Tải bản đầy đủ (.pdf) (142 trang)

đặc điểm sinh học phân tử của haemophilus influenzae typ b (hib) phân lập từ bệnh nhi viêm màng não

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.78 MB, 142 trang )

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Giống vi khuẩn Haemophilus là một trong những loại vi khuẩn ký sinh
ở đường hô hấp người và một số loài động vật. Loài H. influenzae (Hi) là căn
nguyên của một số bệnh nhiễm trùng ở người (có thể từ viêm đường hô hấp
cho đến viêm màng não). Hi typ b (Hib) đã được thế giới xác định là một
trong những căn nguyên chớnh gõy viờm màng não (VMN) do vi khuẩn, đặc
biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [13], [78].
Tại các nước phát triển như khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, Châu Úc hầu hết
những nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ mang Hib ở họng rất cao ở trẻ nhỏ, đặc
biệt là những trẻ được chăm sóc tại các trung tâm giữ trẻ ban ngày có thể
mang Hib đến 15% [41], [58]. Bên cạnh đó, Hib cũng được đánh giá là
nguyên nhân hàng đầu gõy cỏc bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ như
viêm màng não (VMN), viêm phổi để lại di chứng và tỷ lệ tử vong cao
(khoảng 10%). Gánh nặng bệnh tật do Hib đã giảm đáng kể nhờ có vacxin
phòng bệnh tại các nước này [78]. Tuy nhiên, một số nước trên thế giới sau
khi đánh giá quá trình thực hiện phòng bệnh do Hib bằng vacxin đã cho thấy
tỷ lệ thất bại của vacxin cũng không nhỏ. Xuất phát từ vấn đề này, đã có
nhiều nghiên cứu về đặc điểm học phân tử (phổ biến nhất là sử dụng kỹ thuật
PFGE) của Hib được tiến hành để đỏnh giá dịch tễ học phân tử của vi khuẩn
này [71], [90], [95], [101], [102].
Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang
vi khuẩn Hi nói chung [1], tỷ lệ mắc VMN do Hi (chưa có điều kiện xác định
typ huyết thanh) ở trẻ dưới 5 tuổi [6]. Cho thấy tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi mang Hi
chiếm 21,4-35,5% [4] và Hi là căn nguyên hàng đầu gây VMN (50-60% các
trường hợp VMN xác định được vi khuẩn) ở trẻ nhỏ [6]. Từ năm 1999 đến
2004, một số nghiên cứu của Phan Lê Thanh Hương cùng cộng sự đã đưa ra
tỷ lệ VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà Nội và một số tỉnh phớa Bắc [6],
2
[87], cũng như tìm hiểu về sự phân bố theo biotype, genotype (phân loại bằng
PFGE) và gen mã hóa tổng hợp enzym β−lactamase của Hib phân lập từ trẻ


viêm màng não ở trẻ dưới 5 tuổi đã được thực hiện [6]. Tuy nhiên, số lượng
chủng Hib sử dụng trong nghiên cứu vẫn còn hạn chế và chưa có những so
sánh với những chủng Hib phõn lập được ở trẻ khỏe mạnh. Vì vậy, để góp
phần tìm hiểu nguồn gốc, đặc điểm sinh học phân tử của những chủng Hib
gõy viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh ở lứa tuổi mẫu giáo
có mang Hib. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Đặc điểm sinh học phân tử của
Haemophilus influenzae typ b (Hib) phân lập từ bệnh nhi viêm màng não
mủ dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại Nhà trẻ - Mẫu giáo”, nhằm thực hiện
3 mục tiêu:
1. Xác định biotype, genotype, khả năng sinh enzym
β
-lactamase
của các chủng Hib phân lập được từ bệnh nhi viêm màng não mủ
và trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi.
2. Đỏnh giá mối liên quan về đặc điểm sinh học và ADN giữa Hib
gõy viờm màng não mủ ở trẻ nhỏ với Hib được phân lập từ trẻ
khỏe mạnh mang vi khuẩn.
3. Xác định tỷ lệ mang Hib ở trẻ khỏe mạnh tại Nhà trẻ - Mẫu giáo
được điều tra.
3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Haemophilus influenzae typ b (Hib)
1.1.1. Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi
Haemophilus influenzae (Hi) được phân lập lần đầu bởi Richard
Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi - cúm trong đại dịch cúm
năm 1890. Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh
cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria). Mãi cho đến khi
đại dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết Hi chỉ là
thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào

cũng gây bệnh. Đến năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của
bệnh cúm, vai trò của Hi mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm,
còn Hi chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô
hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm [11], [32], [78]. Vì vậy, vi khuẩn
này có tên Haemophilus influenzae được xuất phát từ nhu cầu đòi hỏi môi
trường giàu chất dinh dưỡng, bao gồm các yếu tố phát triển có mặt ở máu
(Haemophilus: ưa mỏu), đặc biệt là yếu tố X (hemin) và yếu tố V (NAD hoặc
NADP). Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử với bệnh cúm
(influenzae: bệnh cúm). Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy [11], [78].
1.1.2. Đặc điểm sinh học đặc trưng của Hib
1.1.2.1. Hình thể và cấu trúc [11], [78]
Hi là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực
khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5µm) nhưng uốn cong
ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy nhiên khi chúng ở dịch não tuỷ, hình thể
của Hi có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.1).
Hi bắt màu Gram õm, khụng di động và không hình thành nha bào. Thành tế
4
bào của vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự
như thành của những vi khuẩn Gram õm khỏc. Tuy nhiên, Hi được phân loại
thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable khụng xác định
được typ huyết thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh).
Loài Hi (Hi) có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh
(serotype) từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ
polysaccharide do gen qui định [11], [32], [78]. Vỏ bọc typ b là một dạng
trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol -
phosphate (PRP). Những polysaccharide bề mặt này có liên quan mạnh mẽ
đến tớnh gõy độc của vi khuẩn, đặc biệt là Hi typ b (Hib), nguyên nhân của
nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả VMN
(chiếm trên 90% các ca nhiễm khuẩn lan tràn do Hib).
Hình 1.1 Hình thể của Hi trên tiêu bản nhuộm gram dịch não tuỷ dưới

