(Luận án tiến sĩ) Nghiên Cứu Xây Dựng Phương Pháp Phân Tích Một Số Vi Rút Có Nguy Cơ Cao Trong Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ Và Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.54 MB, 203 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O

<b>ắI HõC BCH KHOA H NịI </b>

NGọI HõNG DN KHOA HàC: 1. TS. Lê Quang Hòa

2. PGS. TS. Tr°¡ng Tuyết Mai

Hà Nái - 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>LàI CAM ĐOAN </b>

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cāu cÿa riêng tơi d°ãi sự h°ãng

trong luận án là trung thực và ch°a từng đ°ÿc các tác giÁ khác công bá.

<i>Hà Nội, ngày tháng năm </i>

<b>TS. Lê Quang Hịa PGS.TS.Tr°¢ng Tuy¿t Mai </b>

<b>Nghiên cąu sinh </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>LàI CÀM ¡N </b>

Từ năm 2005 đến nay, trong những năm hác Đ¿i hác, làm luận văn Th¿c sĩ và luận án Tiến sĩ t¿i Đ¿i hác Bách khoa Hà Nái thân yêu, tôi đã thu nhận đ°ÿc rÃt nhiều kiến thāc quý báu về lý thuyết cũng nh° thực hành nghiên cāu thuác lĩnh vực công nghệ Sinh hác – công nghệ Thực ph¿m. Tôi vô cùng biết ¡n các Thầy

tôi về mái mặt.

Hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tß lịng biết ¡n sâu sắc tãi TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS Tr°¡ng Tuyết Mai đã tận tình h°ãng dÁn, chỉ bÁo, dành nhiều thåi gian trao đổi, đßnh h°ãng trong q trình thực hiện đề tài nghiên cāu cũng nh° viết Luận án. Xin chân thành cÁm ¡n các Thầy Cô, các cán bá cÿa Trung tâm nghiên cāu và phát triển Công nghệ sinh hác, Ban lãnh đ¿o Tr°ång Hóa và Khoa hác sự sáng đã nhiệt tình giúp đỡ, t¿o mái điều kiện thuận lÿi trong quá trình thực hiện và báo Luận án.

Tôi xin chân thành cÁm ¡n Ban Giám đác Viện Dinh d°ỡng, lãnh đ¿o và các đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực ph¿m và Sinh hác phân tử đã t¿o điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành cơng việc chun mơn đ°ÿc phân công.

Låi cÁm ¡n sâu sắc xin gửi tãi Gia đình, B¿n bè ln chia sẻ khó khăn, đáng viên khích lệ tụi vt qua mỏi trỗ ngi hon thnh nhim vā nghiên cāu và hác tập!

Hà Nái ngày tháng năm 20 Nghiên cāu sinh

Phan Thß Thanh Hà

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

1. Tính cÃp thiết cÿa đề tài ... 1

2. Māc tiêu nghiên cāu ... 2

3. Nái dung nghiên cāu ... 2

4. Ý nghĩa khoa hác và thực tiễn cÿa đề tài ... 4

5. Tính mãi cÿa đề tài ... 4

1.1. Tình hình sÁn xuÃt, tiêu thā nhuyễn thể hai mÁnh vß và thách thāc về an tồn thực ph¿m ... 5

1.1.1. Tình hình sÁn xuÃt và tiêu thā nhuyễn thể hai mÁnh vß ... 5

1.1.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong nhuyễn thể hai mÁnh vß ... 6

1.2. Đặc điểm sinh hác các vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong nhuyễn thể hai mÁnh vß ... 8

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

1.5.1. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) ... 28

1.5.2. Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) ... 29

1.6. Ph°¡ng pháp xác đßnh kiểu gen vi rút ... 30

1.7. Tình hình nghiên cāu sự l°u hành các kiểu gen cÿa NoV, HAV, HEV, HAstV trên thế giãi và t¿i Việt Nam ... 31

1.7.1. Tình hình nghiên cāu trên thế giãi ... 31

1.7.2. Tình hình nghiên cāu t¿i Việt Nam ... 35

<b>2. VÀT LIäU VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU ... 38 </b>

2.1. Vật liệu nghiên cāu ... 38

2.1.1. Vật liệu kiểm soát ... 38

2.1.2. MÁu nhuyễn thể hai mÁnh vß ... 38

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

3.2.2. Tình tr¿ng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong nhuyễn thể

<b>DANH MĀC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG Bỉ CĂA LN ÁN ... 128 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>DANH MĀC CÁC HÌNH </b>

Hình 1.1. Xt kh¿u NTHMV Việt Nam 2020-2021 ... 6

Hình 1.2 CÃu trúc Norovirus ... 9

Hình 1.3. CÃu trúc Hepatitis A virus ... 10

Hình 1.4. CÃu trúc Hepatitis E virus... 11

Hình 1.5 CÃu trúc Human Astrovirus ... 12

Hình 1.6. Bá 4 mồi chính cÿa phÁn āng LAMP ... 18

Hình 1.7 Nguyên tắc phÁn āng Real-time PCR ... 20

Hình 1.8. Vß trí gắn cÿa MGB trên mÁu dị và cÃu trúc hóa hác cÿa MGB ... 28

Hình 1.9 CÃu trúc cÿa nucleotide thông th°ång và cÿa nucleotidd LNA ... 29

Hình 2.1. Quy trình lựa chán, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mÁu dò cho phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HEV và HAstV ... 44

Hình 2.2. Quy trình tách dịng trình tự gen đ¿i diện cÿa HEV và HAstV... 45

<i>Hình 2.3. Quy trình phiên mã in vitro </i>t¿o chāng d°¡ng RNA... 47

Hình 2.4. Tái °u phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện, đßnh l°ÿng HEV và HAstV ... 48

Hình 2.5. Chu trình nhiệt cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện, đßnh l°ÿng HEV và HAstV ... 49

Hình 2.6. Tóm tắt quy trình phát hiện và đßnh l°ÿng vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV ... 52

Hình 2.7. Chu trình nhiệt phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013 ... 54

Hình 2.8. Chu trình nhiệt cÿa phÁn āng RT-PCR vãi mồi ngồi khuếch đ¿i RNA cÿa NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ... 57

Hình 2.9. Chu trình nhiệt cÿa phÁn āng PCR vãi mồi trong để khuếch đ¿i cDNA cÿa NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ... 57

Hình 3.1 Đặc điểm bá mồi cÿa Schlosser và cÿa Jothikumar trên trình tự gen HEV chu¿n cÿa WHO... 59

Hình 3.2. Đá bao phÿ cÿa tổ hÿp mồi, mÁu dò trong nghiên cāu cÿa Schlosser và Jothikumar vãi các hệ gen HEV công bá trên GenBank ... 61

Hình 3.3. SÁn ph¿m PCR khuếch đ¿i đo¿n gen đích HEV-A ... 65

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

HEV.A sau biến n¿p vào vector pJET1.2 ... 65Hình 3.5. Kết q giÁi trình tự mát dịng plasmid pJET1.2 mang đo¿n gen HEV.A .... 66Hình 3.6. SÁn ph¿m PCR khuếch đ¿i đo¿n gen đích HEV.B ... 66Hình 3.7. Kết quÁ sàng lác PCR khu¿n l¿c E. coli DH5α mang đo¿n gen đích HEV.B sau biến n¿p vào vector pJET1.2 ... 67Hình 3.8. Kết q giÁi trình tự mát dịng plasmid pJET1.2 mang đo¿n gen HEV.B67Hình 3.9. Chu trình nhiệt rút gán cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV ... 74Hình 3.10. Kết quÁ xác đßnh giãi h¿n phát hiện vãi xác suÃt 95% cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HEV ... 76Hình 3.11. Kết quÁ xác đßnh khoÁng đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HEV trong NTHMV ... 80Hình 3.12. Các đ°ång chu¿n đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HEV trong NTHMV ... 80Hình 3.13. Đá bao phÿ cÿa tổ hÿp mồi, mÁu dò trong nghiên cāu cÿa Cann và cáng sự... 84Hình 3.14. SÁn ph¿m PCR khuếch đ¿i đo¿n gen đích HAstV ... 87Hình 3.15. Kết quÁ sàng lác PCR khu¿n l¿c E. coli DH5α mang đo¿n gen đích HAstV sau biến n¿p vào vector pJET1.2... 87Hình 3.16. Kết quÁ giÁi trình tự mát dịng plasmid pJET1.2 mang đo¿n gen HAstV ... 88Hình 3.17. Kết quÁ xác đßnh giãi h¿n phát hiện vãi xác suÃt 95% cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HAstV ... 94Hình 3.18. Kết quÁ xác đßnh khoÁng đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HAstV trong NTHMV... 97Hình 3.19. Các đ°ång chu¿n đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HAstV trong NTHMV ... 97Hình 3.20. Phân bá nồng đá vi rút trong các mÁu d°¡ng tính năm 2016 ... 103Hình 3.21. Tỉ lệ nhiễm t¿p đồng thåi nhiều lo¿i vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV t¿i chÿ và siêu thß năm 2016 ... 104

