xác định chỉ thị dna barcode và nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai ug 24 eucalyptus urophylla x eucalyptus grandis

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (21.11 MB, 77 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BÙI THỊ HOÀNG YẾN

XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ DNA – BARCODE VÀ NHÂN GIỐNG

IN VITRO DÒNG BẠCH ĐÀN LAI UG24

(EUCALYPTUS UROPHYLLA x EUCALYPTUS GRANDIS)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. BÙI THỊ MAI HƯƠNG

Hà Nội, 2021 Hà Nội, 2021

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohghghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohg

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan, đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác.

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào đã cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm và tn thủ kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học.

Hà nội, ngày 28 tháng 8 năm 2021

Người cam đoan

Bùi Thị Hoàng Yến

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho tơi trong suốt q trình học tập.

Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Thị Mai Hương và TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm và PGS.TS. Hà Văn Huân - Trường Đại học Lâm nghiệp, đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tơi trong suốt q trình làm luận văn Thạc sĩ này.

Ngồi ra, Tơi cũng xin chân thành cảm ơn sự trợ giúp về vật liệu, hóa chất và học thuật từ Đề tài NAFOSTED mã số 106.06-2019.27 do TS. Lê Thọ Sơn, Viện CNSH Lâm nghiệp, Trường ĐH Lâm nghiệp làm Chủ nhiệm.

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ln sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm 2021

Học viên

Bùi Thị Hoàng Yến

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ... 3

1.1. Giới thiệu chung về cây bạch đàn lai ug24 ... 3

1.1.1. Đặc điểm 2 dòng bạch đàn bố mẹ của dòng UG24 ... 3

1.1.2. Giới thiệu về bạch đàn lai UG24 ... 6

1.2. Tổng quan về adn mã vạch ... 6

1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcode) ... 6

1.2.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật .. 7

1.2.3. Những nghiên cứu về ứng dụng ADN mã vạch trong giám định loài ... 10

1.2.4.Tổng quan về phương pháp xử lí dữ liệu nghiên cứu ADN mã vạch trong giám định loài ... 12

1.3. Tổng quan về nuôi cấy mô - tế bào in vitro ... 12

1.3.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro ... 12

1.3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ... 13

1.3.3. Các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống in vitro ... 14

1.3.4. Thành tựu trong nuôi cây mô đối với Bạch Đàn ... 16

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU ... 20

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20

2.1. Mục tiêu nghiên cứu ... 20

2.1.1 Mục tiêu tổng quát ... 20

2.1.2. Mục tiêu cụ thể ... 20

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

2.2. Nội dung nghiên cứu ... 20

2.2.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch cho dòng bạch đàn lai UG24. ... 20

2.2.2. Nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai UG24 ... 20

2.3. Địa điểm, điều kiện nghiên cứu ... 20

2.3.1. Địa điểm nghiên cứu nhân giống ... 21

2.3.2. Điều kiện bố trí thí nghiệm nhân giống ... 21

2.4. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ... 21

2.4.1. Vật liệu nghiên cứu ... 21

2.4.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ... 22

2.5. Phương pháp nghiên cứu ... 23

2.5.1. Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch ... 23

2.5.2. Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro ở dòng Bạch đàn lai UG24 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis) ... 25

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ... 31

3.1. Kết quả xác định một số đoạn adn mã vạch... 31

3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá cây Bạch đàn lai ... 31

3.1.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ... 31

3.1.3. Phân tích kết quả... 32

3.2. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai ug24 ... 47

3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của công thức khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh của bạch đàn lai UG24 ... 47

3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi ở bạch đàn lai UG24 ... 50

3.2.2. Kết quả nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ở bạch đàn lai UG24 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 60PHỤ LỤC

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT

1 ADN Acid Deoxyribonucleic

3 BAP 6 - benzynlaminopurin 4 bp Base pair (cặp bazơ nitơ)

5 CTAB Hexadecyl trimethyl ammonium bromide 6 CTTN Cơng thức thí nghiệm

7 ddNTP Dideoxy nucleo triphotphate 9 ĐHST Điều hòa sinh trưởng

20 NCBI Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học Hoa Kỳ

21 PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp

ADN)

26 WPM Woody plant medium (môi trường cây thân gỗ)

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Vị trí phân loại của Eucalyptus urophylla và Eucalyptus grandis ... 3

Bảng 2.1: Trình tự và thông tin của các cặp mồi được sử dụng ... 22Bảng 2.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi dòng bạch đàn lai UG24 ... 26Bảng 2.3: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của bạch đàn lai UG24 ... 28Bảng 2.4. Hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của bạch đàn lai UG24 ... 29Bảng 3.1. Một số lồi có trình tự đoạn rbcL tương đồng với một số giống Bạch đàn lai trên NCBI ... 33Bảng 3.3. Một số lồi có trình tự đoạn matK tương đồng với giống Bạch đàn lai trên NCBI ... 36Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền của giống Bạch đàn lai với các loài khác của

đoạn matK ... 37

Bảng 3.5. Một số lồi có trình tự đoạn trnH-psbA ... 38Bảng 3.6. Khoảng cách di truyền của giống Bạch đàn lai với các loài khác

của đoạn trnH-psbA ... 40

Bảng 3.7. Một số lồi có trình tự đoạn ITS tương đồng với giống Bạch đàn lai trên NCBI ... 41 Bảng 3.8. Khoảng cách di truyền của giống Bạch đàn lai với các loài khác của đoạn ITS ... 43 Bảng 3.9. Khoảng cách di truyền của giống Bạch đàn lai với các loài khác của đoạn ITS2 ... 44 Bảng 3.10. Khoảng cách di truyền của giống Bạch đàn lai với các loài khác của đoạn ITS2 ... 45 Bảng 3.11. So sánh khả năng phân biệt của các đoạn matK, rbcL, trnH-psbA, ITS và ITS2 giữa UG24 và E.urophylla ... 46

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi bạch đàn lai UG24 (sau 4 tuần nuôi cấy) ... 51 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các loại ánh sáng đèn đến khả năng nhân nhanh chồi ... 53 Bảng 3.15. Kết quả ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của bạch đàn lai UG24 ... 54 Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của bạch đàn lai UG24 ... 55 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ in vitro ... 56

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái cây bạch đàn Eucalyptus urophylla (S.T.Blake, 1977) .... 4

Hình 1.2. Cây bạch đàn Eucalyptus grandis (tại rừng bang Kerewong, Úc) ... 5

Hình 3.1. Ảnh điện di ADN tổng số của 3 mẫu Bạch đàn lai UG24 ... 31

Hình 3.2. Kết quả PCR các đoạn gen trnH-psbA, matK, rbcL, ITS2, ITS của Bạch đàn lai UG24 ... 32

Hình 3.3. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL tạo bởi ML ... 34

Hình 3.4. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn matK tạo bởi ML ... 36

Hình 3.5. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn trnH-psbA tạo bởi ML . 39Hình 3.6. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ITS tạo bởi ML ... 42

Hình 3.7. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ITS2 tạo bởi ML ... 44

Hình 3.8. Bình vào mẫu và mẫu sạch bạch đàn lai UG24 nảy mầm ... 49

Hình 3.9. Cụm chồi dịng UG24 tái sinh từ mẫu sạch ở cơng thức ... 50

khử trùng M4 ... 50

Hình 3.10. Bình chồi UG24 ở cơng thức CT12 thu được sau ni cấy 4 tuần ... 52

Hình 3.11. Bình chồi Bạch đàn UG24 khi nuôi cấy dưới AS2 ... 53

Hình 3.12. Chồi bạch đàn lai UG24 cấy trên mơi trường R4 (A) và cây con ra rễ trên các mơi trường khác nhau (B) ... 56

Hình 3.13. Bạch đàn lai UG24 ra rễ dưới AS3 ... 57

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, không chỉ ở Việt Nam mà trên cả thế giới, công cuộc bảo vệ rừng cũng như sản xuất các sản phẩm thân thiện với môi trường đang là xu thế mới. Một lồi cây góp phần quan trọng trong việc phát triển kinh tế rừng phải kể đến là loài bạch đàn. Bạch đàn nói chung hay cịn gọi là khuynh diệp

(bạc hà), là chi thực vật có hoa Eucalyptus trong trong họ Sim (Myrtaceae).

Hiện trên thế giới có hơn 700 lồi bạch đàn, hầu hết có bản địa tại Australia. Ngồi ra, một số lồi được tìm thấy ở New Guinea, Indonesia và một loài ở vùng viễn bắc Philippines và Đài Loan. Các loài bạch đàn đã được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ... và cả Việt Nam. Bạch đàn là loài cây gỗ có giá trị kinh tế cao như làm gỗ trong xây dựng, làm nguyên liệu chế biến bột giấy và ván ép trong công nghiệp, tinh dầu bạch đàn điều trị đau đầu, nhức xương trong y học…

Gần đây một số giống bạch đàn lai có năng suất cao đã được chọn và gây trồng rất thành công ở một số nước như Brazil, Congo, Trung Quốc, Ấn Độ, Philippin, Indonesia, Zambia… Tại đây, trên những lập địa tốt và áp dụng kỹ thuật trồng thâm canh có thể đạt năng suất 40 - 80m

3

/ha/năm.

Tính đến năm 1995, Việt Nam có khoảng 144.417 ha rừng bạch đàn các loại- chiếm 35% diện tích rừng trồng của cả nước. Bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng, có mặt tại 6/9 vùng sinh thái chính trong cả nước. Tuy nhiên năng suất và chất lượng rừng bạch đàn ở nước ta cho đến nay còn tương đối thấp.

Bạch đàn lai UG24 được tạo ra từ hai loài Bạch đàn E.urophylla và

E.grandis và hiện nay giống Bạch đàn lai UG24 (E.urophylla x E.grandis)

được công nhận là giống quốc gia (3893/QĐ/BNN-TCLN, ngày 20 tháng 09 năm 2016) với mã số BĐL.TVT.16.03, là giống cây có giá trị kinh tế cao trong trồng rừng sản xuất. Do đó, việc nghiên cứu xác định các đoạn mã vạch

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

ADN cho giống Bạch đàn lai UG24 phục vụ giám định dòng cũng như phương pháp nhân nhanh giống này là vấn đề cần thiết và cấp bách cho việc định danh và phát triển vùng trồng để đưa giống lai UG24 vào sản xuất đại trà ở Việt Nam.

Xác định các đoạn mã vạch ADN là một phương pháp định danh, sử dụng một đoạn ADN chuẩn ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật đang nghiên cứu để phục vụ giám định loài. Phương pháp này mang lại hiệu quả cao trong thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào sự định danh và bảo tồn các loài thực vật trên thế giới. Phương pháp xác định các đoạn mã vạch ADN là một công cụ hữu hiệu bổ trợ cho phương pháp phân loại dựa vào hình thái. Một số lồi

Bạch đàn đã được định danh thành công bởi các mã vạch ITS và matK, rbcL,

psbA-matK, trnG-psbK.

Ở Việt Nam phương pháp này vẫn cịn tương đối mới, xong đã có một số đề tài khoa học đang tiến hành xác định DNA barcode ở thực vật và đã thu dược kết quả được đánh giá cao.

Từ những lý do trên, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định chỉ

thị DNA - barcode và nhân giống in vitro dòng Bạch đàn lai UG24 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis)”

Trong nghiên cứu này, đã tiến hành lựa chọn năm đoạn trình tự ADN

để sử dụng làm mã vạch ADN là: matK, rbcL, trnH-psbA, ITS và ITS2. Trong số đó, các đoạn rbcL, trnH-psbA và matK là các đoạn ADN nằm ở hệ gen lục lạp, các đoạn ITS và ITS2 nằm ở hệ gen nhân. Các đoạn trình tự này đều có

tính đặc trưng cao cho lồi, có thể đem lại kết quả khả quan nhằm phân loại, giám định và xác định mối quan hệ di truyền, đồng thời cung cấp cơng thức nhân giống bạch đàn lai UG24 có các đặc tính tốt phục vụ cho cơng tác trồng rừng chất lượng cao. Từ đó góp phần nâng cao hiệu quả bảo tồn và phát triển giống Bạch đàn lai UG24 ở Việt Nam.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Bảng 1.1: Vị trí phân loại của Eucalyptus urophylla và Eucalyptus grandis

Eucalyptus urophylla là loài bạch đàn được nhà thực vật học Stanley

Thatcher Blake mô tả lần đầu tiên vào năm 1977 như một phần của cơng

trình “Bốn lồi Bạch đàn mới” được cơng bố trên tạp chí Austrobaileya [17].

Loài này xuất hiện tự nhiên trên đất có nguồn gốc núi lửa ở bảy hịn đảo miền đơng Indonesia (Timor, Flores, Wetar, Lembata (Lomblem), Alor, Adonara và Pantar) ở độ cao từ 180 m đến 3000m. Nó được tìm thấy ở những khu vực có nhiệt độ trung bình hàng năm là 24 – 28

0

C và lượng mưa trung bình hàng năm là 700 - 2.500mm. Trong phạm vi tự nhiên của nó, lượng mưa

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

là gió mùa với 2-8 tháng khô mỗi năm. Phát triển tốt nhất trên đất sâu, ẩm, thốt nước tốt, có tính axit hoặc trung tính có nguồn gốc từ núi lửa hoặc đá biến chất. Nó cũng thường được tìm thấy trên đá bazan, đá phiến và đá phiến, nhưng hiếm khi trên đá vơi. Nó chịu được đất kém miễn là kết cấu lỏng lẻo. Cây phát triển nhanh, đặc biệt là khi còn nhỏ. Cây trong một lần trồng đã đạt chiều cao trung bình 27 mét khi 8 tuổi [28].

Eucalyptus urophylla là một trong những loài cây trồng rừng quan

trọng về mặt thương mại như một loài ngoại lai trên thế giới. Nó thường được

lai với E. grandis để tạo ra thế hệ con lai thích nghi tốt với điều kiện nhiệt đới và con lai có khả năng kháng bệnh tốt hơn E. grandis bố mẹ.

Hình 1. 1: Hình thái cây bạch đàn Eucalyptus urophylla (S.T.Blake, 1977)

Loài này được trồng ở Java năm 1890 và Brazil năm 1919, du nhập vào Úc năm 1966 và gần đây là đến Cameroon , Congo , Gabon , Guiana thuộc Pháp , Bờ Biển Ngà và Madagascar ở Châu Phi, và Malaysia, Việt Nam, miền nam Trung Quốc và Papua New Guinea ở Châu Á. Chỉ riêng ở Việt Nam đã

có 200.000 ha trồng E. urophylla [19].

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

1.1.1.3 Bạch đàn Eucalyptus grandis.

Eucalyptus grandis lần đầu tiên được Walter Hill mô tả chính thức vào

năm 1862 trong “Danh mục các sản phẩm tự nhiên và công nghiệp của Queensland” [40]. Nó thường được gọi là kẹo cao su ngập nước và kẹo cao su hoa hồng, được tìm thấy trên các khu vực ven biển và các dải phụ ven biển từ vùng lân cận Newcastle ở New South Wales về phía bắc đến Bundaberg ở trung tâm Queensland với các quần thể khơng cịn tồn tại xa hơn về phía bắc gần Mackay , Townsville và Daintree ở phía bắc Queensland , chủ yếu trên đất bằng và các sườn núi thấp hơn, đất có nhiều mùn phù sa màu mỡ . Lượng mưa hàng năm thay đổi từ 1100 đến 3500 mm. [21]

Hình 1.2: Cây bạch đàn Eucalyptus grandis (tại rừng bang Kerewong, Úc)

Eucalyptus grandis là một loại cây thân thẳng, có thể cao 50 – 75m thậm

chí cao đến 85m. Chúng được trồng nhiều ở Úc, các đồn điền tại Nam Phi và Brazil để lấy gỗ, bột giấy. [25,41]

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

1.1.2. Giới thiệu về bạch đàn lai UG24

1.1.1.4 Nguồn gốc giống Bạch đàn lai UG24

UG24 là dòng bạch đàn lai giữa Eucalyptus urophylla và Eucalyptus

grandis. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn ra quyết định công nhận

giống Bạch đàn lai UG24 là giống quốc gia (Quyết định số TCLN, ngày 20 tháng 09 năm 2016) với mã số BĐL.TVT.16.03. Theo tập thể tác giả Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Minh Ngọc và Đỗ Thị Minh Hiển (2016) thì bạch đàn lai UG24 được trồng ngoài thực tế hiện trường đã cho những kết quả đáng mong đợi [11]. Vậy có thể nói, tính đến thời điểm hiện tại này, UG24 là một trong những dòng Bạch đàn lai mới nhất được công nhận là giống quốc gia, và đã được sở khoa học và công nghệ Bắc Giang thành lập hội đồng xây dựng mơ hình trồng thử nghiệm vào 03/08/2015.

3893/QĐ/BNN-1.1.1.5 Những đặc điểm ưu việt của giống bạch đàn lai UG24

+ Thân cây cao, thẳng và ít cành nhánh, chiều cao dưới cành lớn. + Có sức chống chịu với sâu bệnh, sinh trưởng tốt.

+ Có khả năng phát triển tốt ở những vùng đất hơi ẩm ướt, có tính axit hoặc trung tính.

1.2. Tổng quan về adn mã vạch

1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcode)

Trong lịch sử phân loại sinh vật học các nhà khoa học đã sử dụng rất nhiều phương pháp như phương pháp hình thái học, phương pháp giải phẫu, phương pháp sinh hoá … Đến năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Ở thực vật, một số phương pháp chỉ thị phân tử được sử dụng để nhận dạng loài cũng như sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai ADN (RFLP), dấu vân tay ADN (DNA fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR.

Đến năm 2003, Paul Hebert – một nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Canada, đã đề xuất một phương pháp xác định loài dựa trên ADN mã vạch (DNA barcode). Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay đổi theo quá trình tiến hóa [23].

Một vùng trình tự ADN được sử dụng làm mã vạch cần phải đảm bảo các đặc điểm sau: Có tính phổ biến cao, trình tự có tính đặc hiệu cao, có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều lồi [26], có độ dài thích hợp, khơng phải vùng dị hợp để có thể nhân bản trực tiếp trình tự mà không cần tách dịng; thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt các bazơ nitơ và khơng có các đoạn lặp làm giảm chất lượng trình tự [24].

Phương pháp xác định các đoạn mã vạch ADN là một công cụ hữu hiệu bổ trợ cho phương pháp phân loại dựa vào hình thái [16]. Ở động vật, đoạn mã vạch ADN được sử dụng cho phần lớn các loài là đoạn gen ở ty thể cytochrome

C oxidase (CO1) [14,15]. Ở thực vật, thay vào đó, một số gen lục lạp như matK,

rbcL; gen vùng nhân như ITS, ITS2; vùng xen TrnH-psbA, psbK-psbI được sử

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

thường có số lượng bản sao thấp hoặc là gen đơn và tính bảo thủ cao do vậy sẽ khó khăn cho phân biệt ở mức độ dưới lồi.Vì vậy đây là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng chỉ thị ADN mã vạch [38].

1.2.2.2. Vùng gen mã hóa ribosome

Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần ARN của ribosome. Trong tế bào, các DNA mã hóa ribosome 18S; 5,8S; 28S và xen giữa các trình tự khơng

mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Trình tự ITS này bao gồm ITS1-5,8S-ITS2 với kích thước khác nhau, từ

400-1000bp. Trình tự này được sử dụng thường xuyên trong nghiên cứu hệ thống phát sinh ở thực vật do nó có khả năng phân biệt loài cao nhất và dễ khuếch đại [22, 27]. Một số nghiên cứu ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh

sản vơ tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến

cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên cơ sở này nrDNA được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài và dưới loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước, cây một lá mầm, cây hai lá mầm..) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [32, 33, 36].

1.2.2.3. Trình tự gen lục lạp

Hệ gen lục lạp là tồn bộ lượng thơng tin di truyền chứa trong ADN của lục lạp . Giống như ADN trong ty thể ADN trong lục lạp cũng có vai trị rất quan trọng và đáng chú ý vì sự có mặt của ADN trong lục lạp có liên hệ với hệ thống di truyền ngoài nhiễm sắc thể (di truyền ngoài nhân) và hệ thống tự tổng hợp protein của lục lạp. Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng lồi. Hiện nay, có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1kb) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài [37, 38, 42].

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Các gen thuộc cpADN có tính bảo tồn cao và có thể được chia thành 3 nhóm:

- Nhóm 1: Các gen mã hóa cho hệ thống quang hợp như phytosystem

(psaA, psaB, psbA, psbI…), cytochrome b6f (petA, petB..), ATP synthase (atpA, atpB…), rubisco (rbcL) và NADPH dehydrogenase (ndhA, ndhB…).

- Nhóm 2: Các gen mã hóa cho các rARN (rrn16, rrn5…), trnA (trnH,

trnK…), RNA polymerase (rpoA, rpoB…), các gen tiểu phần ribosome (rps2, rps3…).

- Nhóm 3: Các gen mã hóa protein như matK, cemA.

1.2.2.4. Trình tự gen matK

Gen matK có kích thước khoảng 1.550 bp và mã hóa cho protein

maturase K tham gia vào quá trình sau phiên mã của quá trình sinh tổng hợp

RNA vận chuyển amino acid Lysin. matK là một trong những khu vực mã hóa

tiến hóa nhanh nhất của hệ gen lục lạp và cho thấy khả năng phân biệt cao các

lồi trong thực vật hạt kín. CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực

vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng

cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những

locus barcode chuẩn cho thực vật [32, 38].

1.2.2.5. Trình tự hai gen trnH-psbA

Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi

từ 296 đến 1120 bp. Nó là vùng đệm khơng mã hóa nhưng có tính phổ qt và

có khả năng phân biệt loài cao. Gen trnH-psbA đã được khuếch đại thành

cơng ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã

đề xuất việc sử dụng trnH-psbA như chỉ thị mã vạch độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK, rbcL. CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của trnH-

psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó

như là chỉ thị mã vạch bổ sung [36, 38].

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

1.2.3. Những nghiên cứu về ứng dụng ADN mã vạch trong giám định loài

1.2.3.1. Trên thế giới

Hiện nay, kĩ thuật sử dụng mã vạch ADN để nhận dạng các lồi trên quy mơ tồn cầu ngày càng phát triển và có ý nghĩa ngày càng lớn. ADN mã vạch không chỉ nhận diện nhanh các mẫu mà cịn mở rộng nghiên cứu sắp xếp theo nhóm những bí ẩn, cịn mơ hồ hoặc những lồi phức tạp. Các nhà khoa học đã và đang tiến hành nhiều cơng trình nghiên cứu có ý nghĩa rất lớn về ADN mã vạch cụ thể như:

Nerea Larranage và José L.Hormaza (2015) đã xác định được trình tự

mã vạch DNA của 7 lồi trong chi Na, đó là: A. chemirola, A. squamosa, A.

reticulata, A. muricata, A. macroprophylata, A. glabra, A.purpurea nhờ chỉ

thị gen matK và rbcL. Trong đó, gen matK có thể phân biệt được 7 lồi cịn gen rbcL khơng thể phân biệt được 2 lồi A. cpherimola và A. squamosa [31].

Singh, D. & Ahuja, P. S (2006) đã tìm ra đoạn 5S rDNA là một chỉ thị

phân tử để định danh cho loài Camellia sinensis (L.) O. Kuntze, và tìm ra

đoạn này bị methyl hóa rất cao trong hệ gen của Trà [35].

Mark Y. Stoeckle và cộng sự (2011) đã thành công trong việc sử

dụng các đoạn matK và rbcL trong việc định danh cho loài Camellia sinensis,

C. sinensis var. sinensis và C. sinensis var. assamica (J. W. Mast.) [30].

Shih-Chieh Lee và cộng sự (2016) đã thành công trong sử dụng các

chỉ thị ITS2 và trnL-trnF để đinh danh nguồn gốc của 113 dòng trà hoa vàng

Camellia sinensis ở Đài Loan [34].

Hiện nay hệ thống ADN mã vạch cho thực vật vẫn đang được tiếp tục hồn chỉnh. Các nhà khoa học đã và đang có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học

1.2.3.2. Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, đến nay tuy đã có các nghiên cứu về ADN mã vạch nhưng các nghiên cứu này vẫn còn rất nhỏ lẻ, trên một vài đối tượng sinh vật, chưa

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về mã vạch ADN, một số đề tài đã và đang được triển khai tại các viện nghiên cứu và trường đại học trong cả nước.

Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015) đã sử dụng các đọan matK,

rbcL, trnH-psbA, ITS và ITS2 để định danh cho loài trà hoa vàng Camellia tamdaoensis [4].

Hoàng Minh Trang và cộng sự (2016) đã sử dụng các đoạn matK, rbcL,

trnH-psbA, ITS và ITS2 để định danh cho loài trà hoa vàng Camellia tienii

Ninh và tìm ra được ITS là đoạn có khả năng phân biệt loài tốt nhất cho

Camellia tienii Ninh [13].

Năm 2017, Lê Thanh Hương và cộng sự, đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng mã vạch ADN hỗ trợ định loại một số mẫu sâm thuộc chi nhân

sâm (PanaxL.)”. Trong nghiên cứu này, 5 mã vạch phân tử tiềm năng là 18S,

ITS, matk, psbA-trnH và rbcL được sử dụng để đánh giá khả năng phân biệt

loài của 11 mẫu sâm nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy 4 mẫu có

hình thái của Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus) được nhận dạng phân tử là loài Tam thất hoang. Ngoài ra nghiên cứu cũng cho thấy, chỉ thị ITS và psbA-

trnH là 2 chỉ thị tiềm năng, hỗ trợ định danh Sâm Ngọc Linh và Tam thất

hoang [8].

Đề tài: “Đặc điểm hình thái và mã vạch ADN của loài cây bảy lá một

hoa Pari vietnamensis (Takht.) H.Li”. do Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (năm 2018) đã tiến hành nghiên cứu Phân tích trình tự gen vùng ITS và psbA - trnH

riêng lẻ và kết hợp của 3 mẫu bảy lá một hoa Việt Nam cho thấy vùng gen

ITS có thể sử dụng để phân biệt bảy lá một hoa Việt Nam với các loại còn lại

trong chi Paris với độ tin cậy cao [2].

Lê Công Mạnh (2019) đã thực hiện nghiên cứu “Nghiên cứu xác định

DNA mã vạch cho loài lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata.

Trong nghiên cứu, đã sử dụng phương pháp ADN mã vạch với 04 loại locus

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

(matK, rbcL, trnH-psbA và ITS2 để xác định lồi Lan kim tuyến. Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen của 03 loại locus rbcL, matK và ITS2 đều có giá trị làm ADN mã vạch cho lồi Anoectochilus formosanus trong đó trình tự đoạn 27 gen ITS2 cho kết quả tốt nhất sau đó là matK và khả năng phân biệt loài thấp nhất là rbcL [10].

Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng nhằm cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn để bảo tồn và phát triển nguồn gen sinh vật ở nước ta, cũng như nhận dạng, truy xuất nguồn gốc và đăng ký bản quyền về cây giống và sản phẩm của chúng.

1.2.4.Tổng quan về phương pháp xử lí dữ liệu nghiên cứu ADN mã vạch trong giám định loài

BioEdit là phần mềm cho hệ điều hành Windows, thuộc nhóm phần mềm Software được phát triển bởi NA. Chức năng của nó như một chương trình sử dụng để phân tích trình tự và biên tập viên bắt cặp trình tự. Đó là chuột driven và dự định sẽ được sử dụng bởi các nhà sinh học, kỹ sư, và các nhà nghiên cứu.

BLAST (Basic Local Alignmet Tools) là chương trình so sánh cấu trúc chuỗi DNA, chuỗi amino acid cần phân tích với các chuỗi tương ứng lưu giữ trong Ngân hàng dữ liệu nhằm tìm kiếm chuỗi tương đồng với chuỗi kiểm tra và tìm kiếm xác định vùng tương đồng và mức độ phân ly về cấu trúc của chuỗi phân tích với các chuỗi khác trên Ngân hàng gen.

1.3. Tổng quan về nuôi cấy mô - tế bào in vitro 1.3.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro, hoăch vi nhân giống

(micropropagation) là phạm trù khái niệm để chỉ chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được tách khỏi cây trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và được kiểm soát [5].

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

1.3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào dựa vào các cơ sở đó là tính tồn năng của tế bào, sự trẻ hoá của tế bào và q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào.

1.3.2.1. Tính tồn năng của tế bào (totipotency)

Tính tồn năng của tế bào (totipotency) được hiểu là: Mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.

Cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, Gottlibeb Haberlant - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho ni cấy mơ tế bào thực vật. Ơng đã đưa ra giả thuyết về tính tồn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời” năm 1902. Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”.

Như vậy mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ tồn bộ lượng thơng tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Ngày nay các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.

1.3.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Q trình phát sinh hình thái ở thực vật thực chất là kết quả của q trình phân hố và phản phân hoá tế bào. Tất cả những tế bào mới được sinh ra từ mơ phân sinh thì cơ bản giống nhau, chúng sẽ trở thành các loại mơ khác nhau. Q trình tế bào thay đổi từ những hình dạng chưa trưởng thành đến trưởng thành gọi là sự phân hóa (sự chun hố - differentiation).Còn hiện tượng tế bào trưởng thành trở lại trạng thái phân sinh và tạo ra mơ sẹo khơng phân hóa được gọi là phản phân hóa.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình điều hịa hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong hai q trình phát triển của cá thể có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào.

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính tồn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào mơi trường ni cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong mơi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau. Khi trong mơi trường ni cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là IAA)/cytokinin (đại diện là kinetin) thấp thì sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ cịn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mơ sẹo [12].

1.3.3. Các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống in vitro

Theo Murashige (1974), quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn.

1.3.3.1. Giai đoạn 1: Tạo mẫu sạch

Là bước đầu tiên của quy trình nhân giống. Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn vật liệu vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy. Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, chọn cơ quan để lấy mẫu, khử trùng mẫu.

Mẫu mô được chọn phải có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Phương pháp khử trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các tác nhân hố học có tính sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl

2

, NaOCl, Ca(ClO

3

)

2

, H

2

O

2

,... để khử trùng mẫu.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

Nồng độ chất khử trùng được chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo nguyên tắc mô non nồng độ thấp, mô già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất khử trùng với nhau. Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môi trường nhằm tăng hiệu quả khử trùng.

1.3.3.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Là giai đoạn ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh

dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mơ cấy, thường kéo dài 3 - 10 tuần, tùy thuộc nhiều vào loại vật liệu nuôi cấy. Môi trường này được xác lập cho từng loại cây, loại mơ ni cấy. Khó khăn nhất của giai đoạn này là xác định được môi trường nuôi cấy khởi đầu phù hợp với mẫu mô nuôi cấy và phương thức tái sinh mẫu cấy. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.

1.3.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Giai đoạn nhân nhanh chồi sẽ được tiến hành khi mẫu cấy sạch đã cho các cụm chồi, các phơi vơ tính sinh trưởng tốt. Mục đích quan trọng nhất của giai đoạn này là tạo ra hệ số nhân nhanh chồi lớn nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường đã được tối ưu hóa. Để kích thích mơ ni cấy phát sinh thành nhiều chồi mầm ta tiến hành cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn 2 và cấy chúng trong môi trường mới theo định kỳ để tăng số lượng mẫu. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1-2 tháng tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh là vào khoảng 10-36 tháng.

1.3.3.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Tạo cây hoàn chỉnh được tiến hành khi chồi đã đạt được chiều cao, số lượng lá theo tiêu chuẩn. Thường sau 2-3 tuần nuôi cấy trong môi trường kích thích ra rễ, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

chỉnh. Ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống.

1.3.3.5. Giai đoạn 5: Đưa cây mơ ra ngồi vườn ươm

Đây là giai đoạn cuối của q trình ni cấy mơ, nó đánh giá tính hiện

thực của q trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này sẽ tiến hành chuyển dần

cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hồn tồn và thích nghi dần với mơi trường tự nhiên. Khi cây đạt tiêu chuẩn cứng cáp thì mang trồng. Cây từ ống nghiệm đưa ra ngoài vườn ươm thường có hiện tượng “sốc” do thay đổi về điều kiện mơi trường nên cần có giai đoạn thích nghi. Q trình thích nghi với điều kiện bên ngồi của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh để các cây con đạt tỷ lệ sống cao.

1.3.4. Thành tựu trong nuôi cây mô đối với Bạch Đàn

Trong công nghệ tạo giống, phương pháp nhân giống invitro có những

ưu việt mà phương pháp khác khơng có được như: cây con được tạo ra bằng ni cây mơ có độ trẻ hóa cao thậm chí khơng có sự khác biệt so với cây mọc từ hạt, hệ số nhân giống cao, sản phẩm cây giống đồng nhất, nâng cao chất lượng cây giống, khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn, lợi thế về vận chuyển, tiết kiệm không gian, sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào thời vụ. Trên thế giới và Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen thực vật. Với chi

Eucalyptus cũng đã có rất nhiều thành tựu khoa học như sau: 1.3.4.1. Nghiên cứu trên thế giới

Lai giống bạch đàn đã được nhiều nước quan tâm từ cuối những năm 1960. Phương pháp lai giống bạch đàn của Moncur (1995) cũng được giới

thiệu áp dụng trong các nước. Nhiều tổ hợp lai khác loài mà E.grandis và

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

E.urophylla dùng làm cây mẹ đã được tạo ra. Theo Martin (1989) thì đến năm

1989 đã có hơn 20 tổ hợp lai khác lồi được tạo ra ở chi bạch đàn, trong đó

chủ yếu là nhóm E.grandis và E.urophylla được dùng làm cây mẹ. Cịn theo

Shuxiong (1989) thì từ năm 1975, Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây

(Trung Quốc) đã tạo ra một số tổ hợp lai E.saligna và E.exserta, trong đó một số cá thể ở cây lai có thể tích thân cây vượt E.exserta đến 82% [5,9].

Từ năm 1989, Viện lâm nghiệp nhiệt đới của Trung Quốc cũng tạo ra

204 cây lai (không phải tổ hợp lai) giữa E.urophylla với E.tereticornis,

E.camaldulensis, E.grandis, E.pellita. Trung Quốc là một nước thành công

trong việc tạo cây ni cấy mơ cho các lồi cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 lồi cây thân gỗ được nuôi cấy như dương, bạch đàn, tếch, bao đồng (cây hông). Là một trong những nước áp dụng sớm và thành công nuôi cấy mô vào trồng rừng trên diện rộng. Đến năm 1991, ở vùng Nam Trung Quốc, người ta đã tạo nên một triệu cây mô của các cây và các dòng lai được chọn lọc. Những cây mô này được dùng như là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vườn ươm địa phương và dùng thẳng vào để ptrồng rừng.

Các nhà khoa học Ấn Độ cũng đã tiến hành cấy mô từ các chồi bạch

đàn E.camadulensis, E.tereticornis, E.globulus, E.torelliana. Cây mơ có

nguồn gốc từ cây ưu việt sinh trưởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ. Tại Australia, nhân giống nuôi cấy mô đã được áp dụng để nhân nhanh cho các cây được chọn cho tính chịu mặn trong đất và

đang được sản xuất với quy mô lớn cho loài E.camandulensis.

1.3.4.2. Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, đến nay đã có rất nhiều cơng trình khoa học thành công khi nghiên cứu về nuôi cấy mô bạch đàn. Những cơ sở hiện đang nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc viện khoa học Lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh Phú Thọ, công ty giống lâm

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

nghiệp Trung ương, trung tâm khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, xí nghiệp giống Thành phố Hồ Chí Minh, Trường Đại học Lâm nghiệp ... Hiện nay một số tỉnh và địa phương đã thành lập phịng ni cấy mơ để phục vụ

cho công tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu. Đặng Ngọc Hùng và Lê Đình Khả (2009): “ Nghiên cứu nhân giống

dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (Eucalyptus Urophylla và E. exserta)” đã kết luận với HgCl2 nồng độ 0,1% trong 10 phút có kết quả khử trùng mẫu tốt nhất ở cả hai dịng. Mơi trường thí nghiệm nhân chồi nách cây Bạch đàn là mơi trường MS cải tiến có số chồi sống và hệ số nảy chồi tốt nhất. Chất kích thích sinh trưởng được bổ sung là: BAP 2.0mg/l+ NAA 1.0 + Kinetine 0,5mg/l ( UE35); 1,0 mg/l (UE56). Ra rễ thích hợp cho UE35 và UE56 là sự kết hợp IBA 2,0 mg/l + ABT1 0,5 ng/l [6].

Triệu Thị Thu Hà, Cấn Thị Lan (2015) “Nghiên cứu nhân giống Bạch

đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”. Với việc khử trùng mẫu vật bằng HgCl

2

0,05% trong 7 phút, nuôi cấy trong môi trường MS cải tiến bổ sung 1,5 mg/l BAP và 0,25 mg/l IAA đã cho ra kết quả tỷ lệ mẫu nảy chồi đạt tới 23,11% và tỷ lệ mẫu nhiễm chỉ là 37,56%, hệ số nhân chồi bạch đàn lai UP đạt tới 3,13 lần sau 15 ngày. Tỷ lệ ra rễ đạt tới 92,36% trong môi trường 1/2 MS cải tiến bổ sung 1,0 mg/l IBA [3].

Phan Quyền (2017): “ Phương pháp ni cấy mơ cho hai dịng bạch

đàn lai UP54 và UP99: giống lai giũa bạch đàn Uro (Eucalyptus urophyla) và bạch đàn PELLITA (Eucalyptus pellita)”. Mơi trường thí nghiệm nâng

cao chất lượng chồi cây dòng bạch đàn UP54 là mơi trường MS cải tiến có bổ sung chất kích thích sinh trưởng là: 1,0mg/l BAP + 0,25mg/lNAA; dịng bạch đàn UP99 là mơi trường MS cải tiến có bổ sung chất kích thích sinh trưởng là: 1,5mg/l BAP + 0,25mg/lNAA + 0,5mg/l Kinetine. Ra rễ thích hợp cho UP54 là: 1/2MS + 15g/l đường + 4,1g/l agar + 1,5mg/l IBA +

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

0,25mg/l ABT1; cho UP99 là: 1/2MS + 15g/l đường + 4,1g/l agar + 1,5mg/l IBA + 0,5mg/l ABT1 [12].

Phạm Đức Huy (2019) “Nghiên cứu nhân giống 2 dòng bạch đàn

PNCT3 và PNCTIV bằng phương pháp nuôi cấy mô”. Khử trùng mẫu tốt nhất

là HgCl2 nồng độ 0,1%. Với dòng PNCT3 thời gian khử trùng thích hợp là 9 phút. Với dịng PNCTIV thời gian khử trùng thích hợp là 10 phút. Nghiên cứu mơi trường nhân chồi cho thấy:Với dịng Bạch đàn PNCT3, môi trường nhân nhanh chồi thích hợp là mơi trường MS có bổ sung 6,0g/lít Agar + 30g/lít đường sucarose + 1,5 mg/lít BAP + 0,9mg/l NAA + 5mg/l Riboflavin + 1,0mg/l Biotin, điều chỉnh độ pH đến ở 5,8. Với dịng Bạch đàn PNCTIV là mơi trường MS* có bổ sung 6,0g/lít Agar + 30g/lít đường sucarose + 1,0 mg/lít BAP + 0,9mg/l NAA + 10mg/l Riboflavin, điều chỉnh độ pH ở 5,8. Các kết quả nghiên cứu giai đoạn ra rễ thu được với từng dòng như sau: Với dịng Bạch đàn PNCT3, mơi trường hóa học thích hợp cho q trình ra rễ là ½ mơi trường khống MS có bổ sung 2,5mg/l IBA + 2,0mg/l ABT1+ 6,0mg/l Agar, điều chỉnh độ pH ở 5,8. Với dịng Bạch đàn PNCTIV, là mơi trường ½ MS* có bổ sung 2,5mg/l IBA + 2,0mg/l ABT1 + 1,0mg/l than hoạt tính + 6,0mg/l Agar, điều chỉnh độ pH ở 5,8 [7].

Với những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro đã được khẳng

định ở các nghiên cứu trên, tôi đã tiến hành nghiên cứu áp dụng phương pháp

nhân giống in vitro cho giống Bạch đàn lai UG24 để tạo ra nhiều cây giống

chất lượng tốt, phục vụ cho trồng rừng sản xuất.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

- Xác định được chỉ thị DNA - barcode cho bạch đàn lai UG24.

- Xây dựng được 01 kỹ thuật nhân giống in vitro cho dòng bạch đàn lai

UG24.

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch cho dòng bạch đàn lai UG24.

- Tách chiết, tinh sạch DNA tổng số từ mẫu cây Bạch đàn lai UG24. - Nhân bản các đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS, ITS2 ở Bạch đàn

lai UG24.

- Xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen. - Xử lý và phân tích dữ liệu.

- Xác định chỉ thị DNA - barcode cho dòng bạch đàn lai UG24.

2.2.2. Nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai UG24

- Nghiên cứu phương pháp tạo mẫu sạch cho bạch đàn lai UG24.

- Nghiên cứu môi trường và điều kiện ánh sáng cho nhân nhanh chồi in

vitro cho bạch đàn lai UG24.

- Nghiên cứu môi trường và điều kiện ánh sáng cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cho bạch đàn lai UG24.

2.3. Địa điểm, điều kiện nghiên cứu

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

2.3.1. Địa điểm nghiên cứu nhân giống

Thí nghiệm được tiến hành tại phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp.

2.3.2. Điều kiện bố trí thí nghiệm nhân giống

Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo (phịng ni cấy mơ tế bào thực vật) ở điều kiện:

+ Ánh sáng: Thời gian chiếu sáng 12 -16h trên ngày. + Cường độ chiếu sáng 2000 - 3000 lux.

+ Nhiệt độ phịng ni cấy: 25 ± 2

0

C. + Độ ẩm trung bình 60 -70%.

+ Mơi trường nuôi cấy được chuẩn độ pH: 5,8, khử trùng môi trường ở 118

0

C, áp suất 1atm trong 18 phút.

+ Bình ni cấy: Bình thủy tinh trong suốt, thể tích 250 ml.

+ Mỗi thí nghiệm dùng 30 mẫu, lặp lại 3 lần.

2.4. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2.4.1. Vật liệu nghiên cứu

2.4.1.1. Vật liệu nghiên cứu cho giám định loài

Sử dụng 03 mẫu lá bánh tẻ được lấy từ 03 cây Bạch đàn lai UG24

(E.urophylla x E. grandis) khác nhau tại Tân mai - Đồng Mai - Quảng Yên -

Các đoạn mồi rbcL, trnH-psbA, matK, ITS, ITS2 được cung cấp từ

PGS. TS Hà Văn Huân – Trường Đại Học Lâm Nghiệp - Xuân Mai - Hà Nội.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Bảng 2.1: Trình tự và thông tin của các cặp mồi được sử dụng

gắn mồi

Kích thước đoạn gen

psbA

AGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC

ITS2 IsP1F: ATGCGATACTTGGTGTGAAT 48

o

C khoảng 300bp. IsP1R: TCCTCCGCTTATTGATATGC

2.4.1.2. Vật liệu nghiên cứu cho nhân giống

Sử dụng cành bánh tẻ bạch đàn lai UG24 được lấy từ cây mẹ trồng tại vườn giống Viện nghiên cứu Giống & Công nghệ sinh học - Viện khoa học Lâm nghiệp do Bộ môn Lai giống cung cấp làm vật liệu vào mẫu nhân giống

in vitro.

2.4.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

2.4.2.1. Hố chất cho nghiên cứu giám định lồi

- Kit tách chiết ADN tổng số (plant AND Isolation Kid) của Đức. - Hoá chất cho phản ứng PCR nhân bản: Master mix của hãng Intron Biotechnology, Hàn Quốc.

