.6 glycozit. Một số nghiên cứu cho thấy trongphân tử cũng có cả liên kết a-1,3 glycozit. Cấu trúc phân tử của nó bao gồm mộtmạch nhánh trung tâm (chứa liên kết œ-I.4 glycozit) từ đó phat ra các nhánh phụ có

chiều dài vài chục gốc glucoza. Điểm phân nhánh có liên kết œ-I.6 glycozit. Trọng

Ha Noi - 2005

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

lượng phân tử 500000-1000000 kDa. Vì nó có cấu trúc mạch nhánh nên phân tử

không tạo thành dạng xoắn ốc như amyloza.

Khi phản ứng với lot chomàu đỏ nâu (do kết quả của sự

hình thành nên các hợp chất hấp Liew ket a - Lơ glycozit

khơng có xu hướng kết tinh nên 0 0 0

chúng có kha nang giữ nước. Khác L 2N, ti ~~

với dung dịch amyloza, amylopetin k “ k "

có độ nhớt cao và bền hon [11]. Hình 1.5, Cấu trúc mach amylopectin

Trong tự nhiên, tinh bột tồn tại ở dạng hạt gồm nhiều lớp đồng tâm: lớp ngoài

là amylopectin, lớp trong là amyloza. Ngoài cùng của hat tinh bột là lớp vo

xenluloza đặc hơn lớp tinh bột bên trong chứa ít nước nên bền với tác động bênngồi. Với cấu trúc này tinh bột ít chịu ảnh hưởng của axit hoặc enzym. Khi phá vỡ

cấu trúc này bằng nhiệt thì các hạt tinh bột hấp thụ nước, phồng lên, dính vào nhau

làm độ nhớt tăng và gây hiện tượng hồ hoá. Nếu xử lý nhiệt lâu hơn, hạt tỉnh bột sẽ

bị phân cắt do tác dụng thuỷ phân từng phân và hoà tan một phần các phân tử cấuthành tinh bột, độ nhớt của dung dịch giảm xuống [16, 28, 30].

1.3.3.2. Enzym thuỷ phán tỉnh bột

Amylaza là hệ enzym rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật, các enzym này

với sự tham gia của nước.

Cơ chất xúc tác của amylazalà tinh bột va glycogen, theo tính chat

va cách tác dung lên tinh bột, ta phân

biệt amylaza thành các loại amylaza, B-amylaza, glucoamylaza

a-va oligo 1-6 glucozidaza. Hình 1.6. Mơ hình cấu trúc của

œ-amylaza [82]

Hà Nội - 2005

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Sinh học phân tử và các kiến thức phân tích hố học đã mang lại những bướctiến quan trọng về tính chất hố học, cơ chế phân tử, cấu trúc phân tử... của amylaza

và các enzym liên quan [83].

1.3.3.2.1 œ-Amylaza (a-1,4 glucan-glucanhydrolaza EC 3.2.1.1)a-Amylaza từ các nguồn khác nhau

có nhiều điểm giống nhau, a-Amylaza có

kha năng phân cát các liên kết a-1,4glycozit nằm phía bên trong phân tử cơ chất

(tinh bột, glycogen, poliza đồng loại) một

cách ngẫu nhiên khơng tn theo trình tự

nào [89, 123]. Hình 1.7. Mơ hình cấu trúc bậc II

của a-amylaza

Liên kết a-1,6 glycozit khơng bị thuỷ phân sẽ kim toa các mối liên kết a-1,4gần nó làm cho a-amylaza khơng được tác dụng, vi thế với amylopectin thì sản

phẩm tao ra là các dextrin chứa cả liên kết œ-1,4 và a-1,6 glycozit [34, 58].

Khi tác dụng lên tinh bột

enzym này giải phóng glucoza ở

dạng œ-amutanmer nên được

gọi là œ-amylaza. œ-amylaza

không chỉ thuỷ phân tinh bột macịn thuỷ phân cả bột thơ.

thường œ-amylaza chỉ thuỷ phân tinh bột thành các phân tử dextrin có trọng lượngphân tử thấp (không cho màu xanh với lot) và một ít maltoza. œ-Amylaza dễ tan

trong nước, trong các dung dịch muối và rượu lỗng. Các protein œ-amylaza có tính

chất axit béo và tính chất của globulin, điểm đẳng điện nằm trong vùng 4,2-5,7 [41].

