tiểu luận nghiên cứu enzyme amylase

Tiểu luận
Nghiên cứu
Enzyme amylase



Enzyme amylase
Nhom:
TRAN DUY TIEN
MAI HOANG VU
NGUYEN QUOC CUONG
Mục lục
Phần I: Tổng quan về enzym amylase
I.Amylase là gì?
II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
II.1.Đặc tính của enzym α-amylase
II.2. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
III. Lịch sử phát hiện eznym
Phần II: Phân lập, bảo quản giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
I.Vai trò của giống trong công nghệ enzym
II.Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzym
III.Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
IV.Qúa trình phân lập giống VSV
IV.1. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
IV.2. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
IV.3. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
V.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae
VI. Phương pháp bảo quản giống VSV
VI.1. Cấy truyền và bảo quản lạnh
VI.2. Bảo quản giống trong đất hay trong cát
VI.3. Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc

Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase
I.Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt
I.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt
I.1.1. Môi trường lỏng
I.1.2. Môi trường đặc
I.2. Qui trình sản xuất nấm mốc giống
I.2.1. Nguyên liệu
I.2.2.Chuẩn bị mốc giống
I.2.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng
I.2.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác
I.2.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay
I.2.3. Qui trình sản xuất
II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase
II.1. Nguyên liệu
II.2. Qui trình công nghệ
II.3. Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae
II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm
II.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzym
II.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Phần IV : Ứng dụng và kết luận
I.Ứng dụng
I.1.Ứng dụng amylase trong sản xuất bia
I.2. Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn
I.3.Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc
I.4.Ứng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt
II.Kết luận
Phần V: Phụ lục và tài liệu tham khảo
Lời giới thiệu:
Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ
thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn

tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và
khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công
đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó,
chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều
sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ,
amino acid,….
Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá
và giai đoạn đường hoá. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong
thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng acid và
bằng enzym. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như
HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm
soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu
chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym để thuỷ
phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển.
Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành
công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều
nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase càng
ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện nay,
các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà
không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV, cụ thể là
các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài
ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh
bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi
phí cho quá trình tinh sạch dịch đường.
Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy
mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,…
đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở
nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho
nhiều ngành khác phát triển. Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm
mềm vải,…

Phần I: Tổng quan về enzym amylase
I.Amylase là gì?
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử
trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
RH +◊R.R’ + H-OH R’OH
Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( enzyme nội bào ) và
exoamylase ( enzyme ngoại bào ).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme
khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase ( hay α-
dextrin 6 – glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-
glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết
bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân
tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:
• Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ
như khoai lang, khoai tây, khoai mì… , trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và
có công thức tổng quát là (C6H12O6)n.Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều
có cấu tạo từ amylase và amylopectin ( Meyer, 1940 ). Các loại tinh bột đều có
20-30% amylase và 70-80% amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem
là chất dự trữ năng lượng quan trọng.
-Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200-
1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành
một mạch xoắn dài không phân nhánh.
-Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được
cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-
glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không
tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng ( 60-850C ) thì
tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột . Dưới tác dụng của enzyme

amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thủy
phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và đường
hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi
dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose.
-Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho
cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này
một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose. Carbohydrate
có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là
đường và tinh bột.
• Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ
thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò
quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, VSV, glucogen
được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các
vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside.
Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2
triệu-3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều
Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ.
Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan.
II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
II.1.Đặc tính của enzym α-amylase
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi
loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một
protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic
acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên
phân tử enzyme:
- α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
- Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir
1956;Fisher,Stein, 1960 ).
- Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
- Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.

-Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).
-α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham
gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt
động của enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn
tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của
các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó
sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt
độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca
trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các
kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như :Li+, Na+, Cr3+,
Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase.
Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau
( g/100 g protein ): alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9, leucine= 8,3;
Isoleucine= 5,2; prolin= 4,2, phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan=
4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7, cystein + cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9;
amide= 1,5 ( Akabori et amiloza, 1954 ). Không giống các α-amylase khác,
amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose
này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol
enzyme ( Akabori et amiloza, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ,
song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm
hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme.
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương
tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối
với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) . Fenikxova và
Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân
theo sơ đồ sau:
◊ G4+G1; G6◊G5 G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít )
α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của
amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân

nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân cắt
tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh.
Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm
sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ α-amylase
VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men.
Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và
maltose có thể lên tới 84-87%.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8
( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH
tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ
Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích
cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của
Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn
Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau
15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực
của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova,
Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH=
5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-
2,8.Ở 0oC và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác
nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác
động nhiệt. . Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở
70OC( Kozmina, 1991 ).
Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác
động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của
nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. Ở 500C trong 2 giờ, α-
amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ).
II.2. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase

α-amylase ( 1,4-α-glucan-glucanhydrolase ). α-amylase từ các nguồn khác
nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách các liên
kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc
glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase
không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song
với tốc đột rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn.
+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của
hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ).
+ Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với
iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới
disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị
phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vì vậy, người
ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc
glucopiranose 1 ).
+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và
maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân
của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên
amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-
1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác
dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và
19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông
thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử
thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao
của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại

amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide
Amylase oligosacharide poliglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
III.Lịch sử phát hiện eznym
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá
trình lên men.
Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của
mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ
thường.
Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm ở dạng dung dịch và lịch sử
enzyme học thực sự được xem như bắt đầu từ đây.
Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và
Pessoz đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có
thể tách được ở dạng bột.
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại
mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa.
Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết
tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hóa. Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis
- phân cắt) là do Payen và Persoz dùng để gọi enzyme lúc bấy giờ.
Phần II: Phân lập, bảo quản giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus
Oryzae
Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá
trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản
chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và
phương diện thì khác nhau hoàn toàn.

Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của
VSV. Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự
nhiên. Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất
phức tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình
lên men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng.
Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm
kém không đồng nhất.
Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập
giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học,
quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản
phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn
giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng
sản phẩm được cải thiện .
I.Vai trò của giống trong công nghệ enzyme
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
- Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy
- Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt tính
enzyme)
- Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất
- Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm
Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV
II.Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được
sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công
nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó
là:
- Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có
số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình
trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng
nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV

cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác.
Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản
phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.
- Giống phải cho năng suất sinh học cao.
- Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong
điều kiện sản xuất công nghiệp.
- Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại
địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.
- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng
tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.
- Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản.
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men
công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết.
III. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Condium of Aspergillus oryzae
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes
( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi
rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia
sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình
thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh
sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể
nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là
bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là
những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào
tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu
vàng lục hay màu vàng hoa cau…
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại
bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên

liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa
sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có
khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc.
Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận
lợi sẽ mọc thành mốc mới.
IV.Qúa trình phân lập giống VSV
VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi
có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ,
những nơi nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ
thế người, động vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ
cao. VSV có khả năng thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ
khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh
khắc nghiệt nhất.
Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3
cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập
cho phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng
biệt. Sau đây là 1 số ưu điểm:
IV.1.Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
-Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì
cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa
nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều
này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất
công nghiệp ) với một loại enzyme thật sự mạnh.
-Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng
loạt các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên
VSV bắt buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn.

-Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác
biệt đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều
kiện tự nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã quá
quen thuộc với sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng ta
đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường
cố định, đòi hỏi các loài VSV giống phải có một thời gian thích nghi với điều
kiện sản xuất công nghiệp. Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản
xuất công nghiệp là điều rất cần thiết.
-Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập
trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và đặc điểm này
để chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng
hợp enzyme mà ta cần.
Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease cao, ta
phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập
VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều tinh
bột trong tự nhiên.
-Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV
trong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến. Những
đột biến thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ hai là
nhiều đột biến tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao. Việc
tìm ra những đột biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành. Và
một lợi điểm nữa là, những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững. Rất
thích hợp để đưa vào sản xuất ở qui mô công nghiệp.
IV.2. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
-Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với
điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua
giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm.
-Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã
được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh
hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.

-Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch
nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng
thu nhận được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao.
IV.3. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất
nhiều tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị
thoái hoá. Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những
kết quả tốt.
V.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay
có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là
giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo
chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả
đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí
nghiệm.
Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt
lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai
tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao
nyclon và mang về phòng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm phân lập:
Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây
Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất
vô trùng sau đó đảo trộn mẫu.
Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm
khác có chứa 90ml nước cất vô trùng.
Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo.
Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm
mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar).

Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở
nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày.
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện
những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc.
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có
tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.
Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch
nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể
dự trữ trong máy làm đông.
-Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).
Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền
phù.
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa
môi trường sinh trưởng của nấm.
KH2PO4 1,4 MgSO4.7H2O 0,1
NH4NO3 10 FeSO4.7H2O 0,01 PH = 6,5
KCl 0,5 hồ tinh bột 20
Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi
Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó
đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi
nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ,
để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo
quản thích hợp.
VI. Phương pháp bảo quản giống vsv
Mục đích của bảo quản giống VSV dùng trong sản xuất enzym là đảm bảo
tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzym và tính ổn định của hoạt tính
enzym. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như sau:
VI.1. Cấy truyền và bảo quản lạnh
Phương pháp dựa trên nguyên tắt là VSV sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất

trong điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian này
VSV có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzym.
Cách thực hiện: Ống giống VSV được cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm có môi
trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống dùng cho sản
xuất hoặc nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản.Có thể làm thêm hai ống
để tránh sai sót do thao tác đối với những người mới bắt đầu làm công tác bảo
quản giống.
Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh từ
4-70C. Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác này được
thực hiện liên tục.
VI.2.Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát
Phương pháp dựa trên nguyên tắt: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp,
vsv có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzym trong thời gian
dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc Asp.
oryzae.
Trước khi sử dụng , đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5%. Asp.
oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất hoặc
cát đã được làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao, hàn kín và
bảo quản ở nhiệt độ thường.
VI.3.Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc
Phương pháp dựa trên nguyên tắt bào tử nấm mốc được giữ trong hạt ngũ
cốc đã xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzym
trong một thời gian dài.
Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống ống
nấm mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều bào
tử. Bào tử cùng thành phần môi trường được sấy khô ở nhiệt độ < 50oC cho
đến khi độ ẩm < 8%, đưa vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường.
Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase
I. Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt
Thiết kế công nghệ:

Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo
phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không
chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận
kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống.
I.1.Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát
triển trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề
mặt là:
- Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức
tạp.
- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều
so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích
tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại.
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV,
enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận
hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường
đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ
cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ
hoàn toàn được an toàn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc
phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận
thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong
phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng
hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích.
I.1.1.Môi trường lỏng
Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành
khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây,
VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí,

tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ
sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong
sinh khối VSV.
Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay:
Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy
bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm,
chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho
thuận tiện trong thao tác.
Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao
môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất
dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu
thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao.
Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy
có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.
I.1.2.Môi trường đặc
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme,
người ta thường sử dụng môi trường đặc . Để tăng khả năng xâm nhập của
không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt
ngũ cốc để làm môi trường.
Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất
dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại
bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn
các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV.
VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn
( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các
hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có
độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi
trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có
độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người
ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý.

Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme,
người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện
thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy
bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc
Asp.oryzae.
I.2.Qui trình sản xuất nấm mốc giống
I.2.1Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống
Gạo nếp:Nước 14% ,Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và protein 8,2% trong đó
Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein(oryzaine)và glubuline ngoài ra còn một
ít lẫn Cozine và Prolamin.
Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và
hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một
số vitamin như B1,B2,B6,PP và E.
Gạo tẻ:Nước 13,84%; Glucid 77,55%; Protein 7,35%; Lipid 0,52%; cellulose
0,18% và muối khoáng :0,54%.
Bột Mì:Nước 11,6%; Glucid 72%; Lipid 4,8%,Protein 9%; cellulose 1,5% và
muối khoáng 1,2%.
Bắp mảnh:Nước 11,4%; Glucid 78,9%; Lipid0,8%; Protein8,5%,cellulose
0,4% và muối khoáng 0,4%.
I.2.2.Chuẩn bị mốc giống
Nuôi cấy giồng bao gồm:
-Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm
-Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ)
-Trên sàng, khay (nhân giống lớn)
I.2.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng
Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển
những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác.Yêu cầu
ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một
loài VSV nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh
dưỡng.

I.2.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác
Cách làm môi trường trong bình tam giác:
Môi trường gạo:gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt cơm chín
đều không qúa nhão và không qúa khô.Độ ẩm khoảng 45% để nguội bớp rời
thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm. Đậy nút
bình tam giác bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng ở P = 1atm trong vòng
30-45 phút.
Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho nước
vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho
ngấm nước đều. Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày 1cm. Đậy
nút bình bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở P =
1atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục.
Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau
đó làm tương tự như đối với ngô mảnh.
Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng.
Sau khi chuẩn bị môi ttrường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm
mốc. Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống
nghiệm. Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời
cấy chuyển chúng sang bình tam giác. Trung bình cứ một ống nghiệm có thể
cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân bố
đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng.
Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được. Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là
làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ. Trường hợp nào thấy bình bị
nhiễm thì phải loại bỏ ngay.
I.2.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay
Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô
mảnh có kích thước 0,2-0,5mm. Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng
so với ngô nếu hấp dưới áp lực cao. Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô
ngấm nước đều rồi hấp chín. Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với
thời gian hấp cám hay gạo. Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không

