Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng Song mật thu thập từ các tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật RAPD

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên tài nguyên thực vật rất
dồi dào, với diện tích rừng của Việt Nam chúng ta thấy được sự đa dạng các
loài trong hệ sinh thái thực vật là vô cùng phong phú. Với mục tiêu trồng rừng
phát triển kinh tế, tạo nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp cũng như
các làng nghề thì sản phNm từ rừng của chúng ta phải ngày càng được nâng
cao cả về chất lượng và sản lượng.
Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) là một trong những
loài lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao. Song mật có đường kính lớn, dài,
bền, dẻo, dễ uốn và chịu lực tốt nên đây là nguyên liệu sử dụng trong các làng
nghề mây tre đan trên cả nước.
Với sự quan tâm đầu tư của nhà nước cho các cơ sở sản xuất tiểu thủ
công nghiệp thì số lượng sản phNm từ các làng nghề mây tre đan ngày càng
tăng nhưng tỷ lệ nghịch với sự gia tăng này chính là sự giảm sút nghiêm trọng
của nguyên liệu đầu vào. Theo thống kê, khoảng 35 – 42% các cơ sở mây tre
đan đang phải sản xuất cầm chừng và có nguy cơ đóng cửa vì thiếu và không
chủ động được nguyên liệu. Việc thiết lập những vùng nguyên liệu chuyên
canh tập trung Song mật là một nhu cầu bức bách đối với nước ta hiện nay.
Trên cả nước đã có nhiều tỉnh triển khai việc nhân giống Song mật
nhưng công tác nhân giống chỉ mang tính gây trồng và bằng hình thức gieo
ươm hạt tạo cây con rồi đưa vào trồng rừng sản xuất nhưng với song mây
trong giai đoạn phát triển của chúng luôn phải trải qua giai đoạn cỏ. Đây là
giai đoạn mà cây con tạo nhiều chồi, thời gian để các chồi phát triển là rất lâu,
điều này kéo theo sự chậm phát triển của cây trồng. Để khắc phục giai đoạn
cỏ này hiện nay chỉ có thể bằng các phương pháp nuôi cấy invitro.
Giải quyết vấn đề thiếu nguồn nguyên liệu và suy giảm nhanh chóng
nguồn tài nguyên thực vật này ngày 12 tháng 5 năm 2008 Bộ trưởng Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết định số 1462/QĐ/BNN-KHCN về
việc: “Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro”

2
phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và nhân giống Song mật đưa nhanh vào
trồng rừng sản xuất.
Nhận thức được tầm quan trọng của nguồn nguyên liệu đưa vào nhân
giống sản xuất. Để có nguồn nguyên liệu tốt cho công tác nhân giống thì việc
đánh giá, kiểm tra chất lượng nguồn giống là vô cùng quan trọng. Một trong
những phương pháp đem lại hiệu quả, độ chính xác cao, rút ngắn được thời
gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự đa dạng di
truyền bởi nó cho chúng ta biết về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng
1 loài và giữa các loài khác nhau. Đến nay các nghiên cứu về tính đa hình
cũng như tính đa dạng di truyền của Song mật để phục vụ công tác chọn
giống ở Việt Nam vẫn còn bỏ ngỏ.
Vì vậy, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của
một số dòng Song mật thu thập từ các tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật
RAPD.”
Đề tài đặt mục tiêu là đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu
nghiên cứu từ đó làm cơ sở cho việc xác định xuất xứ, giúp các nhà chọn
giống có kết luận chính xác về tính di truyền của các tính trạng mang phNm
chất tốt của đối tượng. Phục vụ cho công tác tuyển chọn và nhân giống các
dòng Song mật có thời gian nuôi trồng ngắn, phNm chất tốt, sản lượng cao đáp
ứng nhu cầu sản xuất và chất lượng sản phNm đầu ra.


3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Vấn đề chung về sinh học phân tử trong phân tích đa dạng di truyền
Sự ra đời và phát triển của sinh học hiện đại đã cung cấp những công
cụ thích hợp cho phân tích, nghiên cứu di truyền một cách nhanh chóng và

