Nghiên cứu sản xuất thuốc chữa bệnh cúm do virut H5N1 gây ra từ nguồn nguyên liệu trong nước

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÓA HỌC







BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC


NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THUỐC CHỮA BỆNH CÚM
DO VIRUT H5N1 GÂY RA TỪ NGUỒN NGUYÊN LIỆU
TRONG NƯỚC
MÃ SỐ: ĐTĐL-2006-O1/06

Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN QUYẾT CHIẾN

7582
28/12/2009

HÀ NỘI – 2009




1
1. BÀI TÓM TẮT

1.1. Đặt vấn đề
Trước nhu cầu cấp thiết về lượng thuốc cần thiết để đề phòng đại dịch cúm gia
cầm bùng phát, nhận thấy Việt Nam có nguồn tài nguyên về hoa hồi, đề tài độc lập cấp
nhà nước “Nghiên cứu sản xuất thuốc chữa bệnh cúm do vi rút H5N1 gây ra từ nguồn
nguyên liệu trong nước” có mã số ĐTDDL-2006-01/G đặt ra các mục tiêu sau đây:
 Hoàn thiện công nghệ chiế
t xuất axit shikimic từ quả hồi của Việt Nam.
 Tổng hợp ra hoạt chất oseltamivir photphat có chất lượng đảm bảo để làm thuốc
chữa bệnh cúm do virut H5N1 gây ra.
Căn cứ theo các nội dung cần phải nghiên cứu để đạt được các mục tiêu trên, đề
tài được phân thành 4 đề tài nhánh, do 3 cơ quan phù hợp với chuyên môn chia nhau
thực hiện, gồm:
 Đề tài nhánh 1: Điều tra và đánh giá nguồn tài nguyên và tình hình sản xuất Hồi
c
ủa Việt nam (Nghiên cứu nguồn nguyên liệu Hồi, Viện Sinh thái và Tài nguyên
Sinh vật thực hiện ).
 Đề tài nhánh 2: Nghiên cứu qui trình chiết xuất và tinh chế axit shikimic từ hồi

của Việt Nam (Chiết xuất và tinh chế Axit shikimic, Viện Hóa học thực hiện).
 Đề tài nhánh 3: Nghiên cứu các qui trình tổng hợp Tamiflu từ axit shikimic (Tổng
hợp Oseltamivir, Viện Hóa học thực hiện)
 Đề tài nhánh 4: Nghiên cứu sử dụng hoạt chất oseltamivir photphat làm thuốc
chữa b
ệnh cúm do virut H5N1 gây ra (Nghiên cứu dược lý và bào chế thuốc,
Trường Đại học Dược Hà Nội thực hiện).

1.2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu:
1.2.1. Nguyên liệu:
 Quả hồi khô, mua trên thị trường hoặc hồi tươi tự thu mua tại nơi sản xuất.

2
 Axit shikimic tự chiết xuất từ quả hồi của Việt Nam.
 Các hoá chất và dung môi dùng cho các quá trình chiết xuất và tổng hợp mua của
các hãng phương tây, Nhật Bản hoặc Trung Quốc.
1.2.2. Phương pháp nghiên cứu:
 Các phương pháp về Sinh học và Sinh thái, Tài nguyên Sinh vật học, được thực
hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
 Các phương pháp chiết tách, tinh chế, xác đị
nh cấu trúc và phân tích các hợp chất
hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Các phương pháp dùng để
phân tích cấu trúc như phổ MS, LC/MS, IR và NMR (một chiều và hai chiều)
được thực hiện tại Viện Hoá học và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ được dựa theo các sách về hữu cơ cơ bản và
các công bố trong tư liệu, được thực hiệ
n tại Viện Hoá học.
 Các phương pháp nghiên cứu về y dược được sử dụng là những phương pháp quy

chuẩn, được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Kiểm nghiệm,
Bộ Y tế.
 Trong bản thuyết minh đề cương ban đầu, đề tài dự kiến thử nghiệm hiệu lực của
sản phẩm oseltamivir photphat trực tiếp trên virut H5N1. Do Việt Nam chư
a có
phòng thí nghiệm có khả năng thử nghiệm hoạt tính trên virut H5N1, Hội đồng
KH&CN của Bộ KH&CN đánh giá hồ sơ đăng ký đã đề nghị bỏ nội dung nghiên
cứu này và thay bằng nội dung nghiên cứu tương đương sinh học của sản phẩm so
với thuốc ngoại, có tính khả thi hơn và có ý nghĩa hơn (Hồ sơ đề tài, mục 02). Sự
thay đổi này so với bản thuyết minh đề tài đã đượ
c thể hiện trong nội dung của
hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ của đề tài (Hồ sơ đề tài,
mục 04).


3
1.3. Các kết quả đã đạt được:
1.3.1. Các kết quả đã đạt được của đề tài nhánh 1 "Nguyên liệu Hồi":
 Kết quả điều tra và đánh giá nguồn tài nguyên và tình hình sản xuất Hồi của Việt
nam cho thấy, tại Việt Nam hồi được trồng tại 8 tỉnh với tổng diện tích 47.650 ha,
trong đó 17.626 ha đang có qủa. Năng suất trung bình của cây hồi đạt khoảng
4000 kg quả
tươi/năm (tương ứng 889 kg quả khô/ha/năm). Sản lượng thực tế
hàng năm của Hồi tại Việt Nam đạt khoảng 6.209,6 tấn/năm. Hàm lượng axit
shikimic trong quả hồi tại các vùng của Lạng Sơn đạt cao nhất 8,17% (các mẫu
thu tại Bình Gia) và thấp nhất đạt 5,78% (các mẫu thu tại Văn Lãng).

1.3.2. Các kết quả đã đạt được của đề tài nhánh 2 "Chiết xuất và tinh chế Axit
shikimic":
 Đ

ã xây dựng được quy trình công nghệ chiết xuất và tinh chế axit shikimic từ quả
hồi của Việt Nam trên quy mô từ 35, 100 và 200 kg hồi khô/mẻ. Hiệu suất axit
shikimic thu được sau khi tinh chế đạt từ 5 – 7% tính theo trọng lượng hồi khô.
Độ tinh khiết đạt >90%, đáp ứng đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu để tổng hợp hoạt
chất oseltamivir. Áp dụng quy trình công nghệ này, đã tiến hành sản xuất được 50
kg axit shikimic từ 1 tấn quả hồi khô đạt hàm l
ượng >90% và hiệu suất so với
trọng lượng quả hồi khô đạt từ 5 - 6%.
1.3.3. Các kết quả đã đạt được của đề tài nhánh 3 "Tổng hợp Oseltamivir":
 Đi từ axit shikimic chiết xuất được từ quả hồi của Việt Nam, đã xây dựng được
quy trình tổng hợp hoạt chất oseltamivir photphat qui mô 100 g / mẻ ổn định và
phù hợp với điều kiện Việt Nam. Qui trình này ứng dụng các ti
ến bộ mới được
công bố, không sử dụng hóa học azit và gồm hai giai đoạn: giai đoạn 1 gồm 6
bước phản ứng, cho hiệu suất 65%, tương đương với kết quả công bố trên tư liệu
quốc tế (63-65%); giai đoạn 2 gồm 7 bước phản ứng, cho hiệu suất 40%, cao hơn
phương pháp công nghiệp của hãng Roche (27-29%) nhưng còn thấp hơn phương
pháp thế hệ hai của Roche (61%). Theo yêu c
ầu của chủ nhiệm đề tài nhánh 4
"Nghiên cứu dược lý và bào chế thuốc", đã được hội đồng kiểm tra định kỳ của