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

Hình 3.22. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV theo thåi điểm lÃy mÁu năm 2016 ... 104Hình 3.23. Phân bá nồng đá vi rút trong các mÁu d°¡ng tính năm 2022 ... 109Hình 3.24. Tỉ lệ nhiễm t¿p đồng thåi nhiều lo¿i vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV t¿i chÿ và siêu thß năm 2022 ... 109Hình 3.25. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV theo thåi điểm lÃy mÁu năm 2022 ... 110Hình 3.26. So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMVnăm 2016 và năm 2022 ... 111Hình 3.27. So sánh sự phân bá nồng đá vi rút trong các mÁu d°¡ng tính ... 111năm 2016 và năm 2022 ... 111Hình 3.30. SÁn ph¿m phÁn āng Nested RT-PCR khuếch đ¿i vùng gen ORF1-ORF2cÿa NoV GI và NoV GII ... 114Hình 3.31. Cây phát sinh loài cÿa các mÁu NoV GI phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu vãi các trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank ... 116Hình 3.32. Phân bá kiểu gen Norovirus GI cÿa các mÁu phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu ... 117Hình 3.33. Cây phát sinh lồi cÿa các mÁu NoV GII phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu vãi các trình tự NoV GII tham chiếu từ GenBank. ... 118Hình 3.34. Phân bá kiểu gen Norovirus GII cÿa các mÁu phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu ... 119Hình 3.35. SÁn ph¿m phÁn āng Nested RT-PCR khuếch đ¿i HEV ... 121Hình 3.36. Cây phát sinh loài cÿa các mÁu HEV phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu vãi các trình tự HEV tham chiếu từ GenBank ... 122Hình 3.37. SÁn ph¿m phÁn āng Nested RT-PCR khuếch đ¿i HAstV ... 123

cāu ... 124

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>DANH MĀC CÁC BÀNG </b>

BÁng 1.1 Tổng hÿp các nghiên cāu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV ... 17

BÁng 1.2 Nhận xét các ph°¡ng pháp xác đßnh vi rút gây bệnh thực ph¿m ... 21

BÁng 1.3 Tổng hÿp các bá mồi và mÁu dò sử dāng trong nghiên cāu ... 23

BÁng 1.4 Chu trình nhiệt cÿa các phÁn āng Real-time RT-PCR ... 25

BÁng 1.5 Tổng hÿp mát sá nghiên cāu về vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m t¿iViệt Nam ... 35

BÁng 2.1. Thông tin mÁu nhuyễn thể hai mÁnh vß thu thập trên thß tr°ång ... 39

BÁng 2.2. Trình tự mồi, mÁu dị sử dāng trong nghiên cāu xây dựng quy trình time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng RNA vi rút từ NTHMV ... 39

Real-BÁng 2.3. Tổng hÿp các bá mồi sử dāng trong phÁn āng Nested RT-PCR xác đßnh kiểu gen vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV ... 41

BÁng 2.4. Thành phần phÁn āng Real-time RT-PCR đßnh l°ÿng RNA vi rút sử dāng SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit ... 49

BÁng 2.5. Thơng tin các biến đ°ÿc phân tích bằng phần mềm SPSS ... 55

BÁng 2.6. Thành phần phÁn āng PCR khuếch đ¿i cDNA cÿa NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ... 56

BÁng 2.7. Thành phần phÁn āng PCR vãi mồi trong để khuếch đ¿i cDNA cÿa NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ... 57

BÁng 3.1. Đặc điểm kỹ thuật cÿa tổ hÿp mồi Schlosser và Jothikumar ... 60

BÁng 3.2. Đặc điểm kỹ thuật cÿa các tổ hÿp mồi sau khi hiệu chỉnh và āng dāng công nghệ MGB, LNA ... 63

BÁng 3.3. Kết quÁ tái °u nồng đá ion Mg<small>2+</small>đái vãi hai tổ hÿp mồi A và B ... 68

BÁng 3.4. Kết quÁ tái °u nồng đá mồi đái vãi hai tổ hÿp mồi A và B ... 70

BÁng 3.5. Kết quÁ tái °u nồng đá mÁu dò đái vãi hai tổ hÿp mồi A và B ... 71

BÁng 3.6. Thành phần tái °u cÿa phÁn āng Realt-time RT-PCR phát hiện HEV .... 72

BÁng 3.7. Kết quÁ khÁo sát nhiệt đá gắn mồi cÿa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gán ... 73

BÁng 3.8. Tái °u hóa thåi gian gắn mồi và kéo dài m¿ch cÿa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gán ... 74

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

BÁng 3.9. Giãi h¿n phát hiện cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HEV trong NTHMV ... 75BÁng 3.10. Giãi h¿n phát hiện vãi xác suÃt 95% cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HEV ... 77BÁng 3.11. Kết quÁ xác đßnh khoÁng đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HEV trong NTHMV ... 78BÁng 3.12. Kết quÁ phÁn āng chéo cÿa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV trong NTHMV ... 82BÁng 3.13. Vß trí trình tự gen HAstV tham chiếu và giá trß nhiệt đá nóng chÁy (Tm) cÿa cÿa bá mồi, mÁu dò cÿa Cann ... 83BÁng 3.14. Đặc điểm kỹ thuật cÿa trình tự mồi phát hiện HAstV sau khi hiệu chỉnh và āng dāng công nghệ LNA ... 86

hiện HAstV ... 89BÁng 3.16. Kết quÁ tái °u nồng đá mồi HAstV ... 90BÁng 3.17. Kết quÁ tái °u nồng đá mÁu dò HAstV ... 91BÁng 3.18. Thành phần tái °u cÿa phÁn āng Realt-time RT-PCR phát hiện HAstV ... 91BÁng 3.19. Kết quÁ khÁo sát nhiệt đá gắn mồi cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gán ... 92BÁng 3.20. Tái °u hóa thåi gian gắn mồi và kéo dài m¿ch cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gán ... 93BÁng 3.21. Giãi h¿n phát hiện cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HAstV trong NTHMV ... 94BÁng 3.22. Giãi h¿n phát hiện vãi xác suÃt 95% cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HAstV ... 95BÁng 3.23. Kết quÁ xác đßnh khoÁng đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HAstV trong NTHMV... 96BÁng 3.24. Kết quÁ phÁn āng chéo cÿa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV trong NTHMV ... 99BÁng 3.25. Tổng hÿp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV năm 2016 theo lo¿i mÁu và đßa điểm lÃy mÁu ... 100

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

BÁng 3.26. Tổng hÿp māc nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV năm 2016 theo lo¿i mÁu và đßa điểm lÃy mÁu ... 101BÁng 3.27. Tổng hÿp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV năm 2022 theo lo¿i mÁu và đßa điểm lÃy mÁu ... 106BÁng 3.28. Tổng hÿp māc nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV năm 2022 theo lo¿i mÁu và đßa điểm lÃy mÁu ... 107

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>DANH MĀC KÝ HIäU VÀ CHĀ VI¾T TÄT </b>

enzyme

the Unated Nation

Tổ chāc L°¡ng thực và Nông nghiệp

ph¿m Mỹ

Quality Assurance Department

Cāc QuÁn lý ChÃt l°ÿng Nông lâm

và Phát triển nông thôn

Biotechnology Information

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

NoV Norovirus

Product Safety Authority

C¡ quan An toàn SÁn ph¿m Tiêu dùng và Thực ph¿m Hà Lan

RT-LAMP <sup>Reverse transcription loop-mediated </sup>isothermal amplification

Ph°¡ng pháp khuếch đ¿i đẳng nhiệt thông qua cÃu trúc vòng phiên mã

ph<b>¿m và thāc ăn chăn nuôi </b>

Exporters and Producers

Hiệp hái Chế biến và XuÃt kh¿u thuỷ

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>MỞ ĐÀU 1. Tính c¿p thi¿t căa đß tài </b>

Báo cáo tháng kê ngành thÿy sÁn toàn cầu cÿa Tổ chāc L°¡ng thực và Nông nghiệp Liên hÿp Quác (FAO) cho thÃy nhu cầu đái vãi các mặt hàng nhuyễn thể hai mÁnh vß (NTHMV) tăng m¿nh vào năm 2021 so vãi 2020 [1]. Theo tháng kê cÿa

NTHMV cÿa Việt Nam đ¿t 141,6 triệu USD, tăng 35% so vãi năm 2020; trong đó, ngao là sÁn ph¿m chÿ lực, chiếm 73% vãi 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Nhuyễn thể cÿa Việt Nam đã đ°ÿc xuÃt kh¿u đến 42 n°ãc; trong đó, Liên minh

EU cũng là thß tr°ång có quy đßnh chặt chẽ nhÃt đái vãi các sÁn ph¿m nhập kh¿u, gây nhiều thách thc ỏi vói ngnh nuụi trng NTHMV ỗ Vit Nam. Tháng 4 năm 2022, trong <Diễn đàn phát triển thÿy sÁn bền vững=, lãnh đ¿o Bá Nông nghiệp và

trong đó việc bÁo đÁm kiểm sốt chÃt l°ÿng An tồn thực ph¿m từ khâu sÁn xuÃt ban đầu đến s¡ chế, chế biến là hết sāc cần thiết [4].

Trong những năm qua, tình tr¿ng viêm d¿ dày ruát, viêm gan do tiêu thā

đßnh đ°ÿc h¡n 100 lo¿i vi rút đ°ång ruát có mặt trong thực ph¿m bß ơ nhiễm; trong đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) v Astrovirus ỗ ngồi (HAstV) là các vi rút gây bệnh th°ång gặp trong NTHMV [5]. Đáng chú ý, mát sá nghiên cāu về các vi rút này t¿i Việt Nam đã cho thÃy tình tr¿ng

Tr°ãc tình hình ơ nhiễm thực ph¿m do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao, cùng vãi những kết quÁ về tình tr¿ng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triển quy trình phát hiện và đßnh l°ÿng bán tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m th°ång gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sāc cần thiết [7]. Hiện nay,

HAV trong thực ph¿m thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và

vậy, việc xây dựng quy trình xác đßnh HAstV và HEV vãi bá mồi, mÁu dò đÁm bÁo

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

đá bao phÿ trên các biến chÿng hiện có, đồng thåi tái °u các điều kiện cÿa phÁn āng

gian phân tích, hß trÿ kßp thåi cho cơng tác điều trß.

Bên c¿nh đó, các sá liệu về đặc điểm sinh hác phân tử cÿa các vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV t¿i Việt Nam cịn rÃt h¿n chế. Vì vậy, việc xác đßnh đặc điểm sinh hác phân tử cÿa vi rút thơng qua xác đßnh kiểu gen (genotype) là cơng đo¿n cần thiết để đánh giá chính xác nguy c¡ bựng phỏt dòch bnh gõy ra bỗi

kh<i><b>òe, kinh tế và xã hái. Do vậy, luận án <Nghiên cứu xây dựng phương pháp </b></i>

<i><b>phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử= đã đ°ÿc thực hiện. </b></i>

<b>2. Māc tiêu nghiên cąu </b>

15216-1:2013.

- Áp dāng quy trình đã xây dựng phát hiện và đßnh l°ÿng vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong nhuyễn thể hai mÁnh vß trên thß tr°ång

ph¿m trong nhuyễn thể hai mÁnh vß.

<b>3. Nội dung nghiên cąu </b>

<b>3.1. Xây dÿng quy trình Real-time RT-PCR phát hiån và đßnh l°ÿng RNA căa HEV và HAstV trong nhuyãn thá hai mÁnh vá </b>

<i>3.1.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

- Xây dựng chu trình nhiệt rút gán cho phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện RNA cÿa HEV phāc vā xét nghiệm nhanh vi rút này

l°ÿng HEV trong nhuyễn thể hai mÁnh vß theo chu trình nhiệt rút gán và chu trình nhiệt cÿa ISO 15216-1:2013

<i>3.1.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ </i>

phát hiện HAstV

<i>mã in vitro </i>

theo tiêu chu¿n ISO 15216-1:2013

RNA cÿa HAstV phāc vā xét nghiệm nhanh vi rút này

l°ÿng HAstV trong nhuyễn thể hai mÁnh vß theo chu trình nhiệt rút gán và chu trình nhiệt cÿa ISO 15216-1:2013

<i><b>3.2. Áp </b></i><b>dāng quy trình đã xây dÿng phát hiån vi rút gây bånh truyßn </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<b>4. Ý nghĩa khoa hßc và thÿc tiãn căa đß tài </b>

<b>4.1. Ý nghĩa khoa hßc </b>

và HAstV theo chu trình nhiệt c miờu t trong ISO 15216-1:2013; t ú mỗ ra khÁ năng phát hiện và đßnh l°ÿng đ°ÿc 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV và HAstV trong mát lần ch¿y Real-time RT-PCR.

RNA cÿa HEV và HAstV phāc vā xét nghiệm nhanh các vi rút này

<b>4.2. Ý nghĩa thÿc tiãn </b>

vãi tính chính xác cao (4 phÁn āng Real-time RT-PCR riêng rẽ ch¿y cùng mát chu trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mÁu thực ph¿m, bệnh ph¿m, môi trồng núi chung cỏc cĂ sỗ xột nghim cú thể āng dāng trong phân tích.

- Góp phần nâng cao năng lực kiểm sốt an tồn thực ph¿m, tăng tính c¿nh tranh cÿa NTHMV và các mặt hàng thÿy sÁn xuÃt kh¿u trên thß tr°ång quác tế.

<b>5. Tính mßi căa đß tài </b>

cÿa HEV và HAstV có đá bao phÿ cao vãi các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữ liệu Genbank.

HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mÁnh vß vãi chu trình nhiệt theo tiêu chu¿n ISO 15216-1:2013.

trong năm 2016 t¿i Việt Nam.

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<b>1. TàNG QUAN </b>

<b>1.1. Tình hình sÁn xu¿t, tiêu thā nhuyãn thá hai mÁnh vá và thách thąc vß an tồn thÿc ph¿m </b>

<b>1.1.1. Tình hình sÁn xu¿t và tiêu thā nhuyãn thá hai mÁnh vá </b>

vào năm 2021 so vãi 2020 do cỏc hn ch v COVID-19 ó gim bót ỗ cỏc quác gia tiêu thā chính những mặt hàng này. Trong năm 2021, khoÁng 71.000 tÃn hàu đã đ°ÿc nhập kh¿u trên toàn thế giãi, cao h¡n 15.000 tÃn so vãi năm 2020 và thậm chí cao h¡n 6.000 tÃn so vãi năm 2019. Cũng trong năm 2021, tổng th°¡ng m¿i ngao trên toàn thế giãi tăng, khoÁng 287.000 tÃn đã đ°ÿc nhập kh¿u, nhiều h¡n 20.000 tÃn so vãi năm 2020 [1].