Phân tử lượng của các œ-amylaza từ các nguồn khác nhau xấp xỉ 40 000 kDa (của

nấm sợi là 45 000-50 000 kDa, của mầm lúa mạch (malt) là 59 000 kDa [123].

Ha Noi - 2005

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Amylaza là một metaloenzym trong phân tử có chứa ion canxi, khi tách hồn tồn

Ca ra khỏi phân tử thì enzym bị mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất vì Ca tham

gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc III và duy trì cấu hình của enzym

[50]. a-Amylaza bền nhiệt hơn so với các amylaza khác, tất cả các a- amylaza đều

bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu”', Hg”, Ag”... Một loạt các ion kim loại

như Li*, Na*, Mg”*, Cr'*, Mn?*, Co?', Sn?!, Cd?' khơng có ảnh hưởng đến œ-amylaza.

Điều kiện hoạt động của œ-amylaza từ các nguồn khác nhau thường khơng giống

nhau. Những khác biệt về tính chất (nhiệt độ, pH tối thích, mức độ thuỷ phân và đặc

tính thuỷ phân) của œ-amylaza từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng

to lớn cho việc ứng dụng chúng một cách thích hợp và đây hiệu quả ở các giai đoạn

khác nhau của quá trình sản xuất.

1.3.3.2.2. B-Amylaza (a-1,4 Glucan maltohydrolaza EC3.2.1.2)

B-Amylaza xúc tác thuỷ phân liên kết 1-4 glycozit trong tinh bột, glycogen

và polysaccarit đồng loại, phân cắt tuần tự gốc glucoza từ đầu không khử mạch [45].

B-amylaza hầu như không thuỷ phân hạt tinh bột nguyên vẹn mà thuỷ phân mạnh

mẽ hồ tinh bột. B-amylaza phân giải 100% amyloza thành mantoza va phân giải

54-55% amylopetin thành mantoza. Mantoza tạo thành có cấu hình j, vì thế enzym nàyđược gọi là B-amylaza [51]. B-Amylaza có trung tâm xúc tác chứa các nhóm -SH và

COOH cùng với dưịng imidazol của gốc histidin.

B-Amylaza hoạt động tối thích ở pH4,6

và nhiệt độ 10-50°C. Khác với œ-amylaza, nó

liên kết rất bén khi khơng có mat Ca”,

B-amylaza bị kìm hãm hồn tồn bởi Cu”, Hg',

iot, ozon... pH tối thích trong dung dịch thuần

khiết của B-amylaza là 4,6; nhiệt độ thích hợp

trong dung dich tinh bột thuần khiết là 10-50°C

B-amylaza bị bất hoạt ở 70°C.

Hà Nội - 2005

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

1.3.3.2.3. Glucoamylaza (a-1,4 D-glucan-glucanohydrolaza, EC 3.2.1.3)

Glucoamylaza là một exoenzym, thuỷ phân liên kết 1-4 glycozit trong phantử polysaccarit tách tuần tu từng gốc glucoza khởi đầu không khử của mach [45, 46].

Nó cũng thuỷ phân liên kết a-1,6 glucozit và a-1,3 chịu ảnh hưởng của kích cỡ cấu

trúc phân tử và các liên kết kế bên. Tại các điểm phân nhánh tốc độ thuỷ phân chậmhơn glucoamylaza có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, amylopectin, dextrin,izomanoza va mantoza tới glucoza [58]. Da số glucoamylaza thuộc loại enzym

"axit" thể hiện hoạt độ tối ưu ở pH 3,5-5,5. So với œ-amylaza thì glucoamylaza bền

với axit hơn nhưng kém bền với tác dụng của rượu ctylic. axit axetic. không đượcbảo vệ bằng Ca”'. Vi thế việc dùng chế phẩm glucoamylaza tách từ vi sinh vật trong

sản xuất bia. rượu, maltoza và glucoza có ý nghĩa và triển vọng lớn lao.

1.3.3.2.4. Oligo-1,6 glucozidaza (dextrinaza tới hạn, EC 3.2.1.10)

Enzym nay thuỷ phan các liên kết a-1-6 glycozit trong izomantoza, các

dextrin tới han có kha nang chuyển hoá chat nay tới đường lên men được. Nó thuỷ

phan dextrin mạnh hơn a, B-amylaza.

1.3.3.3. Khả năng thuỷ phan tinh bột của các loại vi khuẩn

Vi sinh vật là nguồn sinh amylaza rất lớn, a-amylaza gặp ở hau hết các loại

vi sinh vật như nấm sợi. nấm men giả. vi khuẩn có bào tử và xa khuẩn. Chế phẩm

œ-amylaza từ vi sinh vật đã được sử dụng nhiều trong công nghiệp và được sản xuất

với lượng lớn. ở vi khuẩn amylaza chủ yếu được sinh ra từ các chủng Bacillus như Ö.

subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis... [70] hoặc ở các chung Clostridium

[123]. Amylaza của vi khuẩn khác với của nấm sợi ở chỗ ít có khả nang đường hoá

nhưng lại dịch hoá hồ tinh bột rất mạnh. tạo thành những œ-dextrin phân tử cao bat

màu với iot. œ-amylaza của vi khuẩn giống với nấm men ở ché là chúng được ổnđịnh bằng ion canxi. œ-Amylaza của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt cao và có phổ

pH rất rộng từ chịu axit đến chịu kiểm. Vì vậy a-amylaza vi khuẩn được quan tâmnghiên cứu nhiều nhất trong những năm gan đây. Số lượng gen mã hoá a-amylaza

của vi khuẩn đã được tách dòng cũng chiếm tỷ lệ cao trong ngân hàng dữ liệu gen.

Hà Nội - 2005

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

Hiện nay. có nhiều cơng trình nghiên cứu về tính chịu nhiệt của ơ-amylaza từ vi

khuẩn. Các tác giả này đã phân lập được các chủng vi khuẩn sinh a-amylaza chịu

nhiệt cao [83]. Hoạt tính amylaza có nhiệt độ tối ưu 75-85°C.

Ảnh hưởng của ion và nhiệt độ lên hoạt tính của enzym đã được nghiên cứu

rất kỹ lưỡng. pH tối ưu của amylaza là 6,5-7,5. Ngoài ra, các chủng vi khuẩn đã

được xác định trình tự bang ARNr 16S và một trong các chủng đó là Bacillus

1.3.3.4. Anh hưởng của một số diéu kiện nuôi lên sinh tổng hop amylaza ở vi

1.3.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo Kwalk [83] cơ chế bất hoạt hóa a-amylaza do nhiệt xảy ra khi các ion

Ca”' bị tách ra khỏi phân tử enzym. Việc phá vỡ cầu nối canxi và các liên kết hidro

do q trình ion hóa phân tử enzym dưới tác dung của nhiệt độ. dan đến làm biến

dang phân tử protein. Tuy vậy các nghiên cứu trên mới chỉ thực hiện với a-amylazacủa đại mach. Các nghiên cứu sau này cho thấy q trình bất hoạt hóa của œ-

amylaza bởi nhiệt diễn ra qua giai đoạn hình thành các dạng cấu trúc trung gian phụ

thuộc vào nhiệt độ. Vì thế có thể tồn tại rất nhiều dạng biến hình có hoạt tính. Hoạt

tính enzym ở mỗi nhiệt độ phụ thuộc vào dạng cấu trúc trung gian của protein hình

thành ở nhiệt độ đó. Ion canxi cần thiết để làm giảm hang số vận tốc biến hình phân

tử protein của các dạng nguyên thuỷ và dạng trung gian của enzym [83, 96].

1.3.3.4.2. Ảnh hưởng của pH

pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều visinh vật. Các ion H* và OH là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những

biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng ảnh hưởng mạnh mẽ. Giới hạn pH

hoạt động tốt đối với vi sinh vật nói chung là trong khoảng 4-10. Đa số vi sinh vật

sinh trưởng tốt ở pH trung tính. Trong q trình trao đổi chất, màng tế bào tương

đối ít thấm đối với các ion H* và OH. Vì vậy. mac dù pH của mơi trường bên ngồidao dong, nhưng nồng độ của hai ion nói trên trong tế bao chất nói chung vẫn ổn

định [50, 123].

Hà Nội - 2005

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

1.3.3.4.3. Ảnh hưởng của cơ chất và thành phần môi trường lên khả năng tổng

hợp a- amylaza của vi khuẩn

Trong điều kiện có cơ chất, œ-amylaza thường bền nhiệt hơn. vì có thể khi

gắn vào phân tử œ-amylaza. có chất làm cho enzym ổn định được cấu trúc bậc III,

bảo vệ trạng thái khơng hố trị [50. 51]. Nguồn cacbon: amylaza là một enzym cảm

ứng điển hình. Vi vay các chất cảm ứng như tinh bột. dextrin, mantoza có mat trong

mơi trường ni vi sinh vật sẽ kích thích tổng hợp các enzym này. Glucoza là chất

dé sử dụng do đó nếu bổ sung vào mơi trường, glucoza sẽ ức chế hoặc kìm ham tong

hợp œ-amylaza [7]. Nguồn nito: Các muối amoni của axit vô cơ (NH,H;PO,,

(NH,),SO,, NH,CI cho hiệu quả sinh tổng hợp œ-amylaza thấp. Các axit amin bình

thường cho hiệu quả tổng hợp œ-amylaza cao. Vì vậy người ta hay bổ sung các dịchthuỷ phân protein vào môi trường nuôi vi sinh vật [123]. Yếu to khoáng: Nhiều yếutố khoáng ảnh hưởng mạnh mẽ đến tổng hợp a-amylaza. Việc thiếu một số muối

khoáng trong môi trường sẽ dần làm thay đổi một cách đáng kể trao đổi chất trong

tế bào vi sinh vật. Các yếu tố khoáng cần thiết được dùng như muối magiê. phốt

pho, kali, kẽm và một số các nguyên tố vi lượng khác [7. 34. 50. 51]. lon Mg** làmổn định œ-amylaza ở nhiệt độ cao, ion Ca** có trong thành phần protein của a-

amylaza. Độ thơng khí: Với các vi sinh vật hiếu khí, việc tạo chế độ thơng khí tốt

ảnh hưởng lớn đến mức độ và vận tốc tạo thành enzym.

1.3.4. Dac điểm chung của vi khuẩn lactic và vai trị của chúng trong sản xuất

phân bón

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, hầu hết khơng di

động. có hình thái khác nhau. Vi khuẩn lactic lên men bát buộc, tuy nhiên chúng

cũng có thể sinh trưởng được khi có mat 05, đó là bọn sống từ ki khí tới vi hiếu khí.Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giải kị khí đường. hiđrat

cacbon với sự tích luy axit lactic trong mơi trường. Người ta đã ứng dụng q trình

lên men lactic rất rộng rãi để chế biến thức ăn lên men, ủ thức an cho gia súc. sản

xuất axit lactic...[10]. Chính vì vậy vi khuẩn lactic được đưa vào trong chế phẩm

Hà Nội - 2005

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

phân sinh học với mục đích chủ yếu để chuyển hố thức ăn khó tiêu thành thức ăn

dễ tiêu. Hoạt động của vi khuẩn lactic trong phân sinh học khá đa dạng [22, 32, 37,

69, 88]. Axit lactic, là chất diệt trùng mạnh, tiêu diệt các vi sinh vật có hại và góp

phần làm tăng sự phân huỷ các chất hữu cơ. Vi khuẩn làm tăng sự phân cat các hợp

chất hữu cơ như xenluloza sau đó lên men chúng mà khơng ảnh hưởng có hại đến

các chất hữu cơ chưa phân huỷ. Vi khuẩn lactic ngăn ngừa hoạt động và lan truyền

của Fusarium, là nấm gây bệnh cho cây trồng.

1.3.4.1. Nguồn gốc của bacterioxin

Bacterioxin, lần đầu tiên được Andre phát hiện vào năm 1925 khi quan sát

sinh trưởng của một vai chủng Escherichia coli bi ức chế do sự có mat của một hợp

chất kháng khuẩn mà ông gọi là colixin C. Sau đấy, colixin được mô tả đặc điểmdưới dạng một peptit bền nhiệt và có thể thẩm tích, là những protein có trọng lượng

phân tử nhỏ 29-90kDa, có những vị trí cấu trúc đặc hiệu, bao gồm sự dính bám trong

tế bào, chúng liên kết với những thụ thể (receptor) đặc biệt ở phần ngồi màng của

tế bào đích. Tiếp đó, một số bacterioxin khác cũng được tìm thấy như aeroxin của

Pasteurella pestis, pyoxin của Pseudomonas aeruginosa, monoxin của Listeria

monocytogenes, cerexin cua Bacillus cereus va Staphylococcus aureus đánh đấu sự

phát triển của một nhóm polypeptit mà sau này được đặt tên là bacterioxin [5, 29,

38, 52, 53,92]

Ban dau bacterioxin duoc dinhnghĩa là một chất kháng sinh có hoạt lực

cao và có nguồn gốc tự nhiên [103]. Sau

đó, thuật ngữ bacterioxin được sử dụng để

chỉ các protein kháng khuẩn dạng colixin

của Escherichia coli. Một vài tác gia cũngđưa ra cách xác định một bacterioxin mà

theo đó phải thoả mãn được 6 điều kiện

1. Phổ kháng khuẩn hẹp, tác dụng chủ yếu đối với các lồi có

quan hệ họ hàng với lồi sinh ra bacterioxin đó.

Hà Nội - 2005

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

2. Có sự hiển diện của một protein có hoạt tính sinh học trong

phân tử bacterioxin chung

3. Gây độc đối với các vi khuẩn

4. Gan với một chất mang đặc hiệu

5. Gen mã hoá cho bacterioxin và gen mã hoá cho protein kháng

bacterioxin đó thường nằm trong cùng một plasmit.

6. Được tổng hợp khi có tác động qua lại với vi khuẩn đối kháng.

1.3.4.2. Bacterioxin của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic không chỉ được biết đến trong lên men thực phẩm mà còn

biết đến bởi khả nang sinh bacterioxin. Bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra là các

phan tử protein mang điện tích dương, kích thước nhỏ gồm 30 - 60 axitamin. có

điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần

với vi khuẩn sinh ra bacterioxin đó [77, 78. 101, 102].

Bacterioxin có mặt trong tất cả các nhóm của vi khuẩn lactic như:

Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc V,

Pediococcus, trong đó, hai nhóm chính là Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trị

quan trọng.

Theo hệ thống của Kleen - hammer các bacterioxin được chia thành 4 nhóm.

dựa trên trọng lượng phân tử, độ bền nhiệt và sự có mặt của các axit amin [77]:

e Các bacterioxin nhóm I: lantibiotic gồm các bacterioxin có phân tử

lượng nhỏ hơn 5kDa, có chứa các axitamin dị thường lanthionin. tiêu biểu là

nizin, lactixin 481, canoxin U149 và lactoxin S. Nhóm I lại chia thành 2 nhóm

nhỏ dựa trên cấu trúc của chúng.

- Nhóm Ia bao gồm các phân tử có dạng xoan, có trọng lượngphan tử 2,3 —3,5kDa va mang điện tích dương.

- Nhóm Ib bao gồm các peptit có dạng hình cầu. có trọng lượngphân tử là 2kDa.

Hà Nội - 2005

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

e Các bacterioxin nhóm II: Bao gồm các peptit bền nhiệt. có trọng

lượng phân tử nhỏ hơn 10kDa, và được chia thành 3 nhóm nhỏ bao gồm [77, 78,

101, 102, 104]:

- Nhóm Ila gồm các bacterioxin có khả nang ức chế vi khuẩn

Listeria có thé phát triển ở điều kiện lạnh, do sự mặt của chuoi YGNGV

tại khu vực đầu N của chúng đó là pedioxin.

- Nhóm IIb gồm các bacterioxin: lactococxin Ga/Gb [35] va

lactoxin M/N [77] và plantarixin EF va JK [77, 78].

- Nhom IIc bao gồm tất cả thuộc nhóm II nhưng khơng nam

trong nhóm IIa và nhóm IIb. Trong nhóm này, người ta thấy có 2 loại

- Nhom IIb.a. gồm những chat kháng khuẩn với | hoặc 2 gốc

cystein gồm thiobiotic và cystibiotic và nhóm IIb.b các kháng khuẩn

khơng có cystein gồm lactocoxin A và acidoxin B.

e Các bacterioxin nhóm III: nhóm này gồm các kháng sinh peptit. bền

nhiệt. có trọng lượng phan tử lớn hơn 30kDa, gồm helvetixin J và lactoxin B.

e Các bacterioxin nhóm IV: bacterioxin phức hợp là nhóm trong cau

trúc của chúng ngồi protein ra cịn có chứa một hay nhiều loại chất khác (lipit

hay carbonhydrat) tiêu biểu là plantarixin Lewconoxin 27 và pedioxin SI-I [5.

z2; 29,37, 103),

Bacterioxin là những kháng sinh peptit. Ca hai loại vi khuẩn Gram (+) va

Gram (-) đều có thé sản sinh ra chúng. Bacterioxin ở vi khuẩn Gram (-) lần đầu tiênđược nghiên cứu chỉ tiết. Mặt khác những bacterioxin sinh ra từ vi khuẩn Gram (+)

phần lớn đều là peptít nhỏ kích thước từ 3 - 6kDa, hoạt động ở mang, nó làm tăng độ

thẩm thấu của bào chất tại màng. Chúng đều được xếp vào hai lớp lớn.

Hiện nay, người ta quan tâm rất nhiều đến khả năng ứng dụng của

bacterioxin trong cả 2 lĩnh vực bảo quản thực phẩm và ức chế các sinh vật gây bệnh

H01; 115, 116].

Hà Nội - 2005

</div>

Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn phân lập ở Việt Nam dùng trong sản xuất phân hữu cơ đa chức năng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁTChữ viết tắt Chữ viết đây đủ

kDa (Kilo Dalton), khối lượng phân tử i |

OD | (Optical density), mat độ quang

CMC | Cacboxymetyl- xenluloza |CMC-aza | Cacboxymetyl- xenlulaza |

TLE (thin layer chromatography), sac ky ban mong |

HPLC - (High Performance Liquid Chromatography), |

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Chương 1. TONG QUAN TÀI LIỆU...-52 222tr 4

1.3.4. Dac điểm chung của vi khuẩn lactic và vai trò của chúng

Chương 2. NGUYÊN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP...---ccce. 4I

Chương 3. KET QUA VÀ THẢO LUẬN...--2--+°E+e++2E22+z+eee 61

3.1.4. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi

3.2. Vi khuẩn có khả nang sinh tổng hợp aimaz:...- 5-5-5 << sssss<s<sese 803.2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn có khả nang sinh tổng hợp amylaza...- 80

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

3.3.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính proteaza ở 2 chủng H3 và H4... 1063.3.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại hoá trị hai

3.3.4. Anh hưởng của EDTA va PMSF lên hoạt tính của proteaza

3.3.5. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính proteaza

3.4. Tuyển chon các chung vi khuẩn sinh axit lactic và bacterioxin cao... 111

3.4.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi đến kha nang sinh axit lactic

3.5. Dac điểm và tuyển chon vi khuẩn Azotobacter va Rhizobium

3.6. Động thái sinh trưởng, pH và tổng hop IAA

3.6.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng

3.6.2. Anh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến sinh trưởng

3.6.3. Anh hưởng của nguồn axit amin đến sinh trưởng

3.6.4. Anh hưởng của vitamin đến sinh trưởng và tong hop IAA của chủng Rh.... 142

3.6.5. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sinh trưởng

3.7. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi đến tong hop IAA của 2 chủng

3.7.1. Anh hưởng của pH đến sinh tổng hop IAA của 2 chủng HA4 va Rh... 146

3.7.2. Anh hưởng của Na;Mo, đến sinh trưởng va tổng hop IAA của chủng HA4 148

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà3.8. Bước dau nghiên cứu sử dụng hôn hợp vi khuẩn

eG plat Kile Oe Ch Re wane menue 149

3.8.2. Anh hưởng của một số yếu tố môi trường đến kha nang ủ phân... 152

KET 8) ... 162

DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN... 164

TÀI LIEU THAM KHẢO...--222°c2cveeecEvreerrtrreerrvrrerrrrrrrrrrrie 165

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

DANH MỤC CÁC BANG

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp amylaza... 82

Bảng 3.8. Anh hưởng của Ca** lên độ bền nhiệt của amylaza

Bang 3.9. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nhân giống

Bảng 3.18. Anh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng

Bảng 3.19. Anh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến sinh trưởng

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nguồn axit amin đến sinh trưởng

Bảng 3.21. Anh hưởng của vitamin đến sinh trưởng

Bảng 3.22. Ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng đến sinh trưởng

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Bang 3.24. Anh hưởng của nhiệt độ va độ ẩm lên su phân giải co rác

Bang 3.25. Ảnh hưởng của việc duy trì độ ẩm và tần số đảo tron đống

Bảng 3.26. Ảnh hưởng của phan vi sinh đến sinh trưởng và phát triển của cây lạc 158

Bảng 3.27. Ảnh hưởng của phân vi sinh lên sinh trưởng

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử xenluloza [ Í 3] ...--.--- <sup>---- --- 555 -<-<5<<<Ă<50<552556 13</sup>

Hình 1.2. Chuỗi các đơn phân hydroxyetyl xenluloza [23] ... <sup>--- 13</sup>

Hình 1.14. Chu trình nitơ trong sinh quyỂn ...-¿- ¿+ + 555252 s+xsvs+s+zsvsesexsez 32

Hình 3.I. Khả năng chuyển hoá photphat của vi khuẩn trên mơi trường Gerretsen .61

Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR của 2 chủng H2 và HŠ

Hình 3 6. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng

và chuyển hoá photphat của chủng H2 ...-- - - 5 5+5 5+Sz++S+x+t+++zx+xzx+z+szez+z 68Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng

Hình 3.10. Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl

Hình 3.11. Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl

Hình 3.32. Anh hưởng của các nguồn glycozit đến sinh tổng hop amylaza

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hồi Hà

ge) nhướm Latta eaaeeaaradrdrdabiiasiaaknasrissioyoiiedkeardaplltsssssseereuxsaisi6 <sup>94804068 5016110. 91</sup>

Hình 3.34. Anh huong của nhiệt độ tới hoạt tinh amylaza của chủng H3... 92

Hình 3.35. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính amylaza của chủng H4... 92Hình 3.36. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sinh trưởng

Hình 3.37. Anh hưởng của pH ban đầu tới sinh trưởng ... . -.--- 94

Hình 3.41. Phố lọc gel dịch chiết chế phẩm CMC-aza

Hình 3.42. Sắc ky đô chế phẩm CMC-aza qua sắc ký trao đổi ion (DEAE)... 102

Hình 3.46. Anh hưởng của pH lên hoạt độ proteaza ở 2 chủng H3 và H4... 106

Hinh 3.47. Anh huong cua ion kim loai hoa tri hai dén

Luận án Tiến sĩ Sinh học Nguyễn Thị Hoài Hà

Hình 3.56. Điện di đồ. trên gel polyacrylamit 5% sản phẩm PCR

của 2 chủng La và L24, gel nhuộm bạc ... 2226 117

của 2 chủng La và L24 và các lồi có quan hệ gần...-. - --- :-+-++-+-++ 118

Hình 3.58. Ảnh hưởng của mơi trường ni đến khả nang sinh axit... . 120