xây dựng quy trình pma real time pcr phát hiện listeria monocytogenes và salmonella spp trên mẫu sữa

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (18.85 MB, 94 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- </b>

<b>ĐỖ NGỌC DIỄM TRÚC </b>

<b>XÂY DỰNG QUY TRÌNH </b>

<b>PMA REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN </b>

<i><b> Listeria monocytogenes VÀ Salmonella spp </b></i>

<b>TRÊN MẪU SỮA </b>

<b>Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01 </b>

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC </b>

<b>Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020 </b>

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaXay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau sua

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>GIẤY XÁC NHẬN </b>

Tôi tên là: Đỗ Ngọc Diễm Trúc

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 1884202010008 Tôi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Xây dựng qui trình PMA Real-time PCR phát hiện Listeria monocytogenes và Salmonella spp trên mẫu sữa” là bài nghiên cứu của chính tơi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam đoan rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Khơng có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này mà khơng được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

TP. Hồ Chí Minh, Năm 2020

ĐỖ NGỌC DIỄM TRÚC

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể các thầy cơ giáo trong Khoa Cơng Nghệ Sinh Học đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản cũng như giúp tôi định hướng đúng đắn trong q trình học tập.

Đặc biệt, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cơ giáo PGS.TS Lê Huyền ÁI Thuý, Trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học đã dành thời gian, trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn tơi hồn thành tốt luận văn này.

Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các anh chị nhân viên trong Công ty Cổ phần Công Nghệ TBR đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi trong q trình triển khai thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

123docz.net - File bi loi xin lienhe:

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

TÓM TẮT

Sữa và các sản phẩm từ sữa đóng vai trò quan trọng về chế độ dinh dưỡng hàng ngày của mọi người trên toàn thế giới. Tuy nhiên sữa giàu dưỡng chất nên dễ nhiễm vi sinh ở tất cả các giai đoạn từ chế biến đến quá trình tiêu dùng. Hai tác nhân phổ biến gây ngộ độc trong sữa là Salmonella spp và Listeria monocytogenes. Trong đó Salmonella spp được ghi nhận là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến thứ 2 (Aarestrup và cộng sự, 2007). Việc nhiễm Listeria là tương đối hiếm, nhưng thường tiến triển nặng với tỉ lệ tử vong cao từ 20% - 30% (theo báo cáo của FAO và WHO năm 2001).

Để phát hiện vi sinh gây ngộ độc thực phẩm thì phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy lại tốn kém thời gian và nhân lực, khơng đáp ứng được u cầu cần có kết quả nhanh trong việc ứng dụng quy trình vào thực tế. Phương pháp Real-time PCR đã được phát triển với các đặc tính như phát hiện nhanh, chuyên biệt và đơn giản hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống, đặc biệt cho phép phát hiện một hoặc nhiều tác nhân đồng thời. Mặc dù vậy, kỹ thuật phân tử này có thể cho kết quả dương tính giả do khơng phân biệt được vi khuẩn cịn sống hay đã chết khi áp dụng vào thực tế với bước thanh trùng sản phẩm làm chết vi sinh vật nhưng DNA vi khuẩn vẫn còn hiện diện trong sản phẩm sau bước tiệt trùng. Để cải thiện vấn đề này, các cơng trình nghiên cứu đã cho ra đời sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR với chất nhuộm sinh học, propidium monoazide (PMA), một dẫn xuất của ethidium bromide. Cách kết hợp này cho phép phát hiện DNA từ các tế bào có màng nguyên vẹn dựa trên đặc tính của thuốc nhuộm PMA. PMA có thể xâm nhập qua màng tế bào ở vi khuẩn chết, gắn vào DNA bằng liên kết cộng hóa trị. DNA sau khi đã gắn với PMA thì khơng thể khuếch đại dẫn đến ức chế phản ứng PCR (Nocker và cộng sự, 2006). Việc ứng dụng quy trình PMA real-time PCR nhằm phát hiện Salmonella spp và Listeria monocytogenes đã được công bố qua một số cơng trình trên thế giới. Tuy nhiên trong nước chúng tơi chưa tìm thấy bất cứ công bố nào về việc sử dụng PMA kết hợp PCR hay Real-time PCR trong phát hiện vi sinh vật nói chung và các tác nhân

123docz.net - File bi loi xin lienhe:

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

vi sinh gây ngộ độc sữa như Listeria monocytogenes và Salmonella spp nói riêng. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm bước đầu xây dựng quy trình PMA Real-time PCR, phát hiện đồng thời Listeria monocytogenes và Salmonella spp trên mẫu sữa nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước, hạn chế việc nhập khuẩn, có thể giảm giá thành và chủ động hơn trong việc kiểm nghiệm.

Kết quả ghi nhận giới hạn phát hiện của quy trình PMA Real-time PCR là 10CFU/ml trên mẫu chuẩn L. monocytogenes và trên mẫu chuẩn Salmonella. Mặc khác độ nhạy của quy trình trên mẫu gây nhiễm salmonella là 10CFU/ml và trên mẫu gây nhiễm L.monocytogenes là 10<small>2</small>CFU/ml. Không ghi nhận mẫu thực nghiệm nhiễm Salmonella và L. monocytogenes

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

ABSTRACT

Milk and dairy products play an important role in the daily nutrition and diet of people in the world. Milk is rich in nutrients so it can easily be contaminated by microborganisms at all stages from processing to consumption. Two common milk poisoning authors are Salmonella spp and Listeria monocytogenes. Salmonella spp was recognized as the second most common food poisoning agent (Arilyrup et al., 2007). Listeria is relatively rare, but often develops severely with high mortality rates between 20% and 30% (FAO and WHO reports in 2001).

For the detection of food poisoning microbes, traditional culture methods are considered the gold standard. However, the culture method is time-consuming and labor-intensive, does not meet the requirement for fast results in the practical application of the process. The Real-time PCR method has been developed with features such as faster, more specialized and simpler than the traditional culture method, especially allowing the detection of one or more agents simultaneously. This molecular technique can give false positive results because it is impossible to distinguish live or dead bacteria when applied in practice with the sterilization step of the product that kills microorganisms but the bacterial DNA. still present in the product after pasteurization. In order to improve this problem, studies have shown a combination of PCR technique with a biological dye, propidium monoazide (PMA), a derivative of ethidium bromide. This combination allows the detection of DNA from intact membrane cells based on the properties of the PMA dye. PMA can penetrate the cell membrane of dead bacteria, attaching to the DNA by covalent bond. DNA after binding to PMA cannot be amplified, leading to inhibition of PCR reactions (Nocker et al., 2006). The application of PMA real-time PCR process to detect Salmonella spp and Listeria monocytogenes has been published in the world. In Viet Nam, we have not found any claim on the use of PMA in combination with PCR or Real-time PCR in the detection of microorganisms in general and milk poisoning microorganisms such as Listeria monocytogenes and Salmonella. spp in particular. Therefore, this study is carried out to initially build PMA Real-time PCR

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

process, simultaneously detecting Listeria monocytogenes and Salmonella spp on milk samples to meet domestic demand, limit bacteria entry, possibly reduce costs and be more proactive in testing.