Việt Nam có đặc điểm đßa lý thuận lÿi để phát triển ho¿t đáng khai thác và

bên bå Tây cÿa Biển Đông - là mát biển lãn cÿa Thái Bình D°¡ng, vùng biển đặc quyền kinh tế ráng h¡n 1 triệu km2 cùng h¡n 4.000 hịn đÁo, t¿o nên 12 vßnh, đầm phá vãi tổng diện tích 1.160km2 đ°ÿc che chắn tát dễ trú đậu tàu thuyền [9]. Năm 2021, diện tích nhuyễn thể cÿa Việt Nam đ¿t trên 35.000 ha, sÁn l°ÿng 471.000 tÃn; trong đó, diện tích và sÁn l°ÿng nuôi ngao chiếm khoÁng 50%; cā thể, năm 2021,

cÿa Việt Nam đã đ°ÿc xuÃt kh¿u đến 42 n°ãc. Theo tháng kê cÿa Hiệp hái Chế biến và XuÃt kh¿u thuỷ sÁn Việt Nam (VASEP), xuÃt kh¿u NTHMV cÿa Việt Nam năm 2021 đ¿t 141,6 triệu USD, tăng 35% so vãi năm 2020. Trong đó, ngao là sÁn ph¿m chÿ lực, chiếm 73% vãi gần 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Sá liệu cÿa Trung tâm Th°¡ng m¿i Thế giãi (ITC) cho thÃy các thß tr°ång nhập kh¿u chính NTHMV cÿa Việt Nam là: Liên minh châu Âu EU (Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Italy), Mỹ, Nhật BÁn, Đài Loan, Hàn Quác. Trong đó, EU là thß tr°ång nhập kh¿u

Nam ra các thß tr°ång trên thế giãi [3].

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<i>Hình 1.1. Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 [2] </i>

Đáng chú ý, EU cũng là thß tr°ång có quy đßnh chặt chẽ nhÃt đái vãi các sÁn ph¿m nhập kh¿u, đây cũng chính là thách thāc lãn đái vãi ngành nuôi trồng

lô hàng hàu t°¡i °ãp đá từ Vân Đồn QuÁng Ninh bß cÁnh báo phát hiện NoV: 10 lô hàng năm 2020 và 2 lô hàng năm 2021. Tháng 4 năm 2022, trong Diễn đàn về phát triển thÿy sÁn bền vng, Th trỗng Bỏ Nụng nghiệp và Phát triển Nông thơn Phùng Đāc Tiến đã khẳng đßnh, việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trị quan tráng trong việc hoàn thành māc tiêu phát triển kinh tế thÿy sÁn đã đề ra; trong đó việc bÁo đÁm kiểm sốt chÃt l°ÿng An tồn thực ph¿m từ khâu sÁn xuÃt ban đầu đến s¡ chế, chế biến là hết sāc cần thiết [4].

<b>1.1.2. Tình hình nhiãm vi rút gây bånh truyßn qua thÿc ph¿m trong nhuyãn thá hai mÁnh vå </b>

Vãi đặc điểm sinh sáng theo hình thāc lác n°ãc để lÃy thāc ăn, NTHMV là đái t°ÿng thực ph¿m có nguy c¡ ơ nhiễm cao bỗi cỏc vi rỳt v cỏc tỏc nhõn gõy bnh khác có trong mơi tr°ång n°ãc. Theo các nghiên cāu trên thế giãi về nhóm vi

100 lo¿i vi rút đ°ÿc tìm thÃy trong đ°ång ruát ng°åi. Các vi rút này đ°ÿc phân làm 3 nhóm chính theo hái chāng lâm sàng: nhóm vi rút gây viêm d¿ dày ruát, vi rút gây

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

ngá đác thực ph¿m trong NTHMV từ năm 1980 đến năm 2012 trên thế giãi đã chỉ

12,8% [10].

Theo các sá liệu tháng kê dßch tễ gần đây, NoV đ°ÿc coi là mát trong những

nguyên nhân cÿa trung bình 570–800 ca tử vong, 56.000–71.000 ca nhập viện, 400.000 ca cÃp cāu và 19–21 triệu ca bệnh mßi năm [11]. NoV là vi rút gây bệnh xuÃt hiện nhiều nhÃt trong các lo¿i NTHMV, chiếm 83,7%. Mát nghiên cāu giám sát māc đá nhiễm NoV trong NTHMV đ°ÿc thực hiện bỗi CĂ quan An ton Sn phm Tiờu dựng v Thực ph¿m Hà Lan (NVWA) trên 756 mÁu trong khoÁng thåi gian từ năm 2013 đến năm 2017 đã phát hiện 45,5% mÁu d°¡ng tính vãi NoV [12]. T¿i Nhật BÁn, nghiên cāu về tình hình nhiễm vi rút đ°ång ruát trong NTHMV trên 732 mÁu đ°ÿc thu thập trong 5 năm, từ 2014 đến 2018 đã chỉ ra tồn t¿i mái liên hệ giữa tỉ lệ nhiễm NoV trong NTHMV vãi sá ca tiêu chÁy diễn ra trong cáng đồng. T¿i Đông Nam Á, nghiên cāu đ°ÿc thực hiện trên 300 mÁu NTHMV thu thập từ các chÿ t¿i Thái Lan đã phát hiện NoV trong 12,3% mÁu; trong đó tỉ lệ nhiễm trên hàu là 14%, ngao là 6% [13].

Hàng năm trên thế giãi có khoÁng 1,4 triệu ng°åi mắc HAV và khoÁng 200 triệu ng°åi mang bệnh nh°ng khơng thể hiện triệu chāng. HAV có thể lây truyền từ ng°åi sang ng°åi hoặc thông qua n°ãc và thực ph¿m bß ơ nhiễm, đặc bit ỗ NTHMV khụng x lý nhit yêu cầu. Lßch sử đã ghi nhận vā dßch lan truyền ráng rãi nhÃt t¿i Th°ÿng HÁi, Trung Quác vào năm 1988 vãi gần 300.000 tr°ång hÿp do tiêu thā ngao đánh bắt t¿i vùng n°ãc bß ơ nhiễm n°ãc thÁi [14]. T¿i Tây Ban Nha, hai vā dßch lãn do tiêu thā ngao nhiễm HAV đ°ÿc nhập kh¿u từ Peru đã đ°ÿc ghi nhận vãi sá ca nhiễm lên tãi 184 ng°åi năm 1999 và 100 ng°åi năm 2008. Liên quan đến hai vā dßch này, Bá Y tế Tây Ban Nha đã kích ho¿t Hệ tháng cÁnh báo nhanh về thực ph¿m và thāc ăn chăn nuôi (RASFF) cÿa châu Âu; hàng lo¿t hô hàng NTHMV từ Peru vào thåi điểm đó đã đ°ÿc cÁnh báo và cÃm nhập kh¿u vào châu

vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m thực hiện trên 50 mÁu NTHMV đ°ÿc nhập kh¿u từ Ma rác, Peru, Hàn Quác và Việt Nam đã phát hiện tỉ lệ nhiễm HAV lên tãi 50% trên các mÁu NTHMV đến từ Việt Nam [16].

Theo tháng kê cÿa Tổ chāc Y tế Thế giãi, có trên 2,3 triệu ng°åi nhiễm HEV mßi năm vãi khoÁng 70.000 ca tử vong, chÿ yếu liên quan đến việc sử dāng thực ph¿m đ°ÿc thu ho¿ch từ các vùng có nguồn n°ãc bß ơ nhiễm vãi tỷ lệ cao nht ỗ

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

ụng v Nam Á [17]. T¿i Trung Quác, nghiên cāu đánh giá Ánh hỗng ca ụ nhim ngun nóc n sc khòe cỏng đồng thơng qua tiêu thā NTHMV t¿i vßnh Bát HÁi đã tìm thÃy HEV trong 17,5% sá mÁu thu thập [18]. T¿i châu Âu, mát cuác điều tra năm 2008 trờn 789 du khỏch trỗ v t chuyn du thuyn sang Anh cho thÃy có đến 195 ng°åi d°¡ng tính vãi vi rút HEV, trong đó 33 ng°åi có triệu chāng nhiễm trùng cÃp tính. Phân tích ngun nhân cho thÃy có mái liên hệ chặt chẽ vãi việc tiêu thā sò và trai đến từ vùng n°ãc ô nhiễm t¿i Southampton [19]. Nghiên cāu cÿa Rivadulla thực hiện trên 168 mÁu NTHMV t¿i hai vùng nuôi trồng thÿy sÁn t¿i Tây Ban Nha đã phát hiện 24,4% mÁu nhiễn HEV [20].

T°¡ng tự nh° NoV, HAstV th°ång đ°ÿc tỡm thy trong NTHMV c nuụi ỗ vựng nóc ụ nhiễm. Trẻ em là đái t°ÿng có nguy c¡ mắc HAstV cao nhÃt, theo mát nghiên cāu năm 2013, có đến 3% trẻ em d°ãi năm tuổi mắc vi rút này nhập viện mßi năm [21]. Mát nghiên cāu khác thực hiện t¿i Nhật BÁn, n¡i có 4700 trẻ em trong ỏ tui i hỏc bò nh hỗng bỗi bnh viêm d¿ dày rt cÃp tính, HAstV đã đ°ÿc tìm thÃy trong 26% mÁu phân. Năm 2019, nghiên cāu cÿa Diem Lan Vu và cáng sự thực hiện trên 384 mÁu bệnh ph¿m t¿i Tây Ban Nha cho thÃy tỷ lệ nhiễm HAstV chiếm 13,3% và đ°ÿc tìm thÃy trong 66% các mÁu đồng nhiễm vãi các lo¿i vi rút khác [22]. Mát sá nghiên cāu trên thế giãi đã chỉ ra ph°¡ng thāc lây truyền chính cÿa HAstV là do thực ph¿m bß ơ nhiễm, điển hình là NTHMV t¿i các vùng n°ãc bß ơ nhiễm. Nghiên cāu cÿa Vilarino và cáng sự thực hiện t¿i Tây Ban Nha trên 41 mÁu NTHMV đã phát hiện 12,2% mÁu nhiễm HAstV [23]. Nghiên cāu cÿa David Polo và cáng sự trên 50 mÁu NTHMV nhập kh¿u từ Ma rác, Peru, Hàn Quác và Việt Nam đã phát hiện HAstV trong 18% sá mÁu; đáng chú ý, mÁu NTHMV nhập kh¿u từ Việt Nam nhiễm HAstV cũng đồng nhiễm vãi HAV và NoV nhóm GI [16].

Từ các sá liệu về tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m kể trên, có thể thÃy tồn t¿i nguy c¡ nhiễm NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV. Đặc biệt, mát sá nghiên cāu đã chỉ ra tình tr¿ng đồng nhiễm nhiều vi rút trên cùng mát mÁu, cho thÃy tính phāc t¿p trong ch¿n đốn và điều trß. Vì vậy, việc nghiên cāu mát ph°¡ng pháp phù hÿp cho xác đßnh cÁ bán vi rút sẽ là đóng góp hiệu quÁ

<b>1.2. Đặc điám sinh hßc các vi rút gây bånh truyßn qua thÿc ph¿m trong nhuyãn thá hai mÁnh vá </b>

<b>1.2.1. Norovirus </b>

NoV là mát vi rút thuác há Caliciviridae, có cÃu t¿o là mát vi rút RNA sÿi đ¡n d°¡ng, có kích th°ãc gần 7,6kb. H¿t vi rút cÿa NoV rÃt nhß vãi đ°ång kính

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

khoÁng 27-35 nm. Trong cùng genocluster, vß capsid cÿa vi rút th°ång rÃt giáng

thể tồn t¿i trong môi tr°ång vãi pH dao đáng từ 2 đến 10; nhiệt đá từ đông l¿nh đến nhiệt đá cao tãi 60℃. Đặc biệt, vi rút này có thể tồn t¿i thåi gian dài trên các bề mặt khác nhau; ngay cÁ khi tiếp xúc vãi nồng đá clo lên tãi 10 ppm [25].

<i>Hình 1.2 Cấu trúc Norovirus [26, 27].Cấu trúc hạt vi rút (A); Cấu trúc hệ gen (B) </i>

Phân tích về trình tự chiều dài hệ gen cÿa NoV chỉ ra các chÿng vi rút trong mát nhóm gen th°ång có trên 69% t°¡ng đồng về nucleotide. Hệ gen cÿa NoV đ°ÿc chia thành 3 khung đác mỗ (ORF1, ORF2, v ORF3) (Hỡnh 1.2). Khung ỏc mỗ thā nhÃt ORF1 (~5 kb) mã hóa mát phân tử polyprotein có kích th°ãc 194kDa, phân tử polyprotein này bß phõn ct bỗi chớnh protease ca NoV to thnh 6 phân tử protein gồm (1) N-Term, protein ch°a rõ chāc năng (~48 kDa); (2) NTP nucleoside triphosphatase (~40 kDa) có khÁ năng liên kết và thÿy phân toàn bá NTP; (3) p22 t°¡ng tự nh° vùng N-Term, ch°a rõ chāc năng (~22kDa); (4) VPg, protein đóng vai trị quan tráng trong quá trình nhân bÁn và dßch mã RNA (~16 kDa); (5) 3C, 3C-like protease (~19 kDa), có vai trị phân cắt ORF1 polyprotein thành các phân tử protein và (6) RdRp, RNA polymerase phā thuác RNA (RdRp) (~57 kDa). ORF2 chÿ yếu mã hóa protein VP1 có tính biến đổi cao. ORF3 mã hóa mát protein VP2 c¡ bÁn nhß nằm bên trong h¿t vi rút, có vai trị tham gia vào q trình tổng hÿp capsid và hình thành hệ gen. Trong đó, vùng RdRp t¿i khu vực giao giữa ORF1-ORF2 và vùng VP1 là hai vùng chính th°ång đ°ÿc sử dāng để phân lo¿i đặc điểm di truyền cÿa NoV hiện nay; còn vùng C t°¡ng āng vãi vùng trình tự

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

nhò ỗ u 5 ca VP1 thồng c s dāng để xác đßnh kiểu gen (genotype) cÿa

GI, GII, GIV l nhng kiu gen thồng gp ỗ ngồi; trong đó, NoV GI và NoV GII là hai kiểu gen gây bệnh phổ biến [29, 30].

<b>1.2.2. Hepatitis A virus </b>

xāng 20 mặt (Hình 1.3). Về đặc điểm vật lý, HAV có khÁ năng tồn t¿i trong mơi tr°ång pH từ 3 đến 11 và có thể chßu đ°ÿc nhiệt đá đến 60℃. Hệ gen cÿa HAV gồm mát phân tử RNA m¿ch đ¡n, d°¡ng, có kích th°ãc 7.5 kb. HAV có hệ gen t°¡ng tự vãi các Picornavirus khác vãi cÃu trúc đ°ÿc chia làm 3 vùng: vùng 5' khơng dßch mã (5'UTR) chim xp x 10% h gen, mỏt khung ỏc mỗ (ORF), và

đá dài khoÁng 735 đến 745 nucleotid, có liên kết đồng hóa trß vãi protein 3B đ°ÿc mã húa bỗi chớnh h gen (protein VPg) và có chāa mát vß trí đi vào ribosom

các protein cÿa vi rút, vãi các vùng nh° P1 mã hóa cho các protein cÿa lãp vß và

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

vùng P2, P3 cho các protein khơng cÃu trúc, ván tham gia vào q trình tổng hÿp,

cÃu trúc bao gồm khoÁng 2225 đến 2227 nucleotide và mã hóa cho 4 lo¿i protein chÿ yếu cÿa lãp vß vi rút là VP1, VP2, VP3 và VP4. Vùng 2BC và P3 chāa bÁy protein phi cÃu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D). Vùng 3'UTR có khng 40 đến 80 nucleotide chāa trình tự kết thúc dßch mã bao gồm mát chi poly(A) có đá biến đổi cao (tãi 20%) giữa các chÿng và các d¿ng đát biến. HAV có mát kiểu huyết thanh vãi sáu kiểu gen dựa trên việc kiểm tra mát đo¿n 168-nucleotide cÿa vùng

HAV những năm gần đây [32].

