Nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi rút viêm não Nhật Bản, xác định vai trò gây bệnh của vi rút viêm não Nhật Bản genotyp 1

BỘ Y TẾ




BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

TÊN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VIRUS VIÊM
NÃO NHẬT BẢN (VNNB), XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY BỆNH
CỦA VIRUS VNNB GENOTYP 1

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: pgs.TS. Phan ThÞ Ngµ
C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi: ViÖn vÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng





7502
03/9/2009

HÀ NỘI - 2008



BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ


TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VIRUS VIÊM NÃO
NHẬT BẢN (VNNB), XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY BỆNH CỦA VIRUS VNNB
GENOTYP 1


Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. PHAN THỊ NGÀ
Cơ quan chủ trì đề tài: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG
Cấp quản lý: BỘ Y TẾ

M· sè ®Ò tµi (nÕu cã):
Thời gian thực hiện: từ tháng 8 năm 2006 đến tháng 7 năm 2008
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng
Trong đó kinh phí sự nghiệp khoa học: 300 triệu đồng
Nguồn khác nếu có




NĂM 2008

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1. Tên đề tài: Nghiên cúu dịch tễ học phân tử virus viêm não Nhật Bản
(VNNB), xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1.

2. Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. PHAN THỊ NGÀ

3. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương

4. Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế

5. Thư ký đề tài: CN. Nguyễ
n Viết Hoàng

6. Phó chủ nhiệm đề tài hoặc ban chủ nhiệm đề tài (nếu có):

7. Danh sách những người thực hiện chính:

- PGS. TS. Phan Thị Ngà
- BS. Đỗ Phương Loan
- CN. Nguyễn Việt Hoàng
- KS. Bùi Minh Trang
- KTV. Lê Thị Hiền Thu
- Ths. Tống Thị Hà
- Ths. Hoàng Minh Đức
- TS. Nguyễn Thị Thuỳ Dương
- BS. Nguyễ
n Văn Hoà
- BS. Hoàng Anh Vường

- TS. Vũ Thị Quế Hương
- Ths. Huỳnh Thị Kim Loan
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh D
ịch tễ Trung ương
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương
Quân Y viện 108
Viện Vệ Sinh Dịch tễ Tây Nguyên
Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh
Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

8. Các đề tài nhánh (đề mục) của đề tài (nếu có):
(a) Đề tài nhánh 1 (đề mục 1)
- Tên đề tài nhánh:
- Chủ nhiệm đề tài nhánh:
(b): Đề tài nhánh 2
- Tên đề tài nhánh:
- Chủ nhiệm đề tài nhánh:

9. Thời gian thực hiệ
n đề tài từ tháng 8 năm 2006 đến tháng 12 năm 2008.


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

a.a.
Arbo
ADN
ARN
cDNA
ELISA

E-MEM
E
kd
NS
PFU
RT-PCR

HCNC
Tế bào BHK
21


Tế bào Vero
VNNB
Axit amin (amino acide)
Arthropod borne (mang bởi côn trùng tiết túc)
Desoxyribonucleic Acid - DNA (Axit desoxyribonucleic)
Ribonucleic Acid - RNA (Axit Ribonucleic)
Complement DNA (ADN bổ trợ)
Enzym Linked Immunosorbent Assay
(Kỹ thuật miễn dịch enzym)
Eagle Minimum Essential Medium

Envelope (vỏ bao)
Kilodalton
Non-structural protein - protein không cấu trúc
Plaque forming unit (đơn vị tạo đám hoại tử = 1 virus)
Reverse Transcriptase polymerase chain reaction
(Phản ứng chuỗi sao chép ngược)
Hội chứng não cấp
Tế bào có nguồn gốc thận chuột Hamster mới đẻ
(Baby Hamster Kidney cells)
Tế bào có nguồn gốc từ thận khỉ xanh châu Phi
Viêm não Nhật Bản




MỤC LỤC

PHẦN A: Báo cáo tóm tắt
1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu
2. Bản tự đánh giá kết quả nghiên cứu của đề tài
PHẦN B: Báo cáo chi tiết
Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tóm lược những nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
Chương 2. TỔNG QUAN
2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài.
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề
tài.
Chương 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thiết kế nghiên cứu
3.2. Chọn mẫu, đối tượng nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu:
Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Chương 5. BÀN LUẬN
Chương 6. KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC: - Bảng xác nhận chi tiêu tài chính
- Minh chứng đào tạo (văn bằng tốt nghiệp đại học)
- Minh chứng về kế
t quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen E

1
5


7
9
9

10
21

25
25
27
43
59
70

71
72
78
79
của một số chủng virus VNNB genotyp 1

- Minh chứng về các bài báo khoa học liên quan đến đề tài

80

82



1
PHẦN A
BÁO CÁO TÓM TẮT

1.
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1.1. Mục đích nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu thực hiện nhằm đạt được các mục đích sau:
- Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB ở một số vùng của Việt Nam.
- Xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 bằng kỹ thuật sinh
học phân tử và mô hình thực nghiệm trên động vật cảm thụ.

1.2. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Để đạt đượ
c mục đích nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kỹ
thuật phân lập virus VNNB từ muỗi, lợn, người. Kỹ thuật sinh học phân tử

như RT-PCR, Sequencing (giải trình tự gen) Các phần mềm sinh học được
ứng dụng phân tích kết quả của các kỹ thuật giải trình tự gen, so sánh cặp và
sắp xếp đa trình tự, phân tích sự biến đổi của trình tự acid amine của vùng
gen E; xây dựng cây phát sinh loài và phần m
ềm xây dựng bản đồ dịch tễ
học các genotyp virus VNNB ở Việt Nam trong các năm 1988 – 2007 để chỉ
ra mối liên quan giữa các genotyp của virus VNNB.
Cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu là 34 chủng virus VNNB phân lập từ
bệnh nhân, từ muỗi, lợn trong các năm 1988 - 2007.
1.3. Các tiêu chí đánh giá kết quả nghiên cứu
Đánh giá kết quả nghiên cứu của đề tài dựa trên các tiêu chí sau:
- Phân lập được các chủng virus VNNB từ mẫu bệnh phẩm của bệ
nh
nhân có hội chứng não cấp bằng tế bào Aedes albopictus dòng C
6
/36. Kết
quả định loại virus VNNB được xác định bằng kỹ thuật ELISA Sandwich;

2
- Các chủng virus VNNB được khuếch đại vùng gen E bằng kỹ thuật
RT-PCR trực tiếp. Sản phẩm của kỹ thuật PCR được sử dụng để tinh sạch,
làm khuôn để tổng hợp các đoạn PCR cho giải trình từ gen bằng các mồi
xuôi và mồi ngược được thiết kế trong vùng gen E đặc hiệu với virus VNNB
để xác định toàn bộ trình tự vùng gen E dài 1500 nucleotide.
- Xác định đặc điểm di truyền của virus VNNB qua kết qu
ả giải trình
tự gen và phân tích đoạn gen E (Envelope), trên cơ sở đó xây dựng cây phát
sinh loài của virus VNNB, vẽ bản đồ dịch tễ về sự phân bố virus VNNB
genotyp 1 và genotyp 3 ở Việt Nam;
- Khẳng định virus VNNB genotyp 1 có khả năng gây bệnh bằng kỹ

thuật sinh học phân tử và thực nghiệm trên động vật cảm nhiễm.

1.4. Vật liêu và phương pháp
1.4.1. Vật liệu
Trong nghiên cứu này, sinh phẩm và trang thiết bị cần thiế
t cho
nghiên cứu được cung cấp đầy đủ. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
được thực hiện theo quy trình chuẩn thức của phòng thí nghiệm và theo
hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm.
1.4.2. Phương pháp
Phần mềm tin sinh học DNA Star-Lasegene (Madison, Wisconsin,
USA) và MEGA 4.0 (USA) được ứng dụng để nghiên cứu, đánh giá và phân
tích các đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử các chủng virus VNNB. Trình
từ vùng gen E dài 1500 nucleotide của các chủng virus thực hiệ
n trong
nghiên cứu này và các chủng là đại diện cho các genotyp khác được lấy
trong ngân hàng gen được so sánh cặp và sắp xếp đa trình tự theo chương
trình ClustalW. Cây phát sinh loài được vẽ bằng phương pháp Neibour-
Joining (Saito&Nei 1987) với giá trị để tính phần trăm sự lặp lại (giá trị tin

3
cậy) tại mỗi nhánh phát sinh là 1000 lần. Chọn giá trị ngưỡng là 12 % khác
nhau về số nucleotide để phân chia các genotyp virus VNNB. Cây phát sinh
loài là cơ sở để xác định mối quan hệ về mặt di truyền của các chủng virus
VNNB. Tính tương đồng và không tương đồng về trình tự nucleotide của
các chủng virus VNNB được tính bằng phần mềm DNAStar-Lasegene.
Phần mềm vẽ bản đồ HealthMap 8.1 được sử dụng để xây dựng bản
đồ về sự
lưu hành các genotyp virus VNNB khác nhau ở mức độ địa giới
hành chính phân chia cấp độ tỉnh. Ngoài ra, có sử dụng các thuật toán thống

kê sử dụng trong nghiên cứu: Excel, SPSS; các thuật toán thống kê sinh học
chuyên sâu sử dụng trong nghiên cứu UPGMA, Neibour-Joining.


1.5. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã xác định:
- Dịch tễ phân tử virus VNNB ở một số vùng của Việt Nam dựa trên
kết quả giải trình tự và phân tích vùng gen E của 34 chủng virus VNNB
phân lập trong các n
ăm 1988 – 2007 đã khẳng định: Virus VNNB genotyp 1
lưu hành ở cả bốn miền Bắc, Trung, Nam và Tây Nguyên từ các mẫu phân
lập virus có nguồn gốc là muỗi, lợn trong các năm 2001 – 2007; xác định có
sự lưu hành đồng thời cả virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 ở Việt Nam
trong các năm từ năm 1990 cho đến 2007.
- Vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 được khẳng định bằng
kỹ thuật sinh học phân tử với 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân
trong các năm 1988 – 2007: (1) Kết qu
ả xác định có 1 chủng virus VNNB
phân lập từ bệnh nhân ký hiệu 90VN70 được xác định thuộc genotyp 1,
chiếm tỷ lệ rất thấp 1/27 (3,7 %); có 26 chủng phân lập từ bệnh nhân thuộc
genotyp 3, chiếm tỷ lệ rất cao trong số các chủng phân lập từ người 26/27
(96,3 %). Trên động vật cảm thụ (chuột Swiss trằng), chủng virus 90VN70

4
gây ốm, liệt chuột ổ và chuột 11 – 13 gam sau 3 - 4 ngày gây nhiêm, khẳng
định độc lực và tính hướng thần kinh của virus VNNB genotyp 1.

1.6. Các kết quả khác liên quan với khoa học, kỹ thuật và kinh tế.
- Đã đào tạo được 01 cử nhân sinh học có nghiên cứu liên quan đến đề tài.
- Có năm bài báo liên quan đến đề tài đã được công bố trên tạp chí quốc gia
và quốc tế.

- Tham dự ba hội nghị khoa học trong nước và quốc tế.
- Đă
ng ký trình tự vùng gen E của một số chủng vi rút VNNB genotyp 1 và
genotyp 3 trên ngân hàng gen quốc tế.
- Đã áp dụng và chuẩn hoá được một số kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ
thuật RT-PCR, kỹ thuật tinh sạch ADN, kỹ thuật giải trình tự gen trong
nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus VNNB.

1.7. Từ kết quả nghiên cứu của đề tài có thể đưa ra kết luận sau
- Đã xây dựng được cây phát sinh loài và bản đồ
dịch tễ sự lưu hành của
virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 dựa trên trình tự vùng gen E của 34
chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân, muỗi, lợn, trong các năm 1988 –
2007. Xác định virus VNNB genotyp 1 lưu hành ở cả bốn miền Bắc, Trung,
Nam và Tây Nguyên ở muỗi, lợn trong các năm 2001 - 2007.
- Trong số 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân trong các năm 1988
– 2007, tỷ lệ phân lập được virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân chiếm tỷ lệ
rất thấp 3,7 % (1/27), phần lớn các chủ
ng phân lập từ bệnh nhân thuộc
genotyp 3, chiếm tỷ lệ rất cao 96,3 % (26/27). Xác định virus VNNB
genotyp 1 có độc lực và tính hướng thần kinh với động vật cảm thụ (chuột ổ
và chuột 11 – 13 gam).


5
2. BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
a. Tiến độ:
 Đúng tiến độ
 Rút ngắn thời gian nghiên cứu
Tổng số thời gian rút ngắn: 0 tháng

 Kéo dài thời gian nghiên cứu
Tổng số thời gian kéo dài 0 tháng
Lý do phải kéo dài

b. Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đưa ra
 Thực hiện đầy đủ các mụ
c tiêu đề ra
 Thực hiện được các mục tiêu nhưng không hoàn chỉnh
 Chỉ thực hiện một số mục tiêu đề ra
 Những mục tiêu không thực hiện được (ghi rõ)

c. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương
 Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong bản đề cương
 Chất lượ
ng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong bản đề cương
 Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạ
 Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả không đạt chất lượng.
 Tạo ra được một sản phẩm đạt chất lượng
 Những sản phẩm chưa th
ực hiện được (ghi rõ)




X

X





X








6
d. Đánh giá việc sử dụng kinh phí
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng.
Trong đó: Kinh phí sự nghiệp khoa học 300 triệu đồng
Kinh phí từ nguồn khác: không

Toàn bộ kinh phí đã thanh quyết toán: 299.470.000 đ
Chưa thanh quyết toán xong: 530.000 đ
Lý do (ghi rõ):

e. Các ý kiến đề xuất
Đề xuất về tài chính: Không
Đề xuất về quản lý khoa học: Không
Đề xuất liên quan đến đề tài:


1. Cầ
n xác định các loài muỗi là vec-tơ truyền virus mới phát hiện (virus
Banna) ở Việt Nam.

2. Cần giải mã toàn bộ vật liệu di truyền (genome) chủng virus VNNB
genotyp 1 phân lập từ bệnh nhân có ký hiệu 90VN70.








7
PHẦN B: BÁO CÁO CHI TIẾT

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. Tóm lược những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề
tài, tính cấp thiết cần nghiên cứu của đề tài:
Virus viêm não Nhật bản (VNNB) là nguyên nhân chính gây hội
chứng não cấp trong khu vực Châu Á và Tây Thái Bình Dương. Trước năm

2000, hàng năm ở Việt Nam có khoảng 2000 – 3000 trường hợp viêm não
virus, trong những năm 1995, xác định khoảng 67 % trẻ em bị viêm não do
virus là do virus VNNB. Nhưng gần đây, nhờ tăng c
ường sử dụng vắc-xin
VNNB để phòng bệnh, đã góp phần làm giảm số trường hợp viêm não virus,
chỉ có khoảng dưới 1500 trường hợp viêm não virus trong những năm gần
đây và trong số này còn có khoảng 10 – 35 % trẻ em bị VNNB, cho thấy khả
năng khống chế bệnh VNNB ở Việt Nam là rất khả thi [4,22,24].
Virus VNNB có 5 genotyp, sự phân bố và lưu hành của các genotyp
virus VNNB rất khác nhau tuỳ từng vùng địa lý. Trước những năm 1990,
virus VNNB genotyp 1 lưu hành chủ yếu ở Thái Lan, Campuchia. Nhưng từ
năm 1990 đến nay, phát hiện có sự mới xuất hiện của virus VNNB genotyp
1 ở một số nước như Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, miền Bắc Việt
Nam [1,2,32,42,63]. Tuy nhiên, phần lớn các chủng virus VNNB genotyp 1
được phân lập từ muỗi, lợn. Do vậy, virus VNNB genotyp 1 được cho là ít
có khả năng gây nhiễm cho người và chỉ thích ứng với muỗi và lợn. Chính
vì vậy, ở nhữ
ng nước lưu hành virus VNNB genotyp 1 như Thái Lan, cho
đến nay mới phân lập được 5 chủng virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân
trong các năm 1979 – 1984, còn các nước khác trong khu vực châu Á, cũng
chưa có công bố nào về việc phân lập được virus VNNB genotyp 1 từ bệnh

8
nhân sau những công bố về các chủng virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân
ở Thái Lan [42].

Nghiên cứu sự tiến hoá của virus VNNB trong công bố trước đây ở
Việt Nam sử dụng vùng gen PrM để phân tích các genotyp của virus VNNB,
đã xác định các chủng virus VNNB phân lập từ người bệnh, từ muỗi, từ lợn
trong những năm 1964 - 1988 thuộc genotyp 3 [23]. Nghiên cứu dịch tễ

phân tử sự lưu hành của virus VNNB trong những năm đầu thế
kỷ 21 đã xác
định có sự lưu hành của virus VNNB genotyp 1 ở lợn và muỗi ở miền Bắc
Việt Nam [42]. Nhưng cho đến nay, chưa có công bố phát hiện virus VNNB
genotyp 1 ở miền Nam, miền Trung và Tây Nguyên cũng như chưa phát
hiện được virus VNNB genotyp 1 từ người bệnh.
Trên thực tế, lựa chọn chủng cho sản xuất vắc-xin phòng bệnh, hoặc
chọn chủng để sản xuất kháng nguyên trong chẩn đoán huyết thanh họ
c
thường dựa vào kết quả phân tích dịch tễ học phân tử, chủng được lựa chọn
thường là chủng có cùng typ hoặc genotyp với chủng lưu hành của địa
phương. Đối với virus VNNB, dựa trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ phân tử
virus VNNB, xác định phần lớn các chủng virus VNNB genotyp 3 phân lập
từ người ở các vùng địa lý khác nhau của châu Á [12,13,21]. Do vậy, các
chủng virus VNNB thuộc nhóm genotyp 3 thường được lựa chọn
để làm
chủng sản xuất vắc-xin VNNB như chủng Nakayama, chủng Beijing và
chủng SA 14; hoặc để sản xuất kháng nguyên như các chủng Nakayama,
JaGa-01 và chủng Beijing. Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, với sự xuất
hiện genotyp mới virus VNNB ở một số vùng địa lý, như chủng virus
VNNB genotyp 1 ở một số nước châu Á, hoặc có sự mới xuất hiện virus
VNNB genotyp 1 và 2 ở miền Bắc nước Úc trong số các mẫu phân lập từ

9
muỗi (véc-tơ) truyền bệnh và từ lợn (ổ chứa virus), cho thấy sự cần thiết
nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB [18,24,32,34,36].
Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu dịch tễ học phân tử
virus viêm não Nhật Bản (VNNB), xác định vai trò gây bệnh của virus
VNNB genotyp 1”.

1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài:
Có sự xuất hiện của các genotyp mới của virus VNNB ở một số vùng
khác nhau ở Việt Nam.
Virus VNNB genotyp 1 có khả năng gây bệnh cho người.

1.3. Mục tiêu nghiên cứu:
- Xác định dịch tễ học phân tử virus VNNB ở một số vùng của Việt Nam.
- Xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 bằng kỹ thuật sinh
học phân tử và thực nghiệm trên động vật cảm thụ.













10
2. TỔNG QUAN

2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài
2.1.1. Tác nhân gây bệnh, véc-tơ, ổ chứa virus trong tự nhiên và sự lan
rộng của virus VNNB trên thế giới ở một số vùng địa lý.
2.1.1.1. Tác nhân gây bệnh
Virus VNNB, một virus Arbo do muỗi truyền gây bệnh viêm não cấp.

Theo bảng phân loại mới (thập kỷ 90) virus VNNB thuộc họ Flaviviridae, là
một trong 5 họ lớn của virus Arbo. Họ Flaviviridae gồm có 3 chi (Genera)
được phân loại dựa vào một trong nhữ
ng cơ sở hình thái học hoặc cấu trúc
vật liệu di truyền hoặc liên quan tính kháng nguyên, đó là các chi
Hepacivirus, chi Flavivirus và chi Pestivirus.
Chi Flavivirus được chia thành 7 phức hệ huyết thanh học, gần một
nửa trong số các virus này gây bệnh cho người. Những virus gây bệnh cho
người thuộc 1 trong 3 phức hệ: phức hệ Tây sông Nil, phức hệ Dengue và
phức hệ viêm não do ve; còn virus Sốt vàng chưa được xếp là một phức hệ
kháng nguyên, mặc dù nó là chủng đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu
c
ủa chi Flavivirus. Trên cơ sở phân loại bằng huyết thanh học, chi Flavivirus
được chia ra thành những phân nhóm nhỏ. Virus VNNB thuộc về phân
nhóm virus Tây sông Nil, cùng phân nhóm với các virus viêm não thung
lũng Murray, virus viêm não St. Loui. Cho đến nay, virus VNNB được xác
định chỉ có một typ huyết thanh duy nhất, nhưng có 5 genotyp [3,23,24].

Virus VNNB được xác định bằng kính hiển vi điện tử là hình cầu, đối
xứng hình khối, kích thước virus khoảng 40-50 nm, có vỏ bọc là màng lipit
kép. Virus VNNB có vật liệu di truyền là ARN sợi đơn dương, chứa toàn bộ
thông tin di truyền của virus, chi
ếm khoảng 6% trọng lượng của virion.

11
Chiều dài sợi ARN của virus VNNB xấp xỉ 11Kb, được cấu tạo bởi 10.976
nucleotid tương ứng 3.432 acid amin (a.a), mã hoá cho 10 protein gồm 3
protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc [21,38,43,51].
Protein cấu trúc (structural protein) bao gồm:
- Protein màng - Membrane (M) còn gọi là V

1
.
- Protein lõi - Nuleocapsid (C) còn gọi là V
2
.
- Protein vỏ bao - Envelop (E) còn gọi là V
3
. Có giả thiết rằng protein
vỏ bao đóng vai trò quan trọng cho sự xâm nhiễm của virus VNNB và
sự khác nhau về độc lực của virus VNNB trong tự nhiên.
Protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm 7 protein ký
hiệu: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.
- NS1 là glycoprotein rất kỵ nước.
- NS2a và NS2b kị nước.
- NS3 là protein đa chức năng giúp cho sự xâm nhiễm và nhân lên của
ARN trong tế bào nhiễm virus.




Hình 2.1. Mô hình cấu trúc gen của virus VNNB và sự phiên mã [16]

12
Đặc điểm của protein cấu trúc:
- Protein capsid (C) – protein lõi là protein hết sức cơ bản, trọng lượng
≈11kd. Protein C gấp vào trong một nhị hợp kết thành khối với mỗi
một đơn thể có chứa 4 hình xoắn alpha.
- Glycoprotein membrane (prM) – glycoprotein màng: glycoprotein
prM có trọng lượng ≈ 26 kd.
- Glycoprotein Envelope (E) – glycoprotein vỏ có trọng lượng ≈ 53 kd,

là protein chủ yếu trên bề mặt của virus VNNB, là những receptor kết
hợp trung gian và làm biến đổi màng t
ạo kháng thể trung hoà và
kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu.

Đặc điểm của protein không cấu trúc:
- Protein NS1 ≈ 46 kd, trong giai đoạn nhiễm virus, sự đáp ứng miễn
dịch dịch thể mạnh mẽ được hình thành để kháng lại protein này.
- Protein NS2A & NS2B: protein NS2A là rất nhỏ (≈ 22 kd) là protein
kỵ nước. Protein NS2B cũng rất nhỏ (≈ 14 kd).
- Protein NS3 rất lớn (≈ 70kd) là protein có nhiều chức n
ăng.
- Protein NS4A & NS4B rất nhỏ (16 kd & 27 kd, tương ứng), là protein
kỵ nước.
- Protein NS5 rất lớn (103kd), rất bền vững, là protein có nhiều chức
năng với enzym methyltransferase (MTase) và hoạt tính RdRP (RNA
dependent RNA polymerase).

Virus VNNB có kháng nguyên ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên
trung hoà đó là một glycoprotein trên bề mặt hạt virus (mã hoá bởi vùng gen
E), là kháng nguyên tạo kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu và kháng thể

13
trung hoà, nói một cách khác đây chính là kháng nguyên kích thích cơ thể
sinh kháng thể bảo vệ. Kháng nguyên kết hợp bổ thể: NS1 là một kháng
nguyên kết hợp bổ thể ở dạng hoà tan hoặc kết hợp với thành phần màng
nhưng không kết hợp với hạt virus (virion), nó đóng vai trò bảo vệ hạt virus.
Virus VNNB có tính kháng nguyên chung với những virus cùng chi virus
Flavi (Flavivirus genus). Bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu xác
định virus VNNB có phản ứng chéo rộ

ng với các virus trong phân nhóm
virus Tây sông Nil, với các virus Dengue trong phân nhóm virus Dengue.
Bằng phản ứng ELISA (MAC-ELISA) đã chứng minh virus VNNB có tính
kháng nguyên gần với những virus thuộc phân nhóm virus Tây sông Nil, ít
có phản ứng chéo với những virus thuộc phân nhóm Dengue [1,2,8,22,27].
Do vậy, để xác định vai trò gây bệnh của các genotyp virus VNNB không
thể dựa vào chẩn đoán huyết thanh học [1].
2.1.1.2. Sự thích ứng của virus VNNB trên động vật cảm thụ và trên tế bào
Virus VNNB thích ứng với một số động vật cảm thụ như chuột ổ, chu
ột
11 – 13 gam, chuột Hamster, phôi trứng 9 – 11 ngày tuổi. Đối với một số
loài muỗi, virus VNNB thích ứng và nhân lên ở một số loài muỗi như Aedes
albopictus, Toxrhynchites. Đối với các dòng tế bào nguyên phát tế bào phôi
gà, tế bào thường trực có nguồn gốc từ động vật có vú như tế bào Vero, tế
bào BHK
21
, hoặc có nguồn gốc muỗi như tế bào C
6
/36 là những dòng tế bào
nhậy cảm với virus VNNB [25,38]. Chính vì vậy, vắc xin VNNB đã được
nghiên cứu sản xuất từ não chuột gây nhiễm virus VNNB cho mục đích
phòng bệnh. Cho đến nay, vắc-xin VNNB được nghiên cứu sản xuất từ
nhiều nguồn khác nhau như từ não chuột, từ tế bào thường trực Vero
nhưng vắc-xin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột vẫn là vắc-xin được sử
dụng r
ộng rãi [24,57].


14
2.1.1.3. Véc-tơ, ổ chứa virus VNNB trong tự nhiên

Bệnh VNNB do muỗi mang virus truyền, bệnh chỉ xuất hiện ở người
khi có điều kiện sinh thái thích hợp, virus VNNB không truyền từ người
sang người qua muỗi đốt. Chu trình sinh thái của virus VNNB trong tự nhiên
là liên tục, đối với các vùng nhiệt đới bệnh VNNB xuất hiện rải rác quanh
năm, nhưng đối với những vùng ôn đới hoặc cận nhiệt đới thì dịch VNNB
thườ
ng xảy ra vào mùa hè. Một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến quá trình
xẩy ra dịch như mối quan hệ giữa véc-tơ và ổ chứa, mật độ véc-tơ, khả năng
truyền virus của véc-tơ, tập quán sinh hoạt của dân cư, việc sử dụng vắc-xin
phòng bệnh [3,5,10,11]. Nghiên cứu xác định ổ chứa virus VNNB là các loài
chim, muỗi và nhiều loài động vật máu nóng khác đặc biệt là lợn được coi là
vậ
t chủ khuếch đại mầm bệnh [3,5,41,67]. Chính vì vậy, virus VNNB lưu
hành trong tự nhiên ở động vật có xương sống hoang dại hoặc động vật nuôi
trong nhà và muỗi hút máu.

Cho đến nay, virus VNNB đã được phân lập từ khoảng 30 loài muỗi
thuộc 5 giống Culex, Anopheles, Aedes, Mansonia và Amergeres; trong đó
Culex (Cx), đặc biệt là Cx. Tritaeniorhynchus là véc-tơ chính trong việc
truyền bệnh. Virus VNNB thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi ở 27
0
C–
30
0
C, mỗi lần muỗi đốt có tới 100.000 MLD (liều chí tử tối thiểu) đối với
chuột nhắt. Nếu dưới 20
0
C sự nhân lên của virus bị chậm hoặc ngừng lại. Do
vậy, bệnh VNNB thường xuất hiện về mùa hè ở các vùng cận nhiệt đới, đó

là khoảng thời gian thích hợp cho virus nhân lên trong cơ thể muỗi và cũng
là thời gian chỉ số mật độ muỗi cao nhất trong năm [17,24,60].


15
2.1.1.3. Sự lan rộng và xuất hiện của genotyp mới virus VNNB ở một số
vùng địa lý trên thế giới
Bệnh viêm não do virus VNNB lan truyền rộng rãi ở Châu Á bao gồm
Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Philippin, vùng Viễn đông, hầu hết các
nước ở Đông Nam Châu Á và Ấn Độ, theo số liệu thống kê hàng năm ở
Châu Á có khoảng 50.000 trường hợp mắc [24,33,60].

Việc tăng cường sử dụng vắc-xin VNNB đ
ã khống chế bệnh VNNB ở
một số nước như Nhật Bản, Nam Triều Tiên. Ngược lại, tỷ lệ VNNB lại tăng
lên ở Srilanca, Nepal, Ấn Độ và Trung Quốc. Do vậy, VNNB vẫn còn là một
đề cần quan tâm ở nhiều nước trong đó có Việt Nam, vì tỷ lệ sử dụng vắc-
xin VNNB để phòng bệnh còn thấp [7,24].

Trong vài thập kỷ gần đây, bệnh VNNB đã lan rộng tới mộ
t số vùng
trước đây không có bệnh dịch này như quần đảo thuộc eo biển Torres cách
xa lục địa Australia. Có giả thiết về sự lan rộng của virus VNNB ở một số
vùng địa lý mới là do chim di cư mang virus đến, nhưng cho đến nay vẫn
chưa có công bố nào về kết quả phân lập virus từ chim di cư [14,15,20].

2.1.2. Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB ở khu vực châu Á

Phân tích về sự phát triển, tiến hoá c
ủa virus VNNB dựa vào cấu trúc

vùng gen Pr.M của virus VNNB đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu.
Tuy nhiên, đây là vùng gen có độ dài khoảng 500 bp và tương đối ổn định.
Do vậy, nghiên cứu về sự tiến hoá của virus VNNB có thể sẽ bị hạn chế nếu
sử dụng vùng gen này. Ngược lại, vùng gen E với độ dài 1500 bp, là vùng

16
không ổn định, được cho là vùng gen lý tưởng để nghiên cứu về sự tiến hoá
của virus VNNB [1,18,23,29,42,50].

2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3

3
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
1
3
3
3
3
3
3
5
5
4
4
1
1
1
1
1
1

Hình 2.2. Sự phân bố các genotyp virus VNNB trên thế giới

Nghiên cứu dịch tễ phân tử đã xác định, virus VNNB có 5 genotyp,
tính chất gây bệnh cũng khác nhau đối với từng genotyp. Trên thực tế, các
chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân ở nhiều nước trong khu vực châu
Á chủ yếu là các chủng virus VNNB thuộc genotyp 3; virus VNNB genotyp
2 chỉ được phân lập ở Malaysia, Indonesia và Bắc Úc, virus VNNB genotyp
1 được phân lập chủ yếu ở Thái Lan. Ngược lại, đối với virus VNNB
genotyp 4 và 5 vai trò gây bệnh ch
ưa được xác định rõ ràng và cho đến nay
hai genotyp này mới được phân lập từ muỗi và chim. Virus VNNB genotyp

17
4 bao gồm một số chủng virus phân lập được từ muỗi ở Indonesia, qua thực
nghiệm cho thấy độc lực của virus VNNB genotyp 4 thấp hơn so độc lực của
các chủng virus VNNB genotyp 3. Có giả thiết cho rằng, nếu gây bệnh virus
VNNB genotyp 4 sẽ gây bệnh nhẹ hơn virus VNNB genotyp 3 [18,39,45].

Sự xuất hiện virus VNNB genotyp 1 ở một số nước bắc Á được ghi nhận
lần đầu tiên ở Nam Triều Tiên, Nhật Bản vào n
ăm 1994, đó là những chủng
virus genotyp 1 được phân lập từ muỗi. Trong nghiên cứu gần đây, xác định
có vật liệu di truyền của virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 trong mẫu
dịch não tuỷ của bệnh nhân ở Nhật Bản, tuy nhiên cho đến nay virus VNNB
genotyp 1 vẫn chưa được phân lập từ bệnh nhân ở Nhật Bản
[26,30,32,45,50]. Tương tự như vậy, nghiên cứu dịch tễ phân tử các chủng
virus VNNB phân lập ở Trung Quốc trong các năm 1949 – 2005 cũ
ng đã
phát hiện virus VNNB genotyp 1 lưu hành ở Trung Quốc từ những năm

1979 ở muỗi, tuy nhiên trong số 135 chủng virus VNNB được sequencing
vùng gen E để xác định genotyp, mới phát hiện được virus VNNB genotyp 1
từ muỗi và máu lợn, nhưng chưa phát hiện được virus VNNB genotyp 1 từ
bệnh nhân [62].

Mặc dù có sự xuất hiện của các genotyp mới ở một số vùng địa lý
trong những năm gần đây, tuy nhiên chưa có bằng chứng khoa học để gi
ải
thích cho sự mới xuất hiện genotyp mới này. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử
của virus VNNB thường dựa vào kết quả phân tích trình tự các vựng gen mã
hoá cho protein cấu trúc và phi cấu trúc như vùng gen E, PreM hoặc NS5
[52,53]. Xác định virus VNNB genotyp 1 chủ yếu mới xuất hiện ở vùng Bắc
Á và đông Nam châu Á, chưa thấy có sự xuất hiện virus VNNB genotyp 1 ở
các nước vùng Nam Á như Ấn Độ, Malaysia [45,50].

18
Nghiên cứu sinh học phân tử virus VNNB được nhiều nhà khoa học
trên thế giới quan tâm nghiên cứu trong nhiều thập kỷ qua đã làm phong phú
số lượng các vùng gen của virus VNNB đã được giải mã và đăng ký trong
ngân hàng gen. Hơn thế nữa, nghiên cứu giải mã toàn bộ gen của một chủng
virus VNNB cũng đã được nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện, đăng ký trong
ngân hàng gen. Tuy nhiên, kết quả giải mã toàn bộ vật liệu di truyền của các
chủng virus VNNB phân l
ập từ người đã công bố trong ngân hàng gen chủ
yếu là các chủng virus VNNB genotyp 3 như chủng Nakayama, Beijing -1
Cho đến nay, chưa có công bố nào trong ngân hàng gen về kết quả giải mã
gen đối với virus VNNB genotyp 1 phân lập từ bệnh nhân [12,37,39].

2.1.3. Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên
cứu trên thế giới

Năm 1983 Mullis K. B. đã phát minh ra nguyên lý phản ứng kỹ thuật
PCR và công bố cho giới khoa học vào tháng 10 năm 1985. Phát minh của
ông đã tr
ở thành một cuộc cách mạng lớn trong khoa học kỹ thuật. Tiếp sau
đó, là hàng loạt các công bố về phát hiện và phát triển những enzyme mới
ứng dụng cho kỹ thuật sinh học phân tử và phát triển kỹ thuật mới cho
nghiên cứu định lượng cũng như định tính sản phẩm tổng hợp cuả kỹ thuật
PCR. Về nguyên lý, kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại trong ống nghiệm
một đo
ạn ADN đã được biết trình tự hai đầu ADN gồm 3 giai đoạn chuyển
đổi: (1) Làm biến tính sợi kép ADN; (2) Gắn sợi đơn ADN với 1 cặp mồi
đặc hiệu; (3) Sự kéo dài chuỗi mồi bằng enzyme polymeraza [28,56]. Chu
trình được lặp di lặp lại rất nhiều lần, ADN được khuếch đại theo cấp số
nhân. Về nguyên bản gốc, kỹ thuật PCR là khuếch đại một đoạn ADN,
nhưng đối v
ới các virus có vật liệu di truyền là ARN như virus VNNB,

19
phương pháp này lại không thể áp dụng trực tiếp cho sự nhân lên của ARN
được. Nên kỹ thuật PCR đã cải biên thành kỹ thuật RT-PCR trong đó ARN
của virus được chuyển đổi thành ADN bổ trợ - complementary DNA được
gọi là cDNA. Như vậy, ARN nguyên bản của virus được chuyển thành
cDNA là một sợi đơn ADN bổ trợ. Vì phản ứng PCR bao gồm cả hai giai
đoạn sao chép ngược và tổng hợp ADN, nên qui trình này được gọi là phản
ứ
ng chuỗi sao chép ngược - reverse transciptase polymerase chain reaction -
gọi tắt là RT-PCR, thực chất là một sự cải biên từ kỹ thuật PCR.
Với kỹ thuật RT-PCR, nếu quá trình thực hiện được chia làm hai giai
đoạn: giai đoạn sao chép ngược để tổng hợp cDNA sử dụng mồi ngược và

giai đoạn PCR. Mỗi một giai đoạn sử dụng một ống nghiệm riêng biệt với
những thành phần cần thiết và chu trình nhi
ệt riêng, được gọi là kỹ thuật RT-
PCR gián tiếp. Ưu điểm của kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn kỹ thuật RT-
PCR trực tiếp. Tuy nhiên, khả năng dương tính giả cao hơn kỹ thuật RT-
PCR trực tiếp do dễ bị nhiễm. Do vậy, kỹ thuật RT-PCR trực tiếp có hiệu
quả hơn so với kỹ thuật RT-PCR gián tiếp, vì nó sẽ làm giảm tối đa khả
n
ăng tạp nhiễm hoặc kết quả đương tính giả. Để thực hiện kỹ thuật, tất cả
các thành phần cần thiết cho cả hai quá trình sao chép ngược và PCR được
cho vào một ống nghiệm, thực hiện trong một lần duy nhất, chu trình nhiệt
không bị ngắt quãng. Một trong hai đoạn mồi sử dụng cho quá trình sao
chép ngược được sử dụng cho PCR [28,56].

Sản phẩm khuếch đại của phả
n ứng PT-PCR được khẳng định và kiểm
tra bằng phương pháp chạy điện di trên gel. Cho đến nay có nhiều loại thuốc
nhuộm đã được nghiên cứu để ứng dụng cho việc phát hiện sản phẩm PCR
như Ethidium bromide, SYBR Green, FABIO , nhưng Ethidium bromide