kính hiển vi quang học [89].
Trên thực tế lõm sàng, nếu nhuộm gram bệnh phẩm dịch nóo tủy từ
bệnh nhõn mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình
thái và nhiều bạch cầu đa nhõn thì đõy là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho
chẩn đoán sớm VMN do Hi [78].
Hi
Bạch cầu đa nhân
5
1.1.2.2. Sức đề kháng [117]
Hi là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh. Trong
bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp,
để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này
một cách dễ dàng.
Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi khuẩn này nên được vận chuyển về
phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ, hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt độ phòng
thí nghiệm (24 - 28
o
C). Nếu là tăm bông bệnh phẩm phải giữ trong môi
trường vận chuyển (môi trường bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8
o
C tối đa
24 giờ trong môi trường này.
1.1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy [11]
Điều kiện nuôi cấy:
Hi là loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Chỳng khụng mọc trờn cỏc mụi
trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai
yếu tố X và V. Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần tuý mà là hỗn hợp
của các chất màu có chứa sắt (như hemin và hematin); nếu không có cả hai
yếu tố này trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn Hi không phát triển được.
Hi dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase, peroxidase

và cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử. Máu và các sản phẩm của
máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản
xuất yếu tố X. Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà
Hi cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ cần thiết là 0,1
– 1,0 µg/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng
một phần chúng nằm bên trong tế bào. Mặt khác, trong máu của nhiều loài
động vật có enzym NADase, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do.
Thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế bào và enzym NADase bị
nhiệt phá huỷ. Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 µg/ml.
6
Hi hiếu khí, đòi hỏi môi trường nuôi cấy có CO
2
(2-5%) khi mới phân
lập. Mọc tốt trờn mụi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23-
39
0
C, tối ưu là 37
0
C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu mọc trờn cỏc
loại thạch mỏu khỏc (ví dụ máu thỏ) thỡ khụng gõy tan máu và khuẩn lạc nhỏ
hơn nhiều so với trên chocolate trong cựng cỏc điều kiện nuôi cấy. Cũng trên
thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc Hi mọc xung quanh các khuẩn lạc
Staphylococcus aureus bội nhiễm rất to, trong khi đó ở những vùng xa thì
khuẩn lạc hoặc là không mọc, hoặc là rất bé. Hiện tượng này gọi là hiện tượng
“vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đó
giúp Hi phát triển được thạch mỏu thụng thường.
Hình 1.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc của vi khuẩn Hi mọc xung
quanh khuẩn lạc của S. aureus trên môi trường thạch mỏu thỏ
Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc:
Để nuôi cấy Hi, có 3 loại môi trường có thể được được sử dụng [11],

[32], [78], [117]:
- Thạch chocolate có hoặc không có 300µg bacitracin/ml môi trường
(có tác dụng ức chế các vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để phõn lập Hi.
S. aureus
H. influenzae
7
Đõy là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy và phõn lập
vi khuẩn này.
- Thạch máu thỏ tươi 7%
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí
trường 5% CO
2
(nếu không có tủ ấm CO
2
, môi trường nuôi cấy được đặt trong
một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này. Sau khi ngọn
nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO
2
) ở 37
o
C trong
thời gian 18 – 24 giờ.

Hình 1.3: Khuẩn lạc Hi mọc trờn mụi trường chocolate
Sau 16 – 18 giờ nuôi cấy, Hi phát triển thành những khuẩn lạc bóng
mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1- 2mm và khụng gõy tan huyết. Vi khuẩn Hib
luôn vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu
vào và có đường kính lớn hơn. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần
nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol). Sau 24 – 48 giờ, trạng thái
mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có thể tính chất

bắt màu Gram thay đổi.
Trờn môi trường lỏng, Hi thường phát triển làm đục môi trường. Tình
trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trờn mụi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác
định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ).
8
Haemophilus influenzae được phân biệt với những loại Heamophilus
khác ở các đặc điểm sau đây:
Tính chất
Loài
Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO
2
Hi - + + +
H. parainfluenzae - - + -
H. hemolyticus + + + -
H. parahemolyticus + - + ±
H. aphrophilus - + - +
H. paraphrophilus - - + +
Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học đặc trưng để phân biệt Hi với các
Haemophilus khác.
Tính chất sinh hóa đặc trưng của Hi :
Tớnh chất sinh hóa đặc trưng của Hi là nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu
tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy. Tớnh chất này có thể được
xác định bằng một trong các thử nghiệm sau [11], [32], [78], [117]:
Hình 1.4: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi
khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển.
1.1.3. Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và biotype của
Haemophilus influenzae
9
1.1.3.1. Đặc điểm phân loại Hi theo serotype (typ huyết thanh) [11], [32], [78]
Năm 1930, Hi được xác định thành 2 nhúm chớnh, đó là loài không vỏ

(khụng xỏc được typ huyết thanh - non typeable) và loài có vỏ (xác định được
typ huyết thanh - typeable). Dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên của vỏ
polysaccharide, vi khuẩn Hi có vỏ được chia ra thành 6 typ huyết thanh từ a
đến f. Theo hầu hết các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Hi gõy bệnh thuộc loại
có vỏ, nhiều nhất là Hi typ b.
1.1.3.2. Đặc điểm phân loại Hi theo biotype (typ sinh học)
Biotype
Các tính chất hoá học
Test Urease Test Indol Ornithin decarboxylase (ODC)
I + + +
II + + -
III + - -
IV + - +
V - + +
VI - - +
VII - + -
VIII - - -
Bảng 1.2: Phân loại Haemophilus influenzae theo typ sinh học
Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng một số thử nghiệm sinh hoá để
xác định biotype và đặc điểm sinh học của các loài Haemophilus dựa trên kết
quả của 3 thử nghiệm sinh hoá: tìm khả năng sinh Indol, hoạt động của hai
enzym Urease và Decarboxylase của vi khuẩn. Trước đõy, Kilian nghiên cứu
và chia Hi thành 4 biotype từ I đến IV. Những biotype này độc lập với typ
huyết thanh của vi khuẩn đó, bởi vỡ các chủng Hi không có vỏ cũng cho kết
quả tương tự với ba phản ứng sinh hoá ở trên. Sau này, cũng với những thử
nghiệm tương tự, Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến VIII. Vì vậy, Hi
được chia ra làm 8 typ như sau theo tiêu chuẩn của Killian (bảng 1.2) [32].
1.1.4. Miễn dịch [17], [78]

Kháng thể (Kháng nguyên thân)

Kháng nguyên thân (LPS và protein màng ngoài)
Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate)
Kháng thể (Kháng nguyên vỏ)
Đại thực bào
Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng
thể đặc hiệu của kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [78].
10
Miễn dịch tự nhiên đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự hợp nhất
phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn
dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và quá trình hoạt
hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt vi
khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch qua
trung gian tế bào lympho T. Trong đó khó có thể đánh giá rạch ròi cơ chế
miễn dịch nào là quan trong nhất trong những cơ chế bảo vệ cơ thể vật chủ.
Tuy nhiên, hầu hết các cá thể có được khả năng miễn dịch bảo vệ trong những
năm đầu của cuộc đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn. Khả
năng miễn dịch thu được một cách tự nhiên này, đó là kết quả của đáp ứng
với sự xâm nhiễm họng - mũi của Hib cũng như sự xâm nhiễm không triệu
chứng ở ruột của hệ vi khuẩn đường ruột bình thường, dẫn đến có phản ứng
chéo với kháng nguyên Hib. Mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa nguy cơ mắc
11
bệnh nhiễm khuẩn do Hib đặc thù đối với tuổi và nồng độ kháng thể tự nhiên
kháng Hib có được trong những năm tháng đầu của cuộc đời. Đặc điểm này
cũng đã nêu lên được tầm quan trọng của kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể
khỏi bệnh nhiễm khuẩn lan tràn do Hib. Hiện tượng trên được mô tả đầu tiên
bởi Fothergill và Wright năm 1933 [36], người ta biết trẻ sơ sinh đã có được
kháng thể diệt khuẩn Immunoglobulin G (IgG) từ mẹ, kháng thể này yếu dần
đi trong những tháng tuổi đầu tiên, đồng thời với nguy cơ nhạy cảm theo tuổi
giữa tháng tuổi thứ 6 cho đến 2-4 tuổi nên để bảo vệ cơ thể cần phải thông
qua việc gây miễn dịch chủ động.

Mặc dù đặc điểm miễn dịch tự nhiên đối với vi khuẩn Hib là miễn dịch
đáp ứng với vài loại kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn này, song kháng thể
kháng polysaccharide vỏ thuộc typ b (PRP) dường như có tầm quan trọng
nhất. Đối với loài Hi typ b, 90% tổng số những kháng thể kháng PRP có khả
năng hoạt hóa bổ thể giúp tăng hoạt động thực bào và diệt vi khuẩn nhờ
opsonin hóa để bảo vệ cơ thể. Ở người, trước khi có kháng sinh, việc sử dụng
thụ động globulin miễn dịch chống lại Hib đã là phương pháp để điều trị hiệu
quả bệnh nhiễm khuẩn lan tràn này. Tuy nhiên, kháng nguyên vỏ của Hib lại
không được nhận biết bởi đại thực bào và tế bào lympho T nhưng lại kích
thích cỏc dũng tế bào lympho B đặc hiệu, do đó được gọi là kháng nguyên
độc lập với tế bào T. Vì vậy, kháng nguyên vỏ của Hib sẽ bị hạn chế về khả
năng đáp ứng miễn dịch, không hoạt hóa được các tế bào lympho T hỗ trợ đặc
hiệu. Tế bào T hỗ trợ tác động đến sự chín muồi, biệt hóa và tăng sinh các tế
bào B để những tế bào này trở thành tương bào sản xuất kháng thể. Tế bào T
hỗ trợ cũng có thời gian sống dài và tạo nên trí nhớ miễn dịch cần thiết cho
đáp ứng tăng cường tiếp theo khi cơ thể tiếp xúc trở lại với kháng nguyên
này. Kết quả của những đáp ứng kháng thể thiếu sự tham gia của tế bào T thì
hiệu lực miễn dịch sẽ thấp. Để khắc phục nhược điểm này, thành phần PRP đã
12
được cộng hợp (liên kết cộng hóa trị) với nhiều loại protein có tính sinh miễn
dịch làm tăng cường khả năng nhận biết của đại thực bào và tế bào T trong
sản xuất vacxin, để có những ưu điểm như sau:
1) Tạo được nồng độ kháng thể cao hơn, đặc biệt ở trẻ nhỏ.
2) Khi nhắc tiêm nhắc lại, vacxin sẽ kích thích miễn dịch tăng lên, vì
thế đõy là một phương pháp làm tăng tối đa tính miễn dịch.
3) Đáp ứng miễn dịch chín muồi hơn, đặc thù hơn bởi sự chiếm ưu thế
của các kháng thể IgG-1.
4) Việc dùng trước hay dùng đồng thời các protein mang (dạng hapten-
như độc tố uốn ván hoặc bạch hầu) đã tăng cường đáp ứng của tế bào T, nhờ
đó làm tăng tối đa đáp ứng miễn dịch với PRP khi cộng hợp với chất mang.