hiệu quả. Đánh dấu bằng sự ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử, nhờ đó
mà sự biến đổi di truyền được nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ ADN và có thể
phát hiện ra lượng lớn tính đa hình tạo ra do đột biến. Vì vậy, làm cho kết quả
của việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phong phú, chính xác hơn so với
chỉ thị hình thái.
Một số kỹ thuật ADN hiện đang được sử dụng phổ biến là đa hình độ
dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism –
RFLP) và các kỹ thuật dựa vào chuỗi phản ứng Polymerase Chain Reaction
(PCR) như: đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified
Polymorphism ADN – RAPD); Microsatellite hay còn gọi là đa hình các đoạn
lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat – SSR); Đa hình độ dài các đoạn
nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP); . . .
Tuy nhiên, không có kỹ thuật sinh học phân tử lý tưởng nào đáp ứng
được tất cả các chỉ tiêu, mỗi loại đều có những thế mạnh và hạn chế riêng.
1.1.1. Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length
Polymorphism – RFLP)
Kỹ thuật RFLP (Bot Stein, et al., 1980), dùng các cADN hoặc ADN
ngẫu nhiên trong hệ gen như các mẫu dò, các mẫu dò này được đánh dấu bằng
phóng xạ hoặc enzyme tiếp hợp để phát hiện các đoạn ADN có độ dài khác
nhau được tạo ra khi sử dụng các enzyme hạn chế để cắt ADN hệ gen và phân
tách bằng phương pháp điện di trên gel [26]. Nếu trình tự nhận biết có mặt ở
một vị trí trên hệ gen của một cá thể nhưng không có mặt ở cá thể khác,
enzyme sẽ tạo ra các đoạn hạn chế có kích thước khác nhau ở vị trí này. Kết
quả làm phát sinh hàng ngàn đoạn ADN có kích thước khác nhau.

4
RFLP là chỉ thị đồng hợp trội, các đoạn ADN từ tất cả các nhiễm sắc
thể (NST) đồng dạng đều được phát hiện. Vì vậy, RFLP là chỉ thị rất đáng tin
cậy trong phân tích liên kết và chọn giống. RFLP có thể xác định một đặc
điểm liên kết ở trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của một cá thể, đây là

điều đặc biệt lý tưởng đối với các tính trạng lặn. RFLP được ứng dụng có hiệu
quả trong nghiên cứu biến dị di truyền, phân tích liên kết, chọn giống, lập bản
đồ phân tử.
Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng ứng dụng của chỉ thị RFLP lại tốn
kém về kinh tế và thời gian. Phương pháp này cần sử dụng lượng lớn ADN
nên đòi hỏi sự thành thạo về kỹ thuật và các điều kiện phòng thí ngiệm đặc
biệt.
1.1.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cơ sở phản ứng Polymerase
Chain Reaction (PCR).
Phản ứng PCR được Mullis và cộng sự đưa ra năm 1986. Đây là phản
ứng tổng hợp ADN invitro nhờ ADN polymerase của vi khuNn với một mồi
đặc trưng như một điểm xuất phát cho sự nhân lên của ADN khuôn. Quá trình
tổng hợp diễn ra trên một máy điều chỉnh nhiệt, quy trình chạy PCR gồm 25 –
40 chu kỳ. Sản phNm ADN đặc trưng được nhân lên theo cấp số nhân với
công thức tính: N = (2n – 2n). x
Trong đó:
n: số chu kỳ chạy phản ứng
2n: số phân tử có chiều dài không xác định
x: số phân tử khuôn ban đầu
N: số sợi tổng hợp được trong phản ứng.
2
n
: số phân tử có chiều dài bằng khoảng cách giữa 2 mồi [3].
Kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cơ sở là các đoạn nucleotide với kỹ
thuật PCR để phát hiện các locus đơn gen hoặc đa gen trong hệ gen sinh vật,
có thể đòi hỏi hoặc không đòi hỏi không trình tự, có thể khác nhau về mức độ

5
tin cậy, mức độ khó khăn và sự chi phí, cũng như bản chất của sự đa hình mà
chúng phát hiện.

Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nghiên cứu những biến đổi trong
vật liệu di truyền của cơ thể sống ở mức ADN. Biến đổi di truyền được
nghiên cứu trực tiếp ở mức độ ADN có thể phát hiện ra một lượng lớn sự đa
hình tạo ra do đột biến, vì vậy làm cho chúng phong phú hơn so với chỉ thị
hình thái. Để phân biệt các xuất xứ khác nhau, có thể dùng nhiều phương
pháp. Một trong những phương pháp đem lại hiệu quả cao, chính xác, rút
ngắn được thời gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự
đa dạng di truyền bởi nó cho phép chúng ta hiểu biết về thành phần gen giữa
các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau làm cơ sở cho việc
xác định xuất xứ [1, 4].
Sự ra đời của PCR đã làm thay đổi lớn trong sinh học phân tử, đánh
dấu sự ra đời của hàng loạt chỉ thị phân tử: RAPD, AFLP, SSR.
1.1.2.1. Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment
Length Polymorphism – AFLP).
AFLP được phát triển bởi Zabeau và Vos (1993) [30] và được mô tả
chi tiết bởi Vos và cộng sự (1995) [28]. AFLP là kỹ thuật di truyền mới dựa
trên cơ sở PCR, AFLP đã phối hợp được sự tin cậy của RFLP và sự thuận lợi
của kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này gồm ba bước:
(1) : Cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn và gắn các đoạn
oligonucleotide tiếp hợp (adapter).
(2) : Nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn.
(3) : Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên.
Đây là kỹ thuật có nhiều ưu điểm trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở
nhiều đối tượng khác nhau: đậu tương [24], lập bản đồ hệ gen và định vị các
gen, phát triển chỉ thị chuNn ở khoai tây [8], ở lúa mỳ, xác định các gen kháng
virus ở đậu tương [28], ở khoai tây [11], ở lạc [13].

6
AFLP là một kỹ thuật có độ nhạy cao để phát hiện đa hình trong toàn
bộ hệ gen. AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả

năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống có sự trợ giúp của chỉ
thị [10, 21]. Tuy nhiên, phân tích AFLP trước đây có giá thành cao, đòi hỏi có
kỹ thuật phòng thí nghiệm thành thạo vì AFLP thường dùng đồng vị phóng xạ
để phát hiện các đoạn ADN được nhân lên trong phản ứng PCR, song điều
này đã được khắc phục khi sử dụng các kỹ thuật nhuộm huỳnh quang và
nhuộm bạc thay cho việc sử dụng đồng vị phóng xạ. Sự thay thế này giúp cho
giá thành khi sử dụng kỹ thuật giảm đi rất nhiều, không đòi hỏi những thiết bị
quá đắt, các thao tác kỹ thuật đơn giản hơn mà vẫn đảm bảo độ nhạy và tính
chính xác của kết quả. Với việc thay thế bằng nhuộm huỳnh quang và nhuộm
bạc AFLP đã trở thành một kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay trong
nghiên cứu di truyền và lập bản đồ liên kết phân tử.
1.1.2.2. Trình tự vị trí đánh dấu (STS - Sequence Tagged Sites)
STS được tạo ra đầu tiên bởi Olson và cộng sự (1989) dựa vào một loại
locus đã biết (gen, cADN, hoặc gen tách dòng) được nhân lên bởi mồi PCR
thiết kế dựa vào trình tự đầu cuối của những locus đặc trưng này.
Dựa trên cơ sở PCR nó phát hiện một điểm có trình tự xác định, nó
không đòi hỏi sự phân lập nhưng đòi hỏi trình tự. Mồi có 18 – 20bp được thiết
kế để nhân đoạn ADN ngắn, duy nhất trên ADN đã biết trình tự (có thể là
trình tự của sản phNm PCR với chỉ thị RAPD hoặc RFLP) sự đa hình nói
chung được xác định như sự khác nhau về kích thước của sản phNm PCR trên
gel agarose.
EST (Expressed Sequence Tag) là một chỉ thị dựa trên cơ sở PCR với
mồi dài 18 – 20 nucleotide được thiết kế từ những phần trình tự đã biết trên hệ
gen như các đoạn cADN, nó không đòi hỏi sự phân lập nhưng đòi hỏi trình tự
và phát hiện vùng biểu hiện duy nhất của hệ gen nên thích hợp đối với lập bản
đồ. Sự đa hình nói chung được phát hiện bởi sự khác nhau về kích thước của

7
sản phNm PCR. Tuy nhiên việc thiết kế và chuNn hoá mồi có thể đòi hỏi sự
đầu tư đáng kể.

Một chỉ thị khác của STS dựa trên kỹ thuật RAPD là SCARs (Sequence
Characterised Amplified Regions). Các chỉ thị này dựa trên việc tách dòng và
đọc trình tự các đoạn RAPD được quan tâm (có thể vì chúng liên kết với gen
được quan tâm), từ trình tự đã biết thiết kế các mồi dài hơn các mồi thường
dùng trong RAPD (24 nucleotide) bổ sung chính xác với trình tự đầu cuối của
đoạn RAPD ban đầu. Khi các mồi này được dùng trong PCR, một locus đơn
được xác định tương ứng với đoạn ADN ban đầu của locus này. SCARs tiến
bộ hơn RAPD là các kết quả có khả năng lặp lại (dùng mồi dài hơn) và là các
chỉ thị đồng trội.
Chỉ thị CAPS hay "Cleaved Amplified Polymorphic Sequences" [15]
cũng là một ví dụ của STS, được tạo ra bằng cách cắt các sản phNm PCR với
một enzym hạn chế. Chỉ thị ADN này vẫn mang những ưu điểm cơ bản của
PCR là chỉ cần một lượng nhỏ nanogram (ng) ADN và phát hiện dễ dàng nhờ
kết quả huỳnh quang. Các mồi PCR dài hơn (15 – 25 nucleotide) dùng cho
CAPS có xu hướng tạo ra những sản phNm ổn định hơn RAPD hoặc các kỹ
thuật mồi ngẫu nhiên khác.
Tuy nhiên, CAPS cũng có mặt hạn chế là các cá thể có liên hệ gần gũi
thường chứa các alen giống nhau. Điều này gây trở ngại nghiêm trọng trong
việc tạo cặp lai giữa các dạng khác nhau.
1.1.2.3. Chỉ thị đoạn lặp đơn giản (Simple sequence reapeats – SSR)
SSR còn gọi là Microsatillite được Litt và Luty (1989) [20] phát triển
thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử. Microsatellite là đơn vị lặp lại rất ngắn 1 –
5bp, chúng xuất hiện và phân bố ở gần tâm động hoặc đầu mút của các NST,
có vai trò giữ tính ổn định của bộ NST ở các quá trình phân bào trong hệ gen
của tất cả sinh vật nhân thực [5, 26].
Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để
nhân các đoạn trình tự SSR. Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn

8
đến thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di

trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide.
Đa hình về độ dài các đoạn microsatellite cũng có thể được phát hiện
khi lai với ADN trên gel hoặc có thể được nhân bằng PCR để tách dòng, đọc
trình tự với mồi là các đoạn oligonucleotide phụ cận. Các vị trí microsatellite
là các chỉ thị đồng trội vì vậy chứa đựng thông tin cao. Microsatellite cũng là
một chỉ thị trong lập bản đồ và xác định chỉ thị chuNn.
Ở động vật microsatelllite với trình tự CA/GT lặp lại là phổ biến nhất,
trình tự này ít thấy ở nhiều thực vật vì ở thực vật trình tự lặp lại AT/TA phổ
biến hơn nhiều, tiếp đó là trình tự GA/CT. Trong hệ gen lúa (GA)n lặp lại cứ
225kb một lần và (GT)n lặp lại cứ 480kb một lần.
Sự phân tích trình tự lặp lại là hết sức quan trọng đối với phân tích hệ
gen thực vật vì trình tự lặp lại đặc trưng cho ADN hệ gen của cá thể. Perry
Creengam đã sử dụng kỹ thuật SSR để phát hiện ra sự khác nhau giữa các thứ
đỗ mà không phân biệt được bằng kỹ thuật RADP.
Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị
khác. Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ, sử dụng một lượng ADN
và ít tốn thời gian vì vậy kỹ thuật SSR có nhiều ứng dụng trong việc lập bản
đồ phân tử. Kochert đã sử dụng chỉ thị SSR để lập bản đồ liên kết di truyền ở
lúa [29]. Đánh dấu các gen quan trọng, sử dụng trong nghiên cứu ở một vài
thực vật bao gồm: Lúa [29] và đậu tương [7], kỹ thuật in dấu ADN và được
dùng cho xác định các dòng lai từ các loài hoang dại trong cải biến giống cây
trồng.
Hạn chế của các chỉ thị SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong
việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Để xây dựng các cặp
mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một lượng lớn các đoạn ADN hệ
gen chứa SSR [16]. Tuy nhiên dựa vào các ngân hàng gen đã có hiện nay có
thể thiết kế các tổ hợp mồi cho SSR ở nhiều loài cây khắc phục được phần
nào hạn chế này.

9

1.1.2.4. Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified
Polymorphism ADN – RAPD)
1.1.2.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD
Đây là một kỹ thuật phân tử dựa trên cơ sở của phản ứng PCR do
Welsh và Mc ClellADN, 1990; Williams và cộng sự, 1990 đề xuất. Kỹ thuật
RAPD sử dụng các mồi đơn có trình tự nucleotide ngẫu nhiên dài từ 9 – 12
nucleotide các mồi này thường có hơn 60%(G +C) để đạt được liên kết với
mẫu đủ mạnh. Các mồi ngẫu nhiên là ngắn nên khả năng nó tìm được những
điểm gắn theo nguyên tắc bổ sung trên ADN là không quá khó khăn. Điện di
kết quả nhân gen thu được điện di đồ gồm những băng, vạch ADN ở những vị
trí giống nhau trên bản gel. Khi bộ gen của các mẫu kiểm tra có sự khác nhau
(có đa dạng sinh học) cho kết quả khác nhau trên điện di đồ. Kết quả của phản
ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN khác nhau về độ dài và trình tự. Một
mồi ngẫu nhiên có thể cho kết quả là có băng nhân bản với ADN từ nguồn
này nhưng lại không xuất hiện băng nhân bản với ADN từ nguồn khác [5, 12].
Sản phNm PCR gồm nhiều đoạn ADN có kích thước từ 200bp đến hơn
3kb. Sự khác nhau của các đoạn ADN được phát hiện khi điện di sản phNm
PCR trên gel agarose. Sự khác nhau của các đoạn nói chung là do đột biến ở
vị trí gắn mồi ngăn trở việc bắt cặp của mồi. Các đoạn này được ghi nhận như
các yếu tố di truyền Mendel trội trong một cơ thể lưỡng bội.
1.1.2.4.2. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật RAPD
RAPD là một phương pháp nhanh để phát hiện đa hình vì kỹ thuật này
không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng
một lúc.
Đây là một kỹ thuật có giá thành thấp, đơn giản, sử dụng lượng nhỏ
ADN khuôn, không dùng kỹ thuật lai và mẫu dò phóng xạ nên không đòi hỏi
kỹ thuật phức tạp. Vì vậy, trong những năm gần đây phân tích RAPD trở
thành phương pháp phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền và phân loại thực
vật, xác định các đặc điểm quan trọng và nguồn gốc.

10
Mỗi mồi cung cấp số liệu từ nhiều vị trí trong hệ gen vì vậy những đa
hình hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh hơn
với phân tích locus đơn.
Tuy vậy, RAPD là chỉ thị trội nên không phân biệt được cá thể đồng
hợp và dị hợp nên RAPD không được sử dụng rộng rãi trong xây dựng bản đồ
và do mồi ngắn (10 nucleotide) nên khi chạy phản ứng PCR sẽ chịu nhiều ảnh
hưởng của các yếu tố [6]. Mồi ngắn dễ dàng bị ảnh hưởng của điều kiện gắn
mồi nên kết quả có hệ số an toàn không cao, sự nhạy cảm cao với điều kiện
phản ứng như: chất lượng, nồng độ ADN khuôn; nồng độ dung dịch đệm (đặc
biệt là Mg
2+
); nồng độ ADN polymerase; nồng độ nucleotide (dNTP: A, U, G,
C) là những hạn chế chính của kỹ thuật. Do thiếu sự ổn định, kỹ thuật RAPD
bị hạn chế sử dụng trong lập bản đồ QTL các quần thể lai và ít được dùng
trong những trường hợp lập bản đồ so sánh.
Bên cạnh đó là sự phát sinh đa hình giả ảnh hưởng đến sự thể hiện của
các đoạn RAPD do không chắc chắn các đoạn cùng kích thước từ hai mẫu
ADN khác nhau có thực sự được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen hay
không.
Tuy nhiên, kỹ thuật với mồi ngẫu nhiên có nhiều ứng dụng trong các
thí nghiệm đòi hỏi một số lượng lớn bản sao để kiểm tra độ tin cậy nên kỹ
thuật RAPD vẫn là lựa chọn thích hợp cho công tác đánh giá đa dạng di
truyền.
1.1.2.4.3. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
RAPD thường được dùng trong nghiên cứu phát sinh loài và dùng trong
phân tích sự phân ly các dòng gần đồng gen (near isogenic lines - NIL) [22],
RAPD được dùng nhiều nhất trong xác định các trạng thái khác nhau, xác
định quan hệ di truyền và nghiên cứu đa dạng di truyền ở nhiều loài cây như
lúa, đậu tương, lúa mạch đen, kiều mạch, đậu Hà Lan, hoa hồng... [23, 18, 24,

25]. Cùng với RFLP hoặc SSR, RAPD được dùng để xây dựng bản đồ liên

11
kết di truyền (bản đồ có mật độ cao trong nhiều trường hợp) ở nhiều loài cây:
rau diếp, củ cải đường, lúa mạch... [17, 27, 29].
Trong một số ít trường hợp RAPD được dùng trong xác định QTL của
nhiều đặc điểm nông học như: các đặc điểm về năng suất ở lúa mạch và lúa,
trong xác định gen điều khiển các đặc điểm đơn gen ở cà, rau diếp [14, 17].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra RAPD là một phương pháp hữu hiệu để xác
định kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứu phát sinh loài (hệ
thống phát sinh) và lập bản đồ di truyền.
1.2. Tình hình nghiên cứu về Song mật
Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) thuộc họ cau
(Arecaceae), nằm trong nhóm gỗ trung bình. Với giá trị sử dụng cao và được
người dân sử dụng từ rất lâu nên đã có nhiều nghiên cứu về Song mật.
1.2.1. Phân bố, đặc điểm hình thái Song mật
Song mật là loài cây ưa sáng và Nm, luôn vươn lên tầng cao nhất của
tán rừng. Mọc trên đất feralit vàng, trên núi đá và các loại đất phong hóa trên
phiến thạch, sa thạch, granit hoặc đá vôi. Cây thường mọc ven thung lũng núi,
chân và sườn núi đá, ven và dọc các khe Nm. Nơi có độ dốc 30 – 50
o
cũng
thấy Song mật. Song mật mọc xen lẫn rừng Tre, Vầu ở độ cao 100 – 1,500m,
tập trung nhiều ở độ cao 400 – 900m. Trên thế giới, Song mật chủ yếu tập
trung nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam và một số nước khác. Ở Trung Quốc
Song mật chủ yếu phân bố ở tỉnh Vân Nam, mọc trên núi cao hơn 900m thành
từng cụm lớn. Ở Việt Nam đây là loài cây cận đặc hữu thường gặp ở ở các
tỉnh từ Đồng Nai (Nam Cát Tiên) trở ra nhưng tập trung nhất ở các tỉnh:
Quảng Nam, Quảng Bình, Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hoá, Ninh Bình, Hòa
Bình, Hà Nội, Phú Thọ, Yên Bái, Lào Cai,Tuyên Quang, Bắc Kạn, Lai Châu

[2].
Cây Song mật có thân ngầm là phần phình lên của gốc thân khí sinh, có
dạng giống như củ hành ta và được bao bọc bởi nhiều bẹ lá dày, màu trắng
hay vàng nhạt. Các bẹ lá ngoài cùng chết dần và có màu nâu, phía giữa thân

12
ngầm là đỉnh sinh trưởng, mềm màu trắng. Ở cây non, thân được bao bọc bởi
bẹ lá hình ống, màu xanh lá cây, trên mặt có nhiều gai dẹt màu vàng. Khi già,
bẹ ở gốc thân chuyển thành màu vàng, màu nâu rồi rụng đi, để lộ thân khí
sinh màu xanh rêu. Cây một năm tuổi đường kính thân ngầm đạt 1cm, cây
trưởng thành đường kính thân ngầm tới 4 – 6cm hay hơn. Thân khí sinh mọc
thành bụi nhưng thường rất thưa. Ở cây trên ba tuổi giữa các gốc rễ lớn xuất
hiện chồi mầm đầu tiên, chồi cong và hướng lên phía trên sát với thân cây mẹ;
quanh gốc thân ngầm mọc ra các rễ dài, cứng; đôi khi ta gặp bụi Song mật chỉ
có một thân khí sinh. Thân cây trưởng thành rất dài, có thể đến 40m, trong
rừng già có thể đạt 100m. Thân non màu trắng ngà, sau chuyển sang màu
xanh; lóng dài 8 – 25cm, đốt hơi nổi, đường kính trung bình đạt 2,3 – 2,8cm;
cây to đạt 4 – 5cm. Nếu tính cả bẹ lá bao bọc, đường kính thân phần ngọn đạt
8 – 10cm [2].
Lá Song mật là dạng lá đơn, xẻ gân lông chim, gần giống lá Dừa, gồm:
bẹ lá, cuống lá, phiến là và thìa lìa nằm giữa bẹ và cuống lá. Bẹ lá rất dài, bao
bọc kín thân khí sinh.Trên bẹ lá có nhiều gai dẹt, dài 8 – 10cm, gai mọc lật
ngược về phía gốc; Thường khi cây cao 2 – 3m, từ lá thứ 6 – 7 trở lên xuất
hiện roi (flagelle) trên đỉnh cuống lá; roi dài 1,5m hay hơn [2].
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa hình bông mo, dài hơn 1m, mọc ở gần
nách các lá phía ngọn; mỗi thân thường mang 5 – 10 bông mo. Mỗi bông mo
mang nhiều bông nhỏ dài 2 – 2,5cm với 14 – 17 hoa. Hoa đực xếp sát nhau
thành 2 dãy, lá đài 3, cánh hoa 3, nhị 6. Hoa cái tập trung 14 – 32 hoa trong
một bông nhỏ. Thường chỉ 17 – 20 hoa cái phát triển thành quả. Chồi hoa
xuất hiện vào tháng 9 – 10, hoa nở vào tháng 4 – 5 năm sau. Quả chín tháng

10 – 11 dương lịch. Thời gian chín của quả kéo dài khoảng một tháng [2].
Quả hình trứng, dài 15 – 22mm, rộng 9 – 14mm, cuống mập màu xanh
vàng, dài 6mm, đỉnh có mũi hình nón dài 4mm; vỏ quả mang 18 hàng vảy
dọc, mỗi hàng 8 vảy dẹp, có rãnh kích thước 3 × 3,5mm mép màu nâu. Khi