The results recorded detection limit of PMA Real-time PCR procedure was 10CFU /ml on the culture pure Listeria monocytogenes and on the standard Salmonella. On the other hand, the sensitivity of the procedure on samples contaminated with salmonella is 10CFU / ml and on samples contaminated with L. monocytogenes is 10<small>2</small>CFU / ml. No experimental samples were found to be contaminated with Salmonella and L. monocytogenes

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 1

1.1. Listeria monocytogenes và Salmonella spp ... 1

1.2 Phương pháp nuôi cấy ... 8

1.3.Phương pháp Real-time PCR kết hợp PMA ... 11

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy ... 16

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu sữa ... 17

2.2.3. Kiểm tra insilico các đặc tính của Mồi – Mẫu dị ... 17

2.2.4. Phương pháp Real-time PCR ... 19

2.2.5. Phương pháp Real-time PCR kết hợp thuốc nhuộm PMA ... 21

2.2.6. Sơ đồ thí nghiệm ... 23

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ... 26

3.1. Kết quả lựa chọn, kiểm tra các đặc tính của mồi – mẫu dị ... 26

3.1.1. Lựa chọn trình tự mồi – mẫu dị ... 26

3.1.2. Kiểm tra các đặc tính kỹ thuật lý thuyết của mồi – mẫu dò ... 26

3.1.3. Kiểm tra tính đặc hiệu lý thuyết của mồi – mẫu dị ... 28

3.2 Xây dựng quy trình Real-time PCR phát hiện Listeria monocytogenes và Salmonela spp trong mẫu sữa ... 35

3.2.1 Kiểm tra mồi, mẫu dò cho Real-time PCR ... 35

3.2.2 Khảo sát nồng độ mồi – mẫu dị ... 40

3.3.3. Khảo sát quy trình Real-time PCR kết hợp PMA ... 50

3.3.4. Khảo sát và phân tích khả năng phân biệt vi khuẩn sống và vi khuẩn chết ... 52

3.4. Khảo sát mẫu thực tế ... 55

3.4.1. Khảo sát mẫu thực tế bằng phương pháp nuôi cấy ... 55

3.4.2.Khảo sát mẫu thực tế bằng phương pháp Real-time PCR kết hợp PMA .... 56

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 58

4.1. Kết luận ... 58

4.2. Kiến nghị ... 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 59

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IAC Internal amplification control

PCR Polymerase chain reaction PMA Propidium monoazide TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2. 1 Danh mục chủng chuẩn ATCC ... 16

Bảng 2. 2 Màu của thuốc nhuộm phát huỳnh quang sử dụng cho mẫu dò ... 19

Bảng 2. 3 Thành phần phản ứng real-time PCR được sử dụng cho phát hiện Salmonella ... 22

Bảng 2. 4 Thành phần phản ứng real-time PCR được sử dụng cho phát hiện Salmonela và L. monocytogenes ... 23

Bảng 2. 5 Chu trình nhiệt cho phản ứng ... 23

Bảng 3. 1 Thông số của mồi và mẫu dò của Lm835F, Lm998R, TxRd... 28

Bảng 3. 2 Thơng số của mồi và mẫu dị của Sal1598F, Sal1859R, Sal1631P ... 28

Bảng 3. 3 Các cặp nồng độ mồi – Mẫu dò ... 40

Bảng 3. 4 Kết quả Real-time PCR ở dãy gradient nhiệt độ ... 442

Bảng 3. 5 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu chuẩn và mẫu gây nhiễm Salmonella ... 44

Bảng 3. 6 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu chuẩn và mẫu gây nhiễm ... 45

Bảng 3. 7 Kết quả Real-time PCR trên mẫu Salmonella và L. monocytogenes ... 46

Bảng 3. 8 thành phần đặt phản ứng Real-time PCR ... 48

Bảng 3. 9 Chu trình nhiệt phản ứng real-time PCR sau khi đã khảo sát ... 48

Bảng 3. 10 Kết quả Chạy Real-time PCR ở các nồng độ PMA trên vi khuẩn sống 49 Bảng 3. 11 Kết quả chạy Real-time PCR ở nhóm vi khuẩn chết (đã xử lý nhiệt) ... 49

Bảng 3. 12 Kết quả chạy Real-time PCR ở nhóm hỗn hợp vi khuẩn sống/chết ... 49

Bảng 3. 13 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu chuẩn Salmonella không xử lý (0) và xử lý PMA (50μM)... 51

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

Bảng 3. 14 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu chuẩn L. monocytogenes không xử lý (0) và xử lý PMA (50μM). ... 51 Bảng 3. 15 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu chuẩn Salmonella sống (live) không xử lý (0) và xử lý PMA (50μM) ... 52 Bảng 3. 16 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu chuẩn Salmonella xử lý nhiệt (dead) không xử lý (0) và xử lý PMA (50μM) ... 53 Bảng 3. 17 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu chuẩn L.monocytogenes sống (live) không xử lý (0) và xử lý PMA (50μM) ... 54 Bảng 3. 18 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu chuẩn L. monocytogenes xử lý nhiệt (dead) không xử lý (0) và xử lý PMA (50μM) ... 54

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. 1 Vi khuẩn L. monocytogenes cho phản ứng CAMP dương tính ... 2

Hình 1. 2 Vi khuẩn Salmonella tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường XLD ... 4

Hình 1. 3: Nguyên lý liên kết của PMA lên DNA ... 12

Hình 1. 4 Nguyên lý phát hiện chọn lọc tế bào sống của thuốc nhuộm PMA ... 12

Hình 3. 1 Kết quả sắp cặp mồi Lm835F, Lm998R và Mẫu dị TxRd trên trình tự gene AF532302.1 của L. monocytogenes ... 27

Hình 3. 2 Kết quả sắp cặp mồi Sal1598F, Sal1598R và mẫu dị Sal1631P trên trình tự gene LC111489.1 của Salmonella ... 27

Hình 3. 3 Kết quả Blast trình tự mồi Sal1598F: ... 29

Hình 3. 4 Kết quả Blast trình tự mồi Sal1859R ... 30

Hình 3. 5 Kết quả Blast trình tự mẫu dò Sal1631P

5'-FAM-TGGAAGCGCTCGCATTGTGG-BHQ1-3': ... 31

Hình 3. 6 Kết quả Blast trình tự mồi Lm835F

5'-AACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTA-3'... 32

Hình 3. 7 Kết quả Blast trình tự mồi Lm998R: ... 33

Hình 3. 8 Kết quả Blast trình tự mẫu dị ... 34

Hình 3. 9 Kết quả Real-time PCR trên mẫu chuẩn Salmonella ATCC 19115 và

L. monocytogenes ATCC 19115 ... 35

Hình 3. 10 Kết quả phân tích sản phẩm giải trình tự của Salmonella ... 37

Hình 3. 11 Kết quả phân tích sản phẩm giải trình tự của L. monocytogenes ... 39

Hình 3. 12 Kết quả khảo sát nồng độ tối ưu của mồi – mẫu dò theo bảng 3.3; ... 41

Hình 3. 13 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu trên dãy gradient 55-65oC: ... 42

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

Hình 3. 14 Kết quả real-time PCR trên các mẫu chuẩn ATCC theo bảng 2.1 ... 43

Hình 3. 15 Kết quả real-time PCR trên mẫu chuẩn và mẫu gây nhiễm Salmonella ở các nồng độ pha loãng 107CFU/mL đến 101 CFU/mL ... 44

Hình 3. 16 Kết quả real-time PCR trên mẫu chuẩn và mẫu gây nhiễm

L. monocytogenes ở các nồng độ pha loãng 10<small>7</small> CFU/mL đến 10<small>1</small> CFU/mL ... 45

Hình 3. 17 Kết quả Real-time PCR trên hỗn hợp mẫu chuẩn Salmonella và

L. monocytogenes trên ba nồng độ pha lỗng 10<small>3</small> -10<small>2</small>- 10<small>1</small> CFU/mL ... 46

Hình 3. 18 Kết quả nuôi cấy trên môi trường không chọn lọc khi đã xử lý nhiệt: .. 47

Hình 3. 19 Kết quả Real-time PCR dịch khuẩn chết khi không xử lý và xử lý PMA ở hai nồng độ 25μM và 50μM ... 50

Hình 3. 20 Kết quả PMA (50μM) real-time PCR trên các nồng độ mẫu chuẩn pha loãng từ 10<small>7</small> CFU/mL đến 10CFU/ml ... 51

Hình 3. 21 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu sữa gây nhiễm Salmonella (live) không xử lý và xử lý PMA (50μM) ở nồng độ 10<small>7</small>CFU/ml -10CFU/ml ... 53

Hình 3. 22 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu sữa gây nhiễm Salmonella (Dead) không xử lý và xử lý PMA (50μM) ở nồng độ 10<small>7</small>CFU/ml -10CFU/ml ... 53

Hình 3. 23 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu sữa gây nhiễm ... 54

Hình 3. 24 Kết quả PMA Real-time PCR trên mẫu sữa gây nhiễm

L. monocytogenes (live) không xử lý và xử lý PMA (50μM) ở nồng độ 10<small>7</small> CFU/ml -10CFU/ml ... 55

Hình 3. 25 Kết quả nuôi cấy 20 mẫu sữa trên môi trường XLD và BHI Agar ... 56

Hình 3. 26 Kết quả PMA Real-time PCR trên 20 mẫu thực tế... 56

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Listeria monocytogenes và Salmonella spp

1.1.1. Listeria monocytogenes

Phân loại Listeria monocytogenes o Giới (regnum): Bacteria

o Ngành (divisio): Firmicute o Lớp (class): Bacilli

o Bộ (ordo): Bacillales o Họ (familia): Listeriaceae o Chi (genus): Listeria

o Loài (species): L. monocytogenes

Dựa trên hoạt tính miễn dịch của hai loại kháng nguyên O và H, Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) được chia làm 13 loại huyết thanh

(1/ 2a, 1 / 2b, 1 / 2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e và 7). Trong đó phổ biến gây bịnh là 4b, 1/2b và 1/2a (FDA, 2002).

- Hình thái

L. monocytogenes là vi khuẩn gram dương có hình gậy ngắn, mảnh, xếp thành chuỗi, không sinh bảo tử, hiếu khí khơng bắt buộc, nhiệt độ thích hợp 30-37<small>o</small>C, pH 7.2 – 7.4 (Ryser, 2011).

Khuẩn lạc L. monocytogenes điển hình khi mọc trên mơi trường Palcam (Polymyxin-acriflavine-lithium chloride-cefta-zidime-esculin-mannitol có màu xám nâu, đường kính 1.5 – 2 mm, đơi khi có tâm đen nhưng có quầng đen xung quanh. Trên mơi trường Aloa nó có màu xanh da trời, có quầng sáng xung quanh. Trên môi trường LSA (Listeria selective agar) khuẩn lạc tạo vịng đen quanh khóm. Trên mơi trường BHI agar nó tạo khóm trắng sữa trịn lồi, đường kính 1mm.

- Tính chất sinh hố:

L.monocytogenes cho thử nghiệm catalase (+), oxidase (-), có khả năng thủy giải esculin và làm tan huyết trên môi trường thạch máu, sinh acid từ rhamnose

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

nhưng khơng từ xylose, có phản ứng CAMP (+) với Staphylococus aureuse và (-) với Rhodococcus equi (hình 1.1).

- Tính chất đề kháng

L. monocytogenes chịu được các điều kiện sống khắc nghiệt như độ mặn cao (10%) , khoảng pH rộng (pH = 4.0 - 9.6), nhiệt độ thấp ( -1.5 – 45<small>o</small>C) (Elmer H. Marth, 2007)

- Đặc điểm phân bố

L. monocytogenes phân bố rộng rãi trong nông nghiệp như trang trại, trong phân động vật, thức ăn kém chất lượng và khu vực chế biến thực phẩm…(Hunt và ctg, 2017).

L. monocytogenes được tìm thấy trong sữa nguyên liệu, sữa thành phẩm, các thực phẩm có thành phần là sữa (phomat, kem…), các thực phẩm tươi, các thực phẩm đã chế biến được bảo quản lạnh... (Theo TCVN 9778:2013)

- Yếu tố độc lực

L. monocytogenes hoạt động nội bào, có thể phát triển và nhân lên trong tế bào chất của các tế bào động vật có vú. Các tế bào không thực bào hấp thụ các yếu tố độc lực của L. monocytogenes. Trong đó, một số gene mã hóa các yếu tố độc lực này được tập hợp trên nhiễm sắc thể của L. monocytogenes theo thứ tự prfA, plcA, hly, mpl, actA và plcB; các gene liên quan đến bám dính và xâm lấn, cụ thể là

inlA/B và iap, nằm riêng biệt với cụm gene độc lực (Bubert và ctg, 1999). Hình 1.1 Vi khuẩn L.monocytogenes cho phản ứng CAMP dương tính

(Nguồn: Microbiologyinfo, Sagar Aryal, 2019)

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

L. monocytogenes gây bệnh nhờ sự hiện diện của protein p60 liên quan đến hoạt động xâm lấn được mã hóa bởi gene iap. Vùng mã hóa miền trung tâm của protein p60 được đặc trưng bởi trình tự lặp lại ngẫu nhiên (Tandem Repeat Sequence – TRS) ACAAAT, tương ứng với các amino acid Threonine và Asparagine (TN).

Domain này đã được sử dụng để xác định sự biến đổi phân tử giữa các chủng L. monocytogenes. Gene hly có vai trị quan trọng trong quá trình ký sinh nội bào

của L. monocytogenes, nhờ sản xuất kháng nguyên L Listeriolysin O (LLO), exotoxin có hoạt tính tán huyết (Schuerch và ctg., 2005).

1.1.2. Salmonela

Phân Loại Salmonella o Giới (regnum): Bacteria

o Ngành (divisio): Proteobacteria o Lớp (Class): Gramma Proteobacteria o Bộ (ordo): Enterobacteriales

o Họ(familia): Enterobacteriaceae

o Chi (genus): Salmonella Lignieres, 1900

Dựa vào xác định huyết thanh của kháng nguyên O, H, Salmonella được chia thành Salmonella enterica và S. bongori.

-Tính chất sinh hố

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

Salmonella có khả năng tạo H<small>2</small>S, có khả năng lên men và sinh acid từ glucose, mannitol, khơng tạo indol, có khả năng tạo enzyme lysine decarboxylase (Sedeik và ctg., 2019)

- Tính chất ni cấy

Khuẩn lạc của Salmonella trên thạch RV có hình trịn với bề mặt nhẵn và cạnh đều, hoặc phẳng với bề mặt không bằng phẳng và mép có răng cưa. Cấy trên mơi trường XLD (Xylose Lysine Deoxycholate) tạo khuẩn lạc màu đỏ, tâm đen. (Hình 1.2)

- Đặc điểm phân bố

Salmonella thường được tìm thấy ở phân động vật, lông động vật, nguồn nước ơ nhiễm…Từ đó nó có thể nhiễm vào các loại thực phẩm như: Thịt, Trứng, sữa và các sản phẩm làm từ sữa…

- Yếu tố độc lực

Các gene invA, orgA, prgH, spaN (invJ), tolC, sipB, pagC, msgA, spiA, sopB, lpfC, pefA, spvB và sifA mã hóa cho các protein liên quan đến tính xâm nhiễm, như xâm nhiễm tế bào và sự bám dính hoặc tạo ra nhung mao (Skyberg và ctg., 2006). Trong đó invA là gene đặc trưng có trong tất cả các lồi Salmonella nhưng khơng hiện diện ở các vi sinh vật khác, Nó có vai trị trong việc xâm nhiễm vào tế bào biểu mô. Do vậy, gene invA thường được chọn là gene đích trong việc phát hiện Salmonella spp. (Galán và ctg., 1992). Trong nghiên cứu vào năm 1992 Hình 1. 2 Vi khuẩn Salmonella tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường XLD

Nguồn: Microbiologyinfo, Sagar Aryal, 2018

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

Galan và cộng sự đã phân lập được 245 chủng Salmonella từ nhiều loại mẫu khác nhau và tất cả các chủng này đều mang gene invA.

1.1.3. Các công bố trên thế giới về việc sử dụng PMA kết hợp Real-time PCR phá hiện Listeria monocytogenes và Salmonella spp

Pan và Breidt trong một nghiên cứu đã cho thấy sự kết hợp Real-time PCR với thuốc nhuộm PMA (50uM) có thể phân biệt được L. monocytogenes cịn sống trong hỗn hợp với vi khuẩn chết. Kết quả có giới hạn phát hiện của hỗn hợp tương ứng là 10<small>3</small>CFU/ml tế bào sống và 10<small>4</small>CFU/ml tế bào chết (Pan & Breidt, 2007).

Patricia Elizaquível và ctg đã phát triển thành công phương pháp xử lý PMA (50uM) và Real-time PCR phát hiện Salmonella, L. monocytogenes và E. coli

O157:H7 còn sống trên rau củ đã cắt sẵn. Độ nhạy tương ứng 10<small>2</small> cfu/g trên L. monocytogenes và E. coli O157:H7, và 10<small>3</small>cfu/g cho Salmonella (Elizaquível và

Yang và ctg đã thành công trong việc phát hiện Salmonella trên mẫu chuẩn với độ nhạy 10<small>2</small>CFU/ml và 10<small>3</small>CFU/ml trên thực phẩm gây nhiễm bằng kỹ thuật PMA (100uM) – PCR(Yang và ctg., 2012).

Hai nhà nghiên cứu Li và Chen đã sử dụng thuốc nhuộm PMA kết hợp với qPCR có thể phát hiện được Salmonella cịn sống trong hỗn hợp vi khuẩn sống và chết và độ nhạy 30CFU/g từ mẫu chuẩn gây nhiễm vào rau bina được ủ trong 4h (Li & Chen, 2013).

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

1.1.4. Tình hình ngộ độc L. monocytogenes và Salmonella spp:

Theo trung tâm phịng ngừa và kiểm sốt dịch bệnh Châu Âu (ECDC) thì có khoảng hơn 2,500 ca nhiễm Listeria với hơn 220 ca tử vong năm 2017 và 2018. Các trường hợp nhiễm Listeria từ 2013 – 2017 cho thấy theo xu hướng tăng lên ở các nước như Đức ,Ý, Thuỵ Điển, Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha (Seattle & Washington 98104-1008, 2020). Theo báo cáo của Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) và ECDC trong năm 2018 có 1,581 vụ ngộ độc thực phẩm do Salmonella spp gây ra, đặc biệt 67% các vụ ngộ độc Salmonella spp sảy ra ở các nước: Tây Ban Nha, Ba Lan và Slovakia.(Mard.Gov.Vn, 2019)

Theo CDC ước tính có khoảng 1.600 ca nhiễm L. monocytogenes hàng năm tại Hoa Kỳ với khoảng 1.500 ca nhập viện và 260 ca tử vong (theo cdc.gov, 2011). Vi khuẩn Salmonella gây ra khoảng 1,35 triệu ca nhiễm, 26.500 ca nhập viện và 420 ca tử vong ở Hoa Kỳ mỗi năm (Salmonella Homepage | CDC, 2020)

Theo kết quả khảo sát của Jackson và ctg (2018) giai đoạn 1998 – 2018, tại Hoa Kỳ đã có 58 vụ nhiễm khuẩn Listeria, 17 vụ liên quan đến phô mai mềm liên quan đến 180 ca bệnh, 14 ca thai nhi chết sớm và 17 ca tử vong. Đặc biệt tỷ lệ bùng dịch do Listeria liên quan đến phô mai mềm từ sữa tiệt trùng chiếm 33% (12 vụ) giai đoạn 2007 – 2014 cao hơn so với giai đoạn 1998 – 2006 ( 1 vụ) (Jackson và ctg., 2018)

Giai đoạn 2009–2015, hệ thống giám sát dịch bệnh trong thực phẩm (FDOSS) ghi nhận tại Hoa Kỳ có 5.760 vụ ngộ độc gồm 100.939 ca bệnh, 5.699 ca nhập viện và 145 ca tử vong. Trong số 2.953 vụ thì norovirus gây ra 1.130 vụ (38%) liên quan 27.623 ca bệnh (41%), Salmonella với 896 vụ (30%) liên quan 23.662 ca bệnh (35%). Các đợt bùng phát do Listeria, Salmonella và E. coli (STEC) gây ra 82% tổng số ca nhập viện và 82% số ca tử vong. Trong số 1.281 vụ thì liên quan đến cá là 222 vụ (17%), sữa là 136 vụ (11%) và thịt gà là 123 vụ (10%)(Dewey-Mattia, 2018)

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

Tại Việt Nam theo Cục an toàn thực phẩm, từ năm 2010 – 2019, trên cả nước ghi nhận 1.556 vụ ngộ độc thực phẩm, với hơn 47.400 người mắc bệnh; trong đó có 271 người chết, gần 40.190 người phải nhập viện điều trị. Riêng năm 2020, tính đến ngày 31/5, tồn quốc đã ghi nhận 48 vụ ngộ độc thực phẩm làm hơn 870 người mắc, 824 người nhập viện điều trị và 22 người tử vong. So sánh với cùng kỳ năm 2019, tăng 11 vụ (29,7%) ngộ độc thực phẩm, số người mắc bệnh tăng 18 người và tử vong tăng 17 người. Phân tích từ 1.604 vụ ngộ độc được ghi nhận từ năm 2010 đến năm 2020, nguyên nhân gây ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật (chiếm 38,7%), độc tố tự nhiên (28,4%), hóa chất (4,2%)…(thanhuytphcm.vn, 2020)

Trong những năm gần đây thị trường sữa quốc tế đã chứng kiến nhiều vụ nhiểm khuẩn nghiêm trọng gây thiệt hại lớn đối với ngành như: Vào cuối năm 2017 đầu năm 2018 Tập đoàn Lactalis đã gây ra vụ bê bối chấn động toàn cầu khi buộc phải thu hồi hơn 12 triệu hộp sữa do lo ngại chúng bị nhiễm vi khuẩn Salmonella, sự cố này ảnh hưởng tới 83 quốc gia nhập khẩu sữa của Lactalis. Vào tháng 07.2019 Công ty Les Dépendances tại Quebec đã bị Cơ quan Thanh tra Thực phẩm Canada (CFIA) yêu cầu thu hồi toàn bộ một lô phô mai sữa tươi Coulommiers do nhiễm L. monocytogenes (theo baomoi.com, 2019). Cũng vào tháng 07.2019 cơ quan kiểm tra thực phẩm tại Hoa Kỳ đã đưa ra cảnh báo cơng khai và u cầu tạm dừng tồn bộ hoạt động mua bán đối với sản phẩm sữa dê chưa tiệt trùng từ Side Hill Acres sau khi kiểm tra các mẫu sữa tại một cửa hàng phân phối cho kết quả dương tính với khuẩn L. monocytogenes (“tcvn.gov.vn”, 2019).

Tại Việt Nam tháng 1.2019, theo thông tin INFOSAN Cục An toàn thực phẩm yêu cầu thu hồi 12 sản phẩm sữa bột Modilac nhập khẩu từ Pháp vì do sản phẩm liên quan đến trẻ nhỏ bị nhiễm Salmonella Poona tại Pháp (theo vfa.gov.vn, 26/3/2020). Điều này gây mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng vì một lượng lớn sản phẩm bị nhiểm khuẩn đã được bán ra. Bên cạnh đó thị trường sữa bột xách tay tại Việt Nam cũng tiềm ẩn nguy cơ rất lớn việc nhiễm khuẩn, bởi vì các sản phẩm này không được nhập về theo đường chính ngạch, khơng trải qua

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

quá trình kiểm định chất lượng theo qui định của pháp luật trước khi tới tay người tiêu dùng (theo vietnamnet, 19/09/2020).

1.1.5. Quy định kiểm soát L. monocytogens và Salmonella spp trong mẫu sữa

Trên thế giới, quy định tiêu chuẩn thực phẩm được dùng cho phát hiện Listeria monocytogenes và Salmonella tham chiếu theo Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) (BAM) và tiêu chuẩn ISO 11290 của Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế (ISO)(Nutrition, 2019). Đối với các sản phẩm từ sữa, phương pháp AOA/IDF 990.12 được sử dụng.

Tại Việt Nam, tiêu chuẩn quốc gia quy định phương pháp phát hiện Listeria. monocytogenes và Salmonella được áp dụng cụ thể như sau:

TCVN 10780-1:2017 ISO 6579-1:2017: Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm – Phương pháp phát hiện, định lượng và xác định typ huyết thanh của Salmonella – Phần 1: Phương pháp phát hiện Salmonella spp.

TCVN 7700-2:2007 (ISO 11290-2:1998, With amd.1:2004): Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes - Phần 2: Phương pháp định lượng.

TCVN 7700-1:2007 (ISO 11290-1: 1996, With amd.1:2004): Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes - Phần 1: Phương pháp phát hiện.

1.2 Phương pháp nuôi cấy

Dựa theo tiêu chuẩn Việt Nam, quy trình kiểm tra L. monocytogenes cần tiến hành các bước liên tiếp như sau:

- Tăng sinh sơ cấp: Mẫu ban đầu được tăng sinh trong môi trường Half-Fraser broth 24h ở 30<small>0</small>C (Theo sơ đồ mô tả bên dưới).

- Tăng sinh thứ cấp: Mẫu sau khi được tăng sinh sơ cấp sẽ tiếp tục được tăng sinh trong môi trường bằng môi trường Fraser broth 48h ở 35<small>0</small>C hoặc 37<small>0</small>C.

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

- Cấy đĩa và nhận dạng: Sử dụng môi trường Aloa5 (Ottaviani và Agosti) mẫu được ủ ở 37<small>0</small>C và đọc kết quả sau 24h hoặc 48h.

- Khẳng định

Khẳng định: thử sinh hóa (TSYEB, ramnoza và xyloza, Môi trường CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen)

X g / x ml

0.1ml dịch cấy trong 10ml MT tăng sinh thứ cấp (Half Fraser) Cấy ra đĩa

Ủ ở 35<small>o</small>C / 37<small>o</small>C trong 48 ± 3h

Cấy đĩa (Thạch Listeria theo ALOA) và MT chọn lọc thứ 2

Ủ thạch Listeria theo ALOA trong 24h ± 3h. Ủ MT chọn lọc thứ 2

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

- Ủ các đĩa này ở 37 °C và kiểm tra sau 24 giờ hoặc 48 giờ.

- Khẳng định các khuẩn lạc Listeria monocytogenes giả định bằng các phép thử qui định.

- Từ số lượng khuẩn lạc đã khẳng định, tính số lượng Listeria monocytogenes có trong một gram hoặc một mililit mẫu thử.

Quy trình phát hiện Salmonella spp gồm 4 bước như sau: - Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc BPW

- Tăng sinh trong/trên môi trường chọn lọc: môi trường RVS/ môi trường MRSV/ môi trường MKTT

- Nuôi cấy trên môi trường đặc chọn lọc thạch XLD

Ủ ở 37<small>o</small>C trong 24h – 48h Nuối cấy trên ALOA

Hồi phục 1h ở 20<small>o</small>C

Nhận dạng và khẳng định Listeria spp

Khẳng định chủng L. monocytogenes Xg / xml

huyền phù mẫu bằng Peptone hoặc Half Fraser (9xg/ 9ml)

Khẳng định chủng Listeria spp

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

- Khẳng định: thử phẩn ứng sinh hóa (tối thiểu thử trên phản ứng sinh hóa trên Thạch urê và Môi trường L-Lyzin Decarboxylation)

1.3.Phương pháp Real-time PCR kết hợp PMA 1.3.1.PMA

Thuốc nhuộm PMA được phát minh bởi nhà khoa học Biotium.

PMA xâm nhập qua màng tế bào bị tổn thương và gắn vào DNA, trong khi thuốc nhuộm không thể xâm nhập qua màng tế bào sống. PMA có nhóm Azide chuyển đổi thành gốc nitrene thông qua phản ứng quang phân (hình 1.3). Nhóm nitrene liên kết chéo với DNA của các tế bào bị tổn thương màng, gây ra sự thay đổi cấu trúc trong góc nucleotide, và do đó DNA polymerase khơng liên kết với

Lấy 1 KL nghi ngờ trong số 5 khuẩn lạc cấy thạch Không chọn lọc Ủ ở 34<small>o</small>C – 38<small>o</small>C trong

RVS hoặc thạch MRSV Ủ ở 41.5<small>o</small>C ±1<small>o</small>C trong 24h ±3h

Thạch XLD Ủ ở 37<small>o</small>C ±1<small>o</small>C trong 24h ±3h Và MT thạch phân lập thứ 2

Thử sinh hóa, thử huyết thanh

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

DNA, dẫn đến không kéo dài, làm giảm tín hiệu. Ngoài ra, sự liên kết chéo của DNA với nhóm nitrene khiến thuốc nhuộm khơng thể hịa tan trong nước và bị loại bỏ trong các bước tách chiết DNA. Phần thuốc nhuộm không liên kết còn lại bị bất hoạt do phản ứng với các phân tử nước, tạo thành hydroxylamine và không thể liên kết thêm với DNA (Nam và ctg, 2011).

1.3.2 Real-time PCR (qPCR) kết hợp PMA

Ở các tế bào sống thuốc nhuộm không đi qua màng để liên kết DNA do màng còn nguyên vẹn, thuốc nhuộm bị bất hoạt qua phản ứng quang phân khi liên kết với nước và bị loại bỏ trong quá trình tách chiết, phản ứng qPCR diễn ra bình thường. Cịn ở các tế bào chết, thuốc nhuộm PMA liên kết với DNA theo phản ứng quang phân, gây ức chế sự khuếch đại DNA trong phản ứng qPCR (Hình 1.4). Từ đó cho phép phát hiện chọn lọc vi khuẩn sống bằng Real-time PCR.