1.1.5. Khả năng gõy bệnh VMN của vi khuẩn Hib
1.1.5.1. Đặc điểm sinh bệnh học [13]
Hib lây truyền qua tiếp xúc hoặc hít phải các chất bài tiết bị nhiễm
khuẩn của đường hô hấp. Sau khi định cư ở vùng mũi họng, vi khuẩn có thể
gõy nhiễm khuẩn đường hô hấp, lan ra tổ chức lân cận hoặc xâm nhập vào
dòng máu. Người ta cho rằng vi khuẩn từ mũi họng vào dòng máu do kết quả
của sự vận chuyển trong những tế bào thực bào từ niêm mạc vào các mạch
bạch huyết. Trong máu, những vi khuẩn Hib có vỏ PRP kháng lại được hiện
tượng đại thực bào và hoạt tính bổ thể. Ở trạng thái nhiễm khuẩn huyết, Hib
có thể lan tràn và vượt qua hàng rào mỏu – não. Vị trí Hib từ máu vào dịch
não tủy là đám rối màng mạch, nơi có sự phân bố mạch cao. VMN xảy ra
thường có tương quan trực tiếp tới thời gian và tính chất nghiêm trọng của
nhiễm trùng huyết (> 10
3
đơn vị tạo khuẩn lạc: CFU – Colony Formed Unit).
1.1.5.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh VMN [13]
Trên lâm sàng, VMN do Hi typ b có thể tiến triển âm ỉ trên vài ngày,
thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc đột ngột tiến triển
13
trong vài giờ. Những dấu hiệu và triệu chứng của VMN do vi khuẩn này cũng
giống hệt như triệu chứng và dấu hiệu gặp trong VMN do các vi khuẩn gây
bệnh khác.
Những dấu hiệu không đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán
ăn, nôn, suy hô hấp và rối loạn tõm thần. Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu,
cứng gáy, sợ ánh sáng. Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig và cứng gáy đặc
trưng ít thấy ở trẻ dưới 15 tháng tuổi. Thêm vào đó, những dấu hiệu khu trú
có thể xuất hiện sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước khi nhập viện.
Tỷ lệ tử vong bởi VMN do Hi typ b khoảng 5% và tỷ lệ mắc bệnh kéo
dài là 15 – 30%.
1.1.6. Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm VMN do vi khuẩn Hib

Hi là loại vi khuẩn khó nuôi cấy, chỉ mọc trên môi trường giàu chất
dinh dưỡng có chứa đầy đủ hai yếu tố phát triển X (hemin), V (NAD hoặc
NADP) và không có khả năng mọc trờn cỏc môi trường thông thường. Vì
vậy, việc chẩn đoán VMN do Hib chủ yếu được thực hiện ở bệnh viện tuyến
tỉnh hoặc tuyến Trung ương dựa vào phương pháp nuôi cấy phân lập nên gặp
rất nhiều khó khăn. Thêm vào đó, đõy cũng là phương pháp thường được áp
dụng nhất ở Việt Nam nhưng khả năng phát hiện căn nguyên vi khuẩn Hib lại
có độ nhạy thấp (khoảng xấp xỉ 50%) [8].
Hiện nay, bên cạnh phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống,
những phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cũng được áp
dụng để phát hiện Hib trong chẩn đoán VMN. Tuy nhiên, hầu hết các phương
pháp hiện đại có thể giúp chẩn đoán nhanh Hib gây bệnh, nhưng lại gặp hạn
chế là không xác định được mức độ nhạy cảm với kháng sinh. Vì vậy, phương
pháp nuôi cấy phân lập truyền thống vẫn song hành cùng những phương pháp
chẩn đoán hiện đại.
1.1.6.1. Phương pháp nuôi cấy phân lập và xác định vi khuẩn Hib
14
Chẩn đoán vi khuẩn Hib từ bệnh phẩm dịch não tủy [117]
- Bệnh phẩm: lấy bệnh phẩm dịch não tủy (DNT) phải được thực hiện
bởi bác sĩ chuyên khoa có kinh nghiệm trong điều kiện và thủ thuật vô trùng.
Những trường hợp nghi ngờ bệnh nhân mắc VMN, DNT là bệnh phẩm tốt
nhất được sử dụng cho phân lập hoặc phát hiện căn nguyên gây bệnh. Lấy
dịch não tủy nên chỉ sử dụng cho việc chẩn đoán và được cấy trực tiếp vào cả
hai đĩa thạch nuôi cấy (01 đĩa thạch máu và 01 đĩa thạch chocolate). Ngay sau
khi được lấy, bệnh phẩm nên được đưa ngay đến phòng xét nghiệm vi sinh để
tiến hành các kỹ thuật chẩn đoán càng sớm càng tốt (trong vòng 1 giờ sau khi
lấy bệnh phẩm). Không được để DNT bị ánh sáng trực tiếp chiếu vào hoặc để
nhiệt độ quỏ núng hay quá lạnh. Nếu bệnh phẩm không thể vận chuyển sớm
về phòng xét nghiệm thì có thể bơm bệnh phẩm DNT vào môi trường T-I
(Trans-Isolate medium) và để qua đêm ở nhiệt độ 35

o
C. T-I là môi trường hai
pha, rất thuận tiện cho nuôi cấy nguyên thủy N. meningitidis và các loại vi
khuẩn gây bệnh khỏc cú trong bệnh phẩm DNT hay bệnh phẩm máu.
- Nhuộm gram bệnh phẩm DNT:
Đõy là một phương pháp chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như các vi khuẩn
khỏc gõy VMN. Có thể thực hiện bởi kỹ thuật nhuộm gram từ cặn dịch não
tủy hoặc bằng cách phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT bởi
kỹ thuật ngưng kết hạt latex (sẽ đề cập ở phần 1.1.6.2). Kết quả dương tính
của một trong hai kỹ thuật này đều cho thấy bằng chứng nhiễm trùng, thậm
chí nuôi cấy có thể thất bại.
+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.
+ Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một
ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy.
+ Tiến hành nhuộm gram một tiêu bản từ cặn bệnh phẩm DNT vừa ly
tâm. Để khô tiêu bản.
15
+ Soi tiêu bản ở vật kớnh ì 100 để tìm vi khuẩn gây bệnh. Nếu trên tiêu
bản xuất hiện các trực khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái (có thể ở dạng cầu
trực khuẩn, trực khuẩn hoặc mảnh dài như sợi chỉ) thì đõy là dấu hiệu gợi ý
quan trọng định hướng chẩn đoán VMN do Hib.
- Nuôi cấy:
+ Lấy đầy một ăng cặn bệnh phẩm nuôi cấy vào mụt trường thạch
chocolate có bổ sung IsoVitalex.
+ Ủ ở 37
o
C với khí trường 5 - 10% CO
2
khoảng 18-24 giờ. Nếu có
khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch chocolate sau khi ủ, quan sát hình thái khuẩn lạc