13
non quả màu xanh lá cây, khi già màu vàng nhạt. Cùi quả màu trắng nhạt,
mọng nước, dài 1mm, dễ dóc khỏi hạt, cùi có vị chua [2].
Hạt hình trái xoan hay bầu dục, khi non màu trắng ngà, khi già màu nâu
đen. Vỏ ngoài hạt rất cứng, nhăn nheo, màu trắng đục, phía bụng là rốn hạt,
phía đầu to có lỗ với nắp đậy, qua đó phôi sẽ xuất hiện khi nảy mầm. Hạt
chứa nội nhũ, sừng rất cứng, phôi nằm lệch về một phía.
1.2.2. Giá trị và hiện trạng khai thác Song mật trên cả nước.
Thân Song mật dài, rất dẻo, chịu uốn và bền, nên được dùng làm bàn
ghế, hàng mây tre đan và cuốn bè. Hiện nay, Song mật là loại nguyên liệu
quan trọng trong nhiều cơ sở sản xuất mây tre đan ở các tỉnh phía Bắc. Trên
thị trường giá Song mật đắt hơn giá các loài song mây khác từ 2 – 3 lần. Hiện
nguồn Song mật dùng cho chế biến, sử dụng vẫn chủ yếu dựa vào việc khai
thác từ rừng tự nhiên.
Theo đánh giá của các chuyên gia lâm nghiệp, từ những năm 1985
Song mật đã bị khai thác mạnh để làm hàng xuất khNu khiến cho nhiều khu
phân bố thu hẹp dần số cá thể và có nguy cơ bị mất nguồn giống. Nguồn tài
nguyên Song mật đang cạn kiệt, vì vậy trên cả nước cần xây dựng những rừng
giống và khoanh vùng một số khu vực còn nhiều cá thể để khai thác hợp lý,
đảm bảo sản lượng ổn định, lâu dài. Song mật rất thích hợp phát triển trong
các rừng của Việt Nam nên phải có kế hoạch bảo vệ, khai thác, đNy mạnh
công tác gieo trồng và sử dụng bền vững. Trước tiên cần có kế hoạch tích cực
bảo vệ cây Song mật trong các khu bảo tồn để làm nguồn giống; đặc biệt cần
bảo vệ các cây Song mật đã được trồng ở Trạm nghiên cứu Lâm nghiệp Bình
Thanh, tỉnh Hoà Bình và vườn quốc gia Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ để lấy giống

nghiên cứu và phát triển trong giai đoạn đầu. Sớm đưa Song mật vào gây
trồng trong các rừng đặc dụng và rừng đầu nguồn.
1.2.3. Những nghiên cứu về Song mật trên Thế giới và Việt Nam
Đối với các đối tượng nghiên cứu khác như: mây nếp, xoan, bông, dâu
tằm. . . và các loài cây trồng nông nghiệp: đậu tương, đậu xanh, . . . Với kỹ

14
thuật sinh học phân tử, các cơ sở nghiên cứu đã đánh giá được tính đa dạng di
truyền ở nhiều đối tượng trên quy mô cả nước cũng như trên thế giới, phục vụ
công tác tuyển chọn giống cây nông lâm nghiệp để có nguồn giống chất lượng
(kháng sâu, bệnh hại; chịu hạn . . .) và năng suất cao đưa vào sản xuất.
Nhận thức rõ vai trò quan trọng của loài cây có giá trị kinh tế cao này,
tại nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt các nước trong khu vực Đông Nam Á
đã tiến hành nghiên cứu: phân loại, kỹ thuật gây trồng, phân tích lợi ích kinh
tế của việc gây trồng Song mật (Yin Guangtian, et al., 1998). Các nghiên cứu
về nguồn tài nguyên di truyền, xác định những loài có giá trị thương mại đã
được tiến hành ở: Bangladesh, Trung Quốc, ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia,
Myanma, Nepal, Philippines và Thái Lan (Ramanatha Rao, et al., 1999) nhằm
mục đích xác định số lượng, khu vực phân bố, vùng gây trồng phù hợp. Ngoài
ra, còn có một số nghiên cứu ở Thái Lan về phân tích đa dạng di truyền bằng
các phương pháp phân tích phân tử (isozyme, RAPD, RFLP, AFLP ... (L.T.
Hong, et al., 2002).
Với nguy cơ đang mất đi một nguồn gen quý cũng như mất dần nguồn
liệu trong sản xuất nên trong những năm qua Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn cùng các tỉnh đã và đang xây dựng nhiều dự án trồng, bảo vệ Song
mật trong tự nhiên; nhiều dự án trồng vùng nguyên liệu sản xuất và vùng bảo
tồn nguồn gen tự nhiên ở nhiều tỉnh.
Nguồn giống trong công tác trồng vùng nguyên liệu và bảo tồn nguồn
gen trong tự nhiên ở nước ta hiện nay chủ yếu dựa vào hình thái và rất xô bồ,
chưa được quan tâm đúng mức. Nhận thấy những tồn tại đó đề tài: “Nghiên

cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro” đã đặt công tác
đánh giá chất lượng nguồn giống nuôi trồng là giai đoạn đầu tiên để kết quả,
chất lượng đề tài cũng như nguồn giống đạt được là cao nhất. Đối với công
tác nhân giống ở Việt Nam, đặc biệt với đối tượng là Song mật thì đây là vấn
đề đang được khuyến khích và triển khai trên mọi đối tượng là cây trồng sản
xuất cũng như trong bảo tồn nguồn gen thực vật trên cả nước.
15

Hình 1.1. Các bộ phận: thân, bẹ, đốt, gai, hoa, quả
của Song mật (nguồn Internet).

Hình 1.2. Ngọn và roi (flagelle) của Song mật
trong tự nhiên (nguồn Internet).

16
Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
˗ Xác định mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Song mật thu thập
tại 4 tỉnh phía Bắc.
˗ Cơ sở phân tử cho công tác chọn tạo, nhân giống và bảo tồn các giống
Song mật quý, có giá trị cao trong sản xuất kinh tế.
2.2. Nội dung nghiên cứu
˗ Tách chiết ADN tổng số của các dòng Song mật ở 4 xuất xứ khác
nhau.
˗ Sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích các mẫu ADN tổng số thu được với
20 đoạn mồi ngẫu nhiên.
˗ Xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan di truyền của Song mật
với các xuất xứ bằng phần mềm NTSYSpc version 2.02h (Applied
Biostatistics Inc., USA., 1998)

2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
* Vật liệu thực vật:
Mẫu nghiên cứu là lá Song mật sạch bệnh, thu thập từ 4 tỉnh phía Bắc:
Hòa Bình, Bắc Giang, Tuyên Quang, Hà Giang.
Gồm 15 mẫu Song mật, theo đánh giá của cán bộ điều tra thì đây là 15
cá thể trội trong số 4 xuất xứ được thu thập (bảng 2.1) do Trung tâm Giống và
Công nghệ Sinh học Trường Đại học Lâm nghiệp cung cấp.

17
Bảng 2.1. Ký hiệu các mẫu Song mật sử dụng nghiên cứu
Ký hiệu Giống Song mật Ký hiệu Giống Song mật
S1 Hoà Bình 1 S9 Tuyên Quang 2
S2 Hoà Bình 2 S10 Tuyên Quang 3
S3 Hoà Bình 2’ S11 Hà Giang 1
S4 Hoà Bình 3 S12 Hà Giang 2
S5 Hoà Bình 4 S13 Hà Giang 3
S6 Hoà Bình 5 S14 Bắc Giang 1
S7 Hoà Bình 6 S15 Bắc Giang 2
S8 Tuyên Quang 1
* Hóa chất:
˗ Trình tự mồi RAPD được tham khảo trên ngân hàng Gen thế giới
(NCBI) và đặt mua từ hãng OPERON (Mỹ) gồm các mồi có trình tự trong
bảng 2.2.
Bảng 2.2. Tên và trình tự 20 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu
TT
Tên
mồi
Trình tự nucleotide TT
Tên

mồi
Trình tự nucleotide
1 PC01 5’-GGACTGGAGT 11 PC11 5’-AACCGACGGG
2 PC02 5’-TGCTCTGCCC 12 PC12 5’-GGGGGTCGTT
3 PC03 5’-GGTGACGCAG 13 PC13 5’-TACCACCCCG
4 PC04 5’-TGGGGGACTC 14 PC14 5’-GGCGGACTGT
5 PC05 5’-GTAGACCCGT 15 PC15 5’-CCAGACCCTG
6 PC06 5’-TTCCCCCGCT 16 PC16 5’-CAATCGCCGT
7 PC07 5’-GGACCCTTAC 17 PC17 5’-TCGGCGATAG
8 PC08 5’-TGGACCGGTG 18 PC18 5’-GTCCACACGG
9 PC09 5’-AAGCCTCGTC 19 PC19 5’-CAGCACCCAC
10 PC10 5’-ACTTCGCCAC 20 PC20 5’-GGGAAGGACA