4
Bộ KH&CN 5/2007 thống nhất, Viện Hóa học đã ứng dụng quy trình này để tổng
hợp ra 630 gam hoạt chất oseltamivir photphat có chất lượng đảm bảo để nghiên
cứu dược lý và bào chế thuốc. Số lượng sản phẩm này cao hơn rất nhiều so với chỉ
tiêu được giao là 100 g mà không cần kinh phí bổ sung cho hóa chất là nhờ hiệu
suất của các giai đoạn phản ứng thực tế đạt được cao h
ơn so với dự kiến ban đầu.
1.3.4. Các kết quả đã đạt được của đề tài nhánh 4 "Nghiên cứu dược lý và bào
chế thuốc":

 Sản phẩm oseltamivir phosphat tổng hợp ra đã được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn
của Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế; đã được nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt
trắng và trên chó, độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng và trên thỏ, độ
c
tính gây đột biến nhiễm sắc thể, và độc tính trên quá trình sinh sản. Tất cả các tiêu
chí đều đạt.
 Đã nghiên cứu bào chế pellet oseltamivir phosphat bằng phương pháp đùn- tạo
cầu; Bào chế viên nang oseltamivir phosphat ở qui mô 3000 viên. Đã xây dựng và
đề xuất tiêu chuẩn cho viên nang oseltamivir phosphat. Đánh giá độ ổn định của
viên nang oseltamivir phosphat cho thấy: sau 12 tháng, mẫu viên bảo quản ở hai
điều kiện thường và lão hóa vẫn đạt tất cả các chỉ tiêu đề ra về
hình thức, độ hoà
tan, hàm lượng và tạp chất liên quan.
 Nghiên cứu tương đương sinh học của viên nang oseltamivir phosphat từ nguồn
nguyên liệu trong nước được tiến hành trên chó, cho thấy giá trị C
max
, AUC
0-24
của
thuốc thử và thuốc đối chiếu Tamiflu là tương đương

1.4. Kết luận và kiến nghị
 Đề tài đã hoàn thành tốt các mục tiêu đã đề ra.
 Thanh quyết toán tài chính theo đúng dự toán và quy định của nhà nước.

Về tiến độ, đề tài thực hiện chưa tốt. Thời gian thực hiện đề tài được giao là
4/2006 - 4/2008, được gia hạn đến 10/2008 (Hồ sơ đề tài, mục 09). Mặc dù các cơ
quan tham gia thực hiện đề tài đã rất cố gắng, nhưng đề tài đã không kết thúc được
đúng thời hạn (chậm hơn so với hạn cuối 4-2008 là 8 tháng, chậm hơn so với thời

5
gian đã được gia hạn, 10-2008, là 2 tháng). Nguyên nhân khách quan là do các nội
dung chủ chốt về phần dược chỉ bắt đầu được khi có đủ lượng oseltamivir
photphat do Viện Hóa học cung cấp (vào tháng 12-2007), và lượng oseltamivir
photphat cần thiết cho các nghiên cứu phần dược cũng cao hơn nhiều so với hoạch
định ban đầu (600 g so với 100 g). Nguyên nhân chủ quan là do năng lực hoạch
định và điều hành của chủ nhiệm đề tài chưa tốt.


Trên cơ sở các kết quả đã đạt được và nhận thấy tiềm năng của cây hồi Việt Nam
trong việc cung cấp nguyên liệu axit shikimic cho sản xuất thuốc chống cúm gia
cầm Tamiflu, đề nghị các cấp quản lý của Bộ Y tế có chính sách thích hợp để
khuyến khích hỗ trợ trồng cây hồi, đồng thời thúc đẩy hợp tác với Hãng dược
phẩm Roche để tiến tới có thể sản xu
ất và xuất khẩu axit shikimic.

Các hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp: etyl shikimat, etyl 3,4-O-
propyliden-5-methanesulfonyl shikimat, và epoxit là các chất sạch, ở dạng tinh thể
bền, có thể nghiên cứu để thương mại hóa như axit shikimic.

 Cần tiếp tục nghiên cứu để bổ sung và đi sâu vào những nội dung sau:
- Xác định hàm lượng của axit shikimic trong các giống hồi khác nhau, trồng ở
các địa phương khác nhau để chọn ra giống cây thích hợp.
- Tìm phương pháp mới để thu hồi tinh dầu có hiệu quả hơn.
- Nghiên cứu độ ổn định của oseltamivir photphat và viên nang sau thời gian bảo
quản dài hơn.
- Xác đị
nh các thành phần tạp chất có trong sản phẩm oseltamivir photphat.
- Đưa qui trình axit shikimic và oseltamivir photphat vào sản xuất.

6
2. PHẦN TỔNG QUAN:

2.1. Tổng quan tư liệu về cây Hồi ở Việt Nam:
2.1.1. Sơ lược về chi Hồi (Illicium) ở Việt Nam
Hồi (Illicium) là chi duy nhất của họ Illiciaceae, hiện có khoảng 40 loài phân bố
trên nhiều khu vực của thế giới.
Ở Việt Nam đã phát hiện được 16 loài hồi, trừ loài I. verum chỉ gặp trong trồng cấy,
các loài còn lại thuộc dạng hoang dại và thường sinh trưởng tự nhiên trong rừng
nguyên sinh, đôi khi cả rừng thứ sinh ở khắp các tỉnh miền núi phía Bắc, mi
ền Trung
và Tây Nguyên.
Loài hồi (Illicium verum) từ lâu đã được trồng thành những quần thể lớn ở dạng
rừng trồng hoặc bán hoang dại các tỉnh miền núi Đông Bắc nước ta chủ yếu là ở Lạng
Sơn, Quảng Nam, Cao Bằng, Bắc Thái, Quảng Ninh,.v.v…
Tất cả các loài Hồi ở Việt Nam đều thuộc dạng cây gỗ nhỏ hoặc trung bình. Tới nay
mới chỉ có một số công trình nghiên cứ
u về thành phần hóa học của tinh dầu thu từ
một số loài hoang dại; các lĩnh vực khác hầu như chưa được nghiên cứu.
Tại Việt Nam, hiện đã ghi nhận các loài hồi hoang dại dưới đây:
- I. Cambodianum Hance = Hồi Cambôt, phân bố tại Lâm Đồng, Kánh Hoà
- I. difengpi A. N. Chang - syn. I griffithii = Hồi núi đá vôi, phân bố: Hà Giang, Cao
Bằng, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Hoà Bình, Ninh Bình.
- I. henryi Diels. = Hồi Henry, phân bố: Lào Cai (phan xipan)
- I. kinabaluense A. C. Smith = Hồi H
ương Sơn, phân bố: Hà Tĩnh (Hương Sơn)
- I. Leiophyllum A.C. Smith = Hồi lá nhẵn, phân bố Vĩnh Phúc, Thái Nguyên
- I. macranthum A.C. Smith = Hồi hoa to, phân b: Lào Cai (Sa Pa)

- I. fargersii Franch: phân bố ở Phanxipan (Sa Pa, Lào Cai)
- I. majus Hook. f. et Thoms. = Đại hồi, phân bố: Lào Cai (Phanxipan)
- I. pachyphyllum A.C. Smith = Hồi lá dầy, phân bố: Hà Giang (Đồng văn, Phó
Bảng)
- I. parviflorum Merr. = Hồi lá nhỏ, phân bố: chỉ gặp tại Bạch Mã (T.T. Huế) và Bà
Nà (Đà Nẵng)
- I. peninsulare A.C.Smith = Hồi bán đả
o, phân bố: Yên Bái, Kon Tum.

7
- I. petelotii A.C.Smith.= Hồi Petelot, phân bố: Lai Châu, Lào cai.
- I. simonsii Maxim. = Hồi Simons, phân bố: Lào Cai (Sa Pa)
- I. tenuifolum (Ridl.) A.C. Smith. = Hồi lá mỏng, phân bố: Nghệ An, Gia Lai, Lâm
Đồng, Khánh Hoà.
- I. ternstoeminoides A. C. Smith. = Hồi chè, phân bố: Sơn La (Sông Mã, Sốp Cộp).
- I. tsaii A. C. Smith.= Hồi Tsai, phân bố: Lào Cai (Phanxipan).
Trong số các loài Hồi hiện biết, chỉ loài Hồi trồng (I. verum) là loài có diện tích
lớn, tập trong và có giá trị cao do sản phẩm (tinh dầu, quả khô) được sử dụng rộng rãi.
Các loài còn lại chủ y
ếu được khai thác và sử dụng trong dân gian trong một số bài
thuốc dân tộc (rễ hồi núi ngâm rượu chữa bong gân, hoặc trong một vài bài thuốc trị
thương của những người học võ nghệ).
Loài hồi trồng (Illicium verum Hook. f.) là một taxon tương đối nguyên thuỷ
thuộc họ Hồi (Illiciaceae) với các đặc điểm điển hình: cây gỗ lớn hoặc trung bình, bao
hoa chưa phân hoá thành đài và tràng, tồn tại dưới dạng các m
ảnh bao hoa. Quả nhiều
lá noãn, rời, chỉ hợp ở phần gốc tạo thành quả có nhiều đại (cánh quả). Số lượng thành
phần của hoa (mảnh bao hoa, nhị, noãn) nhiều, dao động. Trong nhiều trường hợp vẫn
còn quan sát thấy các dạng tiến hoá trung gian của mảnh bao hoa và nhị.
Đặc điểm cơ bản nêu trên đã được ghi nhận từ lâu; tuy nhiên, trong bản mô tả đầu

tiên để đặt tên cho loài này, quả hồi
được ghi nhận chỉ có 8 đại. Sau này, nhiều nghà
nghiên cứu đã ghi nhận số đại nhiều hơn (13) khi nghiên cứu hìnhthái học cây hòi.
Năm 1978 Phan Kế Lộc đã nghiên cứu chi tiết các dạng biến dị của Hồi tại Lạng Sơn
và chia Hồi thành 6 dạng hình thái. Theo Kết quả nghiên cứu này, Hồi tại Việt Nam
(nghiên cứu tại Lạng sơn) có 3 thứ chính với 7 dạng sau:Thứ quả có 8 cánh, gồm 3
dạng: lá rộng, lé h
ẹp và lá vừa; Thứ quả có trung gian : gồm 2 dạng lá rộng và lá vừa;
Nhóm quả nhiều cánh (8-13 cánh) có 2 dạng lá rộng và lá vừa.
Gần đây trong quá trình điều tra, chúng tôi đã phát hiện một số dạng mới, đưa
tổng số dạng hình thái của Hồi Việt Nam lên 10 dạng.

2.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây Hồi
Cây hồi chủ yếu tái sinh từ hạt. Cây con có nhu cầu ánh sáng thấp, vì vậy trong
vườn ươm c
ần che nắng ở mức độ cần thiết. Cây hồi con được đưa vào trồng sau 2

8
năm ươm giống. Trong điều kiện bình thường, cây hồi ra quả sau 7-8 năm và ổn định
năng suất sau năm thứ 20. Trong giai đoạn 20 đến 60 tuối, hồi cho năng suất cao và ổn
định. Nhìn chung các rừng hồi ở tuổi 80 cho năng thấp, tuy vậy vẫn có một số cây cho
năng suất cao ở tuổi này.
Hồi nảy chồi và ra cành 2 lần mỗi năm. Lần đầu vào khoả
ng tháng 1 gọi là đợt cành
xuân. Đợt thứ hai nảy chồi vào mùa hè – thu thường không tập trung, thường kéo dài
từ tháng 6-7 tới tháng 10-11 và lác đác. Đợt nảy chồi này chỉ hình thành trên ở cành
trên 1 năm tuổi (cành già).
Hồi rụng lá mỗi năm một lần vào cuối tháng 9 và có thể kéo dài tới tháng 4-5 năm
sau. Trong những năm thời tiết không thuận lợi hồi rụng hết lá và đồng loạt ra lá mới
vào đầu mùa xuân làm cho cả rừng hồi có màu đỏ nhạt c

ủa chồi non. Trường hợp này
gọi là "hồi đỏ ngọn" và năm đó hồi thường không có quả.
Mỗi năm hồi ra hoa hai lần kế tiếp nhau. Đợt hoa đầu tiên từ cuối tháng 6 đến cuối
tháng 7 gọi là hoa vụ tứ quý (chủ yếu vào cuối tháng 7). Đợt hoa thứ hai (gọi là hoa vụ
mùa) nở tiếp sau ngay lứa hoa vụ tứ quý kéo dài từ tháng 7 tới tháng 10. Thực tế vào
thời điểm giao thời r
ất khó phân biệt hoa của hai vụ.
Ngay sau khi nở hoa, vụ hoa đầu tiên tiếp tục phát triển và hình thành lứa quả thu
vào tháng 12 hoặc tháng 1 năm sau, gọi là vụ hồi Tứ quý. Lứa hoa thứ hai mặc dù hình
thành ngay sau lứa hoa thứ nhất, nhưng sau khi hoa nở các bao hoa khô đen và bọc lấy
quả non. Các quả này hầu như dừng sinh trưởng cho tới tháng 3 hoặc tháng 4 năm sau.
Lứa quả này thực sự chỉ lớn nhanh vào cuối tháng 3 hoặc đầu tháng 4 khi nhiệt
độ
không khí cao và hình thành vụ quả thu hoạch vào tháng 8-9 gọi là vụ hồi mùa.
Thông thường khích thước và trọng lượng quả hồi vụ tứ quý chỉ bằng 30-40%
quả hồi mùa và năng suất quả tứ quý thường chỉ đạt 20-30 % năng suất quả vụ mùa.
Ngoài hai vụ hoa chính, nhiều khi quan sát thấy một số cây xuất hiện hoa vào các
tháng khác, nhưng không nhiều và không đậu quả. Hiện tượng này thường gặp ở
những n
ăm nhiệt độ không khí cao. Kết quả quan sát này phù hợp với nghiên cứu
trước đây: vào năm 1906, người Pháp đã thử nghiệm trồng hồi tại trạm thí nghiệm Phú
Hộ (Phú Thọ). Tại đây với nhiệt độ không khí cao, lượng mưa trung bình năm đạt
1800 mm, cây hồi ra hoa không tập trung thành vụ và tỷ lệ đậu quả rất thấp. Tới năm

9
1938 việc trồng hồi tại Phú Hộ không tiếp tục với kết luận nhiệt độ không khí cao
không thích hợp và làm rối loạn nhịp điệu sinh trưởng của cây hồi.

