NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

ĐẠI HỌC TH I NGUY N
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
VŨ THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT
SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.)
MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC TH I NGUY N
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
VŨ THỊ ANH ĐÀO
NGHI N CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT
SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.)
MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. Chu Hoàng Mậu
THÁI NGUYÊN - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lời cam đoan
T i xin cam đoan đ y l c ng tr nh nghi n cứu của ri ng t i. C c số liệu, kết
quả nghi n cứu trong luận văn l trung thực v chưa c ai c ng bố trong một c ng tr nh
nào khác.
T c giả
Vũ Thị Anh Đào
i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Lời cảm ơn
T i xin b y tỏ l ng biết ơn s u sắc tới PGS.TS. Chu Ho ng Mậu đã tận t nh
hướng dẫn, chỉ bảo v tạo mọi điều kiện giúp đỡ t i ho n th nh c ng tr nh nghi n cứu
này.
T i xin cảm ơn CN Nguyễn Ích Chiến (Ph ng th nghiệm Di truyền học v
C ng nghệ gen - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Th i Nguy n) đã giúp đỡ t i trong
qu tr nh ho n th nh luận văn.
T i xin ch n th nh cảm ơn c c Thầy C gi o, C n bộ Khoa Sinh - KTNN đã tạo
điều kiện giúp đỡ t i trong qu tr nh học tập v ho n th nh luận văn.
T i xin cảm ơn sự động vi n, kh ch lệ của gia đ nh, bạn b v đồng nghiệp
trong suốt thời gian l m luận văn.
Tác giả
V ũ Thị Anh Đào
ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ABA
DNA
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
Abscisic Acid
Axit deoxyribonucleic
ADN được khuếch đại)
ASTT Áp suất thẩm thấu
CS Cộng sự
EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid
Kb Kilobase
LEA Late Embryogeneis Abundant protein (Protein tổng hợp với số
lượng lớn
ở giai đoạn cuối của qu tr nh ph t triển ph i)
PCR
RAPD

RFLP
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
Random Amplified Polymorphism DNA (Ph n t ch ADN đa h nh
được
nh n bản ngẫu nhi n)
Restriction Fragment Length Polymorphism (Sự đa h nh chiều d i c
c
phân đoạn ADN cắt hạn chế)
SDS Sodium Dodecyl Sulphat
SDS-PAGE Phương ph p điện di tr n gel polyacrylamid c chứa SDS
SSR
TBE
TAE
TE
Tris
Simple Sequence Repeats
Tris - Boric acid - EDTA
Tris - Acetate - EDTA
Tris - EDTA
Trioxymetylaminometan
NAA Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic)
iii
Số hóa bởi Trung
tâm Học liệu –
Đại học Thái
Nguyên
-
tnu.edu.vn
MỤC LỤC
Trang

Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Những chữ viết tắt iii
Mục lục iv
Danh mục c c bảng vii
Danh mục c c h nh ix
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN T I LIỆU 3
1.1. Đặc điểm thực vật học v h a sinh học hạt đậu tương 3
1.2. Nghi n cứu khả năng phản ứng của c y đậu tương đốivới hạn 4
1.2.1. Sự phản ứng của c y đậu tương đối với hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm 4
1.2.2. Sự phản ứng của c y đậu tương đối với hạn ở giai đoạn c y non 7
1.3. Sử dụng kỹ thuật RAPD trong nghi n cứu sự đa dạng di truyền ở mức ph n tử 8
1.3.1. RAPD 8
1.3.2. Nghi n cứu sự đa dạng di truyền bằng RAPD 10
Chƣơng 2. VẬT LIỆU V PHƢƠNG PH P NGHI N CỨU 12
2.1. Vật liệu nghi n cứu 12
2.1.1.Vật liệu thực vật 12
2.1.2. C c ho chất v thiết bị 12
2.2. Phương ph p nghi n cứu 13
2.2.1. Phương ph p x c định sự sinh trưởng của rễ mầm v th n mầm 13
2.2.2. Phương ph p h a sinh 14
2.2.2.1. Ph n t ch ho sinh giai đoạn hạt tiềm sinh 14
2.2.2.2. Đ nh gi khả năng chịu hạn th ng qua ph n t ch một số chỉ ti u ho sinh ở giai
đoạn hạt nảy mầm 15
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.2.3. Phương ph p sinh lý 17
2.2.3.1. Đ nh gi khả năng chịu hạn ở giai đoạn c y non bằng phương ph p g y hạn
nh n tạo 17

2.2.3.2. X c định h m lượng proline 18
2.2.4. Phương ph p sinh học ph n tử 19
2.2.4.1. Phương ph p t ch ADN tổng số từ mầm đậu tương 19
2.2.4.2. Phản ứng RAPD 19
2.2.4.3. Ph n t ch số liệu RAPD 19
2.2.5. Phương ph p xử lý kết quả v t nh to n số liệu 20
Chƣơng 3. KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 21
3.1. Kết quả ph n t ch t nh đa dạng kiểu h nh của c c giống đậu tương nghi n cứu 21
3.1.1.Đặc điểm h nh th i, k ch thước khối lượng v h a sinh hạt của 16 giống đậu
tương 21
3.1.1.1. H nh th i, k ch thước v khối lượng hạt 21
3.1.1.2. H m lượng protein, lipit 23
3.1.2. Khả năng phản ứng của 16 giống đậu tương ở giai đoạn hạt nảy mầm 26
3.1.2.1. Kích thước rễ mầm v th n mầm 26
3.1.2.2. Hoạt độ enzym α - amilase v h m lượng đường trong hạt nảy mầm của c c
giống đậu tương dưới t c động của sorbitol 7 % 28
3.1.2.3. Hoạt độ enzym protease v h m lượng protein trong hạt nảy mầm của c c
giống đậu tương dưới t c động của sorbitol 7 % 33
3.1.2.4. Nhận x t 38
3.1.3. Khả năng phản ứng đối với hạn của 16 giống đậu tương ở giai đoạn c y non 3 l . . 39
3.1.3.1 Tỷ lệ thiệt hại 39
3.1.3.2. Chỉ số chịu hạn tương đối 41
3.1.3.3. H m lượng protein v prolin 42
3.1.3.4. Nhận x t 46
3.1.4. Sự phân bố của c c giống đậu tương nghi n cứu 46
v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3.2. Kết quả ph n t ch t nh đa dạng di truyền ở mức ph n tử ADN của c c giống đậu
tương nghi n cứu 48
3.2.1. Kết quả t ch chiết ADN tổng số 48

3.2.2. Ph n t ch sự đa h nh ADN bằng kỹ thuật RAPD 49
3.2.3. Nhận x t về kết quả ph n t ch đa h nh ADN trong hệ gen của 16 giống đậu
tương địa phương 60
KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ 61
CÔNG TRÌNH Đ CÔNG BỐ LI N QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 63
T I LIỆU THAM KHẢO 64
vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC C C BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Nguồn gốc của c c giống đậu tương nghi n cứu 13
Bảng 2.2. Tr nh tự nucleotit của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghi n cứu 20
Bảng 3.1. H nh dạng, m u sắc, k ch thước, khối lượng 1000 hạt của 16 giống đậu
tương địa phương 22
Bảng 3.2. H m lượng lipit v protein của 16 giống đậu tương (% KL kh ) 24
Bảng 3.3. Chiều d i rễ mầm của c c giống đậu tương nghi n cứu 26
Bảng 3.4. Chiều d i th n mầm của c c giống đậu tương 27
Bảng 3.5. Hoạt độ enzyme α – amylase trong c c giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý
sorbitol 7% của 16 giống đậu tương 29
Bảng 3.6. Hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 7% của 16
giống đậu tương 31
Bảng 3.7. Tương quan giữa hoạt độ enzyme α–amylase v h m lượng đường tan 33
Bảng 3.8. Hoạt độ protease trong c c giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 7%. . . . . . 34
Bảng 3.9. H m lượng protein ở giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 7% 36
Bảng 3.10. Tương quan giữa hoạt độ enzyme protease v h m lượng protein 37
Bảng 3.11. Tỷ lệ thiệt hại của 16 giống đậu tương ở giai đoạn c y non 3 lá 40
Bảng 3.12. Chỉ số chịu hạn tương đối của c c giống đậu tương 42
Bảng 3.13. H m lượng prolin của c c giống đậu tương trong điều kiện hạn nh n tạo 44
Bảng 3.14. H m lượng protein của c c giống đậu tương trong điều kiện hạn nh n tạo 45

Bảng 3.15. Hệ số kh c nhau giữa c c giống đậu tương 46
Bảng 3.16. H m lượng v độ tinh sạch ADN của 16 giống đậu tương nghi n cứu 48
Bảng 3.17. Tổng số ph n đoạn ADN được nh n bản của 16 giống đậu tương khi ph n
t ch với 10 mồi ngẫu nhi n 50
vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Bảng 3.18. T nh đa h nh về ph n đoạn ADN được nh n bản của 10 mồi ngẫu nhi n 51
Bảng 3.19. Th ng tin t nh đa h nh (PIC) của 16 giống đậu tương 52
Bảng 3.20. Gi trị tương quan kiểu h nh (r) 58
Bảng 3.21. Hệ số tương đồng giữa c c giống đậu tương nghi n cứu 59
viii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC C C HÌNH

Trang
Hình 3.1. Hạt của c c giống đậu tương nghi n cứu 21
Hình 3.2. Biểu đồ so s nh h m lượng protein v lipit của 16 giống đậu tương 25
Hình 3.3. H nh ảnh c y đậu tương 3 l trước khi xử lý hạn 39
Hình 3.4. Biểu đồ về tỉ lệ thiệt hại của c c giống đậu tương nghi n cứu 41
Hình 3.5. Sơ đồ quan hệ giữa c c giống đậu tương dựa tr n sự phản ứng trước t c
động của hạn 47
Hình 3.6. Kết quả điện di ADN tổng số của c c giống đậu tương tr n gel agarose 0,8%. . . . 48
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M1 53
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M8 53
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M3 54
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M5 54
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M2 55
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M4 55
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M6 56
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M9 56

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm RAPD tr n gel agarose 1,8% với mồi M7 v mồi M10 . . .57
Hình 3.16. Biểu đồ h nh c y của c c giống đậu tương nghi n cứu theo kiểu ph n nh m
UPGMA 59
ix
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
MỞ ĐẦU
Đậu t ng l loại c y trồng chiến l ợc của
nhiều quốc gia tr n thế giới. Hạt
đậu t ng c h m l ợng c c chất dinh d ỡng cao:
40% - 50% protein, 18% -25%
lipit, chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin,
triptophan, metionin, xystein, lozin )
v nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K ), l
nguồn năng l ợng cần thiết cho cuộc
sống con ng ời.
C y đậu t ng c thời gian sinh tr ởng ngắn, hệ rễ c
nốt sần mang vi khuẩn cố định
đạm n n c y đậu t ng th ờng đ ợc trồng lu n canh
với l a v ng để tăng vụ v cải
tạo đất bạc m u. Với những gi trị to lớn đ m c y
đậu t ng đ ợc trồng phổ biến ở
nhiều n i từ v ng n đới đến v ng nhiệt đới, từ 55
0

vĩ Bắc đến 55
0
vĩ Nam, từ v ng
thấp h n mực n ớc biển cho đến v ng cao tr n
2000m so với mực n ớc biển với

diện t ch khoảng h n 74,4 triệu ha [3], [8]. Trong
đ , ch ng đ ợc trồng nhiều nhất ở
Mỹ, Braxin, Argentina, Trung Quốc, Ấn Độ.
Ở Việt Nam c y đậu t ng đ ợc gieo trồng ở cả 7 v
ng n ng nghiệp tr n cả n ớc.
C c giống đậu t ng ở n ớc ta hiện nay rất
phong ph gồm c c giống đậu t ng
nhập nội, giống lai tạo, giống đậu t ng đột biến v
tập đo n c c giống đậu t ng địa
ph ng. C c giống n y đa dạng v phong ph cả về
kiểu h nh v kiểu gen, đây là
nguồn nguy n liệu để chọn tạo giống đậu t ng mới
cho năng suất v chất l ợng phù
hợp với mục ti u chọn giống [8].
Đậu t ng l c y t ng đối mẫm cảm với
điều kiện ngoại cảnh v thuộc v o nh
m
c y chịu hạn k m. V vậy đ nh gi sự
đa dạng di truyền của c c giống đậu t
ng địa
ph ng để tạo c sở cho c ng t c lai tạo
giống v đề xuất biện ph p nâng cao tính
chịu hạn l vấn đề rất đ ợc quan t m
nghi n cứu. Hiện nay c rất nhiều ph
ng ph p
đ ợc ứng dụng trong ph n t ch sự
đa dạng di truyền của c c giống c y
trồng n i
chung v c y đậu t ng n i ri ng nh
RFLP, AFLP, SSR, RAPD C c

ph ng
pháp này kh ng những ph t huy hiệu
quả m c n khắc phục nh ợc điểm
của c c
ph ng ph p chọn giống truyền thống
bởi hiệu quả s ng lọc cao, nhanh, và
tin cậy.
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học
Th i Nguyên

1
Trong số những ph ng ph p kể tr n th RAPD l ph ng ph p đ ợc sử dụng rộng
rãi bởi đ y l ph ng ph p dễ thực hiện v t tốn k m m vẫn đ nh gi đ ợc sự đa
dạng di truyền v mối quan hệ di truyền ở mức độ ph n tử. Chỉ thị RAPD cho độ đa
h nh cao n n đ ợc sử dụng để nghi n cứu đa dạng sinh học, sự li n kết giữa c c t nh
trạng số l ợng, đ nh gi sự sai kh c hệ gen của c c d ng chọn lọc ứng dụng trong
chọn tạo giống c y trồng.
Ch nh v vậy việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức ADN v sự phản ứng đối
với hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn c y non l c sở khoa học để đề xuất việc
chọn những giống đậu t ng c khả năng chịu hạn g p phần bảo tồn, ph t triển
nguồn gen c y đậu t ng, tuyển chọn giống đậu t ng th ch hợp l m vật liệu chọn
giống l những vấn đề rất đ ợc quan t m nghi n cứu. Xuất ph t từ lý do nh vậy
chúng t i chọn đề t i:
“Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương (Glycine Max (L.)
Merrill) địa phương”.
2. MỤC TIÆU NGHIÆN CỨU
X c định sự đa dạng di truyền của c c giống đậu t ng địa ph ng ở mức
kiểu h nh và mức ph n tử ADN.
3. NỘI DUNG NGHIÆN CỨU
- Khảo s t sự đa dạng kiểu h nh của c c giống đậu t ng th ng qua c c đặc điểm

hình thái, hóa sinh.
- X c định h m l ợng protein, hàm l ợng đ ờng, hoạt độ enzym amylase, enzym
protease ở giai đoạn hạt nảy mầm.
- Ph n t ch sự phản ứng đối với hạn của c c giống đậu t ng trong điều kiện hạn
nh n tạo.
- Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhi n để nh n bản c c đoạn ADN từ
ADN hệ gen của c c giống đậu t ng địa ph ng.
- Thiết lập s đồ h nh c y v x c định khoảng c ch di truyền giữa c c giống đậu
t ng nghi n cứu.
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
2
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÇ SINH HẠT ĐẬU TƢƠNG
Đậu t ng c t n khoa học l (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu
(Fabaceae), họ phụ c nh b ớm (Papilionoidace) c bộ NST 2n = 40, c nguồn gốc
từ Trung Quốc l loại c y trồng h ng năm kh ng thấy xuất hiện ở lo i hoang dại. C c
giống đậu t ng địa ph ng của n ớc ta hiện nay đ ợc du nhập từ Trung Quốc đã từ
lâu [3]. C y đậu t ng l c y trồng cạn thu hạt, gồm c c bộ phận ch nh: rễ, th n, l ,
hoa, quả v hạt. Rễ đậu t ng l rễ cọc, gồm rễ c i v c c rễ phụ, tr n rễ c nhiều nốt
sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, c khả năng cố định đạm của kh ng kh tạo
th nh đạm dễ ti u [3]. C c c ng tr nh nghi n cứu cho thấy những giống c khả năng
cộng sinh v c đủ nốt sần th ờng l m cho h m l ợng protein cao, cho n n trồng c y
đậu t ng c t c dụng cải tạo đất. Th n c y đậu t ng l th n thảo, t ph n c nh dạng
bụi, l đậu t ng l l k p với 3 l ch t, nh ng đ i khi cũng c 4-5 l ch t. Đậu t ng
l c y tự thụ phấn, hoa đậu t ng nhỏ, kh ng h ng vị, c m u t m, t m nhạt hoặc
trắng, hoa mọc từ n ch l hoặc ngọn, quả đậu t ng thuộc loại quả r p, thẳng hoặc
h i cong, c nhiều l ng khi ch n c m u v ng hoặc x m. Hạt đậu t ng kh ng c nội
nhũ m chỉ c một lớp vỏ bao quanh một ph i lớn. Hạt c h nh tr n hoặc bầu dục,
tr n d i, tr n dẹt, ovan vỏ hạt th ờng nhẵn v c m u v ng nhạt, v ng đậm, xanh,

n u, đen đa số l hạt màu v ng. Khối l ợng hạt rất đa dạng dao động từ 20-400 mg/
hạt. M u sắc rốn hạt ở c c giống là khác nhau, đ y l một biểu hiện đặc tr ng của
giống. C y đậu t ng c 2 loại h nh sinh tr ởng: sinh tr ởng hữu hạn v sinh tr ởng
v hạn, thời gian sinh tr ởng th ờng chia ra nh m ch n sớm, trung b nh v muộn.
Theo thời gian sinh tr ởng Piper v Mosse đã cho ra c c giống đậu t ng ch n
rất sớm (75-90 ng y), c c giống ch n sớm (90-100 ng y), c c giống ch n trung b nh
(100-110 ng y), loại ch n muộn trung b nh (110-120 ng y), c c giống ch n muộn
(130-140 ng y), c c giống ch n rất muộn (140-150 ng y) thời gian sinh tr ởng l một
yếu tố rất quan trọng để lựa chọn c y trồng lu n canh xen vụ. Đậu t ng l c y t ng
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
3
đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh. Trong tập đo n giống đậu t ng c những
giống chỉ trồng v o vụ h , c những giống chỉ trồng v o vụ đ ng, c những giống
trồng ở vụ xu n h và c những giống trồng th ch hợp với vụ thu đ ng [8].
Đậu t ng l c y trồng lấy hạt, l c y cung cấp dầu quan trọng nhất trong c c
c y lấy dầu. Hiện nay qua thống k của FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại đ y sản
l ợng đậu t ng thế giới đã tăng l n 2 lần chủ yếu nhờ v o tăng năng suất v diện
t ch. Trong v ng 20 năm qua diện t ch gieo trồng tăng nhanh, năng suất b nh qu n
tăng kh cao 23 tạ/ha. C c n ớc sản xuất đậu t ng đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin,
Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản l ợng đậu t ng tr n thế
giới [8].
Ở Việt Nam, hiện nay đậu t ng đ ợc trồng tr n cả 7 v ng n ng nghiệp, trong
đ v ng n i ph a Bắc c diện t ch gieo trồng lớn nhất l 46,6%, đồng bằng S ng
Hồng 19,3%, v ng T y Nguy n 11%, miền Đ ng Nam Bộ 10,2%, đồng bằng S ng
Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% v vùng Duy n hải miền Trung 1,6% [8]. C y đậu
t ng chiếm một vị tr rất quan trọng trong nền n ng nghiệp n ớc ta, đặc biệt l ở
những v ng n ng th n ngh o, kinh tế ch a ph t triển.
Tuy nhiên việc sản xuất đậu t ng ở trong n ớc vẫn ch a đ ợc đầu t cao, năng suất
c n thấp, do vậy nghi n cứu cải tiến c c đặc điểm n ng học của c c giống địa
ph ng v tạo giống mới c năng suất cao, th ch nghi với điều kiện sinh th i ở những

vùng khác nhau bằng ph ng ph p truyền thống kết hợp với hiện đại sẽ đ p ứng
đ ợc y u cầu của thực tiễn đặt ra v đ cũng l chiến l ợc quan trọng về sự ph t triển
c y đậu đỗ ở n ớc ta.
1.2. NGHIÆN CỨU KHẢ NĂNG PHẢN ỨNG CỦA CÅY ĐẬU TƢƠNG ĐỐI
VỚI HẠN
1.2.1. Sự phản ứng của c y đậu tƣơng đối với hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm
C y họ đậu n i chung, c y đậu t ng n i ri ng l c y c nhu cầu về n ớc cao
h n c c loại c y kh c v l c y chịu hạn k m. Đ ch nh l do trong hạt v c y đậu
t ng c h m l ợng protein v lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất kh cần 500-530 kg
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
4
n ớc. Trong qu tr nh nảy mầm th nhu cầu về n ớc của đậu t ng cũng kh cao
50%, trong khi ở ng chỉ l 30%, l a l 26% [8].
Khi nghi n cứu về c c đặc t nh chịu hạn của c y đậu t ng về ph ng diện sinh l v
di truyền đã cho thấy, c c đặc t nh n y li n quan chặt chẽ đến đặc điểm ho keo của
nguy n sinh chất, đặc điểm của qu tr nh trao đổi chất. T nh chịu hạn của c y đậu
t ng mang t nh đa gen. Ch ng thể hiện ở nhiều kh a cạnh kh c nhau: nh sự ph t
triển nhanh của bộ rễ, t nh ch n sớm t ng đối cũng nh bản chất di truyền của từng
giống c khả năng sử dụng n ớc tiết kiệm trong qu tr nh sinh tr ởng v ph t triển
của c y.
Trong m i tr ờng kh hạn, c y c thể chống lại sự mất n ớc hoặc nhanh ch ng b lại
phần n ớc đã bị mất nhờ hoạt động của bộ rễ v sự điều chỉnh ASTT của tế b o.
Ngo i ra, c y c n c thể chống chịu hạn bằng những biến đổi về h nh th i nh l c
nhiều l ng, lớp cutin d y, l cuộn lại th nh ống để giảm tho t h i n ớc.
Ph n t ch th nh phần h a sinh của c c c y chịu hạn, c c nghi n cứu đều cho
rằng khi c y gặp hạn c hiện t ợng tăng l n về h m l ợng ABA, h m l ợng proline,
nồng độ ion K
+
, c c loại đ ờng, hoạt độ c c enzym, axit hữu c giảm phức hợp
CO

2
, protein và các axit nucleic [1], [12]. Sự tổng hợp v t ch luỹ c c chất tr n diễn
ra rất nhanh khi tế b o bị mất n ớc, với hai chức năng l (1) sự điều chỉnh ASTT nhờ
khả năng giữ n ớc v lấy n ớc v o tế b o v (2) ngăn chặn sự x m nhập của ion Na
+
của c c chất đ . Ch ng c thể thay thế vị tr n ớc n i xảy ra c c phản ứng h a sinh,
t ng t c với lipit hoặc protein trong m ng, ngăn chặn sự ph hủy m ng v c c phức
protein trong m ng. Qu tr nh n y li n quan đến sự biểu hiện của c c gen, h ng loạt
c c gen nghỉ đ ợc hoạt h a tổng hợp c c chất cần thiết để chống lại sự kh hạn [1].
Wan v Li (2006), nghi n cứu về c y Arabidopsis thaliana đã kết luận rằng, khi c y
gặp hạn sự t ch lũy ABA đ ợc tăng c ờng v ở c y lạc c c t c giả cũng chứng minh
rằng NAA c t c dụng tăng c ờng tổng hợp ABA dẫn đến sự biểu hiện của gen
AhNCED1 [31].
Nhiều nghi n cứu sử dụng t c động của ngoại cảnh, thổi kh , hạn sinh lý để khảo
s t sự phản ứng đối với hạn của c c giống c y trồng ở giai đoạn hạt nảy mầm.
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
5
Enzyme l chất x c t c sinh học c hiệu quả cao. Trong giai đoạn hạt nảy mầm qu
tr nh chuyển ho c c chất diễn ra mạnh, sự hoạt động của các enzyme cũng diễn ra
mạnh. Ở giai đoạn n y hai enzym c vai tr quan trọng l enzyme α - amylase và
enzym protease.
Enzyme α-amylase là một trong những enzym quan trọng trong qu trình thủy ph n
tinh bột th nh dextrin v mantose. Sự tăng hoạt độ enzyme α-amylase l m tăng h m
l ợng đ ờng tan trong c y.
Nguyễn Thị Th y H ờng (2005) thấy rằng, ở đậu t ng h m l ợng đ ờng tan trong
c y li n quan trực tiếp đến khả năng chống chịu của c y trồng. Đ ờng tan l một
trong những chất tham gia điều chỉnh ASTT trong tế b o. Sự gia tăng hoạt độ
enzyme α-amylase sẽ l m tăng h m l ợng đ ờng tan do đ l m tăng ASTT v tăng
khả năng phản ứng đối với hạn [5].
H Tiến Sỹ (2007) khi nghi n cứu về c c giống đậu t ng địa ph ng của tỉnh Cao

Bằng r t ra nhận x t, hoạt độ của enzyme α-amylase v h m l ợng đ ờng tan c mối
t ng quan thuận chặt chẽ, li n quan đến khả năng nảy mầm của hạt v sự sinh
tr ởng của mầm. Giữa c c giống c sự thay đổi về hoạt độ của enzyme α-amylase và
h m l ợng đ ờng tan kh c nhau li n quan đến khả năng phản ứng đối với hạn của
từng giống [13].
Khi nghi n cứu ở c y lúa, lạc [12], [7] c c t c giả cũng r t ra kết luận t ng tự.
Trong điều kiện thiếu n ớc, c c enzym protease sẽ hoạt động một c ch t ch cực phân
giải c c protein để tạo ra c c polypeptit ngắn tan trong m i tr ờng nội b o l m tăng
ASTT v tăng khả năng phản ứng đối với hạn.
Trần Thị Ph ng Li n (1999) khi nghi n cứu về một số giống đậu t ng c khả năng
chịu n ng hạn đã nhận x t rằng, hoạt độ enzym protease trong qu tr nh nảy mầm của
hạt ở tất cả c c giống nghi n cứu rất đa dạng, c hoạt t nh cao, c khả năng ph n giải
ho n to n protein dự trữ tạo nguy n liệu để tổng hợp protein cho c thể mới [6].
Đinh Thị Ngọc (2008) khi nghi n cứu về một số giống đậu t ng ở T y Nguy n đã
r t ra nhận x t ở giai đoạn hạt nảy mầm, trong điều kiện bổ sung sorbitol nồng độ
7%, hoạt độ của protease v h m l ợng protein tan biến đổi theo xu h ớng tăng dần
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
6
v đạt cực đại v o ng y thứ 7 bắt đầu giảm ở giai đoạn 9 ng y hạn. Hàm l ợng
protein và protease c mối t ng quan thuận. Trong giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, 7
v 9 ng y tuổi khi kh ng xử lý bởi sorbitol hoạt độ protease v h m l ợng protein
đều thấp h n so với hoạt độ protease v h m l ợng protein trong hạt nảy mầm khi xử
lý bởi sorbitol 7%. Nh vậy, p suất thẩm thấu cao c ảnh h ởng rất r l n hoạt độ
protease [11].
Một số nghi n cứu tr n c c đối t ợng kh c nh : l a, đậu xanh, lạc cho thấy trong
điều kiện hạn sinh lý có sự gia tăng hoạt độ enzym protease và có mối t ng quan
thuận giữa h m l ợng protein v hoạt độ protease thể hiện khả năng phản ứng đối với
hạn kh c nhau giữa c c giống.
1.2.2. Sự phản ứng của c y đậu tƣơng đối với hạn ở giai đoạn c y non
Hạn t c động l n c y theo hai h ớng ch nh đ l : l m tăng nhiệt độ c y v g y

mất n ớc trong c y. N ớc l yếu tố giới hạn đối với c y trồng, vừa l nguy n liệu
khởi đầu vừa l sản phẩm trung gian v cuối c ng của c c qu tr nh chuyển ho sinh
học. N ớc l m i tr ờng để c c phản ứng trao đổi chất xảy ra, do vậy việc cung cấp
n ớc cho c y trồng v h ớng nghi n cứu tăng c ờng t nh chịu hạn của c y trồng l
mục ti u của qu tr nh tạo giống chống chịu v th ờng xuy n đ ợc quan t m. Thiếu
n ớc tr ớc ti n sẽ ảnh h ởng đến sự mất c n bằng n ớc của c y, từ đ ảnh h ởng
đến c c chức năng sinh lý kh c nh quang hợp, h hấp, dinh d ỡng kho ng v cuối
c ng ảnh h ởng đến sinh tr ởng, ph t triển. Mức độ thiếu hụt n ớc c ng lớn th c ng
ảnh h ởng xấu đến qu tr nh sinh tr ởng v ph t triển của c y, nếu thiếu n ớc nhẹ sẽ
l m giảm tốc độ sinh tr ởng, thiếu n ớc trầm trọng sẽ l m biến đổi hệ keo nguy n
sinh chất l m tăng c ờng qu tr nh gi ho tế b o khi bị kh kiệt n ớc, nguy n sinh
chất bị đứt vỡ c học dẫn đến tế b o, m bị tổn th ng v chết. Đối với thực vật nói
chung v c y trồng n i ri ng, hạn ảnh h ởng tới qu tr nh sinh tr ởng, ph t triển của
c y đ l c y non v giai đoạn ra hoa.
Theo th ng b o của Chen v Murant (2002), sức chống chịu của thực vật tăng l n
khi đ ợc chuyển c c gen mã h a enzyme tham gia v o con đ ờng sinh tổng hợp
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
7
proline trong tế b o [21]. Nhiều c ng tr nh nghi n cứu cho thấy sự t ch lũy proline c
thể tăng từ 10 đến 100 lần ở thực vật d ới t c động của ASTT.
Nguyễn Thị Th y H ờng (2005) khi gây hạn nh n tạo ở c y đậu t ng địa ph ng
của tỉnh S n La nhận thấy, c sự tăng nhanh về h m l ợng prolin v giảm h m l ợng
protein của c c giống nghi n cứu, h m l ợng proline của mỗi giống cao h n so với
đối chứng. Khả năng chịu hạn của c y đậu t ng phụ thuộc tuyến t nh v o h m
l ợng proline. Điều đ , chứng tỏ c y đậu t ng đã c phản ứng một c ch t ch cực
tr ớc sự thay đổi của điều kiện m i tr ờng [5].
H Tiến Sỹ (2007) khi nghi n cứu về khả năng chịu hạn của c c giống đậu t ng địa
ph ng của tỉnh Cao Bằng, Đinh Thị Ngọc (2008) nghi n cứu khả năng chịu hạn của
c c giống đậu t ng trồng ở v ng T y Nguy n cũng r t ra những nhận x t t ng tự
nh vậy [11], [13].

Kết quả n y cũng nhận đ ợc khi nghi n cứu ở c c đối t ợng kh c nh l a, lạc [12], [7].
1.3. SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÆN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI
TRUYỀN Ở MỨC PHÅN TỬ
1.3.1. RAPD
Kỹ thuật RAPD l kỹ thuật ph n t ch sự đa h nh chiều d i c c ph n đoạn ADN đ ợc
nh n bản nhờ c c mồi ngẫu nhi n c k ch th ớc 10bp, do hai nhóm nghiên cứu của
Williams và CS (1990) [32] và Welsh và McClelland (1991) [33] đồng thời x y
dựng. Đ y l một kỹ thuật ph t hiện chỉ thị di truyền dựa tr n phản ứng chuỗi
polymerase (PCR). Kỹ thuật RAPD l ph ng ph p t ng đối đ n giản trong đ nh
gi hệ gen thực vật, n kh ng những khắc phục đ ợc nh ợc điểm của ph ng ph p
chọn giống truyền thống m c n g p bảo tồn nguồn gen c y trồng v n ng cao hiệu
quả chọn lọc.
C c yếu tố cần thiết để tiến h nh phản ứng RAPD bao gồm: ADN khu n (DNA
template); Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đ l mồi oligonucleotit c trật tự
nucleotit ngẫu nhi n v c chiều d i khoảng 10 nucleotit, trong đ C + G chiếm h n
60%; ADN - polymerase (Taq polymerase): hoạt động của Taq polymerase phụ thuộc
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
8
vào Mg
2+
, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến t nh ADN; Bốn loại deoxyribonucleotit
triphotphat (dNTP): ATP, TTP, CTP, GTP; Ion Mg
2+
.
Phản ứng RAPD đ ợc tiến h nh qua 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn biến t nh ADN: ở
nhiệt độ 95
0
C trong khoảng 30-60 gi y l m cho hai mạch khu n ADN t ch nhau. (2)
Giai đoạn tiếp hợp mồi: khi nhiệt độ hạ xuống 32-40
0

C mồi tiếp hợp v b m v o sợi
ADN khu n. (3) Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ đ ợc n ng l n 72
0
C th c c đoạn mồi
đã bắt cặp với c c mạch đ n sẽ đ ợc k o d i với sự tham gia của Taq polymerase.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn nh tr n, một ph n đoạn ADN khu n đ ợc nh n
lên thành hai, c c đoạn ADN đ ợc nh n bản trong mỗi chu kỳ lại đ ợc coi l ADN
khu n cho mỗi chu kỳ nh n bản tiếp theo. Vậy sau k chu kỳ nh n bản sẽ tạo ra 2
k
các
đoạn ADN giống đoạn ADN khu n ban đầu. RAPD c thể thực hiện từ 40 - 45 chu
kỳ. Nh vậy, th nh phần v c c b ớc của phản ứng RAPD dựa tr n c sở của phản
ứng PCR chỉ kh c ở chỗ nồng độ Mg
2+
trong th nh phần của phản ứng cao h n, mồi
đ n ngắn (10bp) c thể tiếp hợp ở nhiều vị tr trong ADN v kết quả nh n bản đ ợc
số đoạn ADN từ hai ph n đoạn ADN trở l n. Mỗi đoạn ADN đ ợc nh n c k ch
th ớc 100-5000bp.
Sử dụng kỹ thuật RAPD kh ng cần biết tr nh tự đoạn ADN cần nghi n cứu,
quy tr nh tiến h nh nhanh, chỉ cần một l ợng nhỏ ADN khu n v chỉ cần một bộ mồi
c thể đ ợc sử dụng với c c lo i kh c nhau. Kỹ thuật RAPD c u điểm ở chỗ sử
dụng c c mồi ngẫu nhi n d i 10 nucleotit, qu tr nh nh n bản ADN l ngẫu nhi n.
Đoạn mồi n y c thể b m v o bất kỳ vị tr n o c tr nh tự nucleotit bổ sung tr n ph n
tử ADN hệ gen. Với đặc điểm l ngắn n n x c suất đoạn mồi c đ ợc điểm gắn tr n
ph n tử ADN khu n l rất lớn. T y v o nh m, lo i thực vật hay vi sinh vật m c c
đoạn mồi ngẫu nhi n đ ợc thiết kế chuy n dụng. Theo lý thuyết, số l ợng c c ADN
đ ợc nh n bản phụ thuộc v o độ d i, vị tr của c c đoạn mồi, k ch th ớc v cấu trúc
ADN genome. Th ng th ờng mỗi đoạn mồi ngẫu nhi n sẽ tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm
nh n bản [32]. Kết quả l sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ ph t hiện đ ợc sự kh c
nhau trong phổ c c ph n đoạn ADN đ ợc nh n bản. Sự kh c nhau đ gọi l t nh đa

h nh. Hiện t ợng đa h nh c c đoạn ADN đ ợc nh n bản ngẫu nhi n xuất hiện l do
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
9
c sự biến đổi tr nh tự nucleotit tại vị tr c c đoạn mồi li n kết. Sản phẩm khuếch đại
đ ợc ph n t ch bằng điện di tr n gel agarose hoặc polyacrylamide v c thể quan s t
đ ợc sau khi gel đ ợc nhuộm bằng ho chất đặc tr ng. V vậy, t nh đa h nh th ờng
đ ợc nhận ra do sự c mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nh n bản [32].
1.3.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng RAPD
Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã v đang đ ợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực của sinh học ph n tử. Ng ời ta đã d ng kỹ thuật n y để thiết lập bản đồ di truyền
ph n tử [29], [30], nhận dạng c c giống c y trồng, ph t hiện quan hệ ph t sinh chủng
loại đối với nhiều loại c y trồng, đ nh gi sự thay đổi genome của c c d ng chọn lọc,
đ nh gi hệ gen của giống v sự đa dạng di truyền của tập đo n giống [25], [26], [32].
Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã đ ợc ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối t ợng
kh c nhau nh : đậu xanh, l a, lạc, chuối, ng , đậu t ng trong việc đ nh gi đa
dạng di truyền giữa c c lo i v trong phạm vi một lo i [16], ph n t ch v đ nh gi bộ
genome thực vật nhằm x c định những thay đổi của c c d ng chọn lọc ở mức độ
ph n tử [12].
Để đ nh gi sự thay đổi di truyền của c c d ng l a t i sinh từ m sẹo chịu
mất n ớc, Lê Xu n Đắc, Đinh Thị Ph ng đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhi n để chỉ ra
sự sai kh c ở mức độ ph n tử giữa c c đối t ợng n y [4]. Đ nh gi t nh đa dạng của
một số giống lạc trong tập đo n giống chống chịu bệnh gỉ sắt [16], với 11 đoạn mồi
ngẫu nhi n, t c giả đã nhận đ ợc 109 ph n đoạn ADN, trong đ c 66 ph n đoạn đa
h nh, chiếm 60,6%. Điều n y cho thấy, trong phạm vi của mỗi phản ứng RAPD
giữa 33 giống lạc nghi n cứu kh c nhau về cấu tr c ADN, mức sai kh c từ 4% đến
18%. Kết quả ph n t ch ADN cho thấy c c giống lạc ở c ng một v ng địa lý, sinh
th i đ ợc tập trung th nh từng nh m, giữa c c giống chống chịu bệnh gỉ sắt của tập
đo n giống ICRISAT v c c giống năng suất trong n ớc kh ng nằm trong c ng một
nh nh. V thế c thể lựa chọn c c cặp bố mẹ mong muốn để phục vụ cho công tác
lai giống. Với 10 mồi ngẫu nhi n, Nguyễn Thị T m (2004) đã cho thấy c c d ng

l a chọn lọc tạo ra từ m sẹo l a chịu nhiệt giống CR203, CS4, ML107 đã c
những thay đổi ở mức độ ph n tử [14]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghi n cứu
Số h a bởi Trung t m Học liệu – Đại học Th i Nguyên
10