của Hib thường có đặc điểm: khuẩn lạc có kích thước 1,0-1,5mm, vồng nhẹ,
sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và khụng gõy tan máu.
Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc
biệt (hăng indol).
- Xác định
+ Nhuộm gram: nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch
chocolate sau khi nuôi cấy từ dịch não tủy, nhận thấy trên tiêu bản có các trực
khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái.
+ Tiến hành thử nghiệm xác định nhu cầu đòi hỏi 2 yếu tố phát triển
(growth factors) X và V: thử nghiệm X, V dương tính hoặc thử nghiệm “Vệ
tinh” với chủng S. aureus ATCC dương tính.
+ Tiến hành định typ huyết thanh để xác định Hib bằng kháng huyết
thanh mẫu [32], [78].
+ Tiến hành xác định biotype (typ sinh học) các chủng Hib phân lập
được bằng thanh xác định tớnh chất sinh vật hóa học Api 10s (bioMộrieux)
[8].
Chẩn đoán vi khuẩn Hib từ bệnh phẩm máu
16
Trong chẩn đoán VMN, ngoài bệnh phẩm dịch não tủy thường được sử
dụng trong chẩn đoán thì bệnh phẩm máu cũng được sử dụng với tỷ lệ dương
tính khá cao [8], [117].
- Quy trình cấy máu gồm các bước như sau: [117]
+ Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, bao gồm: găng tay, bơm kim tiêm vô
khuẩn, dây garo, gạc vuụng, bụng vờ trũn vô khuẩn, băng vết thương nhỏ,
môi trường cấy máu và dung dịch sát khuẩn (cồn iod hoặc povidone-iodine,
có thể dùng cồn 70
o
). Kích thước của kim phụ thuộc vào vị trí lấy bệnh phẩm
và kích thước của tĩnh mạch. Kim cỡ 23, tức là dài 20 – 25mm hoặc kim
bướm thường được dùng cho trẻ em.

+ Chọn một cánh tay và buộc dây garo phía trên vị trí cần lấy máu để
ngăn dòng chảy của máu tĩnh mạch. Tĩnh mạch lớn ở cẳng tay là loại tĩnh
mạch nổi thường được lựa chọn.
+ Rửa sạch vùng da định lấy máu bằng cồn 70
o
và sau đó sát khuẩn
bằng cồn iod hoặc povidone-iodine. Để khô. Nếu cần phải bắt tĩnh mạch lại
thì phải sát trùng nơi lấy bệnh phẩm một lần nữa.
+ Sau khi sát trùng da và để khô, chọc kim vào trong tĩnh mạch với mặt
nghiêng của mũi kim ngửa lên trên. Khi kim đã vào tĩnh mạch, hút máu bằng
cỏch rút từ từ pittong, đều đặn. Sau khi hút đủ lượng máu cần thiết (1-2 ml để
cấy vào 20ml môi trường canh thang dinh dưỡng), tháo bỏ dây garo và đặt
một viờn bụng trũn vô khuẩn đã tẩm cồn lên phía trên mũi kim.
(Chú ý: không để cho không khí lọt vào trong tĩnh mạch)
+ Rút bơm kim tiêm ra và đặt cố định viờn bụng trũn chắc ở vị trí lấy
máu cho đến khi không còn chảy máu.
+ Bơm máu vào môi trường dùng để cấy máu theo nguyên tắc vô trùng
(thông thường nên sử dụng chai cấy máu có môi trường pha chế sẵn của Hãng
Becton – Dickinson) [8].
17
+ Đặt một băng nhỏ lên vết thương. Ngay lập tức vận chuyển bình cấy
máu về phòng xét nghiệm vi sinh. Bình cấy máu có thể được giữ ở nhiệt độ
phòng (20
o
– 25
o
C) khoảng 4-6 giờ trước khi ủ ấm ở 35
o
– 37
o

C, thông khí với
khí trường 5 – 10% CO
2
.
(Chú ý: Bình cấy máu không được giữ trong tủ lạnh. Ủ ấm trong quá
trình vận chuyển có thể sử dụng nhiệt độ 25
o
– 35
o
C).
+ Trong một số trường hợp cần lấy máu để thực hiện phương pháp
chẩn đoán khỏc, nờn lấy vào các ống nghiệm chân không vô trùng.
- Theo dõi và chẩn đoán bình cấy máu [117]
Bình cấy máu được kiểm tra sau 14 – 17 giờ ủ trong tủ ấm và sau đó là
theo dõi hàng ngày cho hết 7 ngày. Bất cứ có xuất hiện đục hay tan máu trong
môi trường đều có thể cho thấy là cấy máu (+), do đó lập tức lắc đều bình cấy
máu và cấy chuyển sang đĩa thạch chocolate theo các bước như sau:
+ Sát khuẩn nút cao su chai cấy máu bằng cồn 70
o
và povidone-iodine.
+ Hút 0,5 ml từ môi trường cấy máu bằng bơm kim tiêm vô trùng và
nhỏ lờn gúc (gần rìa đĩa Petri) đĩa môi trường chocolate.
+ Sử dụng que cấy vô trùng ria cấy theo phương pháp phân vùng. Ủ đĩa
thạch ở 37
o
C với khí trường 5% CO
2
khoảng 18-24 giờ. Nếu trên đĩa thạch có
khuẩn lạc Hib mọc, tiến hành xác định Hib và typ sinh học (như phần chẩn
đoán dịch não tủy)