2.1.3. Năng suất và chất lượng hồi của Việt Nam
Hồi của Việt Nam được trồng ở nhiều địa phương với các điều kiện khí hậu, thổ

nhưỡng rất khác nhau. Ngoài ra, do tính đa dạ
ng cao và không được chọn giống, năng
suất và chất lượng tinh dầu hồi ở các khu vực rất khác nhau và khó tìm được nguyên
nhân thuyết phục. Ngay trong một khu vực hiện tượng khác biệt về năng suất và chất
lượng cũng thường xuyên được ghi nhận.
Nhìn chung, hầu hết các nghiên cứu đều thống nhất năng suất hồi của nước ta
không cao. Ở các rừng hồi thành thục năng suất trung bình có thể đạ
t 20 đến 40 kg quả
tươi (5-10 kg qủa khô) trên mỗi cây. Với mật độ 350 -400 cây hồi trên 1 ha, có thể thu
hoạch 7.000 đến 14.000 kg quả tươi/ha. Với các rừng hồi cho năng suất thấp năng suất
trung bình đạt dưới 20 kg quả/cây, thậm chí cho thu hoạch không đáng kể. Mặc dù số
liệu năng suất trên mỗi cây được đưa ra khá khiêm tốn, nhưng thực tế chúng tôi chưa
phát hiện rừng hồi nào có trên 70% cây có quả. Do vậy nă
ng suất thực tế của cây hồi
của nước ta còn có thể thấp hơn. Với kết quả thu thập tại nhiều vùng của Việt Nam,
năng suất trung bình hồi của nước ta không vượt quá 7.000 kg quả tươi/ha/năm, tương
đương với khoảng 1.750 kg quả khô.
Mặc dù năng suất bình quân và phổ biến ở đa số cây không cao, nhưng vẫn có thể
gặp những cây cá biệt có năng suất v
ượt trội, trên 100 kg/vụ. Theo thông tin của địa
phương và các chủ vườn, tại Lạng Sơn trước đây có nhiều cây hồi cho năng suất rất
cao, có cây đạt tới 300 kg quả/vụ. Trong 3 năm điều tra tại nhiều khu vực trồng hồi tại
Lạng Sơn chúng tôi chưa phát hiện được cây nào cho năng suất đạt 150 kg quả/vụ.
Hàm lượng tinh dầu trong quả hồi dao động khá lớn. năm 1977, Nguyễ
n Thị Mê
Linh xác định khoảng dao động của hàm lượng tinh dầu trong quả hồi tươi từ 1,20 đến
2,61% (tương ứng 7,69 đến 12,24% trong quả khô) và hàm lượng tinh dầu trong lá hồi
tươi đạt 1,29-3,36%. Các nghiên cứu gần đây (Nguyễn Văn Toàn, 2005) cho thấy hàm
lượng tinh dầu trong quả hồi khô (tuyệt đối) dao động trong khoảng rất lớn từ 4,37
(mẫu Cao Bằng) tới 17,49% (mẫu Lạng Sơn).

10
Hàm lượng trans-anethole trong tinh dầu hồi ở các vùng khác nhau được xác định
dao động trong khoảng 71,00 % 98,47% (mẫu thu tại Cao Lộc, Lạng Sơn). Nhìn chung,
hầu hết các mẫu tinh dầu nghiên cứu của các tác giả đã công bố đều cho hàm lượng
trans-anethole trên 80%, nhiều mẫu đạt trên 90% và hàm lượng cis-anethole không
vượt quá 1%. Do vậy có thể khẳng định tinh dầu hồi của Việt Nam có chất lượng rất
cao.
Tuy nhiên trong quá trình nghiên cứu, cũng phát hiện các mẫu tinh dầu có hàm
lượng trans-anethol rất thấp: 54,77%. Đặc biệt tại Cao Bằng đã phát hiện mẫu hồi có
hàm lượng cis-anethole rất cao (23,98 %) (Nguyễn Văn Toàn, 2005). Đây là chất có
độc tính cao, theo tiêu chuẩn hiện nay, trong tinh dầu hồi hàm lượng cis-anethole
không được vượt quá 3%. Đáng chú ý là trong mẫu phân tích này xuất hiện methyl
chavicol với hàm lượng 16,38%. Rất có thể mẫu quả này được thu từ loài hồi hoang
dại mọc phổ biến ở các tỉnh miền núi phía Bắc (Illicium griffithii). Dù sao đây c
ũng là
hiện tượng rất cần kiểm tra thêm trong thời gian sắp tới vì liên quan tới chất lượng của
tinh dầu hồi Việt Nam.
Cây hồi là một cây công nghiệp quan trọng, cây tinh dầu có giá trị kinh tế cao của
tỉnh Lạng Sơn nói riêng và của nước ta nói chung. Cây Hồi đã được trồng ở nhiều địa
phương vùng núi Bắc bộ, trong đó nhiều nhất là tỉnh Lạng Sơn. Việc trồng Hồi di
ễn ra
chủ yếu là tự phát, bằng kinh nghiệm của người dân truyền lại cho nhau. Mặc dù nhiều
vùng có Hồi như vậy nhưng năng suất, chất lượng của các sản phẩm từ Hồi (hoa hồi-
quả hồi, tinh dầu hồi) không đồng đều dẫn đến nhiều khó khăn trong quá trình chế biến,
tiêu thụ sản phẩm.
Cây Hồi (Illicium verum) được chồng chủ yếu ở Nam Trung Quốc và m
ột số tỉnh
phía Bắc Việt Nam, trong đó đa phần là tại tỉnh Lạng Sơn. Việc điều tra diện tích,
đánh giá sản lượng và nghiên cứu chất lượng của vùng Hồi nguyên liệu là một trong

những nhiệm vụ quan trọng, góp phần quy hoạch vùng nguyên liệu phục vụ sản xuất
và bảo vệ sức khoẻ cũng như tính mạng của con người.

2.1.4. Biến động di
ện tích hồi tại Việt Nam
Trước cách mạng Tháng 8, mỗi năm sản lượng Hồi của Việt Nam khoảng 200-250
tấn quả. Ngay từ thời Pháp thuộc, ở Lạng Sơn cũng đã có xưởng trưng cất tinh dầu Hồi.

11
Năm 1966-1967 chỉ đạt 400 tấn quả/năm. Sau năm 1980, sản lượng quả đạt trên 1.500
tấn/năm (Hà Chu Chử, 1996).
Hiện nay xưởng trưng cất tinh dầu hồi đã không hoạt động, nhưng sản lượng quả
vẫn ngày càng tăng chủ yếu dùng cho xuất khẩu, phần còn lại được sử dụng trong
nước trong y học và làm gia vị.
Sản lượng Hồi của Việt Nam chính là sả
n lượng Hồi của vùng Đông bắc. Đây là
một loại đặc sản có giá trị cao chỉ có ở Đông Bắc nước ta. Ngoài ra, cây Hồi ở vùng
này còn có giá trị phòng hộ đầu nguồn rất tốt. Người dân trong vùng cũng rất ưa thích
trồng Hồi do giá trị kinh tế cao của chúng và chu kỳ kinh doanh dài.
Hồi có giá trị kinh tế cao và có thể trồng rừng phòng hộ, nên những năm qua đã
được chính quyền và nhân dân địa phương chú ý phát tri
ển trong vùng. Cây Hồi trở
thành một trong những đối tượng ưu tiên trồng rừng ở các huyện có Hồi truyền thống
như Văn Quán, Văn Lãng, Cao Lộc, Lộc Bình (Lạng Sơn) Bình Liêu (Quảng Ninh).
Diện tích Hồi càng ngày càng tăng và sản lượng quả Hồi cũng tăng theo.
Tuy nhiên, diện tích biến động không ổn định, từ 2.678 ha năm 1980 chỉ còn 1800 ha
năm 1990, đến năm 1997 lại tăng rất nhanh lên tới 14.233 ha. Đến n
ăm 2004 thì diện
tích Hồi đã tăng lên trên 40 nghìn ha. Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự biến động này
là do thị trường thu mua sản phẩm Hồi không ổn định. Đặc biệt là giai đoạn 1980-

1987 là giai đoạn thị trường Hồi các nước Đông Âu bị khủng hoảng, đồng thời quan hệ
căng thẳng giữa biên giới Việt Trung, đã làm cho sản lượng Hồi của ta không xuất
khẩ
u được. Do vậy, trong thời gian này một phần diện tích rừng ở Bình Liêu (Quảng
Ninh) và ở Lạng Sơn đã bị thay thế bằng các loài cây trồng khác. Đến những năm
1990, sản phẩm Hồi lại có thị trường từ các nước Tây Âu, Nhật Bản, Singapore, đặc
biệt là sản phẩm Hồi của ta được xuất qua biên giới Việt Trung để sau đó lại tái xuất
sang các nước khác. Như đã trở thành quy lu
ật có cầu sẽ có cung, người dân vùng
Đông Bắc lại tiếp tục trồng Hồi, đồng thời thu hoạch tận dụng trên diện tích Hồi còn
lại.

2.2. Tổng quan tư liệu về "Chiết xuất và tinh chế Axit shikimic"
:
2.2.1.
VAI TRÒ CỦA AXIT SHIKIMIC TRONG SẢN XUẤT THUỐC TAMIFLU

12
Axit shikimic được tách ra lần đầu tiên từ quả của một
loài Hồi có độc tính, gọi là Hồi Nhật bản Illicium anisatum năm
1885 [16] dưới dạng tinh thể màu trắng. Thực tế, axit shikimic
có mặt ở trong rất nhiều loài cây khác nhau và thường là hợp
chất trung gian quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp của
nhiều lớp chất. Tuy nhiên, hiện nay cây hồi được quan tâm
nhiều nhất trong việc tạo ra nguồn axit shikimic bởi hàm lượng
axit này trong quả hồ
i rất cao, 5 – 10%.
Kể từ khi thuốc Tamiflu được bào chế ra cách đây gần 10 năm bởi Tập đoàn Gilead,
nhưng sau đó hãng dược phẩm Roche Holding AG mua lại bản quyền bào chế Tamiflu và
người ta đã chính thức sử dụng công nghệ sản xuất oseltamivir từ nguyên liệu đầu là axit

shikimic [17,18,19,20]. Cho tới nay, nhiều nghiên cứu tổng hợp hoạt chất oseltamivir không
đi từ nguyên liệu đầu là axit shikimic đã được phát triển. Tuy nhiên các phương pháp này có
hiệu quả
kinh tế không cao nên chưa được áp dụng rộng rãi. Do vậy, ngày nay, quả hồi đang
trở thành “vũ khí” quan trọng trong công cuộc chống lại dịch cúm gia cầm trên toàn cầu.

2.2.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT AXIT SHIKIMIC TRÊN THẾ GIỚI
Cho tới nay, các nghiên cứu đã công bố về việc phân lập và tinh chế axit shikimic từ
quả hồi mới chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm. Theo đó, việc chiết xuất axit shikimic được
thực hiện bằng phương pháp chi
ết soxhlet với EtOH, sau đó cặn thu được sau khi loại dung
môi được tinh chế bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion. Tuy nhiên việc thực hiện theo
phương pháp này gặp nhiều khó khăn trong thao tác cũng như hạn chế về công suất khi triển
khai trên quy mô lớn.
Như đã trình bày ở trên, nguồn cung cấp hồi trên thế giới cho tới nay chủ yếu tập trung
ở Trung Quốc và Việt Nam. Do dịch cúm gia cầm ngày càng lan rộng và có nguy cơ bùng
phát toàn cầu nên nhu cầu v
ề axit shikimic ngày càng cao. Chính bởi lý do đó, đã có rất nhiều
công trình nghiên cứu nhằm tìm kiếm nguồn cung cấp axit shikimic. Một trong các nghiên
cứu đó là công trình do nhóm của giáo sư Frost (trường Đại học bang Michigan) đã phát triển
công nghệ sản xuất axit shikimic bằng con đường lên men vi sinh sử dụng một chủng
Escherichia coli tái tổ hợp [21]. Từ dịch lên men này, các tác giả cũng đã xây dựng phương
pháp để tinh chế axit shikimic [7]. Tuy nhiên phương pháp này cho thấy hiệu quả kinh tế
không cao. Một h
ướng khác là tìm cách tổng hợp toàn phần axit shikimic và các dẫn xuất của
chúng, nhưng các nghiên cứu này mới ở mức độ thăm dò [23].

COOH
HO
OH

OH
Axit shikimic

13

Dịch nớc chứa axit shikimic
từ quá trình lên men vi sinh
Cô đặc
Cặn axit
shikimic thô
Dịch axit acetic
chứa axit shikimic
Axit shikimic
Thêm axit acetic,
đun ở 70
o
C
Làm lạnh
đến 6
o
C

Hỡnh II.1: S tinh ch axit shikimic t dch lờn men vi sinh

Ti Vit Nam cho ti khi thc hin ti ny, cha cú cụng trỡnh no cụng b v vic
phõn lp axit shikimic t qu hi. Nc ta cú ngun hi di do thun li cho vic to ra
ngun axit shikimic. Chớnh bi vy nờn vic nghiờn cu cụng ngh chit tỏch v tinh ch axit
shikimic trờn quy mụ ln l vic lm cp bỏch trong bi cnh hin nay.

2.3. Tng quan t liu v tng hp Oseltamivir:
2.3.1. Gii thiu chung v Oseltamivir
Oseltamivir (1) l thuc chng virut dựng iu tr v phũng nga c hai loi
virut cỳm tớp A v B. Oseltamivir chng c vi rỳt do cú kh nng c ch enzym
neuraminidase (NA). Nú c ch enzym NA ca virut cỳm nh cú cu trỳc tng t
vi trng thỏi chuyn tip ca cht hoa tiờu l axit sialic (5). Do ú nú ngn nga s
gii phúng v phỏt tỏn cỏc virion mi c sinh ra t cỏc t bo b lõy nhim.
Oseltamivir l mt tin thu
c (prodrug) v thng c dựng di dng mui
photphat. Trong gan nú s bin i thnh cht chuyn hoỏ cú hot tớnh l axit
carboxylic GS4071 (2) [24].

Oseltamivir cú u im l dựng c dng ung v l cht u tiờn thuc
nhúm hot cht ny c phỏt trin n giai on sn xut thng mi. u tiờn nú
c cụng ty Gilead Sciences phỏt trin thnh thuc, ri sau ú c chuyn giao cho
hóng Hoffmann-La Roche tip tc nghiờn cu phỏt trin v thng mi hoỏ di tờn
Tamiflu
đ
. Hin nay Roche l hóng c quyn sn xut thuc ny cho ti nm 2016.
Hóng Roche c tớnh cú 50 triu ngi ó c iu tr bng Oseltamivir, trong ú cú
35 triu ngi Nht Bn [25]

14
Oseltamivir được dùng rộng rãi trong nạn dịch cúm H5N1 ở Đông Nam châu Á
vào năm 2005. Lo sợ sắp xảy ra đại dịch, các chính phủ, bao gồm cả Anh Quốc,
Canada, Hoa Kỳ và Úc, rồi các tập đoàn và ngay cả các cá nhân ra sức tích trữ
oseltamivir, làm cho các quốc gia như Việt Nam có rất ít cơ hội mua đủ thuốc dự trữ
cho mình. Lúc đó Roche cho biết họ không đủ khả năng cung cấp cho nhu cầu của cả
thế giới và đình chỉ
cung cấp hàng cho các nhà thuốc tư ở Hoa Kỳ, Canada, Hồng

Công và Trung Quốc
Dựa trên tính khẩn cấp của tình hình, tháng 10 năm 2005 Công ty dược Cipla
của Ấn Độ công bố kế hoạch sản xuất Oseltamivir mà không cần li-săng của Roche.
Thái Lan, Hàn Quốc và Đài Loan cũng hành động tương tự [26]. Tháng 12-2005
Roche cấp quyền sản xuất cho Shanghai Pharmaceuticals của Trung Quốc, tháng 3-
2006 cho Hetero của Ấn Độ.
Hiện nay tình hình có thể đã khác. Sau nhiều hoạt động mở rộ
ng sản xuất,
Roche tuyên bốt họ sản xuất tới 400 triệu liều, đủ thuốc để chữa bệnh cúm theo mùa
và cũng đủ cho các chính phủ mua dự phòng [27]. Tuy nhiên, nếu đại dịch xảy ra, sự
khan hiếm có khả năng lại tái diễn.