Hình 1.3 Nguyên lý liên kết của PMA lên DNA

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

1.3.3 Chứng nội (IAC)

Nhằm kiểm soát sự ức chế của phản ứng khuếch đại hay kiểm tra được kết quả âm tính giả do tồn dư các chất ức chế có trong phản ứng thì việc sử dụng chứng nội (IAC) trong mỗi phản ứng PCR là cần thiết. IAC có thể là housekeeping genes hoặc đoạn oligo chèn trong plasmid tổng hợp.

Và trong đề tài này chúng tôi tham chiếu chứng nội từ nghiên cứu của Deer và ctg (2010) với trình tự oligo khơng tương đồng với gene của Salmonella và L. monocytogenes (Deer và ctg., 2010).

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu

- Ống nghiệm f16 (Duran, Đức) - Chai trung tính 500ml (Duran, Đức) 2.1.2. Thiết bị

- Máy real-time PCR LightCycler® 96 (Roche,Thụy Sỹ); LineGene 9600 plus ( Bioer)

- Bể ủ nhiệt khô (MRC-Israel) - Máy ly tâm (Nuve, Thổ Nhĩ Kỳ) - Tủ an toàn sinh học (ABT) - Tủ PCR (SANYO, Nhật) - Tủ mát (SANYO, Nhật) - Tủ âm -20<small>o</small>C (SANYO, Nhật)

- PMA-Lite™ LED (465-475 nm) hoặc thiết bị đèn Led (500nm – 600nm) - Thiết bị đồng nhất mẫu

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

- Mồi L. monocytogenes (IDT, Mỹ) - Mồi IC (IDT, Mỹ)

- Probe Salmonella (IDT, Mỹ) - Probe L. monocytogenes (IDT, Mỹ) - Probe IC (IDT, Mỹ)

- Nước đã xử lý DEPC (ABT, Việt Nam)

- PMA (PMAxx, Biotumn – USA) liên kết với DNA - Môi trường XLD (Neogen, Mỹ)

- Đệm BPW (Neogen, Mỹ) - Đệm Peptone (Neogen, Mỹ)

- Môi trường BHI Broth (Neogen, Mỹ) - Môi trường BHI Agar (Neogen, Mỹ) - Môi trường Half Fraser (Neogen, Mỹ) - Môi trường Nutrient Broth (Neogen, Mỹ) - Môi trường Nutrient Agar (Neogen, Mỹ)

2.1.4.Vật liệu sinh học 2.1.4.1 Mẫu

Mẫu sữa tiệt trùng được mua từ các siêu thị và được xác định không nhiễm Salmonella và L. monocytogenes bằng kỹ thuật nuôi cấy truyền thống tương ứng trên môi trường XLD Agar (Xylose-Lysine Deoxycholate Agar) và BHI Agar.

Mẫu sữa gây nhiễm là mẫu sữa tiệt trùng được gây nhiễm với các nồng độ dịch khuẩn tương ứng.

20 mẫu sữa kiểm tra thực tế là mẫu sữa bột nguyên liệu được thu thập từ Công ty nguyên liệu thực phẩm Á châu Sài Gòn.

2.1.4.2 Chủng chuẩn

Danh mục chủng chuẩn được cung cấp bởi Hãng MicroBiologics - Mỹ theo bảng sau

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

Bảng 2. 1 Danh mục chủng chuẩn ATCC

2.2. Phương pháp

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy

Các mẫu thí nghiệm được thu về, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu sau đó tăng sinh ở 37<small>0</small>C trong 4h trên môi trường không chọn lọc buffer peptone water (BPW) (TCVN 5538: 2002). Sau đó các mẫu dịch sau tăng sinh sẽ chia làm hai lô thí nghiệm khác nhau.

- Lơ thứ nhất sẽ chuyển qua ly trích DNA phục vụ phương pháp PMA time PCR.

real-- Lô thứ hai sẽ chuyển qua nuôi cấy theo qui trình chọn lọc giành cho Salmonella spp, L. monocytogenes.

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu sữa - Nguyên tắc:

Phương pháp tách chiết cột Sillica sử dụng cột có màng được cấu tạo bởi các phân tử silica và acid nucleic sẽ được gắn lên màng khi có mặt của các chất trao đổi ion và Ethanol, sau đó acid nucleic sẽ được rửa giải ở lực ion thấp hơn.

- Quy trình gồm có 4 giai đoạn:

Ly giải tế bào: Mẫu tách chiết được trộn với dung dịch đệm ly giải. Trong dung dịch đệm ly giải có chứa nồng độ muối trao đổi ion cao. Các muối trao đổi ion có hai vai trị quan trọng trong việc ly trích acid nucleic: chúng làm mất ổn định các liên kết hydro, lực van der Waals và tương tác kỵ nước, dẫn đến mất ổn định protein, bao gồm cả các nuclease. Tiếp đó chúng phá vỡ sự liên kết của acid nucleic với nước. Các muối trao đổi ion bao gồm guanidine HCL, guanidine thiocyanate, urê và lithium perchlorate. Ngồi ra, cịn có các chất hỗ trợ ly giải khác (Triton X100, SDS, Tween 20, …) trong dung dịch đệm ly giải để hỗ trợ q trình hịa tan protein và ly giải tế bào.

Tiếp theo là bước gắn acid nucleic lên màng silica – muối trao đổi ion rất quan trọng đối với việc ly giải và gắn DNA lên màng silica. Ethanol sẽ được bổ sung giúp đẩy các phân tử nước ra khỏi acid nucleic và cả Silica làm tăng cường quá trình gắn DNA lên màng silica.

Bước tiếp theo là rửa để loại bỏ các tạp chất như protein và polysacarit bằng cách ly tâm.

Bước cuối cùng là rửa giải, giải phóng acid nucleic ra khỏi màng và thu dịch.

2.2.3. Kiểm tra insilico các đặc tính của Mồi – Mẫu dò

Theo tiêu chuẩn của Kenneth J. Livak (Kenneth J. Livak, 1999) thì mồi – mẫu dị sẽ có những thơng số sau:

- Mồi - Primer:

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

Primer có chiều dài từ 18-30 base (tốt nhất khoảng 24 base) Hàm lượng GC 40-60%

Base kết thúc của primer tốt nhất là G hoặc C

Tránh cấu trúc thứ cấp (kẹp tóc, self dimer) (Bắt buộc ΔG>-9, nếu ΔG<-9 thì Tm phải cao khoảng trên 60<small>o</small>C)

Tránh lặp lại base C hoặc G hơn 3 lần

Lựa chọn vùng trình tự khuôn tốt nhất để thiết kế primer là khoảng 1000base đối với phản ứng PCR và khoảng dưới 200 base đối với phản ứng real-time PCR.

300-Primer nên có nhiệt độ bắt cặp từ 55-60<small>0</small>C

Kiểm tra trình tự của primer xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp bổ sung ở đầu 3’(tránh tạo primer-dimer)

Cặp primer được thiết kế sao cho nhiệt độ nóng chảy Tm của primer F và R khơng được cách biệt nhau quá xa

Tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần,thành phần 5 nucleotide cuối cùng trong đầu 3’ không được lớn hơn hai G hoặc C tránh hiện tượng nhân bản ký sinh, trình tự primer phải đặc trưng cho DNA cần nhân bản.