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR (PCR Purification Kit) của hãng Norgen, Canada.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

- Hoá chất điện di trên gel Agarose: Sử dụng TAE, chất nhuộm Bromophenol blue, Agarose của Đức, AND marker, Redsafe của Hàn Quốc.

- Đệm tách A (EBA- Extraction Buffer A): pha 100 ml

2.4.2.2. Hóa chất nhân giống

- Mơi trường dinh dưỡng cơ bản MS trong nghiên cứu gồm các muối đa lượng, vi lượng, các chất hữu cơ, vitamin theo Murashige và Skoog (1962) đường sucrose, Aga... các chất điều hòa sinh trưởng Auxin, Cytokinin,...

- Chất khử trùng: Ethanol 70%, HgCl

2

0,1%

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch

mồi ngược (1,0 µL), 50 ng/µL AND khn (1,0 µL)

Các bước tiến hành:

- Bước 1: Cho các thành phần phản ứng PCR vào ống PCR. Thực hiện

ở nhiệt độ thấp (trong đá).

- Bước 2: Trộn (mix) đều hỗn hợp bằng pipet hoặc máy Vortex, sau đó

làm lắng (spin) bằng máy ly tâm (8000 vịng/phút, 1 phút).

- Bước 3: Lập chương trình và chạy PCR trên máy.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Chương trình phản ứng PCR: 95

0

C trong 5 phút; (95

0

C: 30 giây, 48

0

C - 52

0

C: 30 giây; 72

0

C trong 1phút) lặp lại 40 chu kì; 72

0

C trong 5 phút; 4

0

C. Nhiệt độ gắn mồi các phản ứng phụ thuộc vào cặp mồi sử dụng. Mỗi phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm.

- Bước 4: Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel Agarose 1%. So sánh

với thang chuẩn marker 1kb.

Pha gel Agarose 1%



Cân 1g Agarose cho vào 100ml TAE 1X.



Đun nóng bằng lị vi sóng.



Bổ sung 4µl RedSafe/100ml gel, mix đều.



Lắp lược vào bản gel, đổ gel, chờ 20 - 30 phút cho gel đông lại.



Điện di

 Tra vào mỗi giếng 2µl sản phẩm PCR.

 Chạy điện di trong dung dịch TAE 1X, 90V trong 30 phút.  Soi gel bằng tia UV.

2.5.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit (PCR Purification Kit) của hãng Norgen, Canada.

Các bước tinh sạch tiến hành như sau:

- Thêm 5V binding solution vào sản phẩm PCR, mix và ly tâm nhẹ - Lắp cột, chuyển dịch sang cột

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML).

Khoảng cách di truyền được tính bằng phần mềm MegaX.

2.5.2. Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro ở dòng Bạch đàn lai UG24 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis)

2.5.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và nồng độ hóa chất đến khả năng tạo mẫu sạch Bạch đàn lai UG24:

- Khử trùng ngoài box cấy:

+ Cắt bớt lá sau đó cắt cành thành những đoạn nhỏ: chứa khoảng 2-3 đốt. + Khử trùng bằng xà phịng: dùng chổi lơng cọ nhẹ để loại bỏ hết bụi bẩn.

+ Rửa lại nhiều lần với nước để loại bỏ hồn tồn xà phịng.

+ Tráng lại bằng nước cất (2-3 lần) để chuẩn bị cho bước tiếp theo. - Khử trùng trong box cấy:

+ Bước 1: Dùng kéo cắt cành thành các đốt nhỏ, cắt tỉa bớt lá và cho cành vào bình Scoth, lắc với nước cất vơ trùng ít nhất 3 lần.

+ Bước 2: Khử trùng với cồn ethanol 70

o

trong 60 giây  loại bỏ cồn, lắc mẫu với nước cất vô trùng (3 lần).

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

+ Bước 3: Khử trùng với HgCl

2

0,1% trong 5 - 10 phút hoặc khử trùng bằng NaClO 6% trong 10 - 15 phút  loại bỏ HgCl

2

và tiếp tục tráng mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần để rửa sạch mẫu..

+ Bước 4: Sau khi đã khử trùng sạch mẫu, cắt mẫu thành các đoạn nhỏ (1- 2 đốt) và cấy vào môi trường dinh dưỡng cơ bản MS bổ sung thêm 30 g/L sucrose, 6,5 g/L agar, ni trong điều kiện tối để kích thích ra chồi.

Kết quả được thu thập sau khoảng 2 - 4 tuần nuôi cấy và được thống kê, xử lí bằng Exel.

2.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi của Bạch đàn lai UG24

a. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi của Bạch đàn lai UG24.

Sau khoảng 2 tuần nuôi tiến hành cấy mẫu sang môi trường nhân nhanh chồi. Tiến hành thí nghiệm với 12 công thức môi trường nhân nhanh chồi khác nhau bao gồm: ½ MS + 20g/L sucrose + 4,5g/L agar + chất ĐHST khác nhau như trong bảng 2.2 dưới đây:

Bảng 2.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi dòng bạch đàn lai UG24

CTTN

Chất ĐHST (mg/l)

Tổng số chồi

cấy

Tổng số chồi

thu được

Hệ số nhân chồi

(lần)

Đặc điểm của

chồi NAA BAPK

i

GA

3

CT3 0,1 0,2 0,1 - CT5 0,1 0,2 0,5 0,1 CT6 0,1 0,2 0,4 0,2

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

CTTN

Chất ĐHST (mg/l)

Tổng số chồi

cấy

Tổng số chồi

thu được

Hệ số nhân chồi

(lần)

Đặc điểm của

chồi NAA BAPK

i

GA

3

CT4 0,1 0,25 0,3 - CT7 0,1 0,25 0,4 - CT8 0,1 0,3 0,3 - CT9 0,1 0,3 0,4 0,2 CT10 0,1 0,35 0,3 - CT11 0,1 0,35 0,4 0,1 CT12 0,1 0,4 0,3 -

(AS1) Đèn huỳnh quang: ánh sáng trắng.

(AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng : (3 sáng xanh : 7 sáng đỏ).

(AS3) Đèn led tổ hợp ánh sáng: (1 sáng xanh: 5 sáng đỏ: 1 sáng trắng). Kết quả theo dõi sau 3 tuần nuôi cấy với các chỉ tiêu: số chồi tái sinh, tỉ lệ chồi tái sinh, tổng số chồi thu được, hệ số nhân chồi.

2.5.2.3. Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cho Bạch đàn lai UG24

a. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ in vitro của dòng Bạch đàn lai UG24.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ in vitro của dòng bạch đàn lai UG24

Sau một số lần cấy chuyển để nhân nhanh, khi lượng chồi đã đủ số lượng và chất lượng về các chỉ tiêu (chồi mập, cao 3 - 4 cm, 3 - 4 đốt thân, 3 - 4 lá xanh) sẽ tiến hành cấy chồi vào môi trường ra rễ gồm: ½ MS + 20g/L sucrose + 6 g/L agar + 1,0 g/l than hoạt tính + IBA được thay đổi số liệu như trong bảng 2.3 dưới đây:

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của bạch đàn lai UG24

CTTN IBA (mg/l)

Số chồi cấy ban

đầu

Số chồi ra rễ

Tỷ lệ chồi ra

rễ (%)

Chiều dài TB/rễ

(cm)

Số rễ TB/chồi

Đặc điểm của rễ

R1 0,5 R2 0,1 R3 0,75 R4 1,0 R5 1,2 R6 1,5 R7 2,0 R8 2,25

Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy và theo dõi.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ in vitro của dòng bạch đàn lai UG24

Tiến hành cấy chuyển các chồi bạch đàn đủ tiêu chuẩn trong các thí nghiệm nhân nhanh chồi ở trên vào các mơi trường kích thích ra rễ có sử dụng IBA với nồng độ 1,5mg/l và bổ sung thêm NAA với nồng độ khác nhau ở

bảng 2.9 dưới đây:

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Bảng 2.4. Hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của bạch đàn lai UG24

(mg/l)

Số chồi cấy ban

đầu

Số chồi ra rễ

Tỷ lệ chồi ra

rễ (%)

Chiều dài TB/rễ

(cm)

Số rễ TB/chồi

Đặc điểm của rễ

ĐC 0 R1 0,2 R2 0,5 R3 0,75 R4 1,0 R5 1,2 R6 1,5 R7 1,75

- Mỗi thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp, 3 bình/1 lần lặp. Đánh giá kết quả sau 4 - 6 tuần nuôi cấy và theo dõi.

b. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ in vitro của dòng Bạch đàn lai UG24.

Khi chọn được môi trường ra rễ phù hợp nhất trong các công thức ra rễ ở thí nghiệm trên. Sẽ tiến hành thực nghiệm ảnh hưởng của điều kiện ánh

sáng đến khả năng ra rễ in vitro của bạch đàn lai UG24 với 3 công thức ánh

sáng đèn khác nhau như sau:

(AS1) Đèn huỳnh quang: ánh sáng trắng.

(AS2) Đèn led tổ hợp ánh sáng : (3 sáng xanh : 7 sáng đỏ).

(AS3) Đèn led tổ hợp ánh sáng: (1 sáng xanh: 5 sáng đỏ: 1 sáng trắng). - Kết quả theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy với các chỉ tiêu: tỉ lệ chồi ra rễ,

số rễ trung bình/cây, chất lượng rễ.

2.5.2.4. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu.

a. Phương pháp thu thập số liệu

Số liệu được thu thập sau khi mẫu tái sinh tạo chồi bằng phương pháp

quan sát, đo đếm trực tiếp.

77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM77Thursday, June 13, 20249:13:27 PM9:13:27 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM77Thursday, June 13, 20249:13:28 PM9:13:28 PM

77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM77Thursday, June 13, 20249:13:30 PM9:13:30 PM

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

</div>

xác định chỉ thị dna barcode và nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai ug 24 eucalyptus urophylla x eucalyptus grandis

<b>BÙI THỊ HOÀNG YẾN </b>

<b>XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ DNA – BARCODE VÀ NHÂN GIỐNG </b>

<i><b>IN VITRO DÒNG BẠCH ĐÀN LAI UG24 </b></i>

<i><b>(EUCALYPTUS UROPHYLLA x EUCALYPTUS GRANDIS) </b></i>

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC </b>

<b>NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. BÙI THỊ MAI HƯƠNG </b>

<b>Hà Nội, 2021 Hà Nội, 2021 </b>

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

<b>CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc </b>

<b>LỜI CAM ĐOAN </b>

Tơi cam đoan, đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác.

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào đã cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm và tn thủ kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học.

<i>Hà nội, ngày 28 tháng 8 năm 2021 </i>

<i><b>Người cam đoan </b></i>

<i><b> Bùi Thị Hoàng Yến </b></i>

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho tơi trong suốt q trình học tập.

Ngồi ra, Tơi cũng xin chân thành cảm ơn sự trợ giúp về vật liệu, hóa chất và học thuật từ Đề tài NAFOSTED mã số 106.06-2019.27 do TS. Lê Thọ Sơn, Viện CNSH Lâm nghiệp, Trường ĐH Lâm nghiệp làm Chủ nhiệm.

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ln sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong quá trình học tập và nghiên cứu.

<i>Xin chân thành cảm ơn! </i>

<i>Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm 2021 </i>

<i><b>Học viên </b></i>

<i><b> Bùi Thị Hoàng Yến </b></i>

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

<b>Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ... 3</b>

1.1. Giới thiệu chung về cây bạch đàn lai ug24 ... 3

<i>1.1.1. Đặc điểm 2 dòng bạch đàn bố mẹ của dòng UG24 ... 3</i>

<i>1.1.2. Giới thiệu về bạch đàn lai UG24 ... 6</i>

1.2. Tổng quan về adn mã vạch ... 6

<i>1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcode) ... 6 </i>

<i>1.2.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật .. 7 </i>

<i>1.2.3. Những nghiên cứu về ứng dụng ADN mã vạch trong giám định loài ... 10 </i>

<i>1.2.4.Tổng quan về phương pháp xử lí dữ liệu nghiên cứu ADN mã vạch trong giám định loài ... 12 </i>

1.3. Tổng quan về nuôi cấy mô - tế bào in vitro ... 12

<i>1.3.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro ... 12 </i>

<i>1.3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ... 13 </i>

<i>1.3.3. Các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống in vitro ... 14 </i>

<i>1.3.4. Thành tựu trong nuôi cây mô đối với Bạch Đàn ... 16 </i>

<b>Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU ... 20</b>

<b>VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20</b>

2.1. Mục tiêu nghiên cứu ... 20

<i>2.1.1 Mục tiêu tổng quát ... 20 </i>

<i>2.1.2. Mục tiêu cụ thể ... 20 </i>

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

2.2. Nội dung nghiên cứu ... 20

<i>2.2.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch cho dòng bạch đàn lai UG24. ... 20 </i>

<i>2.2.2. Nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai UG24 ... 20 </i>

2.3. Địa điểm, điều kiện nghiên cứu ... 20

<i>2.3.1. Địa điểm nghiên cứu nhân giống ... 21 </i>

<i>2.3.2. Điều kiện bố trí thí nghiệm nhân giống ... 21 </i>

2.4. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ... 21

<i>2.4.1. Vật liệu nghiên cứu ... 21 </i>

<i>2.4.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ... 22 </i>

2.5. Phương pháp nghiên cứu ... 23

<i>2.5.1. Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch ... 23 </i>

<i>2.5.2. Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro ở dòng Bạch đàn lai UG24 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis) ... 25 </i>

<b>Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ... 31</b>

3.1. Kết quả xác định một số đoạn adn mã vạch... 31

<i>3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá cây Bạch đàn lai ... 31 </i>

<i>3.1.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ... 31 </i>

<i>3.1.3. Phân tích kết quả... 32 </i>

3.2. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro dòng bạch đàn lai ug24 ... 47

<i>3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của công thức khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh của bạch đàn lai UG24 ... 47 </i>

<i>3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi ở bạch đàn lai UG24 ... 50 </i>

<i>3.2.2. Kết quả nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ở bạch đàn lai UG24 54 </i><b>KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 58</b>

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 60PHỤ LỤC </b>

77hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh du lieh va thuohg mai xohg hohgThursday, June 13, 2024

<b>BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT </b>

<b>1 ADN Acid Deoxyribonucleic </b>

<b>3 BAP 6 - benzynlaminopurin 4 bp Base pair (cặp bazơ nitơ) </b>

<b>5 CTAB Hexadecyl trimethyl ammonium bromide 6 CTTN Cơng thức thí nghiệm </b>

<b>7 ddNTP Dideoxy nucleo triphotphate 9 ĐHST Điều hòa sinh trưởng </b>

<b>20 NCBI </b><sup>Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học Hoa </sup><b>Kỳ </b>

<b>21 PCR </b><sup>Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp </sup>

ADN)

<b>26 WPM </b>Woody plant medium (môi trường cây thân gỗ)