<b>1.2.3. Hepatitis E virus </b>

<i>HEV là vi rút thuác há Hepeviridae, vß capsid là khái gồm 20 mặt đái xāng </i>

hệ gen ca HEV ỗ ỏng vt cú vỳ v cỏc loi cỏ khong 7,2kb; ỗ gia cm khong

kh nng chßu nhiệt từ 4℃ đến 56℃ [33].

660 amino acid; ORF3 có đá dài khoÁng 113 amino acid, mã hóa cho mát protein chāc năng (Hình 1.4). Vùng tiếp giáp (JR) cÿa HEV nằm giữa 2 khung ỏc mỗ ORF1 v ORF3. Vỡ th, vựng mã hóa cho ORF2 đ°ÿc bao phÿ lên khung đác mỗ

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

ORF3 nhng khụng tip giỏp vãi ORF1. Ngoài ra, vùng CRE (cis-reactive element) là vùng thiết yếu cần thiết cho quá trình nhân lên cÿa HEV, vựng CRE th nht ph

trỳc vũng (SL) ỗ vùng JR cũng đóng vai trị quan tráng đái vãi quá trình nhân bÁn cÿa HEV. Vùng bÁo thÿ nhÃt cÿa hệ gen HEV là vùng giao ORF2-ORF3, th°ång đ°ÿc sử dāng làm vùng gen māc tiêu trong xác đßnh HEV bằng ph°¡ng pháp PCR. Trong khi đó, vùng MeT ç đầu 5’ và vùng ORF2 l¿i là hai vùng gen đ°ÿc nhắm đến trong các nghiên cāu đßnh typ HEV. HEV gồm 7 kiểu gen từ HEV-1 đến HEV-7; trong đó năm kiểu gen ó c tỡm thy ỗ ng°åi gồm HEV-1, HEV-2, HEV-3,

gen phā thuác HEV-1 (1a đến 1e), hai kiểu gen phā thuác HEV-2 (2a và 2b), m°åi kiểu gen phā thuác HEV-3 (3a đến 3j), bÁy kiểu gen phā thuác HEV-4 (4a đến 4g) và hai kiểu gen phā thuác HEV-7 (7a và 7b) [35].

<b>1.2.4. Astrovirus </b>

cắt hình lāc giác, đ°ång kính 28-35 nm, chāa mát sÿi RNA m¿ch đ¡n, d°¡ng vãi đá dài khoÁng 6.800 nucleotides [36]. Về đặc điểm vật lý, HAstV t°¡ng đái bền vững; có khÁ năng tồn t¿i ngay cÁ trong môi tr°ång chāa các chÃt t¿y rửa, clo hay dung môi acid vãi pH dói 3; ỗ nhit ỏ t 4 n 60, nng đá HAstV có dao đáng khơng đáng kể và vÁn duy trì khÁ năng lây nhiễm [37]. Hệ gen ca HAstV gm ba khung ỏc mỗ: ORF1a, ORF1b v ORF 2 (Hình 1.5).

<i>Hình 1.5 Cấu trúc Human Astrovirus [36] [38]. Cấu trúc hạt vi rút (A); Cấu trúc hệ gen (B) </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

ORF1a và ORF1b mã hóa các protein phi cÃu trúc, gồm hai enzyme serine protease (Pro) và RNA dependent RNA polymerase (Pol), ORF2 mó húa protein

<i>ỗ tt c cỏc chÿng HAstV giúp phân biệt há Astroviridae vãi các há vi rút khác nh° </i>

<i>Picornaviridae và Caliciviridae gồm vùng tín hiệu dßch khung (frameshift signal) </i>

ORF2; các vùng nãi trên là các vùng gen th°ång đ°ÿc sử dāng làm vùng gen māc tiêu để xác đßnh HAstV cũng nh° phân biệt các kiểu gen cÿa HAstV. HAstV c

u th vói t l phỏt hin ỗ các n°ãc châu Á lên đến trên 80% [39].

<b>1.3. Quy trình phát hiån và đßnh l°ÿng vi rút trong nhuyãn thá hai mÁnh vá </b>

NoV, HAV, HEV và HAstV đều là các vi rút có khÁ năng cháng chßu cao vãi

cực tím cao [40]. Vì vậy, các vi rút này có thể phát triển ổn đßnh và l°u l¿i trong môi tr°ång vãi thåi gian từ 2 ngày đến 4 tuần. Đáng chú ý, các vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m này có liều lây nhiễm thÃp, chỉ từ 10 đến 100 phần tử vi rút [41]; do đó, để

phát hiện và đßnh l°ÿng vi rút trong thực ph¿m gồm hai b°ãc chính: (1) Tách chiết RNA vi rút và (2) Xác đßnh vi rút.

NTHMV là nhóm thực ph¿m tồn t¿i nhiều thành phn c ch phn ng xỏc ònh vi rỳt ỗ giai đo¿n sau tách chiết nh° các polysacarit, protein và axit béo [42,

thực ph¿m, cô đặc vi rút và lo¿i bß các thành phần āc chế nói trên. Các ph°¡ng

giÁi h¿t vi rút – cô đặc vi rút – tách chiết RNA vi rút ; (2) tách chiết trực tiếp RNA vi rút; (3) rửa giÁi vi rút bằng proteinase K – tách chiết RNA vi rút<small>.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<i>1.3.1.1. Phương pháp rửa giải hạt vi rút - cô đặc vi rút - tách chiết RNA vi rút </i>

rút. Ph°¡ng pháp này đã đ°ÿc áp dāng từ những năm 70 cÿa thế kỷ tr°ãc để tách chiết các vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong hàu [44, 45]. æ giai đo¿n rửa

nguyên tắc trao đổi ion hoặc siêu ly tâm, môi tr°ång đệm trung tính th°ång đ°ÿc °u tiên sử dāng. Tiếp theo, việc cơ đặc bằng kết tÿa vi rút sau q trình rửa giÁi đ°ÿc

th°ång đ°ÿc sử dāng gồm: kết tÿa bằng polyethylene glycol (PEG) hay các kỹ thuật nh° siêu ly tâm, sử dāng màng vi lác, cô đặc bằng ph°¡ng pháp miễn dßch hay phân tách cation. Ci cùng, giai đo¿n tách chiết RNA đóng vai trị quyết đßnh đến sự

do enzyme phiên mã ng°ÿc có tính nh¿y cÁm cao vãi các chÃt āc chế. Māc tiêu chung cÿa các ph°¡ng pháp tách chiết RNA là thu đ°ÿc sÁn ph¿m RNA tinh khiết,

nền mÁu thực ph¿m, các ph°¡ng pháp sử dāng hÿp chÃt hóa hác nh° cetrimonium

dāng h¿t từ silica th°ång đ°ÿc sử dāng. Nhìn chung, các ph°¡ng pháp dựa trên nguyên tắc hóa hác th°ång cho phép xử lý mát sá chÃt āc chế: chelex hoặc sephadex cho phép lo¿i muái và mát sá protein, CTAB cho phép lo¿i bß các

hóa hác là Trizol (Invitrogen, Mỹ) vãi sự kết hÿp cÿa ba thành phần guanidinium

Trizol đã đ°ÿc sử dāng ráng rãi trong nhiều nghiên cāu. Tuy nhiên, mát sá nghiên cāu gần đây cũng chỉ ra việc sử dāng Trizol hay các giÁi pháp hóa hác trong tách

đó, việc tồn d° phenol, GuSCN hoặc các thành phần hóa hác khác từ giai đo¿n xử lý thu RNA cũng làm giÁm chÃt l°ÿng cÿa sÁn ph¿m RNA [48-51]. Trong khi đó, các ph°¡ng pháp dựa trên nguyên tắc miễn dßch hay trao đổi ion th°ång mang l¿i

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<i>1.3.1.2. Phương pháp tách chiết trực tiếp RNA vi rút </i>

Các ph°¡ng pháp tách chiết RNA trực tiếp từ thực ph¿m th°ång sử dāng

cho b°ãc tinh s¿ch tiếp theo. Ph°¡ng pháp này đặc biệt đ°ÿc áp dāng đái vãi thực

pháp tách chiết RNA trực tiếp đã cho phép tách chiết 10<small>6</small> phiên bÁn hệ gen NoV

Husman năm 2007 đã tách chiết thành công 10 đ¡n vß RT-PCR vi rút từ 0,15g tuyến

NoV trong tuyến tiêu hóa cÿa các NTHMV cho đá nh¿y thÃp h¡n so vãi các ph°¡ng pháp tách chiết và cô đặc khác [48]. Dù vậy, năm 2009, nghiên cāu cÿa Neonen đã chāng minh điều ng°ÿc l¿i khi lựa chán ph°¡ng pháp tách chiết RNA trực tiếp là ph°¡ng pháp chính để khẳng đßnh sự có mặt cÿa NoV trong các mÁu hàu trong mát vā dßch năm 2007 [56]. SÁn ph¿m th°ång đ°ÿc sử dāng nhÃt trong các nghiên cāu

dßch hay trao đổi ion th°ång đ°ÿc sử dāng [57].

<i>1.3.1.3. Rửa giải vi rút bằng proteinase K – Tách chiết RNA vi rút </i>

dāng enzyme phân hÿy protein, d°ãi tác dāng nhiệt, ngoài các protein từ tế bào NTHMV, các RNase cũng bß biến tính, giúp bÁo tồn sá l°ÿng RNA thu đ°ÿc trong q trình tách chiết. ỉ giai đo¿n xử lý ban đầu này, việc băm nhß các mơ tuyến tiêu

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

hóa cÿa NTHMV cũng góp phần làm tăng hiệu quÁ cÿa proteinase K. Tiếp đến, thu vi rút và tách chiết RNA bằng việc phá hÿy lãp vß capsid cÿa vi rút, từ đó giÁi

để thu vi rút; RNA đ°ÿc tách chiết bằng việc sử dāng dung dßch muái chaotropic là GuSCN để phá vỡ lãp vß capsid cÿa virus; RNA sau đó đ°ÿc hÃp thā vào h¿t silica để thực hiện quá trình tinh s¿ch; RNA cÿa vi rút sau khi đã tinh s¿ch đ°ÿc giÁi phóng ra khßi h¿t silica vào dung dßch đệm tr°ãc khi tiến hành phÁn āng Real-time

h°ãng cho những nghiên cāu về vi rút gây bệnh trên đái t°ÿng mÁu thực ph¿m nói chung và NTHMV nói riêng.

<i>1.3.1.4. Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết vi rút trong NTHMV </i>

mßi cá thể hàu đã cho phép tăng đá nh¿y lên 100 lần [64]. Việc tập trung tách chiết vi rút từ tuyến tiêu hóa đã mang l¿i nhiều °u điểm: giúp tăng đá nh¿y phát hiện,

āng RT-PCR [65]. Quy trình tách chiết vi rút từ NTHMV gồm các giai đo¿n: ly giÁi

dāng cho quá trình tách chiết thông th°ång từ 1,5g đến 2g tuyến tiêu hóa. Các

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

<i>Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV </i>

Đệm kiềm,

Hiện nay, quy trình tách chiết NoV và HAV theo tiêu chu¿n ISO

Tây Ban Nha sử dāng bá kit NucleoSpin RNA virus (Macherey-Nagel, Dürem, Germany) đã đem l¿i hiệu quÁ phát hiện cao [68]. Đáng chú ý, bằng việc sử dāng

hÿp giữa proteinase K và h¿t từ silica cũng đã đ°ÿc sử dāng trong nghiên cāu xác đßnh HAstV trong mÁu NTHMV cÿa Suffredini năm 2020 [69].

theo quy trình đ°ÿc nêu trong tiêu chu¿n ISO 15216-1:2013 là hoàn toàn khÁ thi.

gây bệnh truyền qua thực ph¿m có nguy c¡ cao trong NTHMV (NoV, HAV, HEV,

quÁ kinh tế.

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

<b>1.3.2. Cỏc phÂng phỏp xỏc ònh vi rút </b>

<i>1.3.2.1. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng phiên mã ngược (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) </i>

Ph°¡ng pháp khuếch đ¿i đẳng nhiệt thơng qua cÃu trúc vịng phiên mã ng°ÿc (RT-LAMP) là ph°¡ng pháp khuếch đ¿i đẳng nhiệt đ°ÿc sử dāng phổ biến nhÃt trong sá các kỹ thuật khuếch đ¿i đẳng nhiệt axit nucleic hiện có; vãi kỹ thuật này, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã đ°ÿc đ¡n giÁn hóa thêm mát b°ãc. Ra đåi vào năm 2000, kỹ thuật RT-LAMP sử dāng đặc tính chuyển vß m¿ch cÿa

māc tiêu [71] (Hình 1.6). Nhå việc t¿o ra các cÃu trúc vòng đ¡n nhánh (loop

qua giai on bin tớnh nh ỗ k thut PCR. Ngoi ra, khÁ năng phát hiện trực tiếp sÁn ph¿m cÿa phÁn āng LAMP không cần điện di là mát trong các °u điểm nổi trái

<i>Hình 1.6. Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP [72] </i>

Cơng trình đầu tiên sử dāng kỹ thuật RT-LAMP để phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m là nghiên cāu cÿa Fukuda và các cáng sự vào năm 2006 [73]. Dựa trên việc sử dāng gen māc tiêu là vùng đi từ đầu C cÿa gen mã hóa RNA-dependent RNA polymerase đến đầu N cÿa gen mã hóa VP1 để xác đßnh NoV, nghiên cāu đã đ¿t đ°ÿc đá nh¿y trong khoÁng 10<small>2</small>-10<sup>3</sup> phiên bÁn/phÁn āng tùy thuác vào kiểu gen. Khi đ°ÿc thử nghiệm trên các mÁu phân từ các vā dßch, đá t°¡ng đồng kết quÁ giữa ph°¡ng pháp RT-LAMP và RT-PCR đ¿t gần 100%. Trong mát nghiên cāu t°¡ng tự, Yoda và các cáng sự (2007) đã thiết kế 3 tổ hÿp mồi để

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

GIII ít gặp. Đá nh¿y cÿa ph°¡ng pháp RT-LAMP dao đáng từ 7-200 phiên

l°ÿng vi rút lãn.

<i>1.3.2.2. Phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (Reverse transcription polymerase chain reaction) </i>

dāng phổ biến nhÃt trong sá các kỹ thuật khuếch đ¿i axit nucleic để phát hiện vi rút trong NTHMV hiện nay. Kỹ thuật RT-PCR gồm hai giai đo¿n chính: giai đo¿n thā

Reverse-transcriptase (RT) và giai đo¿n thā hai, khuếch đ¿i DNA bằng enzyme tổng hÿp DNA polymerase. RNA tr°ãc tiên đ°ÿc cô đặc và tinh s¿ch để lo¿i bß các

đ¿i. Các mồi đặc hiệu đ°ÿc sử dāng để khuếch đ¿i chính xác các trình tự māc tiêu, phân biệt vãi các vi rút và vi khu¿n khác có thể có mặt trong mu. Lý tỗng nht, mỏt cp mi cú th bao phÿ tÃt cÁ các biến thể cÿa chÿng vi rút, những mồi vãi

<i>1.3.2.3. Phương pháp RT-PCR thời gian thực (Real-time RT-PCR) </i>

T°¡ng tự nh° kỹ thuật RT-PCR, tr°ãc tiên mRNA đ°ÿc chuyển sang cDNA nhå enzyme phiên mã ng°ÿc Reverse-transcriptase (RT); tiếp theo đó, phÁn āng

đầu tiờn vo nm 1996 bỗi Ken Livak và các cáng sự thuác công ty Applied

đã trỗ thnh bóc tin lón trong cụng ngh sinh hỏc cÿa thế kỷ 20 [79]. Hình 1.7 thể hiện nguyên tắc phÁn āng Real-time PCR.

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<i>Hình 1.7 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR [79] </i>

Khác vãi phÁn āng PCR thơng th°ång, Real-time PCR có khÁ năng phát hiện và đßnh l°ÿng trực tiếp sÁn ph¿m PCR sau mßi chu kỳ cÿa phÁn āng. PhÁn āng Real-time PCR đ°ÿc thực hiện trong mát thiết bß gia nhiệt có khÁ năng chiếu sáng từng mÁu vãi mát chùm ánh sáng có chiều dài b°ãc sóng nhÃt đßnh. Bên

āng. Nh° vậy, bên c¿nh quy trình PCR thông th°ång cÿa phÁn āng tổng hÿp

nh¿y, đá đặc hiệu, đá lặp l¿i, giÁm thåi gian phân tích và h¿n chế hiện t°ÿng

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

<i>1.3.2.4. Đánh giá các phương pháp phát hiện vi rút gây bệnh </i>

¯u điểm và nh°ÿc điểm cÿa các ph°¡ng pháp xác đßnh vi rút gây bệnh

<i>Bảng 1.2 Nhận xét các phương pháp xác định vi rút gây bệnh thực phẩm </i>

<i><b>RT-LAMP </b></i> Khơng u cầu thiết bß cồng kềnh, có thể thực hiện t¿i hiện tr°ång

Thiết kế mồi phāc t¿p, khơng có khÁ năng đßnh l°ÿng

[74]

<i><b>RT-PCR </b></i> Giãi h¿n phát hiện thÃp Khơng có khÁ năng đßnh l°ÿng Đá nh¿y, đá đặc hiệu phā thuác vào hiệu quÁ các giai đo¿n chu¿n bß và mồi phÁn āng

[82]

<i><b>Real-time RT-PCR K</b></i>ết quÁ hiển thß trực tiếp, khơng cần khẳng đßnh sau giai đo¿n PCR.

Có thể đßnh l°ÿng

Đá nh¿y, đá đặc hiệu phā thuác vào hiệu quÁ các giai đo¿n chu¿n bß và mồi phÁn āng.

[82]

¯u điểm và nh°ÿc điểm ca cỏc phĂng phỏp trỡnh by ỗ Bng 1.2 ó đ°ÿc

ph°¡ng pháp phát hiện NoV trên 244 mÁu bệnh ph¿m cÿa Rabenau và cáng sự đã

kit và Cepheid NoV Primer&Probe Set) vãi ph°¡ng pháp ELISA trên 61 mÁu bệnh

cáng sự xác đßnh Rotavirus trên 108 mÁu bệnh ph¿m bằng năm ph°¡ng pháp: ph°¡ng pháp ELISA, ph°¡ng pháp kính hiển vi điện tử, ph°¡ng pháp RT-PCR và ph°¡ng pháp Real-time RT-PCR th°¡ng ph¿m, cho kết quÁ tỉ lệ mÁu d°¡ng tính

đá đặc hiệu và đá nh¿y cao nhÃt, đ°ÿc °u tiên sử dāng trong phát hiện và đßnh l°ÿng các vi rút từ NTHMV.

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Năm 2013, Tổ chāc tiêu chu¿n quác tế ISO (International Organization for Standardization) đã cơng bá quy trình chu¿n đßnh l°ÿng NoV và HAV trong mÁu

cầu có đßnh h°ãng hiệu q h¡n trong nghiên cāu về nhóm các vi rút gây bệnh

T¿i Việt Nam, quy đßnh về việc giám sát đßnh kỳ vi rút trong NTHMV đã đ°ÿc nêu t¿i KhoÁn 3 Điều 19 Thông t° sá 33/2015/TT-BNNPTNT cÿa Bá Nông

phép tiêu thā trực tiếp làm thực ph¿m d°ãi d¿ng t°¡i sáng; đồng thåi các mÁu thu

đá nh¿y lý thuyết đ¿t đến ng°ỡng 1 bÁn sao/phÁn āng là kỹ thuật phù hÿp nhÃt đáp āng quy đßnh về giám sát vi rút trong NTHMV hiện nay [85].

<b>1.4. Các quy trình phát hiån và đßnh l°ÿng vi rút trong nhuyãn thá hai mÁnh vá dÿa trên kÿ thuÃt Real-time RT-PCR </b>

trong xác đßnh NoV và HAV thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện tác nhân HAstV và HEV cịn riêng lẻ. Các thơng sá chi tiết cÿa phÁn āng Real-time

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

<i>Bảng 1.3 Tổng hợp các bộ mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu phát hiện NoV, HAV, HEV và HAstV </i>

NoV GI

NoV GII

HAV

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

HAstV

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

<i>Bảng 1.4 Chu trình nhiệt của các phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện NoV, HAV, HEV, HAstV </i>

<b>Thụng tin bò mòi gỗc (Tỏc gi, nm cụng bỗ) </b>

<b>Chu trỡnh nhiồt </b>

<b>TLTK Phiờn mó </b>

HEV

HAstV

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

BÁng 1.3 và BÁng 1.4 thể hiện thơng tin về bá mồi, mÁu dị và chu trình nhiệt cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR sử dāng trong các nghiên cāu phát hiện NoV,

và HAV đã đ°ÿc mơ tÁ trong quy trình chu¿n ISO 15216-1:2013; theo đó phÁn āng

giao nhau giữa ORF1 và ORF2, trong khi bá mồi xác đßnh HAV tập trung vào vùng 5’NCR, đều là vùng bÁo thÿ cÿa các chÿng vi rút này. Các b°ãc cÿa phÁn āng Real-

Đái vãi HEV, theo kết quÁ khÁo sát cÿa Tổ chāc Y tế thế giãi WHO (World

đ¿i đo¿n gen vói kớch thóc 69bp ỗ vựng ORF3 l bỏ mồi đ°ÿc sử dāng nhiều nhÃt trong các nghiên cāu phát hiện HEV [93]. Năm 2013, trong nghiên cāu so sỏnh 5 bỏ

bit ỗ nhit ỏ giai on phiờn mã ng°ÿc [89]. Ngoài bá mồi cÿa Jothikumar năm 2006, bá mồi cÿa Schlosser thiết kế năm 2014 [87] khuếch i 81bp ỗ vựng ORF3

nóc thi vói quy trình tham khÁo quy trình chu¿n ISO 15216-1:2013 [88]. ỉ

RT-PCR và có mát sá khác biệt so vãi quy trình chu¿n nh°: nhiệt đá và thåi gian cÿa giai đo¿n phiên mã ng°ÿc (nhiệt đá và thåi gian thÃp h¡n so vãi quy trình chu¿n); thåi gian cÿa giai đo¿n ho¿t hóa enzyme polymerase (so vãi quy trình

m¿ch cao h¡n); đặc biệt, bá mồi cÿa Jothikumar sử dāng trong nghiên cāu này đã đ°ÿc kết hÿp vãi chu trình khuếch đ¿i rút ngắn xuáng hai b°ãc thay vì ba b°ãc nh°

</div>