2.3.2. Tính chất và yêu cấu chất lượng của Oseltamivir và Oseltamivir photphat


Oseltamivir là một hợp chất hữu cơ ở dạng tinh thể không mầu, có danh pháp
hoá học tiếng Anh là ethyl (3R,4R,5S)-5-amino-4-acetamido-3-(pentan-3-
yloxy)cyclohex-1-ene-1-carboxylate, có công thức phân tử là C
16
H
28
N
2
O
4
, KLPT
312.4 g/mol, CAS-No. 196618-13-0.
Oseltamivir photphat là muối 1:1 của Oseltamivir với axit photphoric, cũng ở
dạng tinh thể không mầu, có danh pháp hoá học tiếng Anh là (3R,4R,5S)-4-
acetylamino-5-amino-3- (1-ethylpropoxy)-1-cyclohexene-1-carboxylic acid ethyl ester,

15
phosphate (1:1), và có công thức phân tử là C
16
H
31
N
2
O
8
P, KLPT 410.4 g/mol, CAS-
No. 204255-11-8.
Quá trình tổng hợp Oseltamivir được công khai công bố lần đầu tiên bởi Kim
và cộng sự vào năm 1997 [28]. Theo đó, Oseltamivir thu được sau khi tinh chế qua sắc
ký cột trên pha ngược C
18
rồi đem đông khô có các tính chất sau:
Trạng thái vật lý: Chất rắn mầu trắng
1
H NMR (D
2
O) δ 6.50 (t, 1H, J = 2.1 Hz), 4.30-4.26 (m, 1H), 4.03 (dd, 1H, J =
9.0, 11.7 Hz), 3.58-3.48 (m, 2H), 2.88 (dd, 1H, J = 5.4, 16.8 Hz), 2.53-2.41 (m,
1H), 1.62-1.40 (m, 4H), 0.90 (t, 3H, J ) 7.5 Hz), 0.85 (t, 3H, J ) 7.5 Hz).
Anal. Calcd for C
14
H
24
N
2

O4⋅1.5H
2
O: C, 54.01; H, 8.73; N, 9.00. Found: C,
53.69; H, 8.70; N, 8.71.

Trong bài báo công bố năm 1998 [29], Rohloff và cộng sự cho biết Oseltamivir
photphat có các tính chất như sau:
Trạng thái vật lý: Kết tinh trong hỗn hợp phản ứng (EtOH tuyệt đối và axit
photphoric) cho tinh thể hình kim mầu trắng;
Đnc 203-4 °C;
[α]
D
= -39.9° (c 1, H
2
O);
IR (KBr) 3500, 1719, 1661 cm
-1
;
1
H NMR (500 MHz, D
2
O) δ 6.87 (1 H, s), 4.78 (bs, HOD), 4.34 (1 H, d, J = 8.5
Hz), 4.29-4.25 (2 H, m), 4.07 (1 H, dd, J = 8.5, 11.6 Hz), 3.63-3.54 (2 H, m),
2.97 (1 H, dd, J = 5.5, 17.1 Hz), 2.54 (1 H, m), 2.10 (3 H, s), 1.62-1.55 (3 H, m),
1.53-1.45 (1 H, m), 1.31 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 0.90 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 0.86 (3 H,
t, J = 7.3 Hz);
13
C NMR (125 MHz, D
2
O) δ 178.1, 170.3, 140.8, 130.5, 87.1, 78.0, 65.2, 55.6,

52.0, 31.1, 28.3, 27.9, 25.2, 16.2, 11.4, 11.3; 31P NMR (202 MHz, D2O) ä 0.5
(s, PO4).
FAB MS 313, 243, 225, 208, 166.
FAB HRMS calcd for C
16
H
29
O
4
N
2
[MH
+
] 313.2127, found 313.2126.
Anal. Calcd for C
16
H
31
O
8
N
2
P (410.4): C, 46.83; H, 7.61; N, 6.83; P, 7.55.
Found: C, 46.58; H, 7.86; N, 6.80; P, 7.47.

16

Cuốn The Merck Index (13.Ed. 2001) cho biết Oseltamivir là chất rắn mầu
trắng nhạt, pKa 7,7 (25
o

C), 6,6 (70
o
C), còn Oseltamivir photphat là chất rắn dạng tinh
thể mầu trắng. Ngoài ra không có thông số nào khác [30]. Khác với thông thường, các
hãng sản xuất Oseltamivir photphat như Roche, Cipla, Hetero và Trung Quốc không
thấy công bố kết quả phân tích sản phẩm của mình trên thông tin đại chúng qua
Internet.
Đến nay Oseltamivir photphat còn chưa có trong dược điển. Tháng 9-2007
WHO mới công bố bản dự thảo chuyên đề Oseltamivir photphat cho Dược điển Quốc
tế với các thông số và yêu cầu chất lượng như sau [31]:
Mô tả Chất bộ
t mầu trắng đến hơi xám
Công thức phân tử
C
16
H
28
N
2
O
4
⋅H
3
PO
4
(Cũng là: C
16
H
31
N

2
O
8
P)
Tên hóa học (IUPAC) (3R,4R,5S)-4-acetylamino-5-amino-3- (1-ethylpropoxy)-1-
cyclohexene-1-carboxylic acid, ethyl ester, phosphate (1:1)
Khối lượng phân tử 410.4 [g/mol]
Tính tan Dễ tan trong nước
Bảo quản Cần giữ trong chai, lọ kín

Yêu cầu chất lượng:
 Oseltamivir photphat không được chứa ít hơn 97,5%, và không nhiều hơn 102,0%
C
16
H
28
N
2
O
4
, H
3
PO
4
tính theo lượng chất khô.
 Phổ IR: Trùng với phổ chuẩn
 [α]
D
25
= -30,7 đến -42,6

o

 Kim loại nặng: < 10 µg/g
 Tro sunphat: < 2,0 mg/g
 Nước: < 5 mg/g

2.3.3. Sự ra đời của Oseltamivir
Đại dịch cúmg năm 1918 ( cúm Tây Ban Nha) đã cướp đi ước tính từ 20 đến 40
triệu sinh mạng trên khắp thế giới; tức là nhiều hơn cả cuộc thế chiến thứ nhất trước
đó. Dịch năm 1957 ( Cúm châu Á) và năm 1958 ( cúm Hồng Kông) đỡ thiệt hại hơn,

17
song lại chung vài nét cơ bản với cúm Tây Ban Nha: thủ phạm vẫn là virus gốc gác
vốn ở loài chim, đã có sự tái tổ hợp giữa các virus đã biết của loài người và/ hay là các
virus của loài chim. Chẳng còn nghi ngờ gì nữa: những đợt bùng phát trở lại ấy báo
trước, rồi sẽ xuất hiện những dòng virus cúm mới mà loài người không hề được miễn
dịch để chống trả. Có thể rồi lại có một tr
ận đại dịch lớn. Vấn đề quan trọng là bao giờ
và rồi sẽ xử lý như thế nào.
Tên dịch cúm Năm Tử vong Loại virut cúm
Asiatic (Russian) Flu 1889-90 1 million possibly H2N2
Spanish Flu 1918-20 40 million H1N1
Asian Flu 1957-58 1 to 1.5 million H2N2
Hong Kong Flu 1968-69 0.75 to 1 million H3N2
Avian Flu 2003-2008 245 H5N1