được quá bết hoặc quá khô. Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa.
Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội nhanh.
Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi và
dùng quạt thổi. Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình
tam giác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn.
Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m). Đặt ở
nhiệt độ 30-320C, độ ẩm 85-100%. Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi
trường lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi
dài. Lúc này cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ
môi trường không vượt quá 360C. Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng
10-14 giờ sau khi trộn giống. Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường
bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình
thành bào tử của nấm mốc.
Thời gian nuôi mốc giống trên khay thường vào khoảng 60 giờ. Nếu thấy hình
thành bào tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ. Mốc giống khi lấy ra
thường có độ ẩm 32-35 % có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản
xuất. Nếu không dùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng
dần hoặc là cung cấp giống cho các nơi sản xuất. Nhiệt độ phòng sấy không
được quá 400C. Các bao mốc giống cần được bảo quản nơi thoáng, mát ( có
thể bảo quản lạnh 4-50C ) tránh ánh nắng. Thời gian bảo quản tùy điều kiện
có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn.
I.2.3.Qui trình sản xuất
II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase
II.1. Nguyên liệu
Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa
dạng và phong phú.Ví dụ tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô (bắp), sắn, …
Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần
phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần
được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm. Đây là một lợi thế
rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng để có giá thành

thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ
tìm:
+Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo:
Thành phần dinh dưỡng Đơn vị tính Hàm lượng/100g
Protein g 6
Tinh bột g 82
Lipid (tổng số) g 0,8
Cellulse g 0,6
Nước g 10,2
Năng lượng kcal 361
(Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan,1999)
- Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài
ra còn cólẫn ít : cozine và prolamin. Lượng protein thoái hoá và biến tính dần
trong quá trình bảo quản.
- Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột
chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P,K,Mg,…Ngoài ra
còn có một số Vitamin:B1, B2, B6, PP, H, C, E và carotenoid.
+Thành phần dinh dưỡng của ngô:
Thành phần dinh dưỡng /100g Bắp nếp Bắp ngọt
Protein 9,1 12,9
Tinh bột 72,8 69,3
Lipid(tổng số) 2,2 3,9
Cellulose 1,8 2,9
Nước 11,2 9,5
Khoáng 2,9 1,5
(Cortez và Wild-Altamirano,1972)
Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có
nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các
loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được
sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết

cho VSV phát triển. Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất
vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo
lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu.
Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta
thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ
VSV. Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên
những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường.
Chính vì thế ta thấy rằng nấm mốc Asp. oryzae không chỉ phát triển trên bề
mặt môi trường mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường. Hay
nói cách khác, chủng nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai
pha rắn và pha khí của môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng
phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa
của quá trình lên men bề mặt.
+Thành phần dinh dưỡng của sắn(khoai mì):
Sắn là loại củ chứa nhiều tinh bột, rất thích hợp là nguồn cơ chất cảm ứng
cho quá trình tổng hợp enzym amylase ở nấm mốc Asp.oryzae. Củ sắn gồm
ba phần chính: vỏ, thịt củ và lõi. Ngoài ra còn có cuống và rễ củ.
-Vỏ gồm hai phần: Vỏ gỗ ở bên ngoài, cấu tạo chủ yếu là cellulose, thường
chiếm khoảng 1,5-2% khối lượng củ, vỏ cùi cũng cấu tạo từ cellulose nhưng
trong vỏ cùi còn có mủ sắn là các polyphenol, chiếm tới 85-90% polyphenol
của củ sắn .
-Thịt chứa nhiều tinh bột, ít protein và một lượng dầu, lượng polyphenol ở
đây có khoảng 10-15%, nhưng các polyphenol gây trở ngại khi chế biến, đặt
biệt là để sắn chảy mủ sẽ làm cho bột sắn biến màu, thay đổi mùi vị khó ăn
trực tiếp khi luộc, khó thoát nước khi sấy hay phơi khô sắn lát hay săn bột.
-Thành phần hoá học tươi của sắn: Tinh bột:20-34%; protein: 0,8-1,2%; chất
béo: 0,3-0,4%; cellulose: 1-3,1%; chất tro: 0.54%; polyphenol: 0,1-0,3%; và
nước: 60-74,2% .
II.2. Qui trình công nghệ
Thuyết minh qui trình:

Nguyên liệu: Trong phương pháp lên men bề mặt, cấu trúc chính là cám mì,
cám gạo. Hai loại này là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy
nhất của môi trường để nuôi nấm không cần bổ xung thêm chất khác nữa.
Tuy nhiên do là phế liệu của công nghệ xay xát, nhưng làm cũng tương đối
đắt tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi nấm, các chất dinh dưỡng không được
sử dụng hết, vì thế có thể thay thế hoặc pha trộn thêm một số cấu tử rẻ tiền
hơn. Mặt khác cấu tử bổ sung vào (trấu, mạt cưa,…) để làm tăng độ xốp giúp
cho hệ sợi nấm phát triển tốt hơn tận dụng tối đa nguồn cơ chất để sinh ra
hoạt lực enzyme cao nhất. Đặc biệt chú ý, cám không được chứa tinh bột dưới
20-30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không hôi
mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%.
Hấp thanh trùng: Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên
cần phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh
trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi
1-1,5 atm trong thời gian 45-60 phút. Để thuận lợi cho việc thanh trùng có
hiệu quả, cũng như tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển, trước khi thanh
trùng, người ta thường dùng HCl hay H2SO4 để điều chỉnh pH môi trường.
Sau khi thanh trùng môi trường được làm nguội người ta bắt đầu nuôi cấy để
thu nhận enzyme.
Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào
tử vào môi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ, giống mốc có thể
nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay tại các phân xưởng nhân giống hoặc là
giống thương phẩm có bán ở nơi cung cấp giống. Các loại giống này thường
chứa nhiêu bào tử. Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển
thành tế bào nấm mốcvà tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn.Tỷ lệ giống
đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5-20% so với khối lượng của môi
trường.
Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các
khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những
giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông

thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm
không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ
thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường
bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh
hưởng đến toàn bộ khối môi trường.
Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn
phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như
phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy.
Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
-Nhiệt độ tăng rất chậm.
-Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
-Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
-Khối môi trường còn rời rạc.
-Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối
không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm
với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những
thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm
bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng
chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường.
-Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng
xám bằng mắt thường.
-Môi trường được kết lại khá chặt
-Độ ẩm môi trường giảm dần
-Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C.

-Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.
-Enzyme amylase được tổng hợp mạnh.
-Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn
này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng
29-300C là tốt nhất.
Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay
đổi cơ bản như sau:
-Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ
chậm lại.
-Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi
trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt
dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do
đó luợng enzym amylase tạo ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định
thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết.
Thu nhận sản phẩm:
Kết thúc qúa trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym amylase, chế
phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra,
chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi
trường).
Để đảm bảo cho chế phẩm enzym thô α-amylase không bị mất hoạt tính
nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết
bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không- có thể xem ở phần phụ lục).
Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để
đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-
400C. Enzym α-amylase ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên
đến 60-70 độ C.
Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần
phải qúa trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến
hành làm sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành
như sau:

-Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích
của qúa trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần
của chế phẩm thô.Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa
thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.Phần lớn enzym amylase
ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào
thành phần môi trường.Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành
phần này dễ dàng hơn.
-Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong
trường hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là
những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma
sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy
khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV.
Trích ly:Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym α-
amylase. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta
thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym
thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã
thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột
thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa
nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là
làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này.
Qúa trình kết tủa enzym α-amylase: Để làm việc trên người ta tiến hành kết
tủa enzym nhờ những tác nhân gây tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym,
người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm
kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô
và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất
làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện
tượng biến tính.
Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng

như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn
hoặc sulfat amon.
Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ,
sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7OC) theo thời gian,
các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và
lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W).
Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản
người ta sấy kết tủa enzyn α-amylase ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng
đạt 5-8% W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương – có thể xem ở
phần phụ lục).
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym α-amylase ở dạng kết tủa vẫn hoàn
toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym
amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzym α- amylase này còn chứa hoạt tính
protase có tính acid và cellulose do đó muốn thu nhận được enzym có độ tinh
khiết cao hơn ta phải tinh chế enzym α-amylase kết tủa bằng các qúa trình lọc
Gel hay sử dụng phương pháp cố định enzym ,…
II.3. Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae
II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm
Khi nuôi VSV tạo amylase có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá