Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệm

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>Hà Nội, 2024</b>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN</b>

<b>Nguyễn Linh Chi</b>

<b>ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG ĐƠN BƯỚC,ĐA BƯỚC VỚI NỒNG ĐỘ OXY KHÁC NHAU TỚI SỰPHÁT TRIỂN CỦA PHÔI VÀ PHÁT SINH CHẤT THẢI</b>

<b>TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM</b>

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN</b>

<b>Nguyễn Linh Chi</b>

<b>ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG ĐƠN BƯỚC,ĐA BƯỚC VỚI NỒNG ĐỘ OXY KHÁC NHAU TỚI SỰPHÁT TRIỂN CỦA PHÔI VÀ PHÁT SINH CHẤT THẢI</b>

<b>TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM</b>

Chuyên ngành: Khoa học Môi trườngMã số: 9440301.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:1. PGS.TS. Ngơ Thị Tường Châu2. GS.TS. Nguyễn Đình Tảo

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>LỜI CAM ĐOAN</b>

Tôi là Nguyễn Linh Chi, nghiên cứu sinh trường Đại học Khoa học Tự nhiên,Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Khoa học Môi trường (Mã số:9440301.01), xin cam đoan:

1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn củaPGS.TS. Ngô Thị Tường Châu và GS.TS. Nguyễn Đình Tảo;

2. Cơng trình nghiên cứu này khơng trùng lặp với bất kỳ cơng trình nghiên cứu nàokhác đã được công bố tại Việt Nam;

3. Các số liệu và thơng tin nghiên cứu là hồn tồn chính xác, trung thực, khách quan và đã được cơ sở nơi nghiên cứu xác nhận và chấp thuận.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết nêutrên.

<i>Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2024</i>

<b>Tác giả luận án</b>

<b>NGUYỄN LINH CHI</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>LỜI CẢM ƠN</b>

<i>Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Môi trường, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHNvà Ban Giám đốc Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông đã cho phép và tạo điều kiệncho tôi thực hiện thành công luận án này.</i>

<i>Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Mạnh Khải- Trưởng Khoa Môitrường, Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN, TS. Trần Văn Sơn- Trưởng bộ môn Côngnghệ Môi trường. Cảm ơn các Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Môi trường, KhoaMôi trường đã tạo điều kiện thuận lợi và đóng góp nhiều ý kiến quý giá trong cảchặng đường dài hình thành và triển khai luận án.</i>

<i>Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Ngô Thị Tường Châu, KhoaMôi trường- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, GS.TS. Nguyễn Đình Tảo, Ngunphó giám đốc Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội- HVQY, Giám đốc Trung tâm HTSSBệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông, những người thầy trực tiếp, tận tâm hết lònghướng dẫn, tạo điều kiện và cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời giannghiên cứu và hoàn thành luận án.</i>

<i>Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã đóng góp những ý kiến qbáu để tơi hồn thiện luận án này.</i>

<i>Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn đến tập thể cán bộ, nhân viên Trung tâm Hỗtrợ sinh sản Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông đã tạo điều kiện giúp đỡ tơi trongq trình học tập, thu thập số liệu và hoàn thành luận án.</i>

<i>Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã độngviên, hỗ trợ tôi về mọi mặt trong cuộc sống, học tập và công tác.</i>

<i>Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2024</i>

<b>Tác giả luận án</b>

<b>NGUYỄN LINH CH</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>MỤC LỤC</b>

LỜI CAM ĐOAN...1

LỜI CẢM ƠN...2

MỤC LỤC...1

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ...5

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN...9

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN...11

MỞ ĐẦU...12

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...15

1.1. Một số khái niệm và thuật ngữ được sử dụng trong luận án...15

1.2. Khái quát sự phát triển của phôi trong môi trường tự nhiên...17

1.3. Thụ tinh trong ống nghiệm và quá trình phát triển của phôi trong thụ tinh ống nghiệm...22

1.3.1 Quy trình thực hiện IVF...22

1.3.2. Hệ thống ni phơi trong thụ tinh ống nghiệm...26

1.3.3. Q trình phát triển của phơi và các chỉ số đánh giá sự phát triển của phôi trong IVF...27

1.3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển của phôi trong IVF...32

1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu sử dụng mơi trường đơn bước/đa bước và nồng độ oxy 5%/20% trong IVF trên thế giới và tại Việt Nam...41

1.4.1. Môi trường đơn bước/đa bước...41

1.4.2. Nồng độ oxy 5% và 20%...43

1.5. Sơ lược về vấn đề phát sinh và quản lý chất thải trong IVF...45

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...50

2.1. Đối tượng nghiên cứu...50

2.1.1. Phôi người...50

2.1.2. Chất thải môi trường nuôi phôi trong IVF...50

2.2. Môi trường nuôi, trang thiết bị, địa điểm và thời gian nghiên cứu...51

2.2.1. Các loại môi trường...51

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

2.2.2. Trang thiết bị nuôi phôi...52

2.2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu...53

2.3. Phương pháp nghiên cứu...53

2.3.1. Tính cỡ mẫu cho nghiên cứu...53

2.3.2. Thiết kế nghiên cứu...54

2.3.3. Biến số, chỉ số và phương pháp nuôi phơi trong phịng labo...57

2.3.4. Phương pháp đánh giá phơi...60

2.3.5. Phương pháp thu và phân tích mẫu chất thải mơi trường nuôi phôi trong IVF...62

2.3.6. Phương pháp thu thập, quản lý, phân tích và xử lý số liệu...63

2.3.7. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu...64

<i>CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN...67</i>

3.1. Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, môi trường đa bước và nồng độ oxy khác nhau tới các giai đoạn phát triển của phôi trong thụ tinh ốngnghiệm...67

3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường đơn bước và đa bước đến sự phát triển của phôi trong IVF...67

3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ oxy 20% và 5% tới sự phát triển của phôi trong IVF...82

3.1.3. Đánh giá hiệu quả đồng thời của môi trường đơn bước và đa bước với các nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi trong IVF...89

3.2. Ảnh hưởng của môi trường đơn và đa bước với các nồng độ oxy khác nhau đến sự phát sinh chất thải trong IVF...102

3.2.1. Thành phần của mẫu thải khi sử dụng môi trường đơn bước trong nuôi phôi trong IVF...104

3.2.2. Thành phần của mẫu thải khi sử dụng môi trường đa bước trong nuôi phôi trong IVF...109

3.2.3. Ảnh hưởng của môi trường đơn bước/đa bước đến thành phần của các chất thải môi trường nuôi phôi...114

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ oxy (5% và 20%) đến thành phần của các

chất thải môi trường nuôi phôi...119

3.3. Tính chất các chất thải phát sinh từ hoạt động IVF và đề xuất phương án

xử lý...122

3.3.1. Đánh giá chất thải sau 3 ngày nuôi phôi...122

3.3.2. Đánh giá chất thải sau nuôi phôi 5 ngày...125

KẾT LUẬN...128

KIẾN NGHỊ...129

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ...130

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN...130

TÀI LIỆU THAM KHẢO...131

PHỤ LỤC...143

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>BẢNG CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ</b>

AFC Antral Follicle Count Đếm nang noãn thứ cấp: Tổngsố nang nỗn kích thước từ 2 –10mm (trung bình) đếm đượcqua siêu âm đường âm đạo ởcả 2 bên buồng trứng vào ngày2-3 của vòng kinh.

AMH Anti-Mullerian Hormone Hormon kháng ống cận trungthận, được sản xuất bởi các tếbào hạt của nang buồng trứng,cho biết số nang noãn non hiệncó trong buồng trứng củangười phụ nữ

DNA Deoxyribonucleic Axit Vật liệu di truyền của tế bào,lưu trữ trong các nhiễm sắc thểở nhân tế bào và ty thể. Ngoạitrừ một số tế bào (tinh trùng, tếbào trứng và hồng cầu), nhântế bào chứa 23 cặp nhiễm sắcthể. Một nhiễm sắc thể chứa rấtnhiều gen.

EdB Expanded Blastocyst Phơi nang đã dãn rộng hồn toàn

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit etylendiamintetraaxetic [CH₂N(CH₂CO₂H)₂]₂

EEA Essential Amino Acids Axit amin thiết yếuEEB Early Expanding Blastocyst Phôi nang đang dãn rộng

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>Chữ viết tắtChữ viết đầy đủTiếng Việt</b>

EIA Enzyme Immunoassay Loại xét nghiệm được tiếnhành dựa vào ứng dụng tínhđặc hiệu của các kháng thể vàđộ nhạy của các xét nghiệmenzyme. Dựa vào xét nghiệmphân tích hóa sinh, các bác sĩcó thể phát hiện và định lượngđược các phân tử kháng thể,protein, peptide, hormone

eSET elective Single EmbryoTransfer

Chuyển đơn phơi có lựa chọnESHRE European Society of Human

Reproduction and Embryology

Hiệp hội sinh sản và phôi học người của Châu Âu

GM-CSF Granulocyte- macrophagecolony- stimulating factor

Nhân tố kích thích hoạt hóabạch cầu đa nhân trung tính-đại thực bào

ICMART International Committee forMonitoring Assisted

Reproductive Technologies

Ủy ban Quốc tế về Giám sát Công nghệ Hỗ trợ Sinh sảnICSI Intra-Cytoplasmic Sperm

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>Chữ viết tắtChữ viết đầy đủTiếng Việt</b>

morpholino)propanesulfonic sử dụng trong các bộ dụng cụchẩn đoán sinh hóa, bộ táchchiết DNA / RNA. Với pKa là7,20, MOPS là chất đệm chonhiều hệ thống sinh học ở độpH gần trung tính.