1.1.6.2. Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT
bằng phương pháp ngưng kết hạt latex [8], [32]
Nguyên lý: Phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide của Hib trong
dịch não tủy bằng kháng thể (đơn giá) kháng vỏ đặc hiệu với Hib được gắn
lên bề mặt gắn hạt latex. Kết quả phản ứng dương tính khi hỗn dịch làm phản
ứng trên lam kính hoặc phiến giấy xuất hiện các hạt ngưng kết; phản ứng âm
tính khi không có hiện tượng ngưng kết xảy ra.
18
Thực hiện kỹ thuật:
- Dụng cụ, hóa chất: Pasteurex Meningitis Hib (KHT đa giá); Bio
Merieux Slidex meningite KIT (HT đa giá)
- Tiến hành kỹ thuật:
+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.
+ Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một
ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy.
+ Đun nước nổi DNT trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 100
o
C/5 phút.
+ Lắc lọ kháng thể mẫu có gắn hạt latex cho đến khi có dung dịch
thuần nhất.
+ Nhỏ một giọt của mỗi loại kháng thể mẫu gắn hạt latex lên lam kính
ở giữa vòng tròn đã được khoanh bằng bút viết kính hoặc phiến giấy dùng
một lần để thực hiện các phản ứng ngưng kết.
+ Nhỏ 30 – 50 àl dịch não tủy vào từng loại kháng thể mẫu đã được
nhỏ lên lam kính hoặc phiến giấy.
+ Xoay tròn lam kính hoặc phiến giấy làm phản ứng 2 – 10 phút (hoặc
dựng mỏy lắc tròn với tần số 100 vũng/ phỳt)
- Đọc kết quả: phản ứng âm tính khi huyền dịch làm phản ứng vẫn đục
và có màu sữa nhạt; phản ứng dương tính khi xuất hiện các hạt ngưng kết xảy
ra trong vòng 2 phút sau khi thực hiện phản ứng và huyền dịch trở nên trong.

1.1.6.3. Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT
bằng kỹ thuật điện di đối lưu [8]
Nguyên lý: Đõy là loại phản ứng kết tủa dựa trên nguyên lý khỏng
nguyên tích điện âm từ giếng ở phía cực âm và kháng thể tích điện dương từ
giếng ở phía cực dương (các Ig ở pH 8,4 di chuyển về cực âm của hệ mao dẫn
theo lực điện thẩm thấu nội) sẽ di chuyển ngược chiều nhau, khi gặp nhau sẽ
hình thành đường tủa đặc hiệu trong gel (thạch điện di).
19
Thực hiện kỹ thuật:
- Dụng cụ, hóa chất:
+ Dụng cụ:
Phiến kớnh 7ì7cm, bàn mức phẳng ngang, bộ đục lỗ thạch, máy điện di,
nguồn cung cấp điện, lò vi sóng.
+ Hóa chất:
/ Kháng huyết thanh thỏ kháng Hib.
/ Kháng nguyên chuẩn polysaccharide của Hib (NIH – Mỹ).
/ Thạch điện di (Sigma); hóa chất pha thạch và đệm điện di (đệm
Bacbital – Sigma). Trong đó, thạch nền: agarose thường được pha 3% trong
nước cất. Thạch điện I (type I - Sigma): 1% trong đệm bacbital pH 8,4.
- Tiến hành kỹ thuật:
+ Phủ một lớp mỏng thạch nền lên phiến kính, phơi khô.
+ Đặt phiến kớnh lờn bàn mức ngang và đổ thạch 1% lên (6ml cho
phiến kớnh 7ì7cm).
+ Để khô, đục giếng trên thạch với kích thước như sau: đường kính
giếng khoảng 2-3mm; khoảng cách từ giếng kháng thể đến giếng bệnh phẩm
là 5mm.
+ Nhỏ hàng trên là kháng thể (kháng huyết thanh) 5àl/ giếng; hàng dưới
nhỏ 5àl bệnh phẩm (dịch não tủy); chứng dương là 5àl polysaccharide typ b
của Hib + 1àl thuốc nhuộm Bromophenol.
+ Đặt vào bể điện di, chạy với tốc độ 8mA/30 phút.

+ Đọc kết quả sau 1-3 giờ dừng chạy điện di, nếu dương tính sẽ thấy
vạch tủa trắng gần phía giếng kháng thể (cực dương).
1.1.6.4. Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong DNT bằng
kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
20
PCR được biết là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả nhanh, nhạy và đặc
hiệu với Hib ở DNT. Hơn thế nữa, kỹ thuật này cũng góp phần nâng cao tối
đa khả năng quản lý các trường hợp viêm màng não nhằm giảm tỷ lệ trầm
trọng, tỷ lệ chết và những phức tạp trong điều trị các bệnh nhiễm trùng xâm
hại do Hib. Tại những cơ sở xét nghiệm lâm sàng, kỹ thuật PCR truyền thống
thường được dùng nhất trong chẩn đoán Hib. Tuy nhiên, hiện nay kỹ thuật
Realtime-PCR cũng đã được sử dụng trong phân loại và xác định Hi nói
chung và Hib nói riêng với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao [8], [60], [63], [79].
Kỹ thuật PCR truyền thống [79]
- Hóa chất và sinh phẩm:
+ Enzym Taq ADN Polymerase 2.5U.
+ dNTPs gồm : ATP, TTP, GTP, CTP.
+ Cặp mồi (primer) được sử dụng để xác định Hib là Haem Right:
/ Primer 1: 5’ CAGTAAATACACCTGTTGCCCCTG 3’.
/ Primer 2: 5’ GCCATTCATCAAATA 3’.
Cặp mồi này tương tự và bổ sung với trình tự acid nucleic của vùng bảo
tồn gen “hpD” đặc hiệu cho typ huyết thanh b của Hi. Cả hai mồi bao gồm
khoảng 24 cặp base (base pair).
+ Thang ADN mẫu dùng trong diện di gen
+ Đệm, nước khử ion và MgCl
2
25mM.
- Các bước chẩn đoán PCR:
+ Tách chiết ADN của Hib trong dịch não tủy:
/ Bằng kỹ thuật vô trùng lấy 100àl DNT cho vào một ống ly tõm sạch,