- Mẫu dị - Taqman Probe:

Thơng thường probe được thiết kế trước khi thiết kế primer, primer được thiết kế gần với vị trí của probe nhưng khơng được trùng lắp với probe, Khi thiết kế probe cần chú ý các vấn đề sau:

Probe phải nằm gần primer (để khơng ảnh hưởng đến q trình đọc tín hiệu) Probe nên có chiều dài ngắn hơn 30 nu

Khơng nên có G ở đầu 5’ vì G hấp thụ tín hiệu huỳnh quang làm sai lệch kết quả.

Trình tự probe có hàm lượng GC khoảng 30-80% Probe phải có nhiều base C hơn G.

Nhiệt độ nóng chảy của probe lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của primer 8 – 10<small>0</small>C.

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

- Kiểm tra mồi – mẫu dò:

Tiến hành download trình tự gene mục tiêu L. monocytogenes (hlyA) và Salmonella (invA) trên ngân hàng NCBI.

Sử dụng phần Anhyb để kiểm tra mồi – mẫu dị trên trình tự mục tiêu

Sử dụng phần mềm OligoAnalyzer (IDT) đánh giá một số đặc tính hố lý cũng như là khả năng bắt cặp chéo giữa các mồi -mẫu dò.

2.2.4. Phương pháp Real-time PCR

Mẫu sau khi ly trích DNA được cho vào phản ứng Real-Time PCR phát hiện L. monocytogenes và Salmonella spp sử dụng Taqman Probe như sau

Bảng 2. 2 Màu của thuốc nhuộm phát huỳnh quang sử dụng cho mẫu dò

Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Hoạt hóa 1ml dung dịch chuẩn Salmonella ATCC 19115 trong 9ml đệm

peptone đạt nồng độ 10<small>2</small> – 10<small>3</small>CFU/ml; Hoạt hóa 1ml dung dịch chuẩn L. monocytogenes ATCC 19115 trong 9ml đệm peptone đạt nồng độ 10<small>2</small> – 10<small>3</small>CFU/ml.

Quy trình hoạt hóa cho chủng ATCC 19115 (Hai viên khuẩn lạc được sử dụng đạt nồng độ từ 10-100 CFU trên 0.1mL trên môi trường không chọn lọc).

+ Làm ấm chai chứa dịch hydrat và tube chứa 9 mL phosphate buffer ở 34°C–38°C (ít nhất 30 phút).

+ Dùng kẹp vô trùng chuyển, chuyển 2 viên khuẩn lạc vào chai chứa 2mL dịch hydrat.

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

+ Sau khi ủ trong bể ủ nhiệt, vortex chai cho đến khi các viên hồn tồn hịa tan, đồng nhất.

+ Chuyển 1mL dịch đã hydrat vào tube chứa 9 mL phosphate buffer. Vortex kỹ dung dịch. Đo OD.

- Dịch khuẩn sau hoạt hóa được tiến hành ly trích DNA, DNA thu được dùng thực hiện phản ứng Real-time PCR, mỗi mẫu lặp lại 3 lần.

Khảo sát nồng độ mồi – mẫu dò

Theo Protocol của Bioline - UK, Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 nồng độ mồi lần lượt 200, 400, 600nM và 3 nồng độ mẫu dò lần lượt 50, 100, 150nM. Các nồng độ được kết hợp thành chín nghiệm thức (bảng 3.3). Mỗi nghiệm thức sẽ chạy kiểm tra trên 2 nồng độ dịch khuẩn cao (10<small>6 </small>CFU/ml) và thấp (10<small>2 </small>CFU/ml) trên mẫu chuẩn Salmonella ATCC 19115 và L. monocytogenes ATCC 1911. Mỗi mẫu chạy lặp lại ba lần. Mẫu dương tính phải có tín hiệu huỳnh quang vượt tín hiệu huỳnh quang nền và có dạng tín hiệu của một phản ứng real-time PCR chuẩn.

Khảo sát nhiệt độ phản ứng

Nhiệt độ lai tối ưu của phản ứng Real-time PCR được tiến hành với gradient nhiệt độ 55-65<small>o</small>C, chọn 5 khoảng nhiệt độ cách đều nhau (55<small> o</small>C – 58<small> o</small>C – 60<small> o</small>C – 62.5<small> o</small>C – 65<small> o</small>C). Phản ứng được thực hiện ở 2 nồng độ cao và thấp tương ứng là 10<small>6 </small>CFU/ml và 10<small>2 </small>CFU/ml trên mẫu chuẩn Salmonella spp ATCC 19115 và Listeria monocytogenes ATCC 19115. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.

Khảo sát độ đặc hiệu

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò được thực hiện bằng Real-time PCR trên sản phẩm DNA (10ng) của các chủng chuẩn Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococus aureus ATCC 25923; Shigella flexneri ATCC 12022; Bacillus aureus ATCC 11778; Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802; Salmonella spp ATCC 19115; Liseria monocytogenes ATCC 19115 (bảng 2.1), với chu trình nhiệt là 95<small>o</small>C-3 phút (1 chu kỳ), 95<small>o</small>C-10 giây và 60<small>o</small>C – 30 giây (40 chu kỳ) (bảng 3.8) và thành phần phản ứng bao gồm 2x Sensifast Mix, mồi (400uM), mẫu dò

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

(100uM) (bảng 3.7). Mỗi lơ thí nghiệm kèm một mẫu âm và một mẫu chứng dương.

Khảo sát độ nhạy

- Chuẩn bị dịch khuẩn Salmonella ATCC 14028 và L. monocytogens ATCC 19111 ở các nồng độ 10<small>7</small> CFU/mL đến 10<small>1</small> CFU/mL được xác định bằng cách nuôi cấy trên môi trường lần lượt là XLD và BHI broth. Tiến hành real-time PCR trên dãy nồng độ mẫu chuẩn pha loãng.

- Gây nhiễm 1ml chủng khuẩn vào 25ml sữa, đồng nhất mẫu trong 225ml môi trường BPW, ủ 37°C trong 1h. Lấy 1ml dịch khuẩn tiến hành ly tâm thu cặn rồi ly trích DNA, thực hiện Real-time PCR.

- Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần, mỗi lơ thí nghiệm đều kèm một mẫu âm.

- Độ nhạy của quy trình là nồng độ nhỏ nhất mà tại đó tín hiệu huỳnh quang vượt quá tín hiệu huỳnh quang nền là ngưỡng phát hiện của quy trình.

- Mẫu dương tính phải có tín hiệu huỳnh quang vượt tín hiệu huỳnh quang nền và có dạng tín hiệu của một phản ứng real-time PCR chuẩn. Mẫu âm tính có tín hiệu thấp hơn tín hiệu huỳnh quang nền.

- Trộn hỗn hợp mẫu chuẩn 1ml L. monocytogenes và 1ml Salmonella ở ba nồng độ pha loãng từ 103 -102- 101 CFU/mL, tiến hành tách chiết thu DNA, thực hiện real-time PCR. Tín hiệu huỳnh quang xuất hiện kênh màu FAM là mẫu dương Salmonella và kênh màu Texas red là L. monocytogenes.

2.2.5. Phương pháp Real-time PCR kết hợp thuốc nhuộm PMA

Sau khi tối ưu quy trình Real-time PCR chúng tôi tiến hành tối ưu quy trình PMA kết hợp với real-time PCR. Mỗi mẫu sau tăng sinh sẽ được thực hiện 02 quy trình như sau:

- Thu cặn 500ul tế bào bằng cách ly tâm ở 13.000 rpm trong 5 phút; Một ống xử lý với thuốc nhuộm PMA, một ống không xử lý với thuốc nhuộm PMA; Ủ ống có thuốc nhuộm ở điều kiện bóng tối trong 10 phút ở nhiệt độ phòng; tiếp theo phơi sáng 15 phút bằng thiết bị đèn LED (465-475 nm);

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

- Ly trích thu DNA; Thực hiện Real-time PCR.

- Phân tích dữ liệu: tính dCt (dCt = Ct xử lý với PMA - Ct khơng xử lý PMA). Quy trình theo Kit của biotium (code: 31033-X và31051-X):

- Ủ 10 phút, lắc, tránh ánh sáng, phơi sáng trong 15p

Bảng 2.3 và Bảng 2.4; Phản ứng sau khi chuẩn bị được đặt vào máy real-time Linegene 9600 (Bioer) và sử dụng chu trình nhiệt như Bảng 2.5

- Phân tích kết quả dCt (dCt = Ct với thuốc nhuộm - Ct không thuốc nhuộm) Bảng 2.3 Thành phần phản ứng real-time PCR được sử dụng cho phát hiện Salmonella

Bảng 2. 4 Thành phần phản ứng real-time PCR được sử dụng cho phát hiện Salmonela và L. monocytogenes

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

Bảng 2. 5 Chu trình nhiệt cho phản ứng

Chuẩn bị thuốc nhuộm PMAxx

- Ly tâm nhẹ tube PMAxx trong 30 giây với tốc độ ~ 7000 vòng/phút để dung dịch nằm ở đáy lọ; Chuyển 80 μl thuốc nhuộm vào tube sạch; Ly tâm trong 30 giây với tốc độ ~ 7000 vòng / phút; Chuyển 10 μl thuốc nhuộm vào tube ở bước 4; Ly tâm trong 30 giây với tốc độ ~ 7000 vòng / phút; Chuyển thuốc nhuộm còn lại vào tube ở bước 4.

Quy trình xử lý vi khuẩn với thuốc nhuộm PMAxx

- Chuẩn bị dịch khuẩn ở các nồng độ pha lỗng; Hút 500 μL dịch ni cấy vi khuẩn vào các tube sạch.

- Rã đông PMAxx gốc 20 mM (tiến hành nhanh trong điều kiện ánh sáng yếu) và pha loãng thành 5 mM trong nước. Thêm 2 - 4μL PMA 5 mM vào 400μL mẫu để đạt nồng độ cuối cùng tương ứng là 25μM - 50μM (nồng độ cần khảo sát).

- Tube mẫu được lắc ủ ở điều kiện tối trong 10 phút ở nhiệt độ phòng hoặc lắc ủ trên rocker được phủ bằng lá nhôm; Cho các mẫu ra ánh sáng để PMAxx liên kết với DNA; Sử dụng đèn PMA-lite để quang hóa PMA. Phơi sáng mẫu trong 5-15 phút.

- Thu cặn tế bào bằng cách ly tâm ở 5.000 x g trong 10 phút; Tách chiết DNA bộ gene; thực hiện phản ứng Real-time PCR.

- Phân tích dữ liệu: tính dCt (dCt = Ct xử lý với PMA - Ct không xử lý PMA). Có thể tính dCt của mẫu kiểm sốt các tế bào bị chết để xác định mức độ ức chế tối đa mà PMA có thể đạt được trong mẫu và có thể tính dCt của các tế bào

Biến tính Bắt cặp – kéo dài

95<small>o</small>C 5 giây 60oC 30 giây (đọc tín

hiệu huỳnh quang)

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

sống kiểm soát để kiểm soát các âm tính giả có thể phát sinh từ thuốc nhuộm lên tế bào.

Khảo sát nhiệt độ xử lý vi khuẩn

Chuẩn bị dịch khuẩn Salmonella ATCC 19115 và L. monocytogenes ATCC 19115 ở nồng độ 10<small>7</small> CFU/mL.

Gây chết vi khuẩn bằng cách thu 1 mL dịch khuẩn vào các tube, xử lý nhiệt trong bể ổn nhiệt, khảo sát hai điều kiện xử lý nhiệt là 100°C 5 phút và 90<small>o</small>C trong 5 phút. Tiến hành cấy 10 μL vi khuẩn đã xử lý nhiệt trên đĩa môi trường thích hợp và cấy song song 10 μL của dịch khuẩn đối chứng. Ủ ở 37°C và kiểm tra khuẩn lạc

mọc sau 24-48 h. Chủng Salmonella thì cấy trên đĩa XLD và chủng L. monocytogenes thì cấy trên mơi trường BHI Agar.

Khảo sát nồng độ PMA tối ưu

Dựa trên các cơng trình đã nghiên cứu, chúng tơi tiến hành khảo sát PMA ở hai nồng độ là 25μM và 50μM (Li và Chen, 2013) để khảo sát nồng độ tối ưu trên ba nhóm dịch khuẩn là dịch khuẩn sống (LIVE), dịch khuẩn chết (DEAD), hỗn hợp dịch khuẩn sống/chết (MIX). Cả 3 nhóm cùng tiến hành song song Real-time PCR không xử lý và xử lý PMA ở hai nồng độ. Đánh giá so sánh giá trị dCt = Ct (PMA) – Ct (0), chọn nồng độ PMA tối ưu hơn với giá trị dCt lớn hơn.

Chuẩn bị dịch khuẩn ở nồng độ 10<small>7</small>CFU/ml. Với vi khuẩn chết thì chúng tơi tiến hành xử lý nhiệt đã khảo sát ở mục 3.3.1. Tiến hành xử lý PMA ở các nồng độ 25uM và 50uM, tách chiết thu DNA, chạy phản ứng real-time PCR với thành phần phản ứng như bảng 3.7 và chu trình nhiệt như bảng 3.8;

Khảo sát khả năng phân biệt vi khuẩn sống và chết

Gây nhiễm mẫu sữa với các ống chuẩn Salmonella ATCC 14028 và

bị dịch khuẩn sống (LIVE) và dịch khuẩn đã xử lý nhiệt (DEAD) trên các nồng độ. Tiến hành tách chiết thu DNA, chạy phản ứng Real-time PCR trên mẫu không xử lý PMA (0) và xử lý PMA (50μM). Đánh giá và phân tích dữ liệu dCt = Ct (xử lý với PMA) – Ct (không xử lý PMA). Mỗi lơ thí nghiệm điều chạy kèm một mẫu âm.

94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:14 PM8:00:14 PM

94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM94Wednesday, June 12, 20248:00:15 PM8:00:15 PM

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

</div>

xây dựng quy trình pma real time pcr phát hiện listeria monocytogenes và salmonella spp trên mẫu sữa

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- </b>

<b>ĐỖ NGỌC DIỄM TRÚC </b>

<b>XÂY DỰNG QUY TRÌNH </b>

<b>PMA REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN </b>

<i><b> Listeria monocytogenes VÀ Salmonella spp </b></i>

<b>TRÊN MẪU SỮA </b>

<b>Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01 </b>

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC </b>

<b>Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020 </b>

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

<b>GIẤY XÁC NHẬN </b>

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

94Xay dung quy trinh PMA real time PCR phat hien Listeria monocytogenes va salmonella spp tren mau suaWednesday, June 12, 2024

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về