NEAA Non-Essential Amino acids Axit không thiết yếu

hCG Human chorionic gonadotropin Đây là hormone có bản chấtpeptid, được tiết ra từ hợp bàoni, có vai trị kích hoạt các tếbào mầm của bào thai pháttriển và trưởng thành. Đồngthời, hCG cịn giúp kích thíchtiết ra hormone sinh dục, hìnhthành giới tính của thai nhi.Hệ thống ni

Hệ thống ni phôi Hệ thống nuôi phôi bao gồmmôi trường nuôi phôi, dụng cụni, tủ ni và hệ thống cáckhí để đảm bảo duy trì sự sốngcho phơi bên ngoài tử cungngười mẹ trong 5-6 ngày đầuphát triển.

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic

Là hệ đệm được sử dụng rộngrãi trong nuôi cấy tế bào, chủyếu là duy trì độ pH sinh lý tốtkhi thay đổi về nồng độ carbondioxide, dung dịch chứaHEPES cần sử dụng trongbóng để ngăn chặn q trìnhoxy hóa.

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>Chữ viết tắtChữ viết đầy đủTiếng Việt</b>

HSA _{Human Serum Albumin} _{Albumin huyết thanh người}được sản xuất trong tế bào ganngười và là thành phần proteinchiếm ưu thế nhất trong máu,chiếm khoảng 50% tổng sốprotein huyết thanh.

PGT Preimplantation GeneticTesting for aneuploidy

Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ

ROS Reactive Oxygen Species Các dạng oxy hoạt độngUSP United States Pharmacopeia Dược điển Hoa KỳVINAGOFPA Vietnam Gynaecology and

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN</b>

Bảng 1.1. Thành phần chính của một số môi trường nuôi phôi...32

Bảng 1.2. Nồng độ các chất dinh dưỡng trong vòi trứng và tử cung...35

Bảng 1.3. Tỷ lệ phôi phát triển lên ngày 3 khi nuôi phôi...44

Bảng 1.4 Tỷ lệ phôi phát triển lên ngày 5 khi nuôi phôi ở...45

Bảng 2.1. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi ngày 3...60

Bảng 2.2. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi nang (phôi ngày 5)...61

Bảng 2.3. Phân loại phôi nang theo Gardner (1999)...62

Bảng 3.1. Loại vô sinh của các bệnh nhân ở 4 nhóm nghiên cứu...71

Bảng 3.2. Thời gian vơ sinh của các bệnh nhân ở bốn nhóm nghiên cứu...71

Bảng 3.3. Đặc điểm dự trữ buồng trứng của các bệnh nhân...73

Bảng 3.4. Đặc điểm kích thích buồng trứng của các bệnh nhân...74

Bảng 3.5. Tỷ lệ (%) các loại phôi ngày 3 ở các nhóm nghiên cứu ni ởmơi trường đơn bước và đa bước...75

Bảng 3.6. Số lượng và chất lượng phơi ngày 3 của các nhóm nghiên cứuđược ni ở môi trường đơn bước và đa bước...77

Bảng 3.7. Số lượng và chất lượng phơi nang của các nhóm nghiên cứuni ở môi trường đơn bước và đa bước...78

Bảng 3.8. Tỷ lệ hình thành phơi nang của các nhóm nghiên cứu nuôi ở môi trường đơn bước và đa bước...80

Bảng 3.9. Số lượng và chất lượng phôi ngày 3 của các nhóm nghiên cứuni ở nồng độ oxy 5% và 20%...83

Bảng 3.10. Tỷ lệ (%) các loại phôi ngày 3 của các nhóm nghiên cứu ni ở nồng độ oxy 5% và 20%...84

Bảng 3.11. Số lượng và chất lượng phôi nang của các nhóm nghiên cứuni ở nồng độ oxy 5% và 20%...86

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Bảng 3.12. Tỷ lệ hình thành phơi nang của các nhóm nghiên cứu ni ở

nồng độ oxy 5% và 20%...88

Bảng 3.13. Tỷ lệ hình thành phơi nang giữa 4 nhóm nghiên cứu...90

Bảng 3.14. Kết quả sàng lọc PGT phôi nang...97

Bảng 3.15. So sánh sự bất thường nhiễm sắc thể giữa...99

Bảng 3.16. Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi ngày 3 khi sử dụngmôi trường đơn bước...104

Bảng 3.17. Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi nang khi sử dụngmôi trường đơn bước...106

Bảng 3.18. Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi ngày 3 khi sử dụngmôi trường đa bước...109

Bảng 3.19. Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi nang khi sử dụngmôi trường đa bước...112

Bảng 3.20. Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 3 ngày của...115

Bảng 3.21. Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 5 ngày của...117

Bảng 3.22 Thành phần của các chất thải sau nuôi phơi 3 ngày của cácnhóm nghiên cứu ni ở cùng môi trường nuôi...120

Bảng 3.23. Thành phần của các chất thải sau ni phơi 5 ngày của cácnhóm nghiên cứu ni ở cùng môi trường nuôi...121

Bảng 3.24: So sánh thành phần của các mẫu chất thải sau nuôi phôi 3 ngày122Bảng 3.25: Sự khác nhau giữa hướng dẫn phân loại chất thải y tế theothông tư 20/2021/TT-BYT và thông tư liên tịch 58/2015/TTLT- BYT-BTNMT...124Bảng 3.26. So sánh thành phần của các mẫu chất thải sau nuôi phôi 5 ngày125

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN</b>

Hình 1.1. Sự phân chia của phôi trong 3 ngày đầu sau thụ tinh...19

Hình 1.2. Phơi nang (hình chụp tại TTHTSS 16A)...20

Hình 1.3. Sơ đồ sự phát triển của phơi tiền làm tổ...21

Hình 1.4. Hệ thống ni phơi trong phịng Labo...26

Hình 1.5. Quan điểm về phân loại phơi...30

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu...56

Hình 3.1. Hình ảnh phơi ngày 3 (x400) ở các nhóm nghiên cứu...76

Hình 3.2. Hình ảnh phơi nang (x400) của các nhóm nghiên cứu...85

Hình 3.3. Biểu đồ Histogram về tỷ lệ phơi tốt và trung bình của phơi nang ngày 5 (bước rộng là 10%)...92

Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện số lượng phơi trung bình của mỗi chu kỳ trongcác giai đoạn phơi phát triển...93

Hình 3.5. Tỷ lệ các loại phơi ngày 3 và ngày 5 của nhóm nghiên cứu I và II...94

Hình 3.6. Tỷ lệ các loại phơi ngày 3 và ngày 5 của nhóm nghiên cứu III và IV.95Hình 3.7. Biểu đồ Histogram về phân bố tỷ lệ phôi bất thường ở 4 nhóm nghiên cứu (bước dao động 10% trục X)...98

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>MỞ ĐẦU1. Tính cấp thiết của nghiên cứu</b>

Vấn đề về sức khỏe sinh sản luôn là một trong những ưu tiên hàng đầu củaxã hội. Tại Việt Nam, có khoảng 7,7% cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vôsinh, hiếm muộn và tỷ lệ này đang tiếp tục gia tăng, do đó các nghiên cứu khoa họctrong hỗ trợ sinh sản cần được đẩy mạnh. Lĩnh vực này đặc biệt quan trọng trongbối cảnh môi trường và điều kiện sinh sống đang thay đổi nhanh chóng, ảnh hưởngđến sức khỏe con người. Thực chất, để đạt được một chu kỳ thành công trong kỹthuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó mơitrường ni phơi và nồng độ oxy là 2 yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triểncủa phôi và đang gây nhiều tranh luận [9, 14, 35, 49, 87, 88].

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy, với các điều kiện ni phơi khác nhau, đềucó thể mang đến thành cơng trong nuôi phôi ở môi trường nhân tạo, tuy nhiên có sựkhác nhau về tỷ lệ thành cơng theo từng giai đoạn phát triển phôi. Một số nghiêncứu này sử dụng số lượng mẫu không quá lớn (dưới 1000 mẫu), các nghiên cứukhông sử dụng cùng một loại điều kiện để so sánh, không sử dụng cùng hệ thốngnuôi và ở các quốc gia khác nhau, vì vậy các kết quả nghiên cứu đạt được chỉ mangtính chất tham khảo. Điều cần thiết là phải có thêm các nghiên cứu nhằm làm sángtỏ hơn vấn đề này, đặc biệt là nghiên cứu một cách hệ thống và tổng thể đánh giákết hợp các điều kiện khác nhau (về môi trường đơn bước/đa bước và nồng độ oxy5%/20%) đến sự phát triển phôi trong IVF.

Hiện nay, phân loại chất thải đã trở thành một nội dung trọng tâm trong côngtác quản lý chất thải y tế, tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứunào về thành phần, tính chất của chất thải được phát sinh trong quá trình thực hiệnIVF. Việc phân loại đúng chất thải sẽ góp phần giảm thiểu nguy cơ phát tán vi sinhvật gây bệnh hoặc các tác nhân có độc tính. Đồng thời, kết quả nghiên cứu chất thảicũng giúp cho các TTHTSS có phương án thu gom, vận chuyển và xử lý chất thảisau IVF một cách phù hợp, tuân thủ quy định về quản lý chất thải y tế do Bộ Y tế

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

ban hành, cũng như hạn chế tối đa kinh phí phải chi trả cho các hoạt động này. Trêncơ sở đó NCS triển khai đề tài “Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đabước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thảitrong thụ tinh ống nghiệm” với các mục tiêu sau:

<b>2. Mục tiêu của luận án</b>

- Mục tiêu tổng quát: Lựa chọn được điều kiện môi trường tối ưu cho sự phát triểncủa phôi đồng thời đánh giá ảnh hưởng của việc xả chất thải sau khi thực hiện kỹthuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF).

- Mục tiêu cụ thể:

(i) Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, môi trường đa bước và nồngđộ oxy khác nhau tới các giai đoạn phát triển của phôi trong thụ tinh ốngnghiệm

(ii) Đánh giá sự phát sinh chất thải trong hoạt động IVF từ các nhóm mơitrường nghiên cứu.

<b>3. Nội dung nghiên cứu của luận án</b>

(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi (đơn bước và đa bước) tớicác giai đoạn phát triển của phôi trong IVF.

(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy (5% và 20%) tới sự phát triển của phôi trong IVF.

(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của môi trường đơn bước và đa bước với các nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi trong IVF

(iv) Nghiên cứu sự phát sinh chất thải trong hoạt động IVF từ các nhóm mơi trường ni phơi nghiên cứu. .

<b>4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án</b>

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án góp phần bổ sung cơ sở dữliệu và bằng chứng khoa học về hiệu quả của việc sử dụng các loại môi trường nuôiphôi (đơn bước và đa bước), các nồng độ oxy khác nhau (5% và 20%) của tủ nuôiphôi, cũng như hiệu quả đồng thời của việc kết hợp môi trường nuôi (đơn bước vàđa bước) với các nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi trong IVF. Bên

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

cạnh đó, luận án cũng đánh giá về lượng, loại chất thải phát sinh trong quá trìnhthực hiện IVF và đề xuất các giải pháp quản lý loại chất thải này tại các trung tâmhỗ trợ sinh sản.

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án góp phần định hướng lựachọn điều kiện ni phôi tối ưu cho từng giai đoạn phát triển của phôi, nhằm cảithiện tỷ lệ thành công trong một chu kỳ IVF. Đồng thời, luận án có thể được sửdụng làm tài liệu tham khảo có giá trị cho các TTHTSS, các công ty sản xuất môitrường nuôi phôi và hệ thống tủ nuôi phôi... trong việc lựa chọn và đổi mới, nângcao sản phẩm chuyên biệt trong việc nuôi phơi lên giai đoạn phơi nang. Ngồi ra,dựa vào kết quả phân tích đặc điểm của chất thải phát sinh trong IVF, các TTHTSScó thể đề xuất thay đổi phương pháp thu gom, lưu giữ, vận chuyển chất thải hiệnđang được áp dụng, phù hợp với Quy định về quản lý chất thải y tế trong phạm vikhuôn viên cơ sở y tế do Bộ Y tế mới ban hành (Thơng tư số 20/2021/TT-BYT) vàhạn chế tối đa kinh phí phải trả cho các hoạt động này.

<b>5. Những đóng góp mới của luận án</b>

(i) Là cơng trình nghiên cứu mới ở Việt Nam đánh giá được hiệu quả đồng thờicủa 2 yếu tố: môi trường nuôi phôi (đơn bước và đa bước) và nồng độ oxytrong tủ nuôi phôi (5% và 20%), từ đó đã lựa chọn được điều kiện nuôi phôitối ưu cho sự phát triển của phôi.

(ii) Là một trong những cơng trình nghiên cứu mới ở Việt Nam đánh giá được sựphát sinh chất thải trong IVF, đồng thời đề xuất các giải pháp quản lý loạichất thải này tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản. .

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<b>CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1. Một số khái niệm và thuật ngữ được sử dụng trong luận án</b>

- Vô sinh: theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), vơ sinh là tình trạng một cặp vợchồng khơng có thai sau một năm chung sống, giao hợp bình thường, khơng sửdụng các biện pháp tránh thai. Đối với những trường hợp tuổi vợ trên 35 thì thờigian này chỉ khoảng 6 tháng đã được đánh giá là vơ sinh. Vơ sinh có thể đượcphân thành hai loại: vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ phát [108].

- Môi trường đơn bước: chỉ sử dụng một loại mơi trường ni phơi trong suốt qtrình phát triển của phôi.

- Môi trường đa bước: thay đổi môi trường nuôi ở ngày 3 trong q trình phát triểncủa phơi.

- Nang noãn: ngay từ khi mới sinh ra, trong buồng trứng bình thường của các bégái đã có khoảng 1-2 triệu nang noãn nguyên thủy. Nang noãn trải qua lần lượtcác giai đoạn: sơ cấp, thứ cấp và giai đoạn trưởng thành sẽ giải phóng nỗn bào(phóng nỗn) [11].

- Kích thích buồng trứng (kích trứng): là phương pháp sử dụng các loại thuốc nộitiết, có thể ở dạng uống hoặc tiêm, nhằm kích thích những nang nỗn tại buồngtrứng phát triển. Sau khi nang đạt đủ kích thước, bệnh nhân sẽ được tiêm thuốcgây phóng nỗn [39].

- Chu kỳ IVF: bao gồm các giai đoạn: chuẩn bị, kích trứng, theo dõi nang nỗn,chọc hút trứng, thụ tinh, chuyển phơi, bổ sung nội tiết tố, thử thai và theo dõi.- Thụ tinh: là một q trình trong đó phơi thai được hình thành từ sự hợp nhất giữa

giao tử đực (tinh trùng) và giao tử cái (noãn) [15].

- Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF): cho tinh trùng thụ tinh với noãn và ni thành phơi trong ống nghiệm, sau đó một số phôi sẽ được chuyển trở lại vào tử cung.- Phôi dâu: là giai đoạn phôi chứa 16-32 tế bào liên kết với nhau thành khối giống

quả dâu, thường là giai đoạn phôi khoảng ngày 3 đến ngày 4.

- Phôi nang: là phơi có chứa TE, khoang phơi và ICM, sau đó tạo thành phơi thai,

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

- Phương pháp bơi lên (swim-up): được xây dựng dựa vào nguyên tắc tinh trùng diđộng tốt có khả năng di chuyển ra khỏi tinh dịch vào môi trường nuôi cấy, vì vậygiúp thu được tinh trùng có độ di động cao, loại bỏ được tinh trùng chết và tinhtrùng bất động.

- Phương pháp ICSI: là kỹ thuật dùng hệ thống vi thao tác xử lý tiêm tinh trùngvào bào tương noãn. Đây là kỹ thuật cao nhằm hỗ trợ thụ tinh, tăng khả năng thụtinh giữa noãn và tinh trùng [15].

- Phương pháp IVF cổ điển: sau khi swim-up trong tủ nuôi CO<small>2 ở nhiệt độ 370C</small>trong khoảng 30 phút, tinh trùng thu được từ nước nổi lên sẽ được ni với nỗnở phịng labo. Mật độ khoảng 100-150 ngàn tinh trùng/2 nỗn/ một giếng mơitrường ni [15].

- Biểu đồ Histogram: dữ liệu được biểu thị bằng các cột trên biểu đồ có độ caokhác nhau tùy thuộc vào tần suất phạm vi dữ liệu cụ thể xảy ra.

- Chất thải nguy hại: bao gồm chất thải lây nhiễm và chất thải nguy hại không lâynhiễm (thông tư 20/2021/TT-BYT) [5].

- Chất thải lây nhiễm: bao gồm chất thải lây nhiễm sắc nhọn (kim tiêm, đầu sắcnhọn, dao mổ...), chất thải lây nhiễm không sắc nhọn (bông, băng, gạc...) và chấtthải có nguy cơ lây nhiễm cao (mẫu bệnh phẩm, dụng cụ đựng dính mẫu bệnhphẩm...) (Thơng tư 20/2021/TT-BYT) [5]

- Chất thải trong quá trình IVF: bao gồm 2 phần là chất thải lỏng (môi trường nuôiphôi) và chất thải rắn là vật tư tiêu hao trong Labo (Đĩa 5 giếng, đĩa 4 giếng,pippet, đầu côn….)

- Luật bảo vệ môi trường: Luật bảo vệ môi trường là một lĩnh vực pháp luật gồmtổng hợp các quy phạm pháp luật điều chỉnh các quan hệ xã hội phát sinh trựctiếp trong hoạt động khai thác, quản lý và bảo vệ môi trường.

- Phơi bất thường: một tế bào bình thường phải có đủ tổng 46 nhiễm sắc thể nằmtrong 23 cặp nhiễm sắc thể, mọi sự sai lệch với trạng thái nhiễm sắc thể này đượccoi là bất thường về di truyền.

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

- Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ: Xét nghiệm sàng lọc di truyền trước chuyểnphôi là xét nghiệm di truyền học được thực hiện trên 3 – 5 tế bào của phôi ngày5, với mục đích xác định các bất thường về di truyền ở mức độ nhiễm sắc thể, từđó giúp các chuyên gia lựa chọn phơi có bộ nhiễm sắc thể bình thường trước khitiến hành chuyển phôi.

<b>1.2. Khái quát sự phát triển của phơi trong mơi trường tự nhiên</b>

Sự hình thành và phát triển của phôi trong tự nhiên được diễn ra nhờ cáchormone và các cơ quan bên trong của người phụ nữ. Đầu tiên trứng được thụ tinhtại vị trí 1/3 ngồi vịi trứng, sau đó hợp tử và phơi được hình thành di chuyển dầnxuống và làm tổ trong buồng tử cung. Mỗi giai đoạn phát triển khác nhau, phôi sẽđược tiếp xúc với hệ môi trường khác nhau (dịch vòi trứng, dịch tử cung) [11].

<i><b>a) Giai đoạn thụ tinh:</b></i>

Quá trình thụ tinh bao gồm 4 giai đoạn: (i) chọn tinh trùng cho thụ tinh, (ii)tinh trùng xâm nhập vào nỗn, (iii) hịa màng tế bào tinh trùng với tế bào noãn, và(iv) sát nhập hai tiền nhân đực và cái để tạo nên bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội mới củaphơi. Với cấu trúc của nỗn sau phóng noãn, muốn lọt vào bào tương của noãn đểkết hợp với noãn tạo ra hợp tử, tinh trùng phải lần lượt vượt qua 3 chướng ngại vật,từ ngoài vào trong gồm: các lớp tế bào hạt, màng trong suốt, và màng bào tương củanoãn [41].

Chất lượng tinh trùng và chất lượng nỗn bình thường là điều kiện tiên quyếtđể đảm bảo sự thụ tinh. Có rất nhiều loại nỗn bất thường: bất thường cấu trúcmàng trong suốt làm cho tinh trùng bình thường khơng thể xâm nhập; bất thườngtrong bào tương nỗn: bào tương chưa trưởng thành, bào tương có không bào, lướinội bào hoặc mật độ hạt cao... đều là những nguyên nhân ảnh hưởng đến thụ tinh[7]. Tương tự như vậy, tinh trùng dị dạng hoặc khả năng tiến tới của tinh trùng cũnghạn chế hoặc làm tinh trùng khơng có khả năng thụ tinh tự nhiên với noãn.

- Những yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng noãn và tinh trùng:

+ Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng noãn: tuổi mẹ, bất thường về di truyền,

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

+ Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng tinh trùng: (i) suy dinh dưỡng, (ii) nghềnghiệp: làm việc trong môi trường nhiệt độ cao kéo dài làm nhiệt độ bìu tăng,thường dẫn tới giảm sinh tinh, tinh trùng thối hóa nhiều; làm việc tiếp xúc với hóachất, tia xạ...(iii) các bệnh lý của tinh hoàn: viêm, ứ nước, chấn thương... (iv) chế độsinh hoạt: uống rượu bia nhiều, hút thuốc lá nhiều, sinh hoạt tình dục quá nhiều,căng thẳng kéo dài...(v) các bệnh lý ảnh hưởng đến tinh hoàn: suy tuyến yên, suythận mạn, ung thư điều trị tia xạ...và (vi) một số loại thuốc: Depo-provera, Adjudinvà Gossypol là các thuốc đình sản nam, các thuốc nội tiết như corticoid hoặcandrogens nếu điều trị với liều cao và thời gian kéo dài có thể ức chế tuyến yên dẫntới ức chế quá trình sinh tinh và gây teo tinh hồn... [19]

- Điều kiện cho nỗn và tinh trùng gặp nhau để thụ tinh [21]:

+ Các yếu tố tác động đến quá trình di chuyển là dịch ổ bụng, hoạt động cơtrơn của ống dẫn trứng và hoạt động của nhung mao ống dẫn trứng. Vịi trứngthơng, loa vịi đón được nỗn rụng. Nhu động vịi trứng sẽ đưa nỗn đến 1/3 ngồivịi trứng để thụ tinh...

+ Tinh trùng được xuất tinh trong âm đạo có khả năng ly giải bình thường,khả năng tiến tới tốt, vượt qua được chất nhầy cổ tử cung, tiến vào buồng tử cungđể tới 1/3 ngồi của vịi trứng...

- Điều kiện thời gian: ở mọi lồi động vật, nỗn và tinh trùng nói chung cóđời sống rất ngắn. Ở người, trong đường sinh dục nữ, tinh trùng có khả năng sốngvà duy trì chức năng thụ tinh trong vịng 3–4 ngày. Nếu khơng gặp nỗn, tinh trùngsẽ tự thối hóa. Nỗn khi vào vịi trứng thường có khả năng thụ tinh trong vịng 24giờ. Nếu khơng gặp tinh trùng, nỗn sẽ tự thối hóa.

- Số lượng tinh trùng trong mỗi lần giao hợp, tinh dịch chứa:

+ Bình thường: tinh dịch trong một lần xuất tinh có thể tích > 1,4 ml, mật độtinh trùng > 16 triệu/ml, tổng số lượng tinh trùng trong tinh dịch > 39 triệu, tỷ lệtinh trùng di động > 42%, tỷ lệ tinh trùng hình dạng bình thường > 4% (WHO,2021) [102].

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

+ Tinh dịch khơng đạt tiêu chuẩn như trên khó có khả năng thụ tinh tự nhiênvà cần phải có sự giúp đỡ của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản.

<i><b>b) Giai đoạn phôi phân chia:</b></i>

Khi hợp tử phân chia thành 2 phôi bào vào khoảng 23–26 giờ sau thụ tinh,phơi tiến hành hàng loạt q trình ngun phân nối tiếp nhau liên tục làm cho sốlượng phôi bào tăng lên nhanh chóng (chỉ có nhân đơi rồi phân chia nhiễm sắc thểvà phân cắt mà khơng có sự lớn lên). Qua mỗi lần ngun phân, kích thước mỗiphơi bào sinh ra trở nên nhỏ hơn. Vào ngày thứ 2, phơi phân chia thường có khoảng3, 4 hoặc 5 phơi bào, ngày thứ 3 có khoảng 6–8 phơi bào (Hình 1.1). Các phôi bàotrong những lần phân chia đầu tiên (phân chia 2–4–8 phơi bào) có tính tồn năng, ítcó sự khác biệt về hình dạng, hoạt động sinh học và khả năng phát triển. Càng vềsau, sự biệt hóa giữa các phôi bào ngày càng tăng lên. Mỗi phôi bào sẽ thiết lậpchương trình phát triển để biệt hóa các dịng phơi bào đặc hiệu. Các phơi bào đượctổ chức theo nhóm, mỗi nhóm có tốc độ phân cắt riêng để làm cơ sở cho sự hìnhthành các cơ quan sau này. Vào khoảng cuối ngày thứ 3 hoặc đầu ngày thứ 4 sau thụtinh, phôi phân chia 12–32 phơi bào, gọi là phơi dâu. [17, 20].

<b>Hình 1.1. Sự phân chia của phôi trong 3 ngày đầu sau thụ tinh [84]</b>

Sự phân chia phơi xảy ra trong q trình phơi di chuyển từ vịi trứng đến tửcung. Các tế bào hạt vây quanh nỗn bị thối hóa dần dần, màng trong suốt vẫn tồntại trong thời gian phân chia phơi đến khi phơi thốt màng rồi cuối cùng biến mất.

Vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, phôi dâu đã lọt vào khoang tử cung và

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

suốt vào các khoang gian bào của đại phôi bào để nuôi phôi. Dần dần các khoanggian bào hợp lại và cuối cùng tạo thành một khoang xen giữa lớp tiểu phôi bào vàkhối đại phôi bào, khoang này dần dần lớn lên và gọi là khoang phôi nang haykhoang dưới mầm vì mầm phơi được tạo ra nằm phía trên nó. Khối tế bào trung tâmcủa phơi dâu (các đại phôi bào) bị khoang phôi nang đẩy dần về một cực của phôivà lồi vào khoang dưới mầm được gọi là cúc phơi (hay cịn gọi là nụ phơi hoặc khốitế bào nội phơi- ICM). Cúc phơi chính là mầm của phơi và cực đó gọi là cực phơi.Cịn cực đối lập gọi là cực đối phôi. Nếu ICM phân chia sớm ở giai đoạn này thì sẽtạo nên thai đôi. Tiểu phôi bào của lớp ngoại vi của phôi dâu dẹt lại tạo nên thànhcủa khoang phôi nang, phôi ở giai đoạn này giống như một cái túi nên gọi là phôinang và giai đoạn phát triển này của phôi gọi là giai đoạn phôi nang [11, 39].

<small>10 m</small>

1: Nụ phơi2: Khoang dịch 3: Lá ni phơi

<b>Hình 1.2. Phơi nang (hình chụp tại TTHTSS 16A, độ phóng đại ×400)</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<i><b>c) Sự làm tổ của phôi</b></i>

Phôi vào khoang tử cung vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, khi đó phơi ởgiai đoạn cuối phơi dâu hoặc đầu phôi nang. Niêm mạc tử cung sẽ cung cấp chophôi nguồn dinh dưỡng như oxy và các chất chuyển hóa.