vô trùng.
/ Cho ống nghiệm chứa DNT cho vào nồi cách thủy đun 100
o
/15 phút.
/ Ly tõm ống nghiệm bệnh phẩm DNT (sau khi đã đun cách thủy) với
tần số 10.000 vòng/ phút ì 5 phút.
21
/ Lấy 10àl nước nổi sau khi ly tõm sử dụng để làm mẫu ADN
+ Tiến hành kỹ thuật:
/ Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích là 50àL, trong đó
chứa: 1,5àL (1,5mM) MgCl
2
; 1àL (0,2 mM) dNTP; 5àL (1X) 10X PCR buffer
(KCl, Tris-HCl, Mg); 0,5àL (2,5U) Taq ADN polymerase; 10àL ADN mẫu
Haemophilus influenzae (ATCC 35056 Difco làm chứng dương), 40àL nước
khử ion và cặp mồi (mồi 1,2: 2 àL hoặc 40pm) cho mỗi ống.
/ Hỗn hợp phản ứng được chạy theo chương trình cài đặt của máy điều
nhiệt (Ependorff, Germany) khoảng 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ cú cỏc thông số
dưới đây: giai đoạn biến tính khoảng 2 phút ở 94
o
C; giai đoạn gắn mồi
khoảng 2 phút ở 56
o
C; giai đoạn kéo dài khoảng 2 phút ở 72
o
C. Trong đó, giai
đoạn biến tính đầu tiên cần 10 phút ở 94
o
C và giai đoạn kéo dài cuối cùng là 8
phút ở 72

o
C. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu ADN sau khi khuếch đại có thể
được giữ ở 4
o
C cho đến khi phân tích. Sản phẩm của phản ứng PCR để chẩn
đoán Hib được phát hiện bởi kết quả điện di trên thạch agarose.
Kỹ thuật Real-time PCR [8], [63]
- Hóa chất và sinh phẩm:
+ QIAamp blood kit (Qiagen, Hilden, Germany)
+ Mồi (primer):
/ Mồi xuôi: 5’-CAAGATACCTTTGGTCGTCTGCTA-3’ (vị trí 5481
đến 5504)
/ Mồi ngược: 5’-TAGGCTCGAAGAATGAGAAGTTTTG-3’ (vị trí
5631 đến 5607)
+ Probe đặc hiệu: 5’-ATGATATGGGTACATCTGTT -3’ (vị trí 5563 đến
5582)
- Các bước chẩn đoán RT-PCR [63]:
22
+ Tách chiết ADN của Hib từ dịch não tủy dựa vào QIAamp blood kit
(Qiagen, Hilden, Germany) theo quy trình của nhà sản xuất.
+ Tiến hành kỹ thuật:
Phản ứng khuếch đại được thực hiện với hỗn hợp phàn ứng có thể tích
tổng là 25àL, chứa 2ìTaqMan universal master mix (Perkin-Elmer-
Biosystems), mỗi primer với nồng độ 400nM, 200nM probe, và 1àl ADN tách
chiết.
Quá trình khuếch đại PCR có thể được thực hiện trên nhiều mẫu giống
nhau dựa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM 7700. Các thông số
chuẩn cho quá trình khuếch đại: 2 phút ở 50
o
C, và 10 phút ở 95

o
C cho 40 chu
kỳ; trong đó với một chu kỳ gồm 15 giây ở 95
o
C và 1 phút ở 60
o
C.
Kết quả của phản ứng RT-PCR được phân tích phần mềm cho hệ thống
phát hiện trình tự, phiên bản 1.7.
1.1.6.5. Đánh giá các kỹ thuật phát hiện Hib trong chẩn đoán VMN
Giá trị chẩn đoán của các kỹ thuật phát hiện Hib gây VMN được giới
thiệu ở trên đó cú một số nghiên cứu, đánh giá và cho thấy độ nhạy, độ đặc
hiệu của từng phương pháp.
- Phương pháp nuôi cấy chẩn đoán Hib thường có độ nhạy không cao
(khoảng 50 – 55%), nhưng độ đặc hiệu là 100%. Ngoài ra, phương pháp này
cũn giỳp cho những nhà vi sinh lõm sàng xác định được mức độ nhạy cảm với
kháng sinh của những chủng Hib gây bệnh phân lập được mà các phương
pháp khác thường không thực hiện được[8].
- Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong dịch não
tủy bằng phương pháp ngưng kết hạt latex là phương pháp thực hiện rất đơn
giản nhưng có độ nhạy và độ đặc hiệu khá cao (độ nhạy 95%, độ đặc hiệu
99,6%) [8].
23
- Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong dịch não
tủy bằng kỹ thuật điện di đối lưu có độ nhạy 97%, độ đặc hiệu 100% [8]
- Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong dịch não
tủy bằng kỹ thuật PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 99% [8], [63].
1.2. Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib, tình hình viêm màng não
(VMN) do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi trong nước và trên thế giới
1.2.1. Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib

1.2.1.1. Khái niệm về người khỏe mạnh mang vi khuẩn (Hib)
Người khỏe mạnh mang vi khuẩn (carriers) là những người mang vi
khuẩn gây bệnh trong cơ thể mà không có biểu hiện triệu chứng hoặc không
phát hiện thấy dấu hiệu đáp ứng miễn dịch của cơ thể [17].
Trạng thái mang vi khuẩn của cơ thể có thể tồn tại với thời gian ngắn
hoặc dài, có thể gián đoạn hoặc liên tục. Những người mang vi khuẩn thường
có khả năng lây truyền cho người khác. Vì vậy, người lành mang Hib đồng
nghĩa với vi khuẩn này định cư trên cơ thể và xác định được sự xuất hiện của
vi khuẩn Hib sống ở màng nhày họng (pharyngeal mucosa). Tuy nhiên, kết
quả xác định này cũn phụ thuộc vào độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp
xét nghiệm tìm vi khuẩn Hib còn sống ký sinh ở màng nhày họng người khỏe
mạnh [17].
1.2.1.2. Phương pháp xác định
Trong hầu hết các nghiên cứu điều tra về người khỏe mạnh mang Hib,
khó khăn xảy ra trong việc phân lập vi khuẩn này có thể dẫn đến kết quả tỷ lệ
mang Hib thu được thường thấp hơn so với thực tế. Qua một số nghiên cứu,
cho thấy phương pháp sử dụng tăm bông lấy bệnh phẩm từ họng miệng
(oropharyngeal swabs) dùng để nuôi cấy xác định người lành mang Hib
thường có kết quả tương tự hoặc cao hơn so với nuôi cấy từ tăm bông lấy
bệnh phẩm ở họng mũi (nasopharyngeal swabs) [66].
24
Trạng thái người khỏe mạnh mang Hib thường được xác định bằng các
kỹ thuật nuôi cấy. Vì vậy, tất cả các bước thực hiện trong kỹ thuật xét nghiệm
dùng cho nghiên cứu điều tra vi sinh này cần phải đạt được độ chuẩn xác tối
đa. Những sai số có khả năng xảy ra trong quá trình xác định tỷ lệ Hib ký sinh
ở họng người khỏe mạnh, bao gồm: kỹ thuật ngoáy họng lấy bệnh phẩm (đây
là kỹ thuật khó duy trì ổn định), sự sống sót của vi khuẩn trong quá trình vận
chuyển bệnh phẩm cho đến khi nuôi cấy vào môi trường; và sự xuất hiện
nhiều vi khuẩn khác nhau có trong bệnh phẩm nhưng lại có sự tương đồng về
hình thái khuẩn lạc, nên có thể dẫn đến chọn khuẩn lạc nhầm. Sự khác biệt

của các phương pháp nuôi cấy được sử dụng trong phân lập Hib từ tăm bông
bệnh phẩm ngoáy họng là yếu tố chính dẫn đến những khó khăn và phức tạp
trong việc giải thích các số liệu từ các nghiên cứu khác nhau [17].
Hình 1.6: Hình ảnh giải phẫu đường hô hấp trên
1.2.1.3. Dịch tễ học của trẻ khỏe mạnh mang Hib và một số yếu tố ảnh hưởng
Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến dịch tễ học của Hib, đó là
yếu tố xã hội học (soccial) và nhân khẩu học (demographic). Khả năng mang
Hib ở trẻ nhỏ dường như có liên quan rất gần đến khả năng, mức độ phơi
nhiễm (likelihood of exposure to the organisms) đối với vi khuẩn này [17].
Hốc mũi
Lưỡi
Thanh quản
Họng mũi
Họng miệng
Thanh quản-hầu
(vùng dưới hầu)
Thực quản
25
Hi là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên. Trong
đó, Hib có ở 1-5% trẻ em khoẻ mạnh và không có biểu hiện bệnh [78]. Tỷ lệ
mang vi khuẩn thấp nhất ở người lớn và trẻ nhỏ, cao nhất ở lứa tuổi mẫu giáo
[58], [110], [114]. Hầu hết các điều tra đều cho thấy, nuôi cấy từ tăm bông
bệnh phẩm ngoáy họng miệng hay họng mũi phát hiện thấy Hib có khoảng 3 -
5% trẻ nhỏ dưới năm tuổi [58], [110], đây là lứa tuổi với tỷ lệ mang Hib được
xem là nổi trội nhất [47]. Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã
cho thấy:
+ Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lê Huy Chính và cộng sự về tỷ lệ trẻ
em dưới 60 tháng tuổi mang Hi (chưa có điều kiện định typ huyết thanh) ở
cộng đồng một số tỉnh miền Bắc cho kết quả: 21,4% (trẻ dưới 12 tháng);
35,5% (trẻ 13 - 24 tháng); 32,5% (trẻ 25 - 36 tháng); 27,7% (trẻ 37 - 48 tháng)

và 31,6% (trẻ 49 - dưới 60 tháng) [4]. Tuy nhiên, hiện nay có rất ít nghiên cứu
đánh giá, xác định tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib.
+ Trên thế giới, hầu hết các nghiên cứu về trẻ khỏe mạnh mang Hi đều
được định typ huyết thanh. Nghiên cứu của Staphanie H. Factor và cộng sự về
tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi có mang Hib tại Châu Á, cho thấy tỷ lệ chung là 6%.
Trong đó: 3% (trẻ 2 – 5 tháng); 10% (trẻ 6 - 11 tháng); 5% (trẻ 12 - 23
tháng); 8% (trẻ 24 - 35 tháng); 4% (trẻ 36 - 47 tháng) và 5% (trẻ 48 - 59
tháng) [94]. Nghiờn cứu khác của Gúmez Elizabeth và cộng sự về dịch tễ học
trẻ khỏe mạnh mang Hib tại Santo Domingo, nước cộng hòa Dominic cho
thấy tỷ lệ trẻ mang Hib: 1,5% (trẻ dưới 5 tháng); cao nhất 12,5% (trẻ 6 - 11
tháng); 6% (trẻ 12 - 23 tháng); 7,9% (trẻ 24 - 35 tháng); 9,8% (trẻ 36 - 47
tháng) [41]. Tại Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu của Muge Oguzkaya–Artan và cộng
sự cho thấy tỷ lệ trẻ nhỏ ở lứa tuổi 5 - 7 mang Hib với tỷ lệ là 4,2% [76]. Bên
cạnh đó, nghiên cứu của Lucia Ferro Bricks tại Sao Paulo Brasil với 1200 trẻ
nhỏ dưới 6 tuổi được chăm sóc tại 29 Nhà trẻ Taubatộ (trong đó, 213 trẻ

×