Virus cúm H5N1 của loài chim vốn xuất xứ từ đàn gia cầm ở Hồng Kông năm
1997; tính đến tháng 9-2008 387 người đã nhiễm phải nó và tỷ lệ tử vong là 63% (Việt
Nam là 106 và 49%) [55]. Virus cô lập, gốc gác thuần túy ở loài chim, không phải một
dòng ghép, như thế không thể truyền từ người sang người . Tuy vậy vẫn dấy lên mối lo

là một dạng đột biến của nó rất có thể dẫn đến một đại dị
ch mới. Hàng năm, bất chấp
nỗ lực tạo miễn nhiễm rộng rãi, vẫn có 20.000 – 40.000 người Mỹ chết vì cúm, thực tế
ấy hình như chưa được nhận thức đúng. Vì bệnh dịch ấy kinh tế Mỹ năm nào cũng mất
đến 12 tỷ USD vì phải chi về y tế và mất năng suất lao động
Có một cuộc tranh luận chính trị sôi nổi về sự sẵn sàng của n
ước Mỹ và các
nước khác nữa, để dập tắt một đợt đại dịch có thể xảy ra như kiểu đã từng xảy ra năm
1918. Chống lại bệnh dịch này quả là y học đã có tiến bộ ít nhiều so với thời cách đây
đã một thế kỷ, vì thế nhiều người cho rằng hiện đã có vũ khí thích đáng để dập tắt nó,
miễn là có đủ ngu
ồn tài chính.
Virus cúm các kiểu hình A,B,C đều là virus ARN cả. Căn cứ vào cấu trúc của
cả hai protein ở trên mặt, là haemagglutinin (H) và neuramidase (NA), mà sắp xếp
virus theo kiểu hình A thẻ theo những phân kiểu. Thêm nữa ở virus cúm A còn thấy có
protein M2, là một kênh proton. Ở virus các kiểu hình B và C không thấy có protein
này.
Tạo miễn dịch vốn là cách tiếp cận truyền thống dễ dập dịch cúm. Thế nhưng
hiệu lực bảo vệ của những vacxin ấy lại chỉ có 70 - 90%. Ở ngườ
i khỏe mạnh dưới độ

18
tuổi 65; nếu cao tuổi hơn thì hiệu lực còn xuống nữa. Thêm nữa, hiện tượng trệch
kháng thể do sai sót lúc phiên ARN còn đòi hỏi phải không ngừng cập nhật vacxin.
Bởi tạo miễn dịch vẫn còn là một cách tiếp cận quan trọng, các tác nhân kháng virus
phân tử nhỏ được coi là một vận hội mới để phòng ngừa và điều trị cúm một cách có
hiệu quả.

Chất ức chế cỗ bơm proton M2 từng được biết đã nhiều thập kỷ, thế nhưng việc
dùng đại trà amantadin (3) và rimantadin (4), là hai chất ức chế thương phẩm có hiệu

quả lâm sàng, đã bị phản bác vì xuất hiện hiện tượng kháng thuốc và vì những tác
dụng phụ độc hại. Thêm nữa, khả năng áp dụng chỉ cho cúm A cũng là một hạn chế
nghiêm trọ
ng. Ngược lại, neuramidase là một enzym thiết yếu cho sự phiên bản của
virus trong cả ba lớp NA xúc tác cho các mẩu axit sialic ra khỏi các glycoprotein và
giải phóng virion còn đang nẩy chồi ra khỏi tế bào đã bị nhiễm, ức chế sập bẫy và tự
kết tụ. Enzym là một tetramer gồm bốn tiểu phân đơn nguyên đồng nhất; cấu trúc tinh
thể của nó cũng như cấu trúc của phức hệ của nó với axit sialic đã được gi
ải bằng tia
X. Vị trí hoạt động được bảo tồn ở mức cao qua mọi dòng virut cúm A và B, như thế
gợi ra: NA chính là cái bia cần nhằm để mà phát triển kháng sinh chống cúm phổ rộng.
Dữ liệu cấu trúc đã cho phép thiết kế hợp lý những chất ức chế tiềm năng. Hai trong số
những chất ức chế ấy đã có mặt trên thị trường, cụ thể zanamivir, GSK’s Relenza (6),
tháng bẩy 1999 và oseltamivir phosphat, Gilead’s Tamiflu (
2), trong tháng mười 1999.
Sự ra đời của oseltamivir gắn liền với các nghiên cứu bắt đầu từ cách đây 20
năm của các nhà khoa học Úc (von Itzstein và các cộng sự thuộc Đại học Monash) với
enzym NA là một trong hai glycoprotein được biểu hiện trên bề mặt của virut. Chúng
chia cắt axit sialic nằm ở đầu mút của các glycoprotein, glycolipit và oligosaccharit và
do đó là cần thiết để giải phóng và phát tán các virion mới được sinh ra từ các tế bào bị

19
nhiễm bệnh. Nó cũng trợ giúp cho quá trình vận chuyển virut qua lớp chất nhầy của
đường hô hấp. Von Itzstein và các cộng sự đã nhận thấy NA là một đích phân tử có
nhiều triển vọng để nghiên cứu phát triển thuốc. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu cấu
trúc của NA đồng kết tinh với axit sialic (5) bằng nhiễu xạ Rơn-ghen, các nhà khoa
học đã thiết kế và sau đó tổng hợ
p ra một loạt các hợp chất tương tự của axit sialic có
khả năng ức chế hoạt động của enzym này. Trong số đó chất có ký hiệu GG167 sau
này đã trở thành zanamivir (6) (còn gọi là relenza), thuốc chống cúm đầu tiên có tác

động ức chế hoạt động của NA.
Tuy nhiên Bischofberger (trưởng nhóm nghiên cứu của công ty Gilead, Mỹ) đã
nhìn ra điểm yếu của zanamivir là có tính sinh khả dụng thấp theo đường uống và lại
bị thả
i trừ nhanh qua thận nên chỉ có thể dùng được dưới dạng thuốc phun hoặc hít qua
đường hô hấp. Nhằm tìm ra các chất ức chế NA có hiệu quả qua đường uống, công ty
Gilead (Kim và và các cộng sự) đã thiết kế và tổng hợp ra một loạt các chất tương tự
như axit sialic (5) nhưng có vòng carboxylic cùng với các mạch nhánh ưa dầu thay thế
cho nhóm glyxerin có độ phân cực cao. Kết quả đã tìm ra hoạt chất GS4071 có hoạt
tính cao như Zanamivir. GS4071 thiếu c
ả hai nhóm glycerol và guanidin là các nhóm
tạo ra ái lực cao đối với NA. Bù lại nó phát huy tác dụng dựa trên tương tác ưa dầu
mạnh giữa các mạch nhánh 3-pentyloxy của nó với túi ưa dầu trong miền hoạt động
của NA. Các công trình nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh rằng GS4071 là chất ức
chế mạnh đối với quá trình nhân bản của các virut gây bệnh cúm. Hoạt tính in vitro
của nó tương đương với Zanamivir. Oseltamivir là tiền chất của GS4071. Sử dụng
oseltamivir dướ
i dạng uống tạo ra nồng độ GS4071 cao trên các động vật thử nghiệm
và có tác động trị liệu rất mạnh. Năm 1999 oseltamivir đã được cơ quan quản lý thuốc
của Mỹ (FDA) cho phép sử dụng cho người.

2.3.4. Tổng hợp Oseltamivir từ axit Shikimic
Axit shikimic (7) có công thức phân tử là C
7
H
10
O
5
, danh pháp IUPAC là
(3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexenecarboxylic acid, được tách ra lần đầu tiên

năm 1885 từ quả của một loài hồi có độc tính, gọi là hồi Nhật bản Illicium anisatum.
Từ quả hồi của Việt Nam Illicium verum Hook. f. (họ hồi, Illiciaceae), gần đây axit
shikimic đã được chiết tách và phân lập với hiệu suất 7 % [32].

20
Axít shikimic là nguyên liệu tự nhiên lý tưởng để tổng hợp oseltamivir do phân
tử của nó đã có sẵn các nhóm chức cơ bản cần thiết với các cấu hình không gian phù
hợp, nhất là nó lại có nối đôi nằm đúng ở vị trí C-1. Ngay từ những nghiên cứu mở
đường của mình, Kim và các cộng sự đã xuất phát từ axit shikimic để tổng hợp ra một
loạt các hợp chất tương tự với axit sialic dẫ
n tới sự phát minh ra oseltamivir (sơ đồ 1).
Trong quá trình này nhóm 3-isopentyl ete được kiến thiết bằng phản ứng mở vòng
tritylaziridin của 15 với 3-pentanol và xúc tác axit, cho phép nhanh chóng tạo ra hàng
loạt các hợp chất có cấu trúc tương tự bằng cách thay đổi các tác nhân nucleophil.
Sơ đồ 1. Tổng hợp oseltamivir từ axit shikimic theo Kim và các cộng sự [28]
COOHHO
HO
OH
COOCH
3
RO COOCH
3
MOMO
RO
N
3
COOCH
3
MOMO
COOCH

3
RO
H
2
N
N
3
a
O
c
e
NH
f
COOCH
3
N
3
COOCH
3
O
AcNH
N
3
COOHO
AcNH
NH
2
TrN
a) McGowan,D. A., Berchtold, G. A, J. Org. Chem. 1981, 46:2381; b) MeOCH
2

Cl, DIPEA, CH
2
Cl
2
;
c) NaN3, NH
4
Cl, MeOH/H
2
O; d) MeSO
2
Cl, Et
3
N, CH
2
Cl
2
; e) Ph
3
P, THF then Et
3
N/H2O; f) NaN
3
, NH
4
Cl, DMF;
g) CH
3
OH, HCl; h) TrCl, Et
3

N, CH
2
Cl
2
; i) CH
3
SO
2
Cl, Et
3
N, CH
2
Cl
2
; k) BF3.Et
2
O; 3-pentanol; l) Ac
2
O, DMAP, pyridine;
m) Ph
3
P, THF then Et
3
N/H
2
O; n) KOH, THF, H
2
O.
7
12

15 16
1
13:
R = MOM
14:
R = H
g
8:
R = H
9:
R = MOM
b
10:
R = H
11:
R = Ms
d
h, i
k,l
m, n

Tiếp sau đó Rohloff và các cộng sự (hãng Gilead) đã xây dựng một phương
pháp tổng hợp có hiệu quả và có thể triển khai ở qui mô pilot (sơ đồ 2). Những điểm
đặc biệt của phương pháp này là:
a) Kiến thiết nhóm thế không phân cực 3-isopentyloxy thông qua hợp chất 3,4-
isopentyliden xetan 17, kế tiếp bằng một phản ứng khử hoá mở vòng xetan kiểu mới,
có tính chọn lựa vị trí cao;
b) Áp dụng hoá học azit để m
ở vòng epoxit và tạo ra các nhóm chức amin ở các vị trí
C-4 và C-5 thông qua hợp chất chìa khoá 4,5-aziridin 21. Với phương pháp này các tác

giả cho biết đã đạt được hiệu suất tổng thể là 21% với 10 công đoạn phản ứng.
Sơ đồ 2: Tổng hợp oseltamivir từ axit shikimic theo Rohloff và các cộng sự [29].

21
COOHHO
HO
OH
COOEt
COOEtO
HO
OMs
COOEtO
O
OMs
O
O
COOEtO COOEtO
HN
COOEtO
N
3
HO
N
3
RHN
COORO
AcHN
NH
2
. H

3
PO
4
a, b, c
d
e
f
g
h
k, l
22:
R = H
23:
R = Ac
i
7
17
18
19
20
21
a) EtOH, SOCl
2
; b) 3-pentanone, TsOH; c) MsCl, Et
3
N; d) TMSOTf, BH
3
.Me
2
S; e) KHCO

3,
aq. EtOH;
f) NaN
3
. NH
4
Cl, aq. EtOH; g) Me
3
P; h)NaN
3
, NH
4
Cl, DMF; i) Ac
2
O; k) Ra-Ni, H
2
; l) 85% H
3
PO
4
.
(80%)
(63-75%) (96%)
(97%)
(44%)
(71-75%)
(86%)
1.
H
3

PO
4

Sau khi hãng Gilead nhượng lại bản quyền phát minh cho hãng Roche,
Federspiel cùng các cộng sự ở hãng Roche đã giữ nguyên phương hướng tổng hợp này
và nghiên cứu các phương pháp để nâng qui mô sản xuất và nâng cao hiệu suất tổng
hợp hợp chất chìa khóa epoxit 19. Kết quả đã hoàn thiện được quá trình tổng hợp
epoxit 19 từ axit shikimic qua 6 công đoạn, đạt hiệu suất tổng thể 63-65% [33].
Phương pháp này đã được hãng Roche áp dụng để sản xu
ất thuốc Tamiflu ở qui mô
công nghiệp.
Tuy hóa học azit từ lâu đã được áp dụng trong sản xuất, nó luôn tiềm ẩn những
nguy cơ do các tác nhân và các hợp chất azit trung gian có độc tính và có khả năng
phát nổ. Hãng Roche cũng phải thuê các nhà máy hoá chất chuyên dụng để thực hiện
các công đoạn này trong sản xuất [34]. Hạn chế đó đã thúc đẩy các nhà khoa học tìm
ra các phương pháp tổng hợp oseltamivir không qua con đường azit. Năm 2001, Karpf
và Trussardi (hãng Roche) đã thành công trong việc xây dựng một ph
ương pháp như
thế. Quá trình tổng hợp đi từ epoxit được trình bày trên sơ đồ 3. Phương pháp này sử
dụng một axit Lewis mới và rẻ tiền là MgBr
2
.OEt
2
làm xúc tác để mở vòng oxiran của
19 với allylamin . Tiếp theo là phản ứng deallyl hóa bằng xúc tác Pd/C để tạo ra amino
ancol 25. Việc đưa thêm nhóm amin thứ hai vào phân tử được thực hiện thông qua một
loạt các phản ứng kế tiếp nhau bao gồm một chuỗi phản ứng kiểu domino có cơ chế
bảo vệ bằng các nhóm imino trung gian. Hiệu suất tổng thể từ epoxit 19 đạt 35-38% tỏ
ra ưu việt hơn hiệu su
ất đạt được bằng con đường azit (27-29%).

Sơ đồ 3. Tổng hợp oseltamivir từ epoxit theo Karpf và Trussadi [35].

22
COOEtO
O
COOEtO COOEtO
HO
HN NH
2
HO
COOEtO
H
2
N
HN
COOEtO
AcHN
HN
COORO
AcHN
NH
2
. H
3
PO
4
a, b
c, d
e, f, g, h
i

k, l
(97%)
(77%)
(80%)
(83%)
(76%)
19 24
25 26
27
1.
H
3
PO
4
a) allylamine, MgBr
2
.OEt
2
, t-BuOMe / MeCN 9:1,
55
o
C, 16 h; b) (NH
4
)
2
SO
4
/ H
2
O; c) Pd/C, EtOH,

H
2
NCH
2
CH
2
OH, reflux, 3 h; d) H
2
SO
4
/ H
2
O;
e) PhCHO, t-BuOMe, - H
2
O; f) MsCl, NEt
3
;
g) allylamine, 112
o
C, 15 h; h) HCl / H
2
O; i) Ac
2
O,
AcOH, MsOH, t-BuOMe, 15 h, 20
o
C; k) 10% Pd/C,
EtOH, H
2

NCH
2
CH
2
OH, reflux, 3 h; l) H
3
PO
4
, EtOH.

Năm 2004, Harrington và các cộng sự thuộc hãng