nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan gấm (anoectochil

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này
Trước hết tôi xin gởi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban
Giấm Đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường niềm kính trọng, sự tự hào
được học tập tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc tới thầy: Th.s Lê Phương Chung – Viện Công Nghệ Sinh
Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và Th.s Nguyễn Trọng Lực –
Trưởng phòng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung Tâm Ứng Dụng Và
Chuyển Giao Công Nghệ - Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã tận tình
hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ
Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và các anh
chị trong Trung Tâm Ứng Dụng và Chuyển Giao Công Nghệ – Sở Khoa Học Và
Công Nghệ tỉnh Phú yên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiên, động viên, khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa
qua
Nha trang, ngày tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Huỳnh Uyên

i
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3
1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3
1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 3
1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào 3
1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào 4
1.1.2.3. Sự trẻ hoá 4
1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 5
1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 6
1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV 6
1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 7
1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo. 7
1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn. 8
1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast 9
1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời 9
1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn 10
1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV 10
1.1.6.1. Khoáng đa lượng 11
1.1.6.2. Khoáng vi lượng 12
1.1.6.3. Nguồn cacbon 12
1.1.6.4. Các vitamin 13
1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác 13

ii
1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 14
1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 18
1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị 18
1.1.7.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy 18

1.1.7.3. Giai đoạn nhân nhanh 19
1.1.7.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 19
1.1.7.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm 20
1.1.8. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV 20
1.1.8.1. Điều kiện vô trùng 20
1.1.8.2. Ánh sáng và nhiệt độ 22
1.1.8.3. pH môi trường 23
1.2. Giới thiệu về cây lan gấm 23
1.2.1. Phân loại thực vật 23
1.2.2. Đăc điểm thực vật 24
1.2.3. Sự phân bố 26
1.2.4. Tính dược liệu và công dụng 26
1.2.5. Tình hình nghiên cứu cây lan gấm 27
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 28
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 28
2.2. Nội dung nghiên cứu. 29
2.3. Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. 30
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu. 30
2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. 30
2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm 30
2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. 32
2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả
năng nhân nhanh chồi 33

iii
2.4.1.4. Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
đến khả năng nhân nhanh chồi 33
2.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh 35
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu. 36

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm 37
3.1.1. Khử trùng bằng Javen 37
3.1.2. Khử trùng bằng chlorine 39
3.1.3. Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin 40
3.2. Tái sinh chồi 42
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng khoáng thích hợp để nhân nhanh
chồi lan gấm 45
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng
nhân nhanh thể chồi 46
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi.
47
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh
chồi. 49
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi 50
3.5. Khảo sát quá trình nhân nhanh 53
3.6. Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm 55
CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
4.1. Kết luận 57
4.2. Kiến nghị 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
PHỤ LỤC


iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu 31
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của
vật liệu nuôi cấy 33
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi. 34

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. 34
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi. 35
Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh 36
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen 37
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine 39
Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine. 40
Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. 41
Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy 42
Bảng 3.6. Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm. 45
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi 47
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 49
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51
Bảng 3.10. Khảo sát quá trình nhân nhanh 53


v
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume 25
Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. 41
Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng 42
Hình 3.3. Sự tái sinh chồi 44
Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng 46
Hình 3.5. Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau 48
Hình 3.6. Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau 50
Hình 3.7. Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau 52
Hình 3.8. Khảo sát quá trình nhân nhanh 54
Hình 3.9. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm 55
Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh lan gấm 56

vi
KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

TBTV : Tế bào thực vật
DNA : Deoxyribonucleotic acid
RNA : Ribonucleotic acid
MS :Murashige&Skoog
VW :Vaccine và Went
KC :Kundson C
LS : Linsmainer và Skoog
ATP : Adenosine triphosphate
GA3 : Acid ascorbic
ĐTD : Đơn tử diệp
STD : Sông tử diệp

