CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA docx

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
- Sau khi nuôi cấy trên các môi
trường chọn lọc, môi trường phân
biệt  thu được các khuẩn lạc
đơn thuần khiết bằng các kỹ thuật
phân lập.
- Chủng thuần là yêu cầu cho việc
định danh các vi sinh vật.

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Việc định danh:
- Các đặc điểm về hình thái
- Các phản ứng sinh hóa thực hiện
bởi các chủng vi sinh vật.



Kết quả:

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím

Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ.


CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Có ba cách tiếp cận để thực hiện các
thử nghiệm sinh hóa dùng cho
mục đích định danh
1) Cách truyền thống
2) Sử dụng các bộ kit

3) Dùng thiết bị tự động.

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Các kết quả thử nghiệm sinh hóa của hàng
trăm loài vi sinh vật được tổng hợp thành
những Bảng sinh hóa định danh vi sinh
vật.

Bảng bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc
trưng nhất để phân biệt các loài vi sinh vật
gây bệnh thường gặp. Mỗi đặc điểm sinh
hóa được biểu thị một trị số là tỷ lệ phần
trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết quả
dương tính theo thống kê ở một loài vi
sinh vật.

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Các đặc điểm sinh hóa có trị số dao động ở mức
50% không có giá trị trong việc định danh.

Trong thực tế kiểm nghiệm, các kết quả thử
nghiệm sinh hóa biểu thị qui ước bằng các ký
hiệu như:

(+) : dương tính

(-) : âm tính


(+/-) : khoảng trên 70% là dương tính

(-/+) : khoảng trên 70% là âm tính.

Trong các thử nghiệm này, để đảm bảo chính
xác trong việc đọc kết quả, người ta thường thực
hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng.

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.1.Nguyên tắc
- Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện
chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome
đều có enzyme catalase, có khả năng biến
dưỡng năng lượng theo phương thức hô
hấp với oxy tạo ra H
2
O
2
.
- Catalase thủy phân H
2
O
2
thành H
2
O và O
2
,
ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc tính cao

này trong tế bào.
- Sự thủy phân H
2
O
2
sẽ giải phóng O
2
được
ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase


1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành
Hóa chất sử dụng:
- Dung dịch H
2
O
2
30% được giữ trong tủ
lạnh với chai màu nâu tránh ánh sáng
- Dung dịch đệm phosphate pH 7,0.
Có thể thực hiện thử nghiệm catalase
bằng một trong những phương pháp sau:
- Thử trên phiến kính (lame)
- Thử trong ống thạch nghiêng
- Thử bằng ống mao dẫn

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành
- Thử trên phiến kính (lame)
- Thử trong ống thạch nghiêng
- Thử bằng ống mao dẫn

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành
- Thử trên phiến kính (lame): dùng que cấy lấy
một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên một
phiến kính sạch . Nhỏ một giọt H
2
O
2
30% lên sinh
khối vi sinh vật trên phiến kính. Ghi nhận sự sủi bọt
nếu có. Hoặc có thể bằng cách chuyển một ít sinh
khối của khuẩn lạc lên phiến kính, nhỏ một giọt H
2
O
2

0,5% rồi đậy lại bằng một lá kính (lamelle). Ghi nhận
nếu có sự xuất hiện của bọt khí bị giữ lại giữa phiến
kính và lá kính.

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành
- Thử trong ống thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp
1ml H
2
O
2
30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt
thạch nghiêng. Ghi nhận nếu có sự sủi bọt quanh
sinh khối.

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.2.Tiến hành
- Thử bằng ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn
thu lấy dung dịch H
2
O
2
30%, sau đó chấm đầu ống
mao dẫn này vào tâm khuẩn lạc cần thử trên môi
trường. Ghi nhận nếu có sự sủi bọt khí trong ống
mao dẫn. Phương pháp này có ưu điểm là thử được
trên từng khuẩn lạc nên có thể thực hiện trên các
khuẩn lạc của chủng chưa làm thuần.

1.Thử nghiệm bằng phép thử catalase

1.3.Đọc kết quả
- Dương tính (+) : khi có hiện tượng sủi bọt khí do khí O
2

được tạo ra.
- Âm tính (-) : khi không có hiện tượng sủi bọt khí.

Hình1: Phản ứng sủi bọt khi tiếp xúc với dung dịch H
2
O
2
của vi khuẩn có
catalase dương tính.

2.Thử nghiệm bằng Urease

2.1.Nguyên tắc
- Xác định khả năng của vi sinh vật tổng
hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân
urea tạo ra 2 nguyên tử NH
3
và CO
2
làm
tăng pH của môi trường và có thể được
theo dõi qua sự thay đổi màu của chất chỉ
thị pH.
- Thử nghiệm urease là đặc trưng cho các
loài Proteus spp. Và thường được dùng để
phân biệt các dạng Proteus với các thành
viên khác của Enterobacteriaceae.

2.Thử nghiệm bằng urease

Thử nghiệm Urease được thực hiện trên 2 môi
trường:
- Môi trường urea lỏng Rustigian-Stuart’s
Urease Broth
- Môi trường Christensen Urea

2.Thử nghiệm bằng Urease

2.2.Tiến hành
- Dùng que cấy vòng cấy một lượng sinh
khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần lên bề
mặt các ống môi trường thạch nghiêng
- Ủ ở 37
0
C trong 24 giờ.

2.Thử nghiệm bằng Urease

2.3.Đọc kết quả
* Môi trường urea lỏng Rustigian-
Stuart’s Urease Broth:
-
Dương tính (+): Màu đỏ tím trong khắp
môi trường
- Âm tính (-) : Môi trường không có sự
đổi màu (màu vàng cam)

2.Thử nghiệm bằng Urease

2.3.Đọc kết quả
* Môi trường Christensen Urea:
- Dương tính (+): Màu đỏ tím trên bề mặt môi trường
thạch nghiêng
+ + + + : toàn bộ thạch đổi màu
+ + + : chỉ mặt thạch đổi màu
+ : mặt thạch ở đỉnh đổi màu, phần
môi trường còn lại không đổi màu
(+) nhanh: màu đổi trong vòng 1-6 giờ
(+) chậm : màu đổi trong vòng 24 giờ đến 6 ngày ủ
hoặc lâu hơn