khảo sát tác nhân gây viêm phổi kéo dài ở trẻ em tại bệnh viện nhi đồng thành phố bằng kỹ thuật rt pcr dịch rửa phế quản phế nang từ 10

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.97 MB, 119 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH- NĂM 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêutrong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Tác giả

VÕ THÀNH NHÂN

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ... 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4

1.1 Cơ chế bảo vệ của phổi với những tác nhân nhiễm khuẩn ... 4

1.2 Viêm phổi kéo dài ... 12

1.3 Phương pháp rửa phế quản phế nang ... 18

1.4. Tổng quan về phương pháp PCR và vai trị của phương pháp PCR trong chẩnđốn và điều trị viêm phổi ở trẻ em ... 21

1.5. Các nghiên cứu liên quan đến PCR dịch rửa phế quản phế nang trên bệnh nhânviêm phổi và viêm phổi kéo dài ... 26

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...29

2.1 Thiết kế nghiên cứu ... 29

2.2 Đối tượng nghiên cứu ... 29

2.3 Phương pháp chọn mẫu ... 30

2.4 Các bước tiến hành lấy mẫu ... 30

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

2.5 Biến số nghiên cứu ... 33

2.6 Phương pháp xử lý và phân tích số liệu ... 37

2.7 Vấn đề y đức ... 37

2.8 Triển vọng của đề tài ... 38

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...39

3.1 Khái quát các đặc điểm nghiên cứu của mẫu khảo sát ... 39

3.2 Đặc điểm tế bào học, cấy vi sinh và real time PCR của dịch rửa phế quản phếnang ở bệnh nhân viêm phổi kéo dài ... 46

3.3 Đặc điểm điều trị kháng sinh dựa trên tác nhân real time PCR của dịch rửa phếquản phế nang ... 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1: Phiếu thu thập số liệu

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

PHỤ LỤC 2: Phiếu chấp nhận tham gia nghiên cứu

PHỤ LỤC 3: Tài liệu tham chiếu về vi sinh vật thường gặp từ mẫu bệnh phẩmhô hấp bệnh viện nhi đồng thành phố và kháng sinh đồ

PHỤ LỤC 4: Phiếu xác nhận danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Acquired immunodeficiency syndrome Hội chứng suy giảm miễn dịch mắcphải

BAL Bronchoalveolar lavage Phương pháp rửa phế quản phế nangBALF Bronchoalveolar lavage fluid Dịch rửa phế quản phế nang

ERS Erythrocyte sedimentation rate Tốc độ máu lắng

ETA Endo tracheal aspiration

HIV Human immunodeficiency virus Virút HIV

MRSE Methicillin-Resistant Staphylococcusepidermidis

Staphylococcus epidermidis kháng

NTA Nasal tracheal aspiration

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

PCR Polymerase Chain Reaction Phương pháp xét nghiệm sinh họcphân tử

PVL Panton Valentine Leukocidin Độc tố Panton Valentine Leukocidin

tiết bởi tụ cầu S.aureus

PDA Patent ductus arteriosus Tồn tại ống động mạch

Real-time Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerasethời gian thực

SCN Staphylococcus coagulase negative

SMA Spinal muscular atrophy Bệnh teo cơ tủy sống

TGA Transposition of the great arteries Chuyển vị đại động mạch

TIR The intracellular region contains aToll/IL-1 receptor

Vùng nội bào chứa miền thụ thể Toll /IL-1

Tổ chức lympho nằm ở vòm mũihọng, vị trí cửa mũi sau

VSD Ventricular septal defect Thông liên thất

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC LƯU ĐỒ

Lưu đồ 2.1. Lưu đồ miêu tả quy trình thực hiện nghiên cứu ... 33Lưu đồ 3.1. Đặc điểm điều trị kháng sinh từ kết quả tác nhân PCR BAL ... 51

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tóm tắt các protein gắn kết và các thụ thể trong hệ thống miễn dịchđường hô hấp dưới ... 6Bảng 1.2. Định danh tác nhân vi sinh trên dịch rửa phế nang ... 26Bảng 3.1. Đặc điểm dịch tễ học của đối tượng nghiên cứu ... 39Bảng 3.2. Đặc điểm hỗ trợ hô hấp của đối tượng nghiên cứu trước khi làm thủthuật nội soi ... 41Bảng 3.3. Đặc điểm cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu trước thủ thuật ... 44Bảng 3.4. Đặc điểm hình ảnh học của Xquang ngực trên đối tượng nghiên cứu .... 45Bảng 3.5. Đặc điểm tỉ lệ biến chứng của thủ thuật rửa phế quản ... 46Bảng 3.6. Đặc điểm cấy vi sinh của dịch rửa phế quản phế nang ... 47Bảng 3.7. Đặc điểm tổng quan về kết quả PCR dịch rửa phế quản... 49Bảng 3.8. Tỉ lệ định danh tác nhân trong dịch rửa phế quản bằng phương phápPCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống ... 49Bảng 3.9. Ứng dụng của kết quả PCR trong việc quản lý điều trị kháng sinh ... 52Bảng 3.10. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả điều trị của việc ứng dụng phươngpháp PCR-BAL ... 52Bảng 3.11. So sánh hiệu quả điều trị giữa việc ứng dụng PCR dịch rửa phế quảnphế nang và điều trị kháng sinh theo kinh nghiệm ... 53Bảng 4.1. Biến chứng của thủ thuật rửa phế quản qua nội soi hô hấp ... 62

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Bảng 4.2. Đặc điểm đề kháng kháng sinh trong bệnh lý viêm phổi trẻ em tại AiCập ... 67Bảng 4.3. Tỉ lệ định danh tác nhân vi khuẩn bằng phương pháp PCR so với phươngpháp nuôi cấy truyền thống trên mẫu bệnh phẩm dịch rửa phế quản ... 68

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Đặc điểm tiền sử bệnh lý trước nhập viện của đối tượng nghiên cứu 40Biểu đồ 3.2. Đặc điểm triệu chứng cơ năng của đối tượng nghiên cứu ... 41Biểu đồ 3.3. Kháng sinh điều trị viêm phổi đã dùng ở đối tượng nghiên cứu ... 42Biểu đồ 3.4. Kháng sinh đang sử dụng của đối tượng nghiên cứu trước thủ thuậtrửa dịch phế quản ... 43Biểu đồ 3.5. Đặc điểm tế bào học dịch rửa phế quản ... 46Biểu đồ 3.6. Đặc điểm tỉ lệ định danh tác nhân viêm phổi bằng PCR-BAL ... 50

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm phổi kéo dài được định nghĩa là khi triệu chứng và tổn thương trênXquang ngực vẫn còn sau 1 tháng. Việc xác định các tác nhân nhiễm trùng luôn là mộtthử thách khó khăn với tất cả những nhà lâm sàng. Khi viêm phổi kém đáp ứng điều trịhoặc khi có tiến triển lâm sàng, chỉ định nội soi phế quản nên được đặt ra nhằm tìmkiếm nguyên nhân gây bệnh.

Nội soi rửa phế quản phế nang từ lâu đã được xem là một phương pháp chuẩnnhằm xác định tác nhân gây viêm phổi ở bệnh nhân. Việc cấy định danh là một trongnhững phương pháp truyền thống dùng để xác nhận tác nhân vi sinh trong dịch rửa phếquản. Tuy vậy, nhiều tác nhân vi sinh rất khó phát hiện bằng các phương pháp truyềnthống như soi, nhuộm, cấy vì nhiều lý do khác nhau, bao gồm cả việc nuôi cấy chậmphát triển. Với những ưu thế vượt trội như định danh tác nhân nhanh chóng, định danhđược các tác nhân ni cấy khó phục vụ cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh nênphương pháp Real time PCR hiện nay ngày càng được sử dụng nhiều hơn.

Nhiều nghiên cứu đã thực hiện trên thế giới về ứng dụng phương pháp Realtime PCR dịch rửa phế quản phế nang trong việc chẩn đoán tác nhân vi sinh ở bệnhnhân viêm phổi. Tác giả Baudel năm 2014 trong một nghiên cứu đánh giá công dụngPCR trong dịch rửa phế quản đã thực hiện khảo sát trên 53 bệnh nhân. Kết quả chothấy tỉ lệ ghi nhận tác nhân dương tính của phương pháp cấy dịch rửa phế quản thôngthường chỉ khoảng 40%, trong khi tỉ lệ trên với phương pháp PCR lên đến 66%.Nghiên cứu của tác giả Tsai năm 2017 trên 90 mẫu cấy dịch rửa phế quản phế nang ởtrẻ em ghi nhận việc cấy định danh được tác nhân vi trùng góp phần thay đổi điều trịkháng sinh trên 55% trường hợp. Năm 2019 Tschiedel cùng các cộng sự thực hiện thủthuật rửa phế quản trên 70 trẻ viêm phổi kéo dài, sau đó đem dịch rửa đi nuôi cấy vàxét nghiệm PCR. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ ngoại nhiễm khi áp dụng phươngpháp PCR có thể lên đến 40%, tỉ lệ xác định tác nhân là 67% với phương pháp PCR và26% với phương pháp cấy. Tại Việt Nam cũng có các nghiên cứu về nội soi phế quảnvà rửa phế quản phế nang như nghiên cứu của tác giả Trần Quỳnh Hương năm 2018

đăng trên Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh về “Vai trị của nội soi phế quản ốngmềm trong bệnh lý hô hấp nhi khoa".

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Tuy vậy, hiện chưa có nghiên cứu nào tập trung vào đánh giá ứng dụng của kĩthuật Real time PCR dịch rửa phế quản trong bệnh lý viêm phổi kéo dài tại Việt Nam.Liệu rằng phương pháp PCR dịch rửa phế quản với ưu thế định danh sớm và nhạy vớitác nhân vi sinh như thế nào và có thể ứng dụng vào trên thực hành lâm sàng hay

khơng? Vì câu hỏi trên, chúng tơi quyết định thực hiện nghiên cứu “Khảo sát tác nhângây viêm phổi kéo dài ở trẻ em tại bệnh viện Nhi Đồng Thành Phố bằng kỹ thuậtReal time PCR dịch rửa phế quản phế nang từ tháng 10/2022 đến tháng 7/2023”.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng quát: Khảo sát tác nhân gây viêm phổi kéo dài ở trẻ em tại bệnh viện

Nhi Đồng Thành Phố bằng kỹ thuật Real time PCR dịch rửa phế quản phế nang từtháng 10/2022 đến tháng 7/2023

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CƠ CHẾ BẢO VỆ CỦA PHỔI VỚI NHỮNG TÁC NHÂN NHIỄMKHUẨN

1.1.1 Cơ chế bảo vệ nội tại của phổi 1

1.1.1.1 Lọc khí động học

Cấu trúc đường thở từ mũi, hầu họng đóng vai trị quan trọng trong việc bảo vệphổi khỏi các tác nhân gây nhiễm khuẩn. Những vật thể lạ có kích thước lớn hơn 10µm sẽ bị lọc bởi hệ thống lông mũi và các dịch tiết tại mũi hầu. Hệ thống hạch lymphohầu họng bao gồm hệ thống VA và amidan cũng đóng vai trị như một hệ thống lọckhuẩn tại chỗ để ngăn chặn vi khuẩn từ ngoài xâm nhập vào hệ thống khí phế quản.Những tác nhân lạ có kích thước từ 2 đến 10 µm khi đi qua hệ thống hô hấp trên, docấu trúc ngoằn nghèo của đường thở cùng nhiều vật cản như lông mũi, dịch nhầy, cũngbị lắng đọng lại. Những tác nhân có kích thước nhỏ hơn 2 µm (bao gồm nhiều tác nhânvi khuẩn, virus, nấm) khó bị bắt giữ cũng như lắng đọng lại do kích thước siêu nhỏ củachúng, và do vậy, chúng có thể vượt qua hàng rào bảo vệ của hệ thống hô hấp trên2.

1.1.1.2 Làm ấm và ẩm khơng khí hơ hấp

Sự làm ấm và ẩm bắt đầu khi khí được hít vào từ mũi. Luồng khí khi được hítvào từ đường mũi sẽ được làm ấm bởi nhiệt độ cơ thể và được làm ẩm 100%. Việc giữấm và ẩm luồng khí hít vào đóng vai trò quan trọng trọng việc giúp dịch tiết của hệ hơhấp có thể thực hiện chức năng bảo vệ đường thở được bình thường2.

1.1.1.3 Các phản xạ đường thở

Phản xạ hắt hơi, ho và co thắt đường thở đóng vai trò tống xuất những tác nhânlạ khỏi hệ thống hơ hấp. Hắt hơi được kích thích bởi các thụ thể ở mũi và hầu họng vàkhá hiệu quả trong việc làm sạch hệ thống hô hấp khu vực từ mũi đến miệng hầu. Hocũng có cơ chế gần tương tự, với các thụ thể ho nằm rải rác tại yết hầu, thanh quản, khíquản, các nhánh phế quản chính, đóng vai trị làm sạch đường khơng khí từ vùng hầuhọng đến phổi3. Co thắt đường thở ngăn các tác nhân lạ xâm nhập hệ hơ hấp bằng cáchgiảm kích thước và điều hướng luồng khơng khí ra khỏi đường thở bị kích thích. Bằngcách giảm kích thước đường thở, việc co thắt phế quản sẽ giúp tăng khả năng lắngđọng các tác nhân lạ, và việc thanh thải đàm nhớt và phản xạ ho sau đó được kích hoạtđể tống xuất các tác nhân trên ra ngoài cơ thể.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

1.1.1.4 Thanh thải đàm nhớt

Dịch tiết hô hấp và việc thanh thải đàm nhớt đóng vai trị rất quan trọng trongcơ chế bảo vệ nội tại của phổi. Dịch đàm nhớt được cấu thành bởi hơn 90% là nước,cùng với các yếu tố khác như các ions, các glycoproteins (mucins), các proteins và cáclipids. Dịch đàm nhớt cung cấp một số chức năng phịng thủ quan trọng cho hệ thốnghơ hấp. Đó là: (1) tấm phủ có chức năng cuốn theo các hạt vật chất và vi sinh vật; (2)môi trường di động có thể được đẩy bởi lơng mao (các đầu lông mao đẩy lớp gel trênlớp sol về phía hầu họng); (3) lớp chống thấm có tác dụng giảm thất thoát chất lỏngqua đường hô hấp; (4) một lớp bề mặt để giải độc các chất gây kích ứng hít phải độchại; và (5) môi trường vận chuyển các chất cần thiết được tiết ra như enzyme,defensin, collens, antiprotease và immunoglobulin4.

1.1.2 Cơ chế miễn dịch bẩm sinh bảo vệ phổi

1.1.2.1 Các bổ thể

Một số protein huyết thanh đến phổi thơng qua q trình đáp ứng viêm, baogồm các bổ thể và các globulin miễn dịch. Hệ thống bổ thể có chức năng bao phủ cácphần tử lạ bằng cách opsonin hóa cho việc thực bào, bằng cách kích hoạt các tế bàothực bào thông qua giải phóng cục bộ các tác nhân hóa học (ví dụ, C5a), và các tế bàoly giải thông qua việc kích hoạt các thành phần bổ thể muộn C5, C6, C7, C8, và C9(phức hợp tấn cơng màng). Các khía cạnh quan trọng khác của con đường bổ thể làviệc tạo ra các độc tố phản vệ (C3a và C5a) gây ra sự giải phóng các chất trung gianhoạt mạch từ tế bào mast, và sự tạo ra C3b và C4 trên bề mặt tế bào khi tương tác vớicác đại thực bào. Sự thiếu hụt bổ thể có liên quan đến nhiễm trùng tái phát, viêm cầuthận hoặc các bệnh mạch máu collagen như lupus ban đỏ hệ thống. Viêm phổi có biếnchứng tràn dịch màng phổi, viêm phổi trịn và áp xe gan đã được mô tả là hậu quả củaviệc thiếu hụt C1. Các rối loạn tự miễn có liên quan đến cả thiếu C2 và C4, mặc dùnhiễm trùng do vi khuẩn cũng xảy ra ở trẻ em bị thiếu C2 (thiếu hụt bổ thể phổ biếnnhất). Thiếu C3 (về mặt lâm sàng là thiếu hụt bổ thể nghiêm trọng nhất và ít phổ biếnnhất) có liên quan đến cả rối loạn tự miễn dịch và nhiễm trùng tái phát. C3 hoạt độngnhư một tác nhân opsonin hóa và đóng vai trị trong cả hai con đường cổ điển và thaythế5. Thiếu C3 dẫn đến viêm tai giữa, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não

và viêm tủy xương, thường gây ra bởi Streptococcus pneumoniae, Neisseria

meningitidis, Klebsiella sp., Escherichia coli và S. pyogenes. Sự thiếu hụt muộn trong

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

dòng bổ thể (C5 đến C9) làm suy giảm các hoạt động diệt khuẩn và tiêu bào tronghuyết thanh, dẫn đến tăng tính nhạy cảm với nhiễm trùng tồn thân với các sinh vật có

vỏ như N. meningitidis và S. pneumoniae; tuy nhiên nhiễm trùng tại phổi thường

không phổ biến. Các khiếm khuyết ở con đường kích hoạt bổ thể thay thế là rất hiếm.

Thiếu hụt yếu tố thích hợp thường liên quan đến nhiễm N. meningitidis, nhưng nó

cũng liên quan đến viêm phổi. Sự thiếu hụt yếu tố H hoặc I (protein điều hòa của cả

hai con đường) dẫn đến rối loạn tự miễn dịch và nhiễm trùng tái phát S. pneumoniaevà Haemophilus influenzae. Lectin gắn kết với mannose và các ficolin có chức năng

trong miễn dịch chủ yếu thông qua cách ngăn chặn sự lan truyền qua đường máu củacác mầm bệnh đường hô hấp. Tuy nhiên, các khiếm khuyết về MBL cũng liên quanđến nhiễm trùng tại phổi bởi một số tác nhân gây bệnh đường hô hấp thông thường6.

1.1.2.2 Các protein gắn kết và các thụ thể

Sự gắn kết với các protein và di chuyển của các tế bào viêm là yếu tố khơng thểthiếu trong q trình phản ứng của tế bào đối với các tổn thương gặp phải. Ba họ chínhcủa các phân tử gắn kết tham gia vào các quá trình này trong phổi bao gồm siêu họglobulin miễn dịch, các intergrin và các selectin. Tóm tắt về các protein gắn kết tạiphổi được miêu tả trong bảng 1.1.

Bảng 1.1. Tóm tắt các protein gắn kết và các thụ thể trong hệ thống miễn dịch đườnghô hấp dưới1

Phân loại Siêu họ globulinmiễn dịch

Các integrin Các selectin

Cấu trúc Bao gồm các proteinchia sẻ cấu trúc miềnimmunoglobulin.

Bao gồm các dị phântử liên kết khơng cộnghóa trị của 2 chuỗi: αvà β

Bao gồm chuỗi tínhiệu ngoại bào, miềngiống lectin, miềngiống yếu tố tăngtrưởng biểu bì, ...

Các đặcđiểm

Các chuỗi peptide cóthể tồn tại dưới dạngkết nối hoặc khôngkết nối với nhau.

Chịu trách nhiệm chotương tác giữa các tếbào, và giữa tế bào vớicác protein collagen,

Cần ion Ca2+ để thựchiện gắn kết.

Đóng vai trò nhận biếtvà gắn kết các thành

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Chỉ có các globulinmiễn dịch và thụ thểtế bào T trải qua quátrình somatic hóa

Cần các ion Mg2+,Mn2+, Ca2+ để thựchiện chức năng

phần carbonhydratenhư lectin

MHC lớp I, lớp IIICAM-1 (CD54)ICAM-2

Liên kết ß2

LFA-1 (CD11a/CD18)Mac-1 (CD11a/CD18)p150,95(CD11c/CD18)

Liên kết ß1

(thụ thể fibronectin,CD49c/CD29)

1.1.2.3 Các thụ thể nhận diện đóng vai trò miễn dịch tại phổi

Các thụ thể hình que (TLR) là một họ protein thụ thể lớn, có hai vùng chứcnăng gồm các miền ngoại bào (bao gồm các đoạn lặp lại giàu leucine và một hoặc haivùng giàu cysteine) nhận ra các thành phần vi sinh vật: đường, protein, lipid, DNA,ARN) và vùng nội bào chứa miền thụ thể Toll / IL-1 (TIR). Vùng nội bào cung cấpcác hoạt chất có khả năng tương tác với một số protein để bắt đầu dẫn đến kích hoạt vàsản xuất một số cytokine và chemokine. Mười TLR đã được mô tả ở người, và có mốiquan hệ mật thiết với hàng rào bảo vệ miễn dịch của cơ thể như đại thực bào, bạch cầutrung tính và tế bào biểu mơ đường thở trong cả cơ chế miễn dịch bẩm sinh lẫn miễndịch thích nghi của cơ thể7.

Bên cạnh các tế bào hình que, các tế bào thụ thể hình nón cũng là một họ lớngồm 23 thành viên. Chúng nằm trong tế bào chất và chịu trách nhiệm cho cả hai cơ chếgây phản ứng viêm và chết tế bào. Các phức hợp thụ thể này tồn tại trên nhiều tế bào,trải dài từ nhóm tế bào miễn dịch đến nhóm tế bào biểu mơ. Tương tự như tế bào hìnhque, việc kích hoạt hoạt động của tế bào hình nón sẽ dấn đến kích hoạt chuỗi phản ứnghóa học nhằm cảm ứng với các chất tiền viêm như cytokines, chemokines, và các tếbào vi sinh vật. Ngồi 2 nhóm thụ thể chính trên, cịn có nhiều nhóm thụ thể nhỏ kháctham gia đáp ứng vào quá trình xây dựng hàng rào miễn dịch của hệ hơ hấp7

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

1.1.3 Miễn dịch tế bào7

Các tế bào biểu mô hô hấp tham gia vào quá trình miễn dịch thụ động của phổitheo nhiều cách khác nhau. Đầu tiên, các tế bào biểu mô là hàng rào vật lý chống lại sựxâm nhập của vi rút và vi khuẩn. Tế bào biểu mơ có hệ thống lông chuyển rất quantrọng trong việc đẩy chất nhầy lên đường thở, do đó loại bỏ các hạt vật chất có khảnăng làm tổn thương các tế bào thông qua chất nhầy ra khỏi đường thở. Biểu mơ hơhấp cũng có chức năng điều hòa sự di chuyển của nước và ion vào chất nhầy củađường thở. Ngồi ra, tại vùng biểu mơ hơ hấp, sự hoạt động của các tế bào tương tựnhư một trạm sửa chữa cục bộ, sử dụng các lớp tế bào đáy làm tế bào tiền thân thay thếcho các tế bào biểu mô bị tổn thương. Cuối cùng, biểu mơ hơ hấp đóng vai trị điềuhịa trương lực cơ trơn đường thở thơng qua một số cơ chế, do đó hạn chế thơng khíđến các vùng bị thương.

Tế bào tua là tế bào trình diện kháng ngun quan trọng nhất trong nhóm các tếbào trình diện kháng ngun tại hệ hơ hấp dưới. Ở người, có ít nhất 5 loại tế bào tuađược tìm ra và chứng minh là có tác dụng trong việc nhận diện các kháng nguyên lạxâm nhập cơ thể. Hầu hết nhóm tế bào này có nguồn gốc là các tế bào bạch cầu đơnnhân lưu hành trong máu, đến phổi để được biệt hóa tế bào. Đóng vai trò là nơi nhậndiện và khởi xướng chuỗi phản ứng của tế bào T, các tế bào tua lấy mẫu mơi trường và“tín hiệu nguy hiểm”, dẫn đến kích hoạt sự biệt hóa của chúng, xử lý kháng nguyên đểbiểu hiện và giải phóng cytokine để điều chỉnh thêm phản ứng miễn dịch.

Tế bào đại thực bào ở phế nang có bốn tính chất quan trọng bao gồm: tính diđộng, tính thực bào, là tế bào nhận diện tín hiệu và là nơi sản sinh các hoạt chất sinhhọc để điều hòa miễn dịch. Trong phổi, chúng thực hiện nhiều chức năng quan trọngvề mặt sinh học: thực bào và loại bỏ các đại phân tử, tiêu diệt vi sinh vật, hoạt độngnhư các tế bào phụ và điều hòa cho một số chức năng miễn dịch, tạo tín hiệu và kíchhoạt các tế bào viêm khác, duy trì và sửa chữa các mơ phổi bị thương, loại bỏ tế bàochết và điều chỉnh sinh lý phổi bình thường.

Tế bào mast từ lâu đã được công nhận là tế bào tác động chính của phản ứng dịứng, nhờ biểu hiện của chúng với các thụ thể Fc ái lực cao đối với immunoglobulin E(IgE) (FcεRI) và một loạt các chất trung gian mà chúng tạo ra. Tế bào mast được phânbố trong các mơ bình thường khắp cơ thể gần với các mạch máu và không lưu thông

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

trong máu. Người ta đã công nhận rằng chúng đóng một vai trị trong việc bảo vệ vậtchủ chống lại ký sinh trùng, chữa lành vết thương, điều hịa miễn dịch và và q trìnhtăng sinh khối u. Mặc dù số lượng ít, tế bào mast đóng một vai trò quan trọng đối vớisức khỏe và bệnh tật.

Chức năng chính các tế bào bạch cầu trung tính là thực bào và tiêu diệt mầmbệnh xâm nhập. Để bạch cầu trung tính thực hiện được điều này, nó phải đáp ứng cáctín hiệu trong vùng tổn thương, bám dính và di chuyển qua nội mô mạch máu, dichuyển đến vùng nhiễm trùng, nhận biết mầm bệnh, thực bào và tiêu diệt nó. Việc giánđoạn bất kỳ bước nào trong số này sẽ khiến vật chủ dễ bị nhiễm trùng. Bệnh nhân bịthiếu hụt kết dính bạch cầu làm bạch cầu trung tính khơng thể di chuyển đến các vị tríviêm, và kết quả là họ bị nhiễm trùng tái phát, đe dọa tính mạng. Trong bệnh u hạtmãn tính, bạch cầu trung tính thiếu các thành phần của hệ thống NADPH oxidase, vàdo đó mặc dù thực bào các sinh vật nhưng các tế bào bạch cầu không thể tiêu diệtchúng một cách hiệu quả. Các quá trình tuyển chọn và kích hoạt bạch cầu trung tính,tiếp theo là loại bỏ bạch cầu trung tính (chết tế bào) sau khi giải quyết quá trình lâynhiễm hoặc chấn thương, được điều chỉnh chặt chẽ. Sự gián đoạn của các q trìnhđiều tiết này có thể dẫn đến tổn thương phổi cấp tính hoặc mạn tính.

Bạch cầu ái toan là nhóm tế bào bạch cầu hạt lớn thứ hai trong hệ tuần hồn.Chúng tổng hợp một số peptid hoạt tính sinh học góp phần vào khả năng tiêu diệt kýsinh trùng. Tuy nhiên, các sản phẩm sinh học của bạch cầu ái toan và các chất trunggian oxy phản ứng có khả năng gây rối loạn đường thở và các hoạt động sinh lý củachúng có liên quan đến các bệnh lý liên quan đến dị ứng như bệnh hen suyễn.

1.1.4 Miễn dịch thích nghi7

1.1.4.1 . Tế bào lympho T

Nhiều loại tế bào lympho T góp phần vào hệ thống miễn dịch phổi. Hai loại thụthể kháng nguyên chính được tế bào lympho T sử dụng bao gồm γδ TCR và thụ thể αβ(tạo nên quần thể tế bào T CD4 và CD8). Tế bào T αβ gắn kết các phản ứng phân giảitế bào với các tế bào bị nhiễm, tổng hợp các cytokine và kích thích các phản ứng củatế bào B. Tế bào T αβ biểu hiện protein thụ thể CD4 được gọi là tế bào T trợ giúp (Th).Tế bào T CD4 nhận ra các kháng ngun được trình bày thơng qua kháng nguyênMHC lớp II và chúng cung cấp chức năng hiệu ứng chủ yếu bằng cách giải phóng các

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

cytokine. Các tế bào Th có thể được biệt hóa thêm về mặt kiểu hình thành các quần thểTh1 và Th2 dựa trên cấu hình sản xuất cytokine của chúng. Tế bào Th1 biệt hóa khi cóIL-12 và IL-18 và sản xuất interferon-γ, IL-2, và TNF-α để đáp ứng với kháng nguyên.Các tế bào này được coi là nguyên nhân gây ra phản ứng quá mẫn chậm đối với nhiễmvirus hoặc vi khuẩn, kích thích hoạt hóa đại thực bào tại chỗ và tuyển dụng bạch cầutrung tính, và thay đổi phản ứng của tế bào T cụ thể. Tế bào Th2 được thúc đẩy để biệthóa khi có IL-4, và khi có kháng nguyên, chúng đáp ứng bằng cách tạo IL-4, IL-5, IL-10 và IL-13. Các cytokine này chịu trách nhiệm thúc đẩy các tế bào lympho B tạo rakháng thể, và chúng dẫn đến việc tuyển dụng và kích hoạt các bạch cầu ái kiềm vàbạch cầu ái toan. Kiểu hình Th2 có liên quan đến kiểu hình dị ứng / hen suyễn trongcác mơ hình chuột và nghiên cứu trên người. Tế bào T CD8 có chức năng gây độc tếbào. Độc tính của tế bào T CD8 được thực hiện qua trung gian giải phóng các hạt tếbào có chứa perforin (làm xáo trộn màng tế bào) và granzyme (phá vỡ các tế bào đíchbằng cách thay đổi các mục tiêu nội bào). Ngồi ra, các tế bào T CD8 có thể bắt đầuquá trình chết tế bào ở các tế bào đích bằng tương tác Fas-FasL. Tế bào CD8 củng cốkhả năng phòng thủ tác nhân vi sinh bằng cách làm cho các tế bào lân cận có khả năngchống lại sự lây nhiễm, có lẽ là bằng cách giải phóng interferon.

1.1.4.2 . Tế bào lympho B

Miễn dịch dịch thể qua kháng thể trung gian được sản xuất bởi tế bào lympho B(tế bào B). Kháng thể là các protein có chức năng loại bỏ hoặc vơ hiệu hóa các khángngun đặc biệt tạo ra chúng. Sự tương tác của kháng nguyên với tế bào lympho Bkích hoạt sản xuất các kháng thể cụ thể và thiết lập khả năng giải phóng nhanh chóngmột lượng lớn kháng thể khi được kích thích trong tương lai (trí nhớ miễn dịch). Khitương tác của một kháng nguyên với IgM liên kết màng, bản sao của tế bào B vớithông tin di truyền mã hóa cho kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên sẽ trải qua haithay đổi: tăng sinh, mở rộng dòng và biệt hóa, dẫn đến sản xuất các kháng thể của cácisotype khác nhau. Tùy thuộc vào loại kháng nguyên, phản ứng của tế bào B có thểđược phân loại là phụ thuộc vào tế bào T hoặc không phụ thuộc vào tế bào T. Cácmầm bệnh khơng phụ thuộc vào tế bào T có thể kích thích tế bào B mà khơng cần sựhỗ trợ của tế bào T. Ví dụ về kháng nguyên không phụ thuộc vào tế bào T bao gồmpolysaccharide, cung cấp nhiều biểu mô lặp lại. Các kháng nguyên không phụ thuộcvào tế bào không gây ra sự hình thành các trung tâm mầm và do đó không thể tạo ra

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

các tế bào B bộ nhớ hoặc quá trình tăng sinh soma dẫn đến việc sản xuất các kháng thểcó ái lực cao.

1.1.4.3 . Miễn dịch dịch thể8

 Globulin miễn dịch A (Secretory immunoglobulin A - IgA)

Globulin miễn dịch A (IgA) là immunoglobulin chủ yếu có trong trong dịch tiếtđường thở. Phức hợp globulin IgA bao gồm hai phân tử IgA (dimeric IgA), mộtprotein kết nối (chuỗi J), và một phức bộ protein bài tiết (có chức năng giúp tránh phânhủy globulin IgA trong môi trường dịch tiết của phổi). Phức hợp globulin IgA đượctạo ra bởi các tế bào lympho B trong các mô dưới niêm mạc và có các chức năng baogồm trung hòa vi rút và ngoại độc tố, tăng cường hoạt tính của lactoferrin vàlactoperoxidase và ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Phức hợp globulin IgA có thểliên kết đồng thời hai kháng nguyên, và theo cách này, IgA vô hiệu hóa vi khuẩn vàtạo điều kiện cho việc loại bỏ chúng thông qua cách thanh thải đàm nhớt, ức chế vikhuẩn liên kết với các tế bào biểu mô, và ức chế các dị ngun có thể gây phản ứng dịứng. Nhìn chung, nồng độ IgA trong máu dưới ngưỡng 7mg/dL sẽ được xem như là cósự giảm miễn dịch IgA. Khi nồng độ IgA trong máu lớn hơn 7mg/dL, nhưng thấp hơnso với trị số bình thường theo tuổi, bệnh nhân sẽ được xem như giảm IgA một phần.Độ tuổi dùng để chẩn đoán các thể bệnh trên trên lâm sàng thường là 4 tuổi. Độ tuổitrên nhằm tránh việc chẩn đoán nhầm ở một số trẻ nhỏ mà việc sản xuất IgA chậm hơnso với độ tuổi chứ không hẳn là khiếm khuyết di truyền.

 Globulin miễn dịch G (Secretory immunoglobulin G - IgG)

Mặc dù nồng độ của globulin miễn dịch G trong đường thở ít hơn của IgA, tấtcả các phân lớp IgG có thể phát hiện được trong dịch tiết đường hơ hấp. IgG hoạt độngbằng cách opsonin hóa vi khuẩn tạo điều kiện thuận lợi để việc thực bào và tiêu diệt vikhuẩn xảy ra, kích hoạt các dịng thác bổ thể, và vơ hiệu hóa nhiều nội độc tố của vikhuẩn và vi rút. Sự thiếu hụt IgG có liên quan đến vấn đề viêm tai giữa, viêm xoang,viêm phế quản, và viêm phổi kéo dài hoặc tái phát nhiều lần. Ở những bệnh nhân nghingờ thiếu hụt IgG, định lượng của các phân lớp IgG nên được thực hiện. Bên cạnh đó,

việc đánh giá mức độ đáp ứng với các vắc xin dòng polysaccharide (S. pneumoniae, H.

influenzae) cũng là cần thiết đối với những bệnh nhân trên, do không ước lượng được

khả năng sản xuất kháng thể sau khi tiêm ngừa.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

 Globulin miễn dịch E (Secretory immunoglobulin E - IgE)

Globulin IgE đóng vai trị đáp ứng miễn dịch đối với các tác nhân dị ứng, đặcbiệt là kí sinh trùng. Khi kí sinh trùng xâm nhập, IgE kết nối với tác nhân trên và bắtđầu osponin hóa, sau đó gắn kết với bạch cầu ái toan thông qua các thụ thể trên phứchợp. Bạch cầu ái toan khi đó sẽ thực hiện vai trò ly giải các tác nhân dị nguyên. Trên yvăn hiện chưa ghi nhận bệnh suy giảm IgE đơn độc. Tuy nhiên những báo cáo ở nhữngbệnh nhân suy giảm IgE cộng gộp với suy giảm IgG, các bệnh nhân trên thường bịviêm tai giữa và viêm xoang tái đi tái lại.

 Globulin miễn dịch M (IgM)

Hầu hết các globulin miễn dịch M (IgM) do trọng lượng phân tử lớn, chủ yếulưu hành trong hệ thống mao mạch phổi. Tuy nhiên, phân tử IgM có thể vào đường thởthơng qua cơ chế tiết dịch của hệ thống bài tiết hô hấp. IgM có khả năng ngưng kết vikhuẩn và hoạt hóa dịng bổ thể. Do đó, mặc dù nồng độ IgM trong chất tiết của đườngthở khá thấp, nó đóng một vai trò trong việc bảo vệ niêm mạc. Tuy vậy, việc suy giảmIgM đơn độc không phải là yếu tố liên quan đến nhiễm trùng đường hô hấp tái phát.Những người bị thiếu hụt IgM dường như có khiếm khuyết trong quá trình trưởngthành của tế bào lympho B, nhưng các tế bào lympho B có khả năng tiết ra các isotypekháng thể khác.

1.2 VIÊM PHỔI KÉO DÀI

1.2.2 Nguyên nhân gây tình trạng viêm phổi kéo dài

1.2.2.1. Tác nhân khơng điển hình hoặc chẩn đốn nhầm tác nhân gây bệnh

Mycoplasma pneumoniae là nguyên nhân phổ biến của nhiễm trùng đường hô

hấp nhưng là nguyên nhân hiếm gặp của viêm phổi nặng. Lý do là vì viêm phổi do

M.pneumonia thường hồi phục và đáp ứng nhanh với điều trị. Cải thiện lâm sàng đáng

kể thường xảy ra trong vòng hai tuần đầu tiên. Xquang ngực xấu đi sau khi điều trị là

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

rất hiếm, xảy ra ít hơn 25% trong các trường hợp ghi nhận viêm phổi. Thời gian trungbình của các bất thường trên X quang là từ hai đến bốn tuần, tùy thuộc vào việc sửdụng kháng sinh. Khoảng 40% có cải thiện trên hình chụp X quang sau 4 tuần và 90%ghi nhận cải thiện sau 8 tuần. Các bất thường chụp X quang cịn lại sau đó là bất

thường đối với tác nhân M.pneumonia10. Tổn thương trên X-quang ngực phổ biến nhấtlà tổn thương dạng lưới nốt hoặc các vùng đông đặc từng mảng rời rạc; chúng có thể làmột bên hoặc hai bên và chủ yếu xuất hiện nhiều hơn ở thùy dưới phổi11.

Chlamydia pneumoniae là một nguyên nhân không phổ biến của bệnh viêm

phổi, nhưng nó có liên quan đến việc bùng phát vấn đề viêm phổi ở những khu chămsóc y tế tập trung dài hạn và những khu quân đội. Đây là một bệnh tương đối nhẹ, và tỉlệ tử vong là rất hiếm. Ảnh hưởng bất thường trên nhu mô phổi là không phổ biến, vớinhững tổn thương chủ yếu là dạng tổn thương mô kẽ và tràn dịch màng phổi, và cácdấu hiệu trên chỉ thường gặp ở trẻ chưa đầy ba tháng tuổi. Khoảng 50% hình ảnh Xquang phổi sẽ cải thiện trong vòng bốn tuần. Tuy vậy, các bất thường trên X quangcòn lại vẫn tồn tại trong 10-20% các trường hợp viêm phổi12,13.

Haemophilus influenzae thường được coi là nguyên nhân gây viêm phổi, đặc

biệt là ở người lớn tuổi, ở những người hút thuốc lá và ở những bệnh nhân mắc bệnhphổi tắc nghẽn mãn tính. Dựa trên khuynh hướng lây nhiễm của sinh vật đối với ngườisuy giảm miễn dịch và người lớn tuổi, việc hồi phục thường chậm, nhiều bệnh nhânphải nhập viện kéo dài14.

Bệnh lao cũng là một trong những nguyên nhân gây viêm phổi kéo dài rất đángđược quan tâm, đặc biệt là ở bệnh nhân người lớn tuổi, và những người có các yếu tốnguy cơ của AIDS. Biểu hiện lâm sàng của bệnh lao như một nguyên nhân của viêmphổi kéo dài thường khơng điển hình, đặc biệt ở bệnh nhân tiểu đường và bệnh nhânlớn tuổi, những người thường có phát hiện X quang ở vùng giữa hoặc dưới phổi. Việcchẩn đốn có thể khó khăn vì khơng phải lúc nào cũng có sẵn đờm và mất thời gianchờ kết quả nuôi cấy. PCR đã được chấp thuận cho các mẫu dương tính với phết tế bàođể cho phép xác nhận bệnh lao, nhưng vai trị của nó trong các trường hợp âm tính vớiphết tế bào là khơng chắc chắn15. Hai bệnh cảnh cần nghĩ đến lao ở trẻ em là viêmphổi kéo dài kém đáp ứng điều trị và có tiếp xúc gần với nguồn lây trong thời gian dài(trong vòng 3 tháng trước thời điểm bắt đầu triệu chứng).

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Nấm - Ở bệnh nhân bị viêm phổi kéo dài, Aspergillus là một mầm bệnh đặc biệt

quan trọng, biểu hiện dưới dạng hoại tử mãn tính hoặc nhiễm nấm xâm lấn. Bệnh nhânAIDS giai đoạn cuối có nhiều nguy cơ mắc viêm phổi xâm lấn do aspergillus, trongkhi những bệnh nhân mắc bệnh ít tiến triển hơn có thể bị viêm khí phế quản. Mặc dùbệnh aspergillus xâm lấn thường xảy ra ở những bệnh nhân giảm bạch cầu trung tínhđã dùng nhiều loại thuốc kháng sinh trong vài ngày, nhưng nó ngày càng được ghinhận ở những bệnh nhân lớn tuổi bị bệnh phổi mãn tính đang điều trị bằngcorticosteroid. Aspergillus trong bối cảnh lâm sàng có thể tương tự như một trườnghợp viêm phổi nhiễm trùng do vi khuẩn, và một loạt dữ liệu chứng minh rằng bệnhnhân bị aspergillus xâm lấn đã được điều trị trung bình 18 ngày với nhiều loại khángsinh trước khi chẩn đoán được xác định16,17. Các bệnh nhiễm nấm đặc hữu khác nhưhistoplasmosis, coccidioidomycosis, blastomycosis và cryptococcosis cũng nên đượcxem là những nguyên nhân gây viêm phổi kéo dài ở những vùng lưu hành thích hợp18.Những nơi này bao gồm Thung lũng sông Mississippi đối với bệnh histoplasmosis,Tây Nam Hoa Kỳ đối với bệnh coccidioidomycosis, và phía Đơng Nam và Trung Tâyđối với bệnh blastomycosis. Mỗi loại nấm này có thể gây ra bệnh sốt cấp tính khơngđặc hiệu, có thể bị nhầm lẫn với bệnh viêm phổi mắc phải ở cộng đồng19-21.

Nocardia và Actinomyces - Biểu hiện lâm sàng của nhiễm trùng do những sinh

vật này lại tương tự viêm phổi do các tác nhân nấm. Viêm phổi do Nocardia biểu hiện

phổ biến nhất trên phim X quang phổi như một thâm nhiễm khu trú phế nang thườngđồng nhất22

. Nhiễm trùng do Actinomyces có hình thức tương tự nhưng có xu hướng

lan rộng và xâm lấn thành ngực23.

Ký sinh trùng như giun đũa, giun kim, giun lươn, sán lá phổi, giun chỉ, sán chólà những tác nhân thường gặp tại vùng Đông Nam Á. Biểu hiện phổi đa dạng như ho,khó thở, khị khè, ho ra máu, suy hô hấp (hội chứng Loffler). Trên lâm sàng nghi ngờtổn thương phổi do nhiễm ký sinh trùng khi có bất thường ở phổi kèm xét nghiệmphân có ký sinh trùng và/hoặc bạch cầu ái toan trong máu tăng và/hoặc huyết thanhchẩn đốn dương tính kết hợp các yếu tố nguy cơ dịch tễ của nhiễm ký sinh trùng.

1.2.2.2. Tác nhân gây bệnh kháng thuốc

Sự hiện diện của mầm bệnh kháng thuốc là một cân nhắc quan trọng đối với bấtkỳ bệnh viêm phổi nào khơng đáp ứng thích hợp với liệu pháp kháng sinh. Mặc dù vi

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

khuẩn S.pneumoniae (phế cầu) kháng penicilin là sinh vật được quan tâm nhất, nhưngvi khuẩn H.influenzae và P.aeruginosa đa kháng thuốc cũng như S.aureus kháng

methicillin ngày càng được công nhận trong cộng đồng như là nguyên nhân có thể gâyra viêm phổi khơng thun giảm hoặc tái phát24.

1.2.2.3. Viêm phổi có biến chứng

Tràn mủ màng phổi là một biến chứng ít gặp của viêm phổi, với 1,3% viêmphổi được chẩn đốn có biến chứng tràn mủ25. Các bệnh nhân bị tràn mủ màng phổithường trẻ và có thể có tiền sử sử dụng ma túy bất hợp pháp.

Việc đánh giá khả năng có tràn mủ màng phổi hay khơng có thể thơng quanhiều phương tiện hình ảnh học, từ Xquang ngực, siêu âm ngực, đến chụp cắt lớp điệntoán lồng ngực. Ở một bệnh nhân bị viêm phổi kéo dài, việc nhận diện có bất kỳ lượngdịch màng phổi đáng kể nào cũng nên đánh giá vấn đề tràn mủ màng phổi cho đến khicó bằng chứng loại trừ.

Áp xe phổi - Vi khuẩn kỵ khí là hệ sinh vật chiếm ưu thế của đường hô hấp trênvà là tác nhân gây bệnh thường gặp trong viêm phổi hít và di chứng của nó: viêm phổi

hoại tử và áp xe phổi. Các tác nhân gây bệnh chính là Peptostreptococcus spp,

Bacteroides melaninogenicus và Fusobacterium nucleatum26. Những bệnh nhiễmtrùng này thường khởi phát và tiến triển tương đối chậm. Bệnh nhân thường có biểuhiện sốt, đổ mồ hôi ban đêm, sụt cân, ho, khó thở và khạc đờm có hoặc không kèmtheo viêm màng phổi. Các yếu tố tiên lượng làm tăng nghi ngờ hình thành áp xe baogồm nghiện rượu, co giật, vệ sinh răng miệng kém và hút dịch trước đó. Chụp X quangngực thường cho thấy tổn thương có mức khí dịch bên trong, nhưng CT ngực nhạyhơn và có thể xác định chẩn đốn trong những trường hợp khó. Hầu hết các bệnh nhânbị áp xe phổi đều xử trí tốt với điều trị bảo tồn và một đợt kháng sinh kéo dài. Tuynhiên, một số yếu tố có liên quan đến việc tăng tỉ lệ tử vong bệnh nhân và do vậy bệnhnhân cần được điều trị tích cực hơn. Chúng bao gồm các yếu tố liên quan đến tuổi tác(trẻ em hoặc người lớn tuổi), thời gian từ lúc khởi phát triệu chứng đến trước khi điềutrị, vị trí thùy dưới, liên quan đến bệnh ác tính và sự hiện diện của nhiều áp xe.

1.2.2.4. Cơ địa kí chủ

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Ở những bệnh nhân cơ địa tim bẩm sinh, bất thường đường thở, đái tháo đường,suy giảm miễn dịch,… cũng có thể gây ra tình trạng viêm phổi kéo dài. Trong tất cảcác yếu tố liên quan đến cơ địa bệnh nhi, bên cạnh tim bẩm sinh, viêm phổi hít do tràongược thường được đặc biệt quan tâm. Viêm phổi hít xảy ra khi hít dịch/nước bọt/thứcăn/dị vật từ vùng hầu họng hoặc đường tiêu hóa vào đường hơ hấp dưới. Đó có thể chỉlà tình trạng viêm mà khơng kèm nhiễm trùng gặp trong hít dịch dạ dày hoặc có nhiễmtrùng trong trường hợp hít dịch từ vùng hầu họng hoặc từ đường tiêu hóa. Tổn thươngphổi do hít mạn tính có thể gây ra biến chứng giãn phế quản, thậm chí ngay cả độ tuổinhũ nhi. Hai nhóm nguyên nhân thường gặp nhất gây ra hội chứng hít là rối loạn nuốtvà trào ngược dạ dày thực quản. Rối loạn nuốt có thể do bất thường giải phẫu như bấtthường sọ mặt, tắc nghẽn hơ hấp trên, rị khí thực quản hoặc do bất thường thần kinhcơ hoặc do rối loạn chức năng nuốt vô căn. Trào ngược dạ dày thực quản rất thườnggặp ở trẻ nhũ nhi (50-70%), đỉnh cao lá 4-6 tháng, cải thiện sau 12 tháng. Dù tràongược dạ dày thực quản có thể gây ra thở rít, ho kéo dài, viêm phổi tái phát, cơn tím,ngưng thở, nhưng vẫn phải loại trừ các bệnh lý khác trước khi kết luận triệu chứng hôhấp do trào ngược dạ dày thực quản.

AIDS - Mặc dù viêm phổi do Pneumocystis jirovecii (trước đây là P. carinii)

chưa được phát hiện vẫn là một cân nhắc chẩn đoán quan trọng ở bệnh nhân AIDS vàsố lượng CD4 < 200 tế bào/mm3, nhiễm trùng đường hô hấp dưới phổ biến nhất ởnhóm bệnh nhân này vẫn là viêm phổi do vi khuẩn, đặc biệt là phế cầu 27,28. Điều quantrọng là phải xem xét khả năng nhiễm HIV tiềm ẩn ở những bệnh nhân bị viêm phổikhông thuyên giảm hoặc đang tiến triển.

Suy giảm miễn dịch dịch thể nguyên phát - Điều quan trọng là phải xác địnhsuy giảm miễn dịch dịch thể ngun phát có hay khơng trên bệnh nhân có tình trạngviêm phổi vì điều trị bằng globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (IVIG) có khả năng cảithiện lâm sàng. Các tác nhân gây bệnh phổ biến nhất ở những bệnh nhân này bao gồm

S. pneumoniae và H. influenzae, trong khi đó M. pneumoniae và P. jirovecii ít phổ

biến hơn29.

1.2.2.5. Phối hợp những nguyên nhân không do nhiễm khuẩn khác

Nhiều căn nguyên khơng do nhiễm khuẩn có thể gây ra tình trạng viêm phổikéo dài. Những bệnh này thường thuộc các loại ung thư, bệnh tự miễn, do thuốc và

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

bệnh mạch máu. Một số nguyên nhân cũng có thể liên quan đến viêm phổi kéo dàithông qua các cơ chế sinh lý bệnh khác, chẳng hạn như tắc nghẽn nội phế quản do ungthư biểu mô phế quản30.

1.2.3 Tiếp cận một trường hợp viêm phổi kéo dài

Đánh giá bệnh nhân bị viêm phổi kéo dài thường xoay quanh vấn đề phân tíchhình ảnh học, phân tích vi sinh và bệnh học trong các nghiên cứu. Tuy vậy, để đánhgiá chẩn đoán thất bại điều trị trong bệnh viêm phổi được chính xác, bác sĩ lâm sàngcần bắt đầu bằng việc hỏi bệnh sử cẩn thận, khám lâm sàng và xem xét kĩ lại hồ sơbệnh án.

Trong trường hợp viêm phổi ổn định hoặc cải thiện chậm, đặc biệt khi có cácbệnh đi kèm hoặc các yếu tố vật chủ được biết là có thể làm chậm q trình giải quyếtbệnh viêm phổi, cần theo dõi cẩn thận khi có hoặc khơng điều trị trong bốn đến támtuần. Nếu khơng có cách giải quyết với những dữ kiện lâm sàng hiện tại hoặc bệnh tiếptục tiến triển, một phương pháp chẩn đốn tích cực hơn là cần thiết31,32.

Nếu cần đánh giá thêm, việc thực hiện các xét nghiệm cơ bản là cần thiết nhằmđịnh hướng tác nhân gây viêm phổi. Chụp cắt lớp vi tính lồng ngực (CT) để tìm kiếmcác khu vực nhiễm trùng bị cô lập hoặc các phát hiện gợi ý chẩn đốn thay thế31. Khiviêm phổi khơng khỏi hoặc khi có tiến triển lâm sàng, nên xem xét nội soi phế quản,

đặc biệt với một số tác nhân khó xác định bằng nuôi cấy vi sinh như Mycoplasma

pneumoniae32. Dù không nhiều, nhưng một số bệnh khơng được chẩn đốn dễ dànghoặc điển hình bằng nội soi phế quản bao gồm hội chứng viêm mạch phổi, viêm phổitổ chức do crypto và tổn thương phế nang lan tỏa. Khi phim X quang phổi xấu đi vàcác triệu chứng tiến triển kèm theo nội soi phế quản âm tính, có thể cần đánh giá thêmbằng nội soi lồng ngực hoặc sinh thiết phổi. Lưu đồ tiếp cận viêm phổi kéo dài cũngnhư chỉ định nội soi rửa phế quản phế nang là khác nhau giữa các trung tâm y tế, phụthuộc vào mức độ thành thạo vể mặt kĩ thuật, nhân lực cũng như trang thiết bị thựchiện33.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

1.3 PHƯƠNG PHÁP RỬA PHẾ QUẢN PHẾ NANG

1.3.1 Lịch sử về sự áp dụng của dịch rửa phế quản trong chẩn đoán bệnh vànghiên cứu

Bác sĩ Jackson đã lần đầu tiên giới thiệu về ống nội soi phế quản cứng vào năm1904. Kể từ đó, rửa phế quản phế nang đã trở thành một công cụ ngày càng quan trọngtrong việc chẩn đoán, điều trị các bệnh thuộc đường hô hấp. Ban đầu, rửa phế quảnphế nang được sử dụng như một phương pháp điều trị giúp lấy dịch đàm mủ ở nhữngbệnh nhân mắc các bệnh như xơ nang phổi, viêm phổi vi khuẩn 34. Phương pháp đượcthực hiện bằng cách bơm vào lòng phế nang một lượng lớn nước muối sinh lý (từ 15đến 30 lít) và hút nước ra một cách liên tục từ 2 đến 3 giờ đồng hồ để làm sạch phổi 35

.Khoảng những năm thập niên 1960, các nhà khoa học giới thiệu phương pháprửa phế quản phế nang với một lượng thể tích nhỏ (khoảng 300ml nước muối vô trùng)nhằm phục vụ cho nghiên cứu và chẩn đoán bệnh. Khi tiến hành thử nghiệm trênnhững người tình nguyện khỏe mạnh, phương pháp trên đã chứng tỏ được tính an tồn,chi phí hợp lý mà vẫn cung cấp nhiều thông tin về các thành phần tế bào của dịch phếquản phế nang bình thường (BALF)36,37. Do vậy, từ những năm 1970, các báo cáo chothấy sự phát triển trong việc triển khai phương pháp rửa phế quản phế nang trong thựchành lâm sàng, thể hiện qua sự gia tăng các ấn phẩm xuất bản khoa học về phươngpháp rửa phế quản phế nang (gấp 40 lần) trong giai đoạn 1970-1990 38. Phương pháprửa phế quản phế nang tiếp tục phát triển, không chỉ giới hạn ở người lớn mà còn đượcthực hiện ở trẻ em. Đến năm 1996, Hiệp hội Hô hấp Châu Âu đã lần đầu tiên đưa ranhững hướng dẫn cùng các khuyến nghị nhằm chuẩn hóa thực hành lâm sàng khi thựchiện rửa phế quản phế nang ở trẻ em39.

1.3.2 Các tiêu chuẩn về kĩ thuật của phương pháp rửa phế quản ở trẻ em

1.3.2.1. Dụng cụ

Ở trẻ em ngoài giai đoạn sơ sinh, rửa phế quản phế nang thường được thực hiệnqua ống soi phế quản mềm với đường kính ngồi 2.8 - 5mm. Bệnh nhân > 9 tuổithường dùng ống nội soi mềm với đường kính lớn hơn. Ở bệnh nhân đặt nội khí quản,rửa phế quản phế nang được thực hiện sau khi đưa ống nội soi mềm qua ống nội khíquản bằng cách sử dụng khớp xoay dạng chữ Y cho phép thơng khí cơ học trong lúcsoi40. Với những bệnh nhân ở độ tuổi sơ sinh, do ống nội soi nhỏ nhất có đường kính

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

ngồi 2mm khơng có khả năng hút dịch hiệu quả, việc thực hiện lấy dịch phế quản phếnang để xét nghiệm thơng thường chỉ có thể thực hiện ở những trẻ được đặt nội khíquản, cịn được gọi là phương pháp lấy dịch rửa phế quản phế nang không qua nội soi.

1.3.2.2. Thuốc an thần

Trong khi rửa phế quản phế nang có thể được thực hiện dưới gây mê toàn thân,phần lớn bệnh nhân được được dùng an thần và gây tê tại chỗ trong các trường hợp nộisoi phế quản ống mềm ở trẻ em. Ở trẻ em, dùng an thần đường tĩnh mạch thường đượcưu tiên. Thuốc thường được sử dụng là meperidine kết hợp với diazepam, meperidinevới midazolam, hoặc fentanyl với midazolam, propofol, hoặc remfentanyl. Mục đích làđạt được đủ an thần và thời gian an thần vừa đủ để thực hiện thủ thuật32

. Tuy vậy, việcsử dụng propofol cần có sự giám sát của bác sĩ gây mê vì những thuốc trên có thể gâyngưng thở trong quá trình khởi mê.

Nhiều trung tâm cũng sử dụng atropine trước thủ thuật vì nó giúp giảm thiểunguy cơ nhịp tim chậm gây ra bởi việc kích thích vasovagal cùng với nguy cơ giảm bàitiết dịch tiết đường thở khi gây mê. Một nghiên cứu ở đối tượng là người trưởng thànhcho thấy rằng việc dùng atropine trước thủ thuật sẽ thuận lợi hơn cho việc thu lại dịchrửa phế quản phế nang39, tuy vậy chưa nhiều bằng chứng nghiên cứu về tác độngatropin trên trẻ em. Gây tê đường thở tại chỗ hiệu quả đạt được với xịt lidocaine 4% ởđường hô hấp trên và lidocaine 2% ở đường hô hấp dưới, với tổng liều lidocaine đượcgiới hạn ở mức tối đa là 7 mg/kg41.

1.3.2.3. Vùng khảo sát

Thông thường, rửa phế quản phế nang thường tập trung vào vùng phổi bị tổnthương. đối với bệnh phổi có tổn thương lan tỏa, trên lâm sàng, thùy giữa phổi phải lànơi thường được tập trung nhiều hơn do dễ hút lại dịch so với những vùng khác42. Ở sơsinh, việc thực hiện rửa phế quản phế nang có vẻ dễ dàng hơn ở thùy dưới phổi phải.Trong trường hợp sinh thiết xuyên thành phế quản và rửa dịch phế quản phế nangđược thực hiện cùng lúc trên bệnh nhân, rửa phế quản phế nang nên được thực hiệntrước.

1.3.2.4. Dung dịch dùng trong việc thực hiện thủ thuật

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

Rửa phế quản phế nang được thực hiện bằng cách sử dụng nước muối vơ trùngthơng thường đã được làm ấm trước đó đến nhiệt độ cơ thể (37 độ C)43. Hiện chưa cóthực hành chuẩn về lượng dịch và số lượng mẫu cần được sử dụng để lấy mẫu đại diệncho khoang phế nang ở trẻ em ở các độ tuổi và kích thước khác nhau. Nhiều cách thứcthực hiện khác nhau do vậy đã được áp dụng. Một số sử dụng cùng một thể tích (10 -20 mL) chia làm 2 hay 4 lần rửa, bất kể trọng lượng cơ thể và tuổi của bệnh nhân, nhưở người lớn44,45

. Những người khác điều chỉnh thể tích rửa phế quản phế nang theodung tích cặn chức năng của trẻ (FRC) với 5 - 20 mL với phân số tùy thuộc vào kíchthước của bệnh nhân46

. Những người khác điều chỉnh thể tích rửa phế quản phế nangtheo trọng lượng cơ thể bằng cách sử dụng 3 ml/kg nước muối sinh lý được chia thànhba phần bằng nhau ở trẻ em cân nặng < 20 kg và 20 mL ở trẻ em nặng > 20 kg47,48.Dịch rửa phế quản sau đó được thu hồi bằng cách hút tay bằng ống tiêm hoặc bằngcách hút cơ học vào bẫy hút với áp suất 3,33 ± 13,3 kPa (25 ± 100 mmHg).

Khi tiến hành thu dịch bệnh phẩm, phần mẫu đầu tiên được thu thập, có nguồngốc từ phế quản nhiều hơn, sẽ được sử dụng để nuôi cấy; hai phần còn lại được tổnghợp lại và gửi cho các nghiên cứu tế bào học và phân tích các chất hòa tan, bao gồmprotein và các chất trung gian gây viêm. Rửa phế quản phế nang thể tích nhỏ mặc dùchỉ có được thơng tin tế bào học, sinh hóa, vi sinh từ vị trí gần vùng khảo sát nhưngvới một thể tích lớn hơn được chia ra làm nhiều lần bơm rửa có thể thu được các mẫutế bào từ các vị trí xa hơn. Nói chung, rửa phế quản phế nang có thể được coi là chấpnhận được về mặt kỹ thuật nếu thu lại được trên 40% dịch rửa và dịch rửa (ngoại trừmẫu đầu tiên) chứa ít tế bào biểu mô. Tuy nhiên, khả năng lấy dịch lại có thể thấp hơnở trẻ em bị bệnh phổi tắc nghẽn39,49

1.3.2.5. An toàn thủ thuật

Bệnh nhân nên được theo dõi thường quy bằng phương pháp đo SpO2 liên tục,sử dụng máy đo oxy xung được hiệu chỉnh tốt, và điện tâm đồ với kiểm tra huyết ápngắt quãng. Việc theo dõi được tiếp tục cho đến khi bệnh nhân đạt được trạng thái ýthức đã định trước. Rửa phế quản phế nang phải được thực hiện trong một cơ sở đượctrang bị đầy đủ. Mỗi đứa trẻ phải chuẩn bị một đường truyền tĩnh mạch, nguồn oxy,thiết bị hồi sức và thuốc đối kháng với thuốc an thần (naloxone và flumazenil) để sẵnsàng hồi sức khi cần. Quy trình làm sạch và khử trùng thích hợp là bắt buộc để ngăn

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

ngừa lây nhiễm chéo từ bệnh nhân này sang bệnh nhân khác hoặc sự lây nhiễm từ xa,và bất kỳ giải thích sai lầm nào về kết quả phịng thí nghiệm39.

1.3.2.6. Biến chứng

Rửa phế quản phế nang làm tăng thời gian của thủ thuật nội soi lên 2 - 5 phút,làm tăng nguy cơ tăng CO2 và / hoặc giảm oxy máu50. Tuy vậy rửa phế quản phế nangcó thể được thực hiện một cách an toàn ở hầu hết các bệnh nhân thở máy nặng với cácthông số huyết động và thơng khí ổn định51. Về lý thuyết, nguy cơ chảy máu niêm mạccao hơn ở trẻ mắc chứng rối loạn đông máu. Tuy nhiên, rửa phế quản phế nang đãđược thực hiện mà khơng có biến chứng ở những bệnh nhân có < 20 K/uL52

. Một sốbệnh nhân bị sốt và thâm nhiễm phổi thoáng qua vài giờ sau BAL. Trong một sốtrường hợp hiếm hoi, điều này có thể liên quan đến nhiễm trùng lây lan thứ phát saurửa phế quản phế nang. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, cơn sốt chỉ thoángqua và nguồn gốc của nó vẫn cịn ít người biết đến53.

1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ VAI TRÒ CỦA PHƯƠNGPHÁP PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ VIÊM PHỔI Ở TRẺ EM1.4.1. Tổng quan về phương pháp PCR

Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)là một kỹ thuật khuếch đại axit nucleic trong phòng thí nghiệm được sử dụng để biếntính và tái tạo các đoạn ngắn của chuỗi axit deoxyribonucleic (DNA) hoặc axitribonucleic (RNA) bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase I, một chủng phân lậptừ Thermus Aquas, được gọi là Taq DNA. Năm 1985, PCR được Mullis cùng cộng sựgiới thiệu và nhóm nghiên cứu đã nhận được giải thưởng Nobel với phát minh trên54.Phương pháp trên là một công cụ tuyệt vời ứng dụng những công nghệ sinh học phântử trong việc kiểm tra và phát hiện các thành phần khuếch đại của DNA dị nguyên.

Quy trình phản ứng chuỗi polymerase bắt đầu bằng việc thu thập một mẫuDNA nhỏ vào ống nghiệm. PCR bao gồm ba giai đoạn chính: biến tính, giai đoạn mồivà khuếch đại55. Trong giai đoạn biến tính, DNA được làm nóng đến 95 độ C (C) đểphân tách các liên kết hydro giữa các cặp bazơ bổ sung của chuỗi kép DNA55. Ngaysau khi biến tính, quá trình mồi diễn ra; giai đoạn liên quan đến việc làm mát DNA bịbiến tính ở nhiệt độ từ 37-72 C cho phép các liên kết hydro được hình thành. Nhiệt độ

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

tối ưu khi thực hiện phương pháp được xác định dựa trên tính chất vật lý và hóa họccủa đoạn mồi sử dụng trong dung dịch. Đoạn mồi thường có chiều dài 20-25nucleotide. Quá trình mồi cho phép các đoạn mồi liên kết với chuỗi DNA đơn tại cácvị trí bổ sung tương ứng của chúng, bắt đầu từ đầu 3' của mẫu DNA. Sau đó, sự liênkết của các đoạn mồi với vị trí bổ sung của chúng trên chuỗi DNA đơn sẽ tạo ra haiphân tử chuỗi kép. Cuối cùng, nhiệt độ phản ứng tối ưu, 75-80 C, phù hợp nhất choquá trình sao chép DNA do enzyme tạo ra, được chọn để đảm bảo hoạt động của DNApolymerase. Để bắt đầu chức năng của DNA polymerase, việc ghép chuỗi kép DNA làbắt buộc để xảy ra quá trình sao chép. Sau đó, DNA polymerase tổng hợp DNA theohướng 3’ đến 5’ tạo ra các chuỗi giống hệt với chuỗi mẫu. Quy trình này được lặp lạinhiều lần thơng qua máy luân nhiệt. Máy luân nhiệt là một thiết bị kiểm soát thời gianvà nhiệt độ của từng chu trình và các bước tương ứng. Điều này cuối cùng dẫn đếnmột số DNA nhân đơi có sẵn trong ống. Sau 30-40 chu kỳ, các chu kỳ lặp đi lặp lạicuối cùng sẽ giảm dần do khả năng hạn chế của thuốc thử cũng như các yếu tố khácnhư sự tích tụ các phân tử pyrophosphate và sự hiện diện của chất ức chế PCR trongmẫu. Có một số chất ức chế có thể ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của PCR.Các chất ức chế PCR phổ biến nhất là proteinase K, phenol,Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)55.

Proteinase K có xu hướng phá vỡ Taq polymerase. Các chất khác có thể tácđộng tiêu cực đến xét nghiệm PCR là chất tẩy rửa ion, heparin, tinh trùng và huyết sắctố. Ngoài ra, thuốc nhuộm bromophenol và xylene cyanol có thể gây ra các sai sóttrong kết quả. Để khắc phục những vấn đề này, các mẫu DNA có thể được làm sạchbằng phương pháp lọc và kết tủa bằng ethanol. Một số cách khác để làm sạch mẫuDNA bao gồm sử dụng chloroform cho mục đích chiết xuất và sắc ký55.

Sau các bước trên, mẫu kết quả sau khi được khuếch đại sẽ được đưa vào quátrình điện di trên gel agarose bằng ethidium bromide. Sau đó, gel được đánh giá dướiánh sáng cực tím. Một bước bắt buộc trong thành phần này của quy trình u cầu kiểmtra tính đặc hiệu của kết quả thông qua việc chuyển sang bộ lọc và triển khai đầu dòchẳng hạn như Southern blot để lai. Cuối cùng, nó loại bỏ các đoạn mồi đã khuếchđại55.

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Có nhiều lợi ích khác nhau khi sử dụng PCR trong khoa học cơ bản và y sinh.Trong những năm qua, phương pháp PCR đã trở nên phổ biến và trở thành tiêu chuẩnvàng trong một số chẩn đoán lâm sàng. Những lý do cho sự phát triển đó bao gồm:

- Thứ nhất, PCR được biết đến với khả năng tạo ra kết quả nhanh chóng và tiếtkiệm thời gian; quy trình PCR thường cần vài giờ đến 3 ngày để có kết quả.

- Chỉ cần một mẫu nhỏ DNA hoặc RNA (0,1- 5 mcg) để thực hiện phản ứngnày.

- PCR cũng có khả năng khuếch đại 106 đến 109 bản sao DNA trong mộtkhoảng thời gian ngắn.

Với những tiềm năng trên, phương pháp PCR truyền thống tiếp tục được pháttriển thành hai phương thức PCR hiện dùng hiện nay.

1.4.1.1. Real time PCR

Phương pháp real time PCR là một phương pháp thay thế để kiểm tra các đoạnDNA nhỏ thông qua việc rút ngắn thời gian của chu kỳ, loại bỏ các bước xử lý quytrình sau PCR, thực hiện nhãn phát huỳnh quang cũng như phát hiện lượng phát thảihiệu quả. Sự khác biệt nổi bật nhất giữa real time PCR và PCR thông thường nằm ởkhả năng phát hiện nhanh các phân tử khuếch đại. Tuy nhiên, nhược điểm của phươngpháp trên so với phương pháp PCR thơng thường là nó địi hỏi phải mở hệ thống đểtheo dõi quá trình khuếch đại. Ngồi ra, có một số hóa chất phát huỳnh quang có thểkhơng tương thích với nền tảng real time PCR (chủ yếu là do sự khơng tương thích củaphần cứng và khả năng tiếp cận của thuốc nhuộm fluorogen). Cuối cùng, giá thành củareal time PCR là đắt hơn so với PCR thông thường55.

1.4.1.2. Phương pháp phiên mã ngược (Reverse Transcriptase-PCR)

Phản ứng chuỗi sao chép ngược-polymerase ngược (RT-PCR) là một quy trìnhsử dụng mRNA để khuếch đại DNA thơng qua DNA polymerase. PCR thông thườngvà phương pháp PCR phiên mã ngược có thể được sử dụng kết hợp để nghiên cứu cácbiểu hiện gen cụ thể. Cho đến nay, real time PCR và PCR phiên mã ngược được sửdụng đồng thời để đánh giá sự khác biệt về số lượng trong biểu hiện gen giữa các mẫukhác nhau. Trong đại dịch COVID-19, PCR phiên mã ngược là công cụ chẩn đốn

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

chính do có độ nhạy, độ đặc hiệu và tốc độ nhanh. Các mẫu SARS-CoV-2 thườngđược lấy từ nhiều vị trí khác nhau ở đường hơ hấp trên56.

1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phương pháp PCR

Phương pháp PCR bên cạnh ưu điểm vượt trội so với phương pháp cấy vi sinhtruyền thống cũng tồn tại một vài nhược điểm riêng. Thứ nhất, phương pháp này có độnhạy cao nên khi có sự tạp nhiễm xảy ra dù là rất nhỏ, kết quả mang lại có thể làkhơng chính xác. Đây cũng là thử thách lớn nhất của phương pháp trên trong việc ứngdụng vào thực hành lâm sàng chẩn đốn và điều trị bệnh. Bên cạnh đó, đoạn mồi đượcthiết kế cho PCR địi hỏi trình tự để phát hiện các mầm bệnh và gen cụ thể, do đó chấtlượng đoạn mồi sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả xét nghiệm. Sự xuất hiện quá nhiềucác đoạn DNA ngoại lai tương tự các gen mục tiêu trong q trình mồi mà đoạn mồikhơng phân biệt được là một yếu tố gây nhiễu thứ hai của phương pháp trên. Ngoài ra,việc xử lý đoạn mồi (ngoại trừ phương pháp real time PCR) nếu không được thực hiệntốt sẽ dẫn đến sự cạnh tranh với thuốc thử PCR, là một yếu tố gây nhiễu thứ ba55.

1.4.3. Kiểm soát vấn đề tạp nhiễm của quá trình thực hiện PCR

Tạp nhiễm là vấn đề quan trọng nhất trong quá trình thực hiện PCR. Để ngănchặn vấn đề tạp nhiễm, điều quan trọng là phải có một khu vực được chỉ định trongphịng thí nghiệm dành riêng cho xét nghiệm PCR để hạn chế sự hỗn loạn không cầnthiết trong khu vực. Nhân viên trong phịng xét nghiệm phải ln đeo khẩu trang, găngtay và mũ trùm đầu trong phịng thí nghiệm để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn. Việc chuẩnbị và bảo quản dung dịch trong các thiết bị như pipet, dụng cụ thủy tinh và đồ nhựakhông được bị nhiễm bẩn hoặc tiếp xúc với dịch bệnh phẩm trước đó. Một phần cụ thểtrong tủ đơng, gần tủ hút dịng chảy tầng nhất, phải chứa enzym và chất đệm. Việc sửdụng bất kỳ thuốc thử nào phải được loại bỏ ngay lập tức. Tủ hút dịng chảy tầng cóđèn cực tím (UV) là vị trí lý tưởng trong phịng thí nghiệm để thực hiện PCR. Cácthiết bị như pipet, găng tay vô trùng và máy ly tâm siêu nhỏ phải có trong tủ hút dịngchảy tầng. Pipet tự động được biết là có thể gây ơ nhiễm, do đó, nên sử dụng pipetdịch chuyển dương để xử lý thuốc thử đúng cách. Không nên hấp bất kỳ thiết bị dùngmột lần nào trong phịng thí nghiệm như đầu tip và ống pipet trước khi sử dụng. Ngoàira, thiết bị dùng một lần nên được sử dụng trực tiếp từ bao bì tương ứng của nó. Trướckhi sử dụng các ống máy ly tâm siêu nhỏ bao gồm các thuốc thử dành riêng cho PCR,

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

cần phải ly tâm trong khoảng 10 giây để chất lỏng lắng xuống đáy ống, ngăn ngừa xảyra ô nhiễm. Cuối cùng, kỹ thuật hậu khuếch đại phải được hồn thành tại bàn thínghiệm thay vì khu vực được chỉ định để xét nghiệm PCR.

1.4.4. Vai trò của phương pháp PCR trong việc chẩn đốn tác nhân viêm phổi

PCR là một cơng cụ tiềm năng để chẩn đoán nguyên nhân gây viêm phổi, bởi vìphương pháp trên có thể phát hiện lượng nhỏ axit nucleic từ tất cả các mầm bệnh viêmphổi, không phụ thuộc vào khả năng sống sót của vi khuẩn mục tiêu, ít bị ảnh hưởngbởi liệu pháp kháng sinh điều trị trước đó hơn so với ni cấy- dựa trên phương phápcũng như cung cấp kết quả một cách nhanh chóng. Trang thiết bị y tế cũng như nguồnlực y tế không ngừng phát triển khiến cho phương pháp PCR ngày càng trở nên sẵn cóở các phịng xét nghiệm vi sinh. Những tiềm năng trên khiến PCR có thể trở thànhphương pháp xét nghiệm chẩn đoán lý tưởng cho bệnh viêm phổi, mặc dù còn nhiềunhược điểm khi dựa vào các phương pháp tiếp cận phân tử thay vì ni cấy. Nhữngnhược điểm như vậy bao gồm khả năng hạn chế trong việc thực hiện xét nghiệm độnhạy cảm với thuốc kháng sinh, thiếu kho lưu trữ phân lập nếu cần thử nghiệm trongtương lai cũng như vấn đề tạp nhiễm trong kết quả vi sinh. Dù vậy, xét nghiệm PCR từmột xét nghiệm chưa được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ(FDA) phê duyệt để chẩn đoán bệnh lý viêm phổi vào những năm 2000 đã dần trởthành một trong những công cụ đắc lực trong thực hành lâm sàng, thậm chí là tiêuchuẩn vàng trong chẩn đoán một số tác nhân gây bệnh56. Tuy vậy, do khả năng tạpnhiễm cao của dịch bệnh phẩm đàm hô hấp, sự khác biệt về nguy cơ và tỉ lệ tạp nhiễmcủa từng phương pháp thu thập dịch bệnh phẩm đàm (phương pháp NTA, phươngpháp ETA, phương pháp rửa phế quản) là khác nhau, khả năng sai sót kết quả cao nếutạp nhiễm xảy ra của phương pháp PCR, dù có rất nhiều nghiên cứu thực hiện PCRđàm trên bệnh nhân viêm phổi, hiện vẫn chưa có một đồng thuận thống nhất nào về chỉđịnh thực hiện PCR đàm. Trong thực hành lâm sàng, ở bệnh nhân viêm phổi kéo dài,PCR đàm thường được thực hiện ở những bệnh nhân viêm phổi kéo dài hay tái phátkém đáp ứng điều trị mà kết quả cấy vi sinh âm tính. Tuy nhiên do tính nhạy cảm vớiviệc tạp nhiễm, các nghiên cứu về phương pháp PCR dịch đàm hầu hết đều dưới mẫubệnh phẩm là dịch rửa phế quản, được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc đánh giá tácnhân nhiễm trùng gây viêm phổi57-59.

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

1.5. CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN PCR DỊCH RỬA PHẾ QUẢN PHẾNANG TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM PHỔI VÀ VIÊM PHỔI KÉO DÀI

Việc chẩn đoán được tác nhân vi sinh trong viêm phổi kéo dài luôn là một thửthách. Phương pháp xét nghiệm dịch rửa phế quản trên y văn đã được chứng minh làđáng tin cậy trong việc định danh tác nhân nhiễm trùng tại phổi, đặc biệt ở nhóm trẻ bịsuy giảm miễn dịch 53,57-59. Bảng 1.2 tóm tắt các kỹ thuật thường dùng để phát hiện cáctác nhân vi sinh.

Bảng 1.2. Định danh tác nhân vi sinh trên dịch rửa phế nang

Tác nhân vi sinh Phương pháp định danh thường dùng

Vi khuẩn chung Nhuộm gram, cấy vi sinh

Chlamydia PCR, cấy, phương pháp sinh học phân tửNấm chung Phương pháp Gomori-Grocott

Pneumocystis carinii Phương pháp nhuộm xanh Toluidine, nhuộm

Wright-Giemsa, PCR

Nấm khác Phương pháp Gomori-Grocott, nhuộm gram, PCR, cấyTác nhân khác

Legionella Phương pháp Gomori-Grocott, nhuộm gram, PCR, cấy

Mycobacteria Nhuộm Ziehl-Neelsen, cấy, sinh học phân tử

Mycoplasma Phương pháp Gomori-Grocott, nhuộm gram, PCR, cấy

CMV, HSV PCR, cấyOther virus PCR, cấy

Theo nghiên cứu của tác giả Tsai năm 2017 trên 90 mẫu cấy dịch rửa phế quảnphế nang ở trẻ em ghi nhận việc cấy định danh được tác nhân vi trùng góp phần thayđổi điều trị kháng sinh trên 55% trường hợp, với tỉ lệ các vi khuẩn ghi nhận được lần

lượt là Streptococus viridians (11%), Pseudomonas aeruginosa (10%), Staphylococcus

aureus (6,7%), Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia, Enterobacteraerogenes (3,3%), Moraxella catarrhalis, Escherichia coli, Enterobacter cloacae,Streptococuss pneumoniae Haemophilus parainfluenza, Neisseria spp (2%). Việc cấy

định danh là một trong những phương pháp truyền thống dùng để xác nhận tác nhân visinh trong dịch rửa phế quản phế nang. Tuy vậy, việc ni cấy vi khuẩn định tính dịchrửa phế quản có thể cho kết quả không thật sự đáng tin cậy, vì có khả năng ngoại

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

nhiễm từ việc hút đàm vùng hầu họng của ống soi. Nuôi cấy định lượng vi khuẩn,cũng như những phương pháp như xét nghiệm riêng dịch rửa phế quản vùng bị tổnthương và vùng không bị tổn thương đã được đề xuất như một cách để phân biệt giữatác nhân gây viêm phổi thật sự hay là tác nhân ngoại nhiễm47. Một phương pháp nhúngslide bán định lượng đã được báo cáo là đáng tin cậy trong việc đo lường sự phát triểncủa vi khuẩn60. Tuy vậy, nhiều tác nhân vi sinh rất khó phát hiện bằng các phươngpháp truyền thống như soi nhuộm cấy vì nhiều lý do khác nhau, bao gồm cả việc nuôicấy chậm phát triển. Do đó, phương pháp PCR hiện nay ngày càng được sử dụngnhiều hơn, với những ưu thế vượt trội như định danh tác nhân nhanh chóng, định danhđược các tác nhân ni cấy khó phục vụ cho việc chẩn đốn và điều trị bệnh57-59

. Tuyvậy, nhươc điểm cũng lộ ra là độ nhạy cao của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) cóthể dẫn đến kết quả dương tính giả và phát hiện các sinh vật ngoại nhiễm57-59.

Tác giả Baudel năm 2014 trong một nghiên cứu đánh giá công dụng PCR trongdịch rửa phế quản đã thực hiện khảo sát trên 53 bệnh nhân. Kết quả cho thấy tỉ lệ ghinhận tác nhân dương tính của phương pháp cấy dịch rửa phế quản thông thường chỉkhoảng 40%, trong khi tỉ lệ trên với phương pháp PCR lên đến 66%. Khi việc tìm trựctiếp tác nhân vi sinh (direct examination) trong dịch xét nghiệm âm tính thì sự khácbiệt trên thậm chí cịn ấn tượng hơn (27% so với 63%, p = 0,007)59. Điều đó chứng tỏđộ nhạy của PCR trong việc định danh tác nhân vi khuẩn, đặc biệt là những vi khuẩnkhó ni cấy. Tuy nhiên, đánh giá tạp nhiễm trong nghiên cứu không được thực hiệnvà do vậy, bỏ ngỏ một câu hỏi rằng có khả năng tỉ lệ định danh vi khuẩn ấn tượng trênchưa hẳn sẽ giúp định hướng điều trị chính xác trên lâm sàng.

Tương tự năm 2019, Tschiedel cùng các cộng sự thực hiện thủ thực rửa phếquản trên 70 trẻ viêm phổi kéo dài, sau đó đem dịch rửa đi nuôi cấy và xét nghiệmPCR. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ ngoại nhiễm khi áp dụng phương pháp PCR cóthể lên đến 40%, tỉ lệ xác định tác nhân là 67% với phương pháp PCR và 26% vớiphương pháp cấy, nâng tổng số tỉ lệ định danh tác nhân vi khuẩn bằng dịch rửa phếquản lên 76%58. Tần suất phổ biến của tác nhân thường gặp cũng thay đổi (S.aureus,

S.pneumoniae, A.fumigatus, H.influenzae) so với báo cáo trước đó của tác giả Tsai

năm 2017 khi chỉ áp dụng duy nhất kĩ thuật cấy vi sinh57,58. Sự khác biệt có thể đượcgiải thích do sự khác biệt về đặc điểm hệ vi sinh gây bệnh của hai cơ sở y tế, tuy nhiên

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

không thể không nhắc đến ưu thế của việc định danh nhanh các tác nhân khó ni cấyđồng thời phải xem xét kết quả PCR một cách cẩn trọng để tránh nguy cơ tạp nhiễm.Việc định nghĩa tạp nhiễm trong nghiên cứu của tác giả Tschiedel khá mơ hồ khi chỉmơ tả các trường hợp bệnh đó không phù hợp lâm sàng. Một trong những lý do có thểkhiến cho tỉ lệ tạp nhiễm khá cao trong các báo cáo có thể là do chưa có quy trình thựchành chuẩn cùng những tiêu chuẩn kĩ thuật cho riêng việc lấy mẫu dịch rửa phế quảnphế nang ở những bệnh nhân viêm phổi. Nghiên cứu về việc chuẩn hóa quy trình hiệnvẫn đang được tiến hành thực hiện bởi tiến sĩ Wu Jianfeng thuộc Đại học Sun Yat-sen,đăng kí trên thử nghiệm lâm sàng với mã định danh NCT04200742 từ năm 2019. Vấnđề làm rõ việc phát hiện tác nhân và định hướng đúng tác nhân do vậy vẫn cịn là câuhỏi chưa có lời đáp, dù rằng đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới đánh giá công dụngcủa PCR trong khảo sát dịch rửa phế quản ở bệnh nhân viêm phổi kéo dài.

Tại Việt Nam, hiện có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc áp dụng phươngpháp rửa phế quản phế nang để chẩn đoán các bệnh lý về phổi. Năm 2018, tác giả TrầnQuỳnh Hương trên tạp chí Y học Thành Phố Hồ Chí Minh đã bước đầu khái quát đặcđiểm của dịch rửa phế quản phế nang cũng như các ứng dụng tiềm năng của nó trongchẩn đốn và điều trị bệnh ở trẻ em61. Năm 2020, tác giả Hoàng Hà cùng cộng sự tiếnhành nghiên cứu hiệu quả chẩn đoán tác nhân lao ở các cá thể AFB âm tính thơng quadịch phế quản lấy qua nội soi và chứng minh tính ứng dụng của phương pháp trên làkhả thi 62. Tuy vậy, hiện chưa có nghiên cứu nào tập trung vào đánh giá ứng dụng củakĩ thuật PCR dịch rửa phế quản trong bệnh lý viêm phổi kéo dài tại Việt Nam. Bêncạnh đó, vấn đề mức độ hiệu quả trong việc can thiệp điều trị theo tác nhân PCR dịchrửa phế quản vẫn chưa được làm sáng tỏ, kể cả trên y văn thế giới lẫn y văn Việt Nam.

Vì những lý do trên, chúng tôi quyết định thực hiện nghiên cứu “Khảo sát tác nhân

gây viêm phổi kéo dài ở trẻ em tại bệnh viện Nhi đồng Thành Phố bằng kỹ thuật realtime PCR dịch rửa phế quản phế nang từ tháng 10/2022 đến tháng 7/2023”

</div>