Khi phơi vào đến khoang tử cung, phơi vẫn tiếp tục phân chia trong môitrường dịch tiết của niêm mạc tử cung vài ngày trước khi làm tổ. Đến thời điểm làmtổ, màng nuôi (TE) sẽ tiết ra men tiêu protein làm thủng và tiêu dần màng trongsuốt, nhờ vậy mà phơi có thể “thốt màng”. Mơi trường niêm mạc tử cung cũng cómen tiêu protein như trên, nhưng cơ chế để giúp phơi thốt màng của niêm mạc tửcung vẫn chưa rõ ràng. Sau khi thốt màng, phơi tự vùi mình vào niêm mạc tử cungrồi bám vào đó để phát triển, được nói là phơi làm tổ trong niêm mạc tử cung. Phôilàm tổ vào khoảng ngày thứ 6 sau thụ tinh, tương ứng với “cửa sổ làm tổ” của niêmmạc tử cung vào khoảng ngày thứ 18 đến ngày thứ 21 của chu kỳ kinh.

<b>Hình 1.3. Sơ đồ sự phát triển của phôi tiền làm tổ [11]</b>

Lúc bấy giờ phôi đang ở giai đoạn phôi nang và niêm mạc tử cung đang ởgiai đoạn trước kinh và sẽ tiếp tục phát triển. Ở cực phôi, lá nuôi được tạo ra từ các

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

lớp đệm, phá hủy mơ tử cung xung quanh để tồn bộ phơi tự vùi mình dần vào niêmmạc tử cung. Sự phá hủy mô tử cung là do những enzyme tiêu protein được tiết rabởi những tế bào lá nuôi [99].

<b>1.3. Thụ tinh trong ống nghiệm và quá trình phát triển của phơi trong thụ tinhống nghiệm</b>

<i><b>1.3.1 Quy trình thực hiện IVFa) Kích thích nang nỗn</b></i>

Quy trình bao gồm kích thích nang nỗn, chọc hút nỗn, cho tinh trùng thụtinh với nỗn và ni thành phơi. Sau đó, một số phôi sẽ được chuyển trở lại vàobuồng tử cung. Quá trình phát triển của phơi và thai sẽ diễn ra hồn tồn bìnhthường trong tử cung người mẹ. Kỹ thuật này được thực hiện thành công trên thếgiới lần đầu tiên năm 1978 và thành công lần đầu tiên ở Việt nam năm 1998 [15].

Mục đích của kích thích nang nỗn trong kỹ thuật hỗ trợ sinh sản là có nhiềunỗn phát triển và trưởng thành. Ưu điểm của kích thích nang nỗn là tạo ra nhiềunỗn để có nhiều phơi; khi có nhiều phơi có thể dễ chọn lựa được một số phôi tốtnhất cho chuyển phôi. Nếu chuyển nhiều hơn một phơi thì tỷ lệ thành cơng của kỹthuật IVF có thể cao hơn. Một ưu điểm khác là bác sỹ lâm sàng có thể kiểm sốtđược cả chu kỳ, các trung tâm có thể chọn giờ và ngày lấy nỗn. Tuy nhiên kíchthích nang nỗn cũng có những nhược điểm. Các nang nỗn trong buồng trứng kíchthích có thể trưởng thành khơng đồng đều, làm chất lượng nỗn thu được có thểkhơng bằng nỗn của các chu kỳ tự nhiên [15].

<i><b>b) Chọc hút noãn</b></i>

Bệnh nhân được gây mê và tiêm thuốc giảm đau. Chọc hút noãn được thựchiện dưới hướng dẫn của siêu âm đầu dò âm đạo. Một cây kim chọc hút dài sẽ đượcđưa vào âm đạo, đâm xuyên qua cùng đồ để đi đến 2 buồng trứng và chọc hút cácnang noãn bằng máy hoặc bằng tay. Dịch chọc hút sẽ được soi dưới kính hiển vi soinổi để tìm nỗn. Nỗn thu được sẽ ủ ấm trong tủ CO<small>2, 370C khoảng 3–6 giờ trước</small>khi được cấy với tinh trùng hoặc cho thụ tinh bằng kỹ thuật ICSI [15].

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

<i><b>c) Chuẩn bị tinh trùng</b></i>

Lấy tinh dịch người chồng bằng cách thủ dâm hoặc sử dụng bao cao suchuyên dụng. Tinh dịch sẽ được đánh giá để có kỹ thuật lọc rửa chuẩn bị tinh trùngthích hợp. Kỹ thuật lọc rửa tinh trùng trong labo IVF thường được áp dụng hiện naylà lọc bằng phương pháp “thang nồng độ” (gradient) và quay ly tâm để thu được cặngồm các tinh trùng có chất lượng tốt và sạch nhất, cặn bẩn, tinh trùng chết và lớptinh tương sẽ được các lớp thang nồng độ giữ lại. Sau đó, lớp cặn thu được sẽ đượcrửa lại bằng môi trường rửa chuyên biệt để loại bỏ mơi trường thang nồng độ do cóảnh hưởng khơng tốt đến tinh trùng và nỗn. Nếu tinh trùng có chất lượng tốt, cónhiều tinh trùng tiến tới nhanh đạt tiêu chuẩn của WHO (2021) [102], cặn ly tâmsau rửa tinh trùng sẽ được áp dụng kỹ thuật “bơi lên” (swim-up). Các trường hợptinh trùng ít, yếu hoặc hai vợ chồng vô sinh không rõ nguyên nhân sẽ được chỉ địnhlàm ICSI (tiêm tinh trùng vào bào tương noãn). Một số trường hợp khi xuất tinhkhơng có tinh trùng thì có thể sử dụng các phương pháp thu tinh trùng từ tinh hoànhay mào tinh [12, 92]. Chuẩn bị tinh trùng cho các mẫu tinh trùng ít và yếu này cóthể có nhiều cách khác nhau tùy trung tâm.

<i><b>d) Tạo phôi và nuôi phôi</b></i>

Sau khi chọn lọc được tinh trùng tốt, tinh trùng sẽ được tiêm vào bào tươngnoãn để tạo thành phôi, sự phát triển của phôi trong IVF tương tự với sự phát triểncủa phôi trong tự nhiên (trong tử cung người mẹ). Sáng ngày hôm sau ngày chọchút noãn (ngày 1), đánh giá thụ tinh được tiến hành 18–20h sau cấy với tinh trùngtrong kỹ thuật IVF cổ điển, 16–18h sau tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn. Đánhgiá thụ tinh bình thường khi thấy hai tiền nhân. Trong trường hợp đa thụ tinh (thụtinh bất thường) sẽ thấy ba đến bốn tiền nhân (do có hơn một tinh trùng xâm nhậpvào noãn). Noãn thụ tinh bất thường cần phải được loại bỏ vì chuyển phơi thụ tinhbất thường sẽ gây chửa trứng hoặc sảy thai.

Hiện nay, các TTHTSS luôn cố gắng nuôi phôi lên phôi nang trước khichuyển phơi vào người mẹ vì nhiều lợi ích mà phôi nang mang lại. Theo Deng(2020) nuôi phôi đến giai đoạn phôi nang sẽ gần với sinh lý tự nhiên, hơn khi vào

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

mới sống sót và phát triển đến giai đoạn phôi nang khi nuôi trong ống nghiệm, vàdo đó giúp lựa chọn được phơi tốt để chuyển phơi, làm tăng khả năng có thai. TheoMangalraj (2009), chuyển phôi ở giai đoạn phôi nang làm tăng tỷ lệ làm tổ và tỷ lệcó thai [68]. Trên thực tế, nhiều nghiên cứu nhận thấy chỉ có 1/3 số phôi phát triểnđến giai đoạn phôi nang. Người ta cho rằng, ở giai đoạn phân chia sớm, sự pháttriển của phôi từ chỗ dựa vào hoạt động di truyền của nỗn chuyển sang của chínhbản thân phơi. Giai đoạn chuyển tiếp này hay còn gọi giai đoạn “embryo block” donhiều phôi ngừng phát triển ở thời điểm này, hay nói cách khác phơi có khả năngphát triển và làm tổ tốt hơn khi vượt qua được giai đoạn “ block” này.

Do chất lượng phôi tốt hơn, tỷ lệ làm tổ cao hơn nên chuyển phôi ở giai đoạnphôi nang có thể hạn chế số lượng phơi chuyển. Nhờ vậy, nguy cơ đa thai cũng đượcgiảm thiểu [68]. Đa thai là một thai nghén nguy cơ cao, ảnh hưởng lớn đến tàichính và tinh thần của bệnh nhân khi giải quyết đa thai. Nếu kỹ thuật giảm thiểu thaikhơng tốt, bệnh nhân có thể bị sảy thai hoặc con sinh ra khả năng dị tật sẽ cao hơn.Nếu không giảm thiểu được (ở một số nước trên thế giới pháp luật cấm giảm thiểuthai), khả năng sinh con thiếu tháng và phát triển khơng bình thường của trẻ sinh racũng rất lớn. Nuôi phôi đến giai đoạn phôi nang phải trải qua sự chọn lọc của chínhcác phơi, vì vậy mỗi lần chỉ nên chuyển một phôi nang vào buồng tử cung người mẹ[65].