1
LỜI MỞ ĐẦU
Thế kỉ 21 được coi là thế kỷ của sự phát triển công nghệ sinh học trong đó
dược liệu là tài nguyên di truyền - tài nguyên tái tạo. Nắm được, phát huy được tài
nguyên di truyền là nắm kinh tế, nắm tương lai. Dùng thế mạnh dược liệu đẩy
-
-
tộc.Từ lâu, người phương đông đã tôn hoa Lan là “ vương giả chi hoa” và người
phương tây cũng tôn hoa Lan là “ nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa Lan đã chinh
phục người phương Đông và người phươngTây không chỉ cấu trúc kì diệu và sự đa
dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ mà còn bỡi giá trị làm thuốc
của nó.
Từ xưa, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương
pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn

nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân
thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng
cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ. , Hơn nữa, hạt lan lại quá
nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm
trong tự nhiên là rất thấp. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến
hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra
với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành
phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không
ngừng tăng lên của thị trường Đây là điều mà phương pháp truyền thống không
thực hiện được.
Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, thì loài lan gấm Anoectochilus setaceus
Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm cảnh do lá và hoa đẹp
mà còn vì giá trị làm thuốc của nó. Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài
cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng
khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng

2
huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả
năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.
Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus. Blume là loại thảo dược có giá trị
và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự
nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm
thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng
trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan
Gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang
nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007.
Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ
sinh học- Viện công nghệ sinh học và môi trường - trường Đại học Nha Trang, tôi
tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus
setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.

3
Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói
về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ
quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng [3]
Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện
như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực
vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo
mục tiêu và yêu cầu đặt ra.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả
nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phương pháp này giúp mở
ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh
tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và
nhiều vấn đề sinh học khác…
Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước:
- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi
phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau
trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn.
- Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu
lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.[3]
1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV)
1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả
năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi .
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng

của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào

4
bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền
(DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào
đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, các nhà khoa học đã chứng
minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng
rẽ.[7]
1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể
hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ
tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này
quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình
đó gọi là quá trình phản biệt hóa.
Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt
hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng
chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình
phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào.
Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao
nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các
tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa.
Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả
năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều
hướng từ ngọn xuống gốc.
1.1.2.3. Sự trẻ hoá
Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác nhau. Vì

vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu.
Trong nuôi cấy mô TBTV( hay còn gọi là nuôi cấy in vitro), các mẫu non trẻ có sự

5
phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong
nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh,
mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn.[7]
1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV
Quá trình nuôi cấy mô TBTV có những ưu điểm như sau:
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công
nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi được nuôi cấy
từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây.
- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân
dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp
hay đồng hợp.
- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí
nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu có kích
thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản
xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
- Nâng cao chất lượng cây giống: cây được nuôi cấy đã được loại trừ các mầm bệnh
như virus, nấm, vi khuẩn … nên cấy giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh. Vì vậy, cây
giống tạo ra có sức sinh trưởng và phát triển tốt, năng suất cây trồng tăng 15-30%
so với phương pháp truyền thống.
- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác
nhau có thể tạo ra từ phương pháp nuôi cấy môTBTV như cây con in vitro (trong
ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi
hay là thân củ.
- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ
dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận
là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật

quốc tế.

6
- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời
gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.[4]
1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV
Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp nuôi cấy mô TBTV còn có những nhược
điểm:
- Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn nhiều
năng lượng… nên giá thành sản xuất của cây giống cao so với các phương pháp
truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
- Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác
với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ
được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân
giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng
các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm
đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. [4]
1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV
Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm :
- Cấy cây : nuôi cấy cây con và cây lớn hơn
- Cấy phôi : gồm nuôi cấy các phôi cô lập đã trưởng thành và chưa trưởng thành
- Cấy cơ quan : cấy các cơ quan thực vật tách rời
- Cấy mô hoặc mô sẹo : cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một
cơ quan thực vật
- Cấy tế bào và huyền phù tế bào : cấy các tế bào cô lập hoặc cụm tế bào rất
nhỏ trong môi trường lỏng
- Cấy tế bào trần : cấy teé bào trần thực vật là nuôi cấy những tế bào không
có thành (vách) được dùng trong kỹ thuật di truyền
- Cấy túi phấn (thể đơn bội) : cấy túi phấn hoặc những hạt phấn chưa trưởng
thành để thu được tế bào đơn bội hay mô sẹo trong kỹ thuật di truyền.[3]

Trong các phương pháp được liệt kê như trên, các phương pháp thường được
áp dụng phổ biến như sau:

7
1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Trong nuôi cấy mô TBTV, một phương thức đơn giản và thường hay được
sử dụng để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, có kích thước
từ 0,1 –0,15mm tính từ chóp sinh trưởng. Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện
dưới kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường
không cao, Phương pháp này được ứng dụng tạo cây con sạch bệnh virus.[16]
Trên thực tế người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng
vài mm. Đó có thể là đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách. Mỗi đỉnh sinh trưởng
nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển
thành cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó, có thể có ba khả năng:
- Cây phát triển từ chồi ngọn
- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ
- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ hạ diệp của cây
mãng cầu (Annona squamosa) sẽ cho rất nhiều mầm trên mô cấy và một số mầm
sau đó sẽ phát triển thành chồi và sau đó sẽ thành cây invitro hoàn chỉnh.
1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo.
Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã
phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật…). Mẫu cấy ban đầu để tạo mô sẹo có thể lấy từ cây con vô trùng
trong ống nghiệm, rễ, thân, lá của cây bên ngoài đã được vô trùng. Không phải tất
cả mọi tế bào trong mẫu cấy đều góp phần hình thành mô sẹo và chỉ có một số loại
mô sẹo nhất định mới có khả năng tái tạo lại các cơ quan có tổ chức. Mô sẹo là
nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế
bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi
soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học… Các tế bào thuộc các mô

hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên.
Nhìn chung sự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình:

8
- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm
các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn STD dễ
dàng phân chia dưới tác động của auxin thấm chí không cần auxin ngoại sinh như ở
các loài cây cỏ hay dây leo.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được
ưu tiên áp dụng ở ĐTD (đơn tử diệp), vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô
khó phản phân hoá so với STD (song tử diệp). Màu sắc của mô sẹo không giống
nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và
chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…
Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu
tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo. Thường mô sẹo được hình
thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau
hoặc có thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây.
Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong
mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy
mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh
mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy.[16]
1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn.
Nuôi cấy bao phấn và túi phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh
phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bao tử, các hạt
phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù cảu bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân
tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi
Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn
khác nhau. Vì vậy mỗi chồi hoa phải kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát
triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy.

Có hai phương pháp cơ bản trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là :

9
- Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng
và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn.
- Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học hoặc
do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng.[16]
1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast
Nuôi cấy protoplast được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông
là người đầu tiên dùng enzyme để thủy phân thành tế bào và tách được protoplast từ
tế bào rễ cà chua. Trong điều kiệ nuôi cấy phù hợp protoplast có thể táo sinh thành
tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Do không có thành tế bào nên protoplast trở thành một đối tượng lý tưởng
trong nghiên cứu biến đổi di truyền thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai
protoplast có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung
hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene.[4]
1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời
Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi nho dai, cùng với một số tác giả khác, ông
đã chứng minh các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều
hơn.
Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây
là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng
đường và các muối của các nguyên tố đa lượng (nitơ, phospho, kali, canxi) và vi
lượng (magiê, sắt, mangan, cobê, kẽm,…). Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như
vitamin (B
1
, B
6
, B
3

…) và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng
và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường
mới.
Dối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đôi với nuôi
cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ ở dạng acid
amine, có đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh

10
trưởng có vai trò quan trọng hơn vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp chất
này. [4]
1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn
Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể
được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy
tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX.
Tế bào đợn có thể ghi nhân bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng
enzyme. Mỗi loiạ cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy
khác nhau.
Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu
ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân
hóa của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.[4]
1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV
Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết
cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực
vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục
đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như
MS (Murashige&Skoog, 1962) , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi trường
MS (Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong
nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá
mầm, 2 lá mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên

đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần.
Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô đóng vai trò quyết định
đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật
liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần môi trường thích hợp để
phù hợp với mục đích việc nuôi cấy mô tế bào thực vật.

11
Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ
bản sau :
+ Các khoáng đa lượng
+ Các khoáng vi lượng.
+ Nguồn cacbon
+ Các vitamin
+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
+ Các chất điều hòa sinh trưởng.
+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar
1.1.6.1. Khoáng đa lượng
Các khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên
30 ppm tức là 30mg/l. Những nguyên tố đó là : N, Fe, P, K, Ca, Mo. Riêng Na và Cl
cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng
- Nitrogen: Mô, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khoáng như
ammonium và nitrate. Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và trạng
thái phát triển của mô. Nitrogen được cung cấp dưới NO
3
-, NH
4
+ [3]
- Phospho ( P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó
tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và
tham gia vào cấu trúc màng. Ngoài ra khi phosphor ở dạng H

2
PO
4

-
và HPO
4

2-
còn
có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong
quá trình nuôi cấy.
- Kali ( K): K
+
là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng các
anion vô cơ và hữu cơ. Ion K được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai
trò chính là điều hòa pH và áp suất môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K
+
trong môi
trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ
hấp thu photphate. Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat
(KNO
3
), kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat (KH
2
PO
4
) [3]
- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Sự có mặt
của Ca

2+
rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm. Sự ổn định

12
của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bỡi ion Ca
2+.
Sự thiếu hụt Ca
2+
sẽ làm tăng
quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào. Canxi được cung cấp dưới
dạng canxi nitrat ( Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O) canxi clorua (CaCl
2
.6H
2
O)
- Magiê (Mg): Là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng đến quá
trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme lien quan trong biến dưỡng
cacbonhydrat sự tổng hợp acid nucleic… Ion Mg có tính linh động cao, hầu hết ion
Mg
2+
đều đc sử dụng cho việc điều hòa pH nội bào và ổn đinh cân bằng anion và
cation. Nếu thiếu hụt Mg sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp RNA. Kết quả là cấu trúc
và chức năng của lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra thiếu hụt Mg, là
yếu tố không thể thiếu trong quá trình trao đổi năng lượng cảu thực vật bỡi vì nó có

vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP. Mg được cung cấp dưới dạng magiê
sunphat ( MgSO
4
.7H2O)
- Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl
2
,
FeCl
3
.6H
2
O, FeSO
4
.7H
2
O, Fe
2
(SO
4
)
3
, Fe(C
4
H
4
O
6
). Hiện nay hầu hết các phòng
phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na
2

-Ethylene Diamine
Tetra Acetate (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng tư từ ra môi
trường theo nhu cầu mô thực vật.[3]
1.1.6.2. Khoáng vi lượng
Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi
trường nuôi cấy invitro. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt
động của enzyme. Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên
tố đa lượng. Các dung dịch vi lượng thường dùng là : Nistch (1951), Heller (1953),
Murashige – skoog ( 1962).[7]
1.1.6.3. Nguồn cacbon
Trong nuôi cấy mô TBTV, các mẫu nuôi cấy nói chung không thể quang hợp
hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung
các hợp chất hydratcacbon. Nguồn hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường

13
saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V). Những loại đường khác như fructose,
glucose, maltose, sorbitol, rất ít dùng [7]
1.1.6.4. Các vitamin
Thông thường thực vật tổng hợp các vitamincần thiết cho sự tăng trưởng và
phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác
nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy invitro một vài vitamin trở thành yếu tố giới
hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong
nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol.
Thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào.
Thiamine thường được sử dụng với nồng độ từ 0,1 – 10mg/l. Acid nicotini và
pyridixine thường được bổ sung vào môi tường nuôi cấy nhưng cũng không cần
thiết cho sự tăng trưởng của nhiều loài thực vật. Acid nicotinic được sử dụng với
nồng độ từ 0,1 – 5 mg/l. Pyrdoxine thường được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10mg/l.
Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dù đây là
một cacbonhydrate chứ không phải là vitamin nhưng nó cũng được chứng minh là

kích thích sự tăng trưởng tế bào đa số loài thực vật.[4]
Các vitamin khác như biotine, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid,
vitamin E … cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy.
Inositol cũng được đề cập tới như một loại vitamin có tác dụng kích thich sự
sinh trưởng và phát triển của cây một cách đáng kể.[13]
1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các aminoacid cần thiết nhưng sự
bổ sung các aminoacid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của
tế bào. Việc sử dung amino acid đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào và tế bào
trần. Amino acid cung cấp cho thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của
tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.[3]
Các nguồn nitrogen thường sử dụng trong nuôi cấy mô TBTV là hỗn hợp amino
acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adnine.

14
1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các chất hữu cơ có bản chất hóa học
khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ phận nhất
định của cây để điều hòa hoạt động sinh lý cũng như quá trình sinh trưởng và phát
triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, các bộ phận trong
cơ thể thực vật.
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật tham gia vào quá trình phân chia tế bào,
phân hóa các mô, phát sinh phôi, tác dụng lên chức năng của DNA và RNA làm ảnh
hưởng mạnh đến những quá trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá
trình sinh tổng hợp các enzyme, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp … Chính vì vậy
chúng có tác dụng điều hòa sinh trưởng phát triển của cây. Các chất điều hòa sinh
truỏng bao gồm những chất sau:
a.Auxin
Auxin là chất điều hòa sinh trưởng được nghiên cứu đầu tiên với việc xác
định cấu trúc hóa học đầu tiên vào năm 1934. Auxin là chất xúc tác cho sự sinh

trưởng của cây trồng , có phổ hoạt động rộng hơn giberelin. Tác động sinh lý của
auxin đối với thực vật rất phức tạp. Các mô thực vật khác nhau có phản ứng khác
nhau đối với tác động của auxin. Hoạt động của auxin tùy thuộc vào nồng độ và sự
tác động tương hỗ giữa chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác.[3]
Auxin kết hợp chặt chễ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi
cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát
sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinine. Khi nồng
độ cytokinine cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy, ngược lại hoặc khi chỉ
xử lý với auxin thì rễ sẽ được tạo thành [3] [10]
Auxin đẩy mạnh sự sinh trưởng thông qua sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là
do chúng thúc đẩy các hoạt động của enzyme, làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế
bào làm cho sự xâm nhập của nước vào trong tế bào được dễ dàng, giảm sức đề
kháng của thành tế bào và tế bào tự kéo dài ra. Auxin hoạt hóa các quá trình sinh
tổng hợp các chất cao phân tử ( protein, xenluloza, pectin,… ) và ngăn cản sự phân

15
giải chúng. Vì vậy, chúng có tác dụng làm chậm trễ quá trình già hóa, kích thích ra
rễ và xúc tiến sự sắp xếp của những rễ bất định.
Nồng độ sử dụng của auxin liên quan chặc chẽ đến sự chiếu sáng, nhiệt độ và
sự có mặt của chất điều hòa sinh trưởng khác.
Năm 1957 Skoog và Miller nuôi cấy mô cây thuốc lá cho thấy khả năng tạo
chồi ở môi trường có nồng độ cytokinine cao và auxin thấp, tạo rễ trong môi trường
có nồng độ cytokinine thấp vào auxin cao. Sau đó một vài năm, sự hình thành phôi
sinh dưỡng bằng cách nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D vì thế auxin chỉ được
sử dụng trong giai đoạn đầu của sự hình thành rễ bất định và phát sinh phôi soma,
sau đó trở thành chất ức chế của các cơ quan và phôi mới được hình thành.
Các chất điều hòa sinh trưởng trong nhóm auxin được biết đến như IBA (3-
Indolbutyric acid); IAA (3-Indolacetic acid); NAA (Naphtalenacecetic acid); 2,4D (
acid 2,4 Dichloropphenoxy acetic).
b. Cytokinine

Cytokine được phát hiện trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật
vào năm 1945-1955. Nhưng đến năm 1965, Miller mới tách được chất hoạt tính
sinh học này với tên gọi là kinetin, sau đó mới xác định được cấu trúc hóa học của
nó. Cytokine là chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác dụng đẩy mạnh sự sinh
trưởng của cây trồng.[6]
Cytokinine có khả năng kích thích sự phân chia tế bào, tính đặc hiệu của nó
là kích thích quá trình phân bào giảm nhiễm. Bên cạnh đó cytokinine có vai trò
quan trọng trong quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan. Để thực hiện
được quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan thì cytokinine phải kết hợp
với auxin hoặc giberelin. Nếu vắng mặt auxin hoặc giberelin thì quá trình phân hóa
tế bào và tạo mới các cơ quan sẽ không hiệu quả auxin thúc đẩy quá trình nhân đôi
DNA và cytokinine cho phép tách rời các nhiễm sắc thể. [6]
Trong nuôi cấy mô tế bào thực, cytokinine đẩy mạnh quá trình hình thành
chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo. Cytokinine rất có hiêu quả trong vai trò

16
kích thích tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên
mô thực vật nuôi cấy invitro.
Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinine sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh
hình thái mẫu cấy, khi nồng cytokinine cao hơn nồng độ cytokinine thì kích thích sự
tạo chồi và ngược lại nồng độ auxin cao hơn cytokinine thì kích thích sự tạo rễ.
Nồng độ cytokinine cao thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ đồng thời cũng ngăn
cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin.
Đại diện chính của cytokinine là kinetine được phát hiên trong dịch thủy
phân nấm men. Đặc trưng nhất của chất này là ngăn cản sự mất màu của lá trong
tối, tăng cường sự xâm nhập của dòng chất dinh dưỡng và thúc đẩy sự phân chia tế
bào khi nuôi cấy tế bào rời.
Trong nhóm cytokinine còn bao gồm các chất thường được sử dụng phổ biến
trong nuôi cấy mô: BA (6-benzylaminopurin) và TDZ (1-phenyl 3-(1-2,3 thiadiazol-
5yl) urea); Zeatine

c. Giberelin
Giberelin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất
khác nhau. Hoạt động của mỗi chất phụ thuộc vào khả năng di chuyển qua mô hoặc
sự biến đổi nó thành một dạng hoạt động khác. Acid giberelic (GA3) và hỗn hợp
giũa GA3 và GA7 là những giberelin duy nhất có giá trị thương phẩm do chúng
thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật
Khi bổ sung giberelin vào môi trường nuôi cấy mô thực vật thì chúng thường
có tác dụng như auxin tự nhiên, sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi,
Acid giberelic có ảnh hưởng chủ yếu lên sự phân hóa tế bào invitro ngoài sự
tác động của auxin. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và mẫu
cấy chồi cũng có thể tăng thêm khi bổ sung acid giberelic.[3][13]
d. Ethylene
Ethylen là chất điều hoà sinh trưởng dạng khí. Ethyllen có rất nhiều tác dụng
đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật. Đã từ lâu vai trò của
ethyllen đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng

17
dụng nhiều. Trong những năm gần đây đã xem xét tác dụng của ethyllen lên sự kéo
dài thân và rễ, kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích nảy mầm, tạo
lông rễ, tạo hoa ở dứa và lan, ức chế vận chuyển ngang và xuống của auxin. [7]
1.1.6.7. Các chất bổ sung
a. Nƣớc dừa
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và
chất kích thích sinh trưởng [15]. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa
và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường được lấy từ quả dừa
để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5- 20%
thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi.[4]
b. Dịch chiết nấm men
Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào.
Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế

bào động vật với nồng độ thích hợp.
Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1- 1%) hoặc
bột chuối với hàm lượng 40g bột tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan
nuôi cấy.
c. Agar
Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hoá
môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6- 10%, đây là loại tinh bột đặc chế
từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu O
2

nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh
d. Than hoạt tính
Thường được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản
phẩm trao đổi chất thứ cấp Trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức
chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào môi trường, than
hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do môi trường trở nên sẫm vì vậy có thể
kích thích quá trình tạo rễ, một số trường hợp còn có tác dụng thúc đẩy phát sinh
phôi vô tính và kích thích sinh trưởng phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ. Tuy

18
nhiên, than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng. Nồng
độ than hoạt tính thường sử dụng từ 0,2 - 0,3 % (w/v).
1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị
Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn nguyên liệu thực
vật vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy. Khâu đầu tiên của giai đoạn này có
thể coi như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy.
Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi
trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ
động nguồn mẫu trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm

trẻ hoá vật liệu giống. Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và
xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô trùng.
Người ta thường sử dụng một số loại hoá chất như: HgCl
2
0,1 %, cồn 70
0
,
H
2
O
2
, Ca(OCl)
2
để khử trùng mẫu cấy .Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu nuôi cấy
mà lựa chọn loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp.[7]
1.1.7.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu vật đã được
khử trùng và nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Về nguyên tắc thì mô nuôi cấy có
thể là bất kỳ bộ phận nào của cây lấy từ các phần non của cây (thân, rễ, lá,…)
nhưng theo Bhatt thì mô nuôi cấy lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy
thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành khác. Vì vậy, người ta
thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro.
Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của cây mô, các
mô ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh
chồi tốt hơn
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống
cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Giai đoạn này thường kéo dài trong 4-6 tuần.