Hơn nữa, nuôi phôi nang rất cần thiết khi thực hiện kỹ thuật chẩn đốn ditruyền trước làm tổ. Ni phơi nang giúp sinh thiết được nhiều tế bào hơn so vớigiai đoạn phân cắt trong kỹ thuật chẩn đoán và sàng lọc di truyền tiền làm tổ. Gầnđây các phơi nang có chất lượng tốt đóng vai trị quan trọng trong ni tế bào gốc(stem cells) của người thông qua sinh thiết các tế bào của nụ phôi giúp cho việc điềutrị một số bệnh trong y học [16].

<i><b>e) Sinh thiết phôi và PGT</b></i>

Lựa chọn những phôi nang loại tốt và trung bình (theo đồng thuận Istanbul)để sinh thiết mẫu và tiến hành sàng lọc phôi PGT, so sánh kết quả giữa các nhómnghiên cứu (nếu bệnh nhân được chỉ định sàng lọc phôi).

- Kỹ thuật sinh thiết:

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

Khởi động máy vi tính và phần mềm laser. Gắn kim giữ (bên trái) và kimsinh thiết (bên phải) vào hệ thống vi thao tác. Chỉnh áp lực của kim sinh thiết: hút 1đoạn dầu Paraffin vào kim, tiếp theo hút 1 đoạn PVP (mơi trường này có độ nhớtcao sẽ giúp cho áp lực của kim ổn định hơn). Tiến hành sinh thiết khi phơi nang có6-10 TE chui qua lỗ thủng trên màng trong suốt.

Đặt từng phôi vào từng giọt môi trường sinh thiết, để tủ ấm 37°C, trong thờigian 10 phút. Xoay phơi sao cho vị trí các TE chui qua lỗ thủng màng trong suốttương ứng với điểm 3 giờ. Cố định phôi bằng kim giữ tại vị trí 9 giờ. Dùng kim sinhthiết MBB-FP XS-35-Origio có đường kính trong 23-27µm, đầu vát 35° vừa hútvừa kéo các TE, kết hợp với laser để tách rời các TE được sinh thiết khỏi phôi.Chuẩn bị đĩa rửa các TE sinh thiết: 3 giọt môi trường rửa phôi với thể tích 30µl mỗigiọt trong đĩa petri kích thước 30x10mm (Falcon). Các TE sinh thiết được rửa qua 3giọt môi trường rửa phôi, rồi chuyển vào tuýp eppendorf cùng với thể tích PBS2,4µl, cất trong hộp chun dụng và gửi đến labo sinh học phân tử.

- Kỹ thuật PGT: được sử dụng dựa trên quy trình tách chiết, khuếch đại, chuẩn bịthư viện và giải trình tự ADN của mẫu tế bào phôi bằng bộ Kit VeriSeq PGS trên hệthống Miseq - Illumina. Phân tích dữ liệu giải trình tự bằng phần mềm MiseqReporter và BlueFuse Multi để xác định lệch bội NST của mẫu phôi bào. Cácphương pháp xử lý mẫu, phân tích dữ liệu tuân thủ các khuyến cáo của Hiệp hộiChẩn đoán di truyền tiền làm tổ quốc tế (PGDIS), Hiệp hội Sản khoa Hoa Kỳ(ASRM), và Hiệp hội Phôi học và Sinh sản Châu Âu (ESHRE).

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<i><b>1.3.2. Hệ thống nuôi phôi trong thụ tinh ống nghiệm</b></i>

<b>Hình 1.4. Hệ thống ni phơi trong phịng Labo [45]</b>

Hệ thống nuôi phôi bao gồm môi trường nuôi phơi, dụng cụ ni, tủ ni vàhệ thống các khí (Hình 1.4). Hệ thống ni phơi bao gồm khơng chỉ tương tác củaphôi với môi trường vật lý xung quanh nó mà cịn giữa các thơng số trong labo [45].Ni phôi thành công trong labo phụ thuộc chủ yếu vào quản lý chất lượng(QC) và đảm bảo chất lượng (QA). Trước hết, bất cứ vật dụng gì mang vào phịngni phôi đều phải đảm bảo không gây độc cho phôi. Ngồi ra, việc quản lý các quytrình kỹ thuật trong phịng ni và quản lý các nhân viên phịng ni phôi cũng nhưquản lý các trang thiết bị, môi trường ni, khơng khí trong phịng ni phơi đềuquan trọng nhằm đảm bảo tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt đồng thời hạn chế tối đa cácsự cố. Hơn nữa, cần đào tạo kiến thức chuyên môn cho các nhân viên phịng niphơi để tư vấn, cung cấp thơng tin đầy đủ cho bệnh nhân. Mục đích của hệ thốngni phôi là:

- Nâng cao tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt và đáp ứng được nhu cầu của các cặpvợ chồng vơ sinh là có những em bé khỏe mạnh.

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

- Cung cấp thông tin đầy đủ về nỗn, tinh trùng, phơi cho bệnh nhân. Bệnhnhân phải có quyền được giải thích, tư vấn về những kỹ thuật áp dụng trên nỗn,tinh trùng, phơi của họ và có quyền tham gia vào các quyết định đối với nỗn, tinhtrùng, phơi của họ.

- Tránh nhầm lẫn mẫu nỗn, tinh trùng, phơi [70].

Để đạt được mục đích của hệ thống ni cần phải có các chính sách đườnglối cụ thể: các luật, các quy định, các pháp chế, các quy trình của phịng ni phơiđược tạo thành một hệ thống tài liệu. Các tài liệu có thể sử dụng được cho tất cả mọingười và được kiểm soát thơng qua các quy trình kiểm tra tài liệu.

<i><b>1.3.3. Q trình phát triển của phơi và các chỉ số đánh giá sự phát triển của phôitrong IVF</b></i>

Sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn, phơi được hình thành và pháttriển lên giai đoạn phôi phân chia: 2 tế bào, 4 tế bào, 8 tế bào, phôi dâu và cuối cùnglà phát triển thành phơi nang. Q trình phát triển của phôi trong IVF thường kéodài khoảng 5 ngày, những phơi phát triển chậm có thể kéo dài đến 6 ngày ở mơitrường bên ngồi.

Trong IVF, việc đánh giá chính xác chất lượng phôi là một trong những yếutố quan trọng ảnh hưởng đến tỷ lệ thành công. Trong các hệ thống phân loại nóichung, đối với phơi giai đoạn phân chia, các chỉ tiêu đánh giá bao gồm: số lượngphơi bào, sự phân mảnh, tính đối xứng; có thể ghi nhận thêm sự hiện diện của hiệntượng đa nhân và trạng thái nén chặt của các phôi bào. Đối với phôi nang, các đặcđiểm đánh giá bao gồm: độ nở rộng của khoang, đặc điểm ICM và khối tế bào lánuôi (trophoblast) [11].

<i><b>a) Đánh giá phôi giai đoạn phân chia sớm:</b></i>

Khoảng 16 giờ sau khi thụ tinh, xuất hiện 2 tiền nhân. Ở một số bệnh nhân,tiền nhân có thể xuất hiện sớm 12–14 giờ sau khi thụ tinh hoặc xuất hiện muộn sau20–22 giờ. Sự phân chia đầu tiên xảy ra khoảng 20–24 giờ sau khi thụ tinh. Bìnhthường cứ mỗi 24 giờ, phơi có số lượng phơi bào phát triển tăng gấp đôi. Vào ngày

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

thứ 2, phơi phát triển bình thường sẽ có 2 đến 4 phơi bào và có khoảng 8 phơi bàovào ngày thứ 3. Trong q trình phát triển phơi trải qua 3 chu kỳ phân chia. Thờiđiểm của 3 chu kỳ phân chia lần lượt là 35,6 giờ; 45,7 giờ và 54,3 giờ sau khi thụtinh. Số lượng phôi bào khơng chẵn có thể gặp ở phơi phát triển bình thường dophơi bào đang trong giai đoạn phân bào hoặc do sự phân chia của các phôi bàokhông đồng bộ. Cuối ngày thứ 3 sau khi phát triển thành 8 phơi bào (rất ít trườnghợp phát triển đến 16–32 phơi bào) phơi sẽ kết dính và bắt đầu xuất hiện nhữngnang nhỏ vào cuối ngày thứ tư [11]

Đánh giá hình thái phơi giai đoạn phân chia sớm dựa vào các tiêu chí sau: sốlượng phơi bào, sự đồng đều về kích thước giữa các phơi bào và các mảnh vỡ bàotương.

<i><b>- Đánh giá số lượng phôi bào</b></i>

Giai đoạn phân chia của phôi bắt đầu từ giai đoạn phôi 2 phôi bào đến giaiđoạn nén của phôi dâu gồm 8–16 phôi bào. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bêncạnh thời điểm phân chia, khoảng cách thời gian giữa các lần phân chia cũng rấtquan trọng. Nếu tất cả các phơi bào phân chia đồng bộ một cách chính xác, chúng tachỉ quan sát được các phôi 2, 4, 8 phôi bào. Tuy nhiên, trong thực tế, chúng tathường quan sát thấy các phôi 3, 5, 6, 7 hoặc 9 tế bào, điều này cho thấy sự pháttriển không đồng bộ giữa các phôi bào. Thời điểm đánh giá phôi được nghiên cứuvà thiết lập nhằm đánh giá chính xác tính động học của phơi. Số lượng phơi bào làđặc điểm chính, có giá trị tiên lượng cao nhất trong đánh giá chất lượng phôi. Phôichất lượng tốt phải là phơi thể hiện tính động học thích hợp và tính đồng bộ trongcác giai đoạn phân chia. Ở phơi có sự phát triển bình thường, sự phân chia phơi bàosẽ diễn ra cách nhau 18–20 giờ. Các phôi phân chia quá chậm hoặc quá nhanh cóthể có những khiếm khuyết ở nhiễm sắc thể hoặc ở quá trình trao đổi chất.

Trong đánh giá phôi giai đoạn phân chia, các mốc thời gian quan sát tốt nhấtđược thông qua trong hội thảo đồng thuận Istanbul (Alpha Scientists inReproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011)như sau: Ngày 1: (26 ± 1) giờ sau ICSI, (28 ± 1) giờ sau IVF: 2 phôi bào; Ngày 2:

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

<i><b>- Đánh giá độ đặc hiệu về kích thước giữa các phôi bào theo từng giai</b></i>

Theo lý thuyết, quá trình nguyên phân sẽ tạo ra 2 phơi bào có kích thướcbằng nhau. Kích thước phơi bào trong một phôi phụ thuộc vào số lần phân chia vàđộ đồng đều của mỗi lần phân chia. Do đó, để đánh giá chất lượng phơi giai đoạnphân chia một cách chính xác hơn, người ta đưa ra hai khái niệm: phôi “stagespecific” và “non-stage specific”. Việc phân loại được thực hiện dựa trên số lượngphơi bào và kích thước phơi bào (Hình 1.5). Theo đó, phơi có các phơi bào đúngkích thước (stage specific) là:

- Phơi có 2, 4, 8 phơi bào: các phơi bào có kích thước giống nhau- Phơi 3 có phơi bào: 1 phơi bào to và 2 phơi bào nhỏ

- Phơi 5 có phơi bào: 3 phôi bào to và 2 phôi bào nhỏ- Phơi 6 có phơi bào: 2 phơi bào to và 4 phơi bào nhỏ- Phơi 7 có phơi bào: 1 phôi bào to và 6 phôi bào nhỏ

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

<b>Hình 1.5. Quan điểm về phân loại phơi</b>

Màu xanh đậm là các phơi bào đúng kích thước (stage specific), màu xanh nhạt làcác phơi bào khơng đúng kích thước (non stage specific)

(Nguồn: Fernando, 2012) [82]

<i><b>- Đánh giá độ phân mảnh bào tương</b></i>

Ở phơi đang phân chia, q trình ngun phân thường tạo ra các mảnh tế bàochất, không chứa nhân được bao quanh bởi một màng plasma, gọi là mảnh vỡ tế bào(fragment). Kích thước và sự phân bố các mảnh vỡ tế bào bên trong khoảng khônggian bao quanh là màng trong suốt (zona pellucida) thường rất khác nhau. Người tathường sử dụng lượng mảnh vỡ tế bào để dự đốn khả năng làm tổ của phơi và sựlệch bội. Tuy nhiên, nếu mảnh vỡ tế bào chỉ chiếm ít hơn 10% thể tích tồn bộ phơithì khơng ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển của phôi [11].

Mức độ phân mảnh thường được biểu diễn theo tỉ lệ phần trăm trong tổng thểtích tế bào chất và được chia thành 3 cấp độ:

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

 Phân mảnh thật: xuất hiện tách hẳn ra khỏi phôi bào và hiện diện trongsuốt q trình phát triển của phơi.

 Phân mảnh giả: xuất hiện tạm thời trong giai đoạn phân chia của phơi vàkhơng hiện diện trong q trình phát triển sau này của phôi.

<i><b>b) Đánh giá chất lượng phôi nang</b></i>

Thời điểm này phôi tiếp tục phân chia, số lượng các phôi bào tăng dần vàphát triển thành phôi nang. Phơi nang phát triển hồn tồn vào ngày thứ 5. Số lượngphôi bào ở thời điểm này vào khoảng 50 đến 150 phôi bào và bao gồm 2 loại:

- Loại phơi bào thứ nhất hình thành ICM sau này sẽ phát triển thành thai,chiếm khoảng từ 20–30% tổng số phơi bào. Ngồi ra kích thước ICM cịn là tiêuchuẩn quan trọng nhất đối với tỉ lệ thành công làm tổ của phôi. Để chi tiết hơn,Gardner và cộng sự (1999) đã phân loại ICM thành 3 loại: loại A khi các tế bàonhiều, gắn kết chặt chẽ; loại B có một vài tế bào, gắn kết lỏng lẻo; và loại C có rất íttế bào [43].

- Loại phơi bào thứ hai là tế bào lá nuôi sẽ phát triển thành các phần phụ củathai. Tế bào lá nuôi tạo thành một lớp bao quanh ICM.

Ở giữa là khoang phôi chứa đầy dịch do hai loại tế bào này tiết ra để bảo vệvà nuôi dưỡng thai. Vào giai đoạn này, màng trong suốt bị dàn mỏng ra và baoquanh như một màng mỏng, sau đó màng trong suốt vỡ ra để các phơi bào thốt rangồi màng gọi là hiện tượng phơi thốt màng chuẩn bị cho sự làm tổ của phôitrong tử cung.

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

<i><b>1.3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển của phôi trong IVF</b></i>

<i>1.3.4.1. Thành phần môi trường dinh dưỡng</i>

Trước đây, người ta thường sử dụng môi trường nuôi phơi bên ngồi đếnngày thứ 2 hoặc 3 khi phơi đạt đến giai đoạn 4–8 phôi bào. Gần đây, nhiều nghiêncứu hơn về sự trao đổi chất của phôi, nhu cầu cụ thể của phơi từng giai đoạn vàphân tích rõ về môi trường ống dẫn trứng và tử cung, các nhà khoa học đã có thểni phơi đến giai đoạn phơi nang, chọn lựa được phơi có tiềm năng phát triển vàgiúp đồng bộ hóa phơi với đường sinh sản người phụ nữ.

Các thành phần trong môi trường nuôi phôi (Bảng 1.1) bị ảnh hưởng bởi hainguyên lý khác nhau cơ bản: (i) tôn trọng sự biến đổi môi trường nuôi phôi tuần tựtrong tự nhiên, hoặc (ii) giảm tối đa sự căng thẳng cho tế bào/tiêu tốn năng lượngcủa phơi trong việc thích nghi với sự thay đổi môi trường liên tục. Trước năm 2016,đa số các TTHTSS tại Việt Nam đều chỉ sử dụng môi trường nuôi đa bước. Hiệnnay, các TTHTSS tại Việt Nam và thế giới đang sử dụng song song cả hai loại môitrường thương mại là môi trường đơn bước và đa bước.

<b>Bảng 1.1. Thành phần chính của một số mơi trường ni phơi </b>[47]

<b>Gynemed GM501<small>®</small>G-1™PLUSG-2™PLUS</b>

Muối Sodium chloride Sodium chloride Sodium chloridePotassium chloride Potassium

Calcium chloride Calcium chloride Calcium chlorideMonopotassium

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Sodium lactate Sodium lactate Sodium lactateSodium pyruvate Sodium pyruvate Sodium pyruvateAmino axit

Dipeptide ^{Alanyl-Glutamine}Amino axit

Mơi trường ni phơi có thành phần rất phức tạp. Những thành phần trongmôi trường nuôi này sẽ hỗ trợ phơi trong q trình phát triển. Một số thành phầnđóng vai trị cung cấp năng lượng, một số thành phần giúp cân bằng nội mơi, trongkhi đó một số thành phần tạo ra pH tối ưu cho sự phát triển.

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

<i><b>a) Nước: Là thành phần cơ bản của bất kỳ loại môi trường nuôi phôi. Nguồn</b></i>

nước và độ tinh khiết của nước có vai trị rất quan trọng, đảm bảo chất lượng củamôi trường [44]. Có thể sử dụng nước cất với hệ thống lọc siêu sạch hoặc nước cấtđã được thương mại. Dù sử dụng loại nào, nước trong môi trường nuôi cũng phảiđảm bảo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt, chẳng hạn đạt các tiêu chuẩn vô khuẩn củaDược điển Hoa Kỳ (USP)/Châu Âu (EP) dành cho nước pha tiêm (USP/EPCertified Water). Nước khi kết hợp với các thành phần khác cũng cần được kiểm trachất lượng trước khi dùng trong điều trị [83].

<i><b>b) Ion và áp suất thẩm thấu: các ion bổ sung trong thành phần nuôi phôi đầu</b></i>

tiên được mô tả dựa vào môi trường Krebs-Ringer Bicarbonate (KRB) bao gồmNa+, K+, Mg2+, Ca2+, SO<small>4</small>^2-, PO<small>4</small>^3-và HCO<small>3</small>^-[44]. Đây là dung dịch muối ion cơbản được sử dụng cho đến những năm 1980. Sau đó, các thí nghiệm trên chuột sauđó với mơi trường dịch vịi trứng (Human tubal fluid – HTF) cho thấy tỉ lệ dư thừaNa<small>+</small> và K<small>+</small> gây ức chế sự phát triển của phôi [83]. Tiếp theo, những phát hiện về ảnhhưởng của phosphate và glucose trên phôi chuột gây ngừng phát triển phôi giaiđoạn sớm dẫn đến việc loại bỏ phosphate ra khỏi môi trường nuôi và bổ sung cácacid amin, vitamin, EDTA để loại trừ các ức chế này [44]. Mg<small>2+</small> và Ca<small>2+</small> đóng vai trịquan trọng trong q trình nén của phôi. Tuy nhiên, nghiên cứu trên phôi chuột ởgiai đoạn 1 đến 2 tế bào cho thấy nồng độ Ca<small>2+</small> dư thừa làm giảm khả năng pháttriển của phôi [60]. Ngồi các ion nói trên, HCO<small>3</small>^-là ion có vai trị rất lớn được sửdụng trong hệ đệm của mơi trường ni nhằm duy trì độ pH sinh lý cho phôi pháttriển [83].

Nồng độ và thành phần các ion khác nhau tùy thuộc vào từng loại môitrường, nồng độ các ion ngoại bào có thể ảnh hưởng đến nồng độ ion nội bào. Dovậy, ion đóng vai trị rất lớn trong việc quyết định áp suất thẩm thấu của môi trườngnuôi. Cho đến nay, áp suất thẩm thấu tối ưu của môi trường nuôi phôi người vẫnchưa được khẳng định. Áp suất thẩm thấu ở một số môi trường nuôi truyền thốngthường được duy trì ở mức 275–295 mOsmols [44].

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

<i><b>c) Nguồn năng lượng và cơ chế chuyển hóa: năng lượng cho phơi được</b></i>

cung cấp bởi các carbohydrate hiện diện trong ống sinh dục với hàm lượng khácnhau tùy thuộc vào mỗi giai đoạn phát triển, nhu cầu năng lượng và cách thứcchuyển hóa của phơi [42]. Môi trường nuôi được thiết kế với thành phần mô phỏngnhư môi trường sinh lý tự nhiên. Ở giai đoạn trước nén, phơi đang cịn ở vịi trứng,nơi có chất dịch chứa lượng pyruvate và lactate với nồng độ cao và lượng glucosenồng độ thấp. Phơi có xu hướng thụ động với các hoạt động chuyển hóa và sinhtổng hợp dạng thấp.

<b>Bảng 1.2. Nồng độ các chất dinh dưỡng trong vòi trứng và tử cung [107]</b>

<b>Acid amin</b>

Các acid amin không thiết yếu cơ bản (alanine, aspartate, glutamate,glycine, serine, taurine)

Tử cung 0,10 5,87 3,15 ^{Kết hợp với acid amin thiết yếu và}khơng thiết yếu

Sau q trình chuẩn bị, phơi bước vào giai đoạn hồn tất q trình nén. Khiphơi đến tử cung (lúc này đã phát triển thành phôi nang), nơi chứa lượng lớnglucose và nồng độ thấp pyruvate và lactate, quá trình sinh tổng hợp bắt đầu giatăng, cơ chế chuyển hóa phụ thuộc vào glucose, do đó glucose được ưu tiên sử dụngtrong giai đoạn này (Bảng 1.2) [107].

Glucose và phosphate được cho là gây độc cho phôi giai đoạn phân chia nêntrước đây thường được loại bỏ, thay thế bởi glutamine và EDTA. Tuy nhiên, việcthiếu hụt glucose lại gây ảnh hưởng đến tỉ lệ tạo phôi nang. Một số nghiên cứu sauđó cho thấy những tác động ức chế của glucose trên phơi phân chia có thể do môitrường thiếu hụt acid amin và vitamin. Bổ sung acid amin và vitamin giúp cải thiệntỉ lệ phôi phân chia [105].

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

Acid amin không chỉ đóng vai trị là nguồn năng lượng cho phơi phát triểnmà cịn có vai trị quan trọng trong duy trì sự cân bằng nội mô thông qua hoạt độngđệm pH, kháng oxy hóa và là chất hữu cơ hịa tan nhằm kiểm sốt thể tích tế bào[45]. Do đó, các acid amin là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôiphôi.

Thuật ngữ acid amin thiết yếu và acid amin không thiết yếu phản ánh nhucầu sử dụng acid amin của các tế bào khi nuôi phôi trong ống nghiệm. Nhóm acidamin khơng thiết yếu kích thích sự phân chia phơi ở giai đoạn sớm. Trong khi đó,nhóm acid amin thiết yếu kích thích sự phát triển của tế bào ICM. Trước giai đoạnnén, các phôi bào sử dụng các acid amin ngoại sinh để điều chỉnh cân bằng nội mơ.Do đặc điểm ion lưỡng tính tự nhiên, các acid amin không thiết yếu hoạt động tốttrong giai đoạn này. Ngược lại, sau giai đoạn nén, phơi có thể điều chỉnh môitrường nội bào và không phụ thuộc vào acid amin không thiết yếu. Các nghiên cứutrên động vật đã xác định mơ hình bổ sung các acid amin khơng thiết yếu trong bangày ni đầu tiên, sau đó là tất cả 20 acid amin trong suốt 2 đến 3 ngày tiếp theo.Thí nghiệm trên hợp tử chuột và mơi trường thiếu acid amin cho thấy sự phát triểncủa phôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Vì vậy, cần phải bổ sung acid amin vào tất cảmơi trường có tiếp xúc với nỗn và phơi [42].

Mặc dù cơng thức chính xác của môi trường nuôi phôi thương mại khôngđược tiết lộ bởi các nhà sản xuất, có một số nghiên cứu độc lập đã xác định đượcthành phần của một số môi trường nuôi phôi được sử dụng trong IVF [23, 73, 87]và nhận thấy sự khác biệt nhỏ về thành phần một số acid amin trong môi trường đơnbước và môi trường đa bước.

<i><b>d) Các đại phân tử và sự phát triển của phôi: môi trường nuôi cũng cần</b></i>

được bổ sung các protein do vai trò của chúng trong việc duy trì sự ổn định củamàng tế bào và ngăn chặn các gốc oxy hóa tự do hiện diện trong môi trường nuôi.Hầu hết các loại môi trường nuôi hiện nay đều chứa albumin huyết thanh ngườihoặc thay thế [32]. Thơng thường, huyết thanh của chính bệnh nhân được sử dụngtrong mục đích này. Tuy nhiên, sử dụng huyết thanh từ bệnh nhân cũng có nhiềunhược điểm do nguy cơ lây nhiễm từ quá trình chuẩn bị và sự biến đổi về nồng độ

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

các thành phần khác trong huyết thanh từ hormone, vitamin và acid béo. Có thể sửdụng các albumin huyết thanh tái tổ hợp của người được thương mại hóa sẵn, đượcchuẩn hóa nồng độ trong môi trường và loại bỏ các nguy cơ lây nhiễm nhưng vẫncó hiệu quả trong cải thiện tỉ lệ thụ tinh và phát triển của phôi [24]. Phôi khi nitrong mơi trường có albumin tái tổ hợp cũng tăng khả năng tiếp xúc với các chấtbảo quản lạnh [61].

Một đại phân tử khác trong đường sinh dục có vai trị quan trọng trong mơitrường ni là hyaluronan. Hyaluronan là một glycosaminoglycan có trọng lượngphân tử cao hiện diện trong đường sinh dục nữ và có nồng độ tăng ở thời điểm làmtổ của phôi [110]. Hyaluronan được bổ sung vào môi trường chuyển phôi để làmtăng tỷ lệ làm tổ [96]. Trong thử nghiệm 1282 chu kỳ IVF cho thấy, việc sử dụngmôi trường giàu hyaluronan giúp tăng tỉ lệ thai lâm sàng trên chuyển phôi ngày 3lẫn ngày 5. Hiệu quả của hyaluronan rõ rệt nhất ở nhóm bệnh lớn tuổi (>35 tuổi), ởnhững trường hợp chuyển phơi có chất lượng thấp và ở những phụ nữ có tiền cănthất bại làm tổ [52, 96]. Tỷ lệ trẻ sinh sống cũng được cải thiện khi chuyển phôi vớimơi trường có bổ sung hyaluronan [52].

<i><b>e) Các chất chống oxy hóa (antioxidant) và các chất bắt ion kim loại(chelator): Các gốc oxy hóa tự do sinh ra do hoạt động biến dưỡng của tế bào nuôi</b></i>

hoặc từ các nguồn khác như ion kim loại, ánh sáng, các đại phân tử trong môitrường nuôi. Các dạng oxy hoạt động (ROS) gây tác động đến phân tử chất béo,protein, DNA, ti thể và có thể gây chết tế bào theo chu trình, phân mảnh phơi và dođó ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi [48].

<i><b>g) Giá trị pH và các hệ đệm</b></i>

Độ pH được định nghĩa là thước đo của nồng độ ion H<small>+</small>, trong đó pH đượctính qua cơng thức pH = -log (H+). Khi CO<small>2 </small>hòa tan trong dung dịch, nó sẽ phảnứng với nước để tạo nên acid yếu là H<small>2</small>CO<small>3</small>, sau đó đạt trạng thái cân bằng giảiphóng HCO<small>3</small>^-và ion H+ theo phương trình phản ứng;

CO<small>2 </small>+ H<small>2</small>O H<small>2</small>CO<small>3</small> HCO<small>3</small>^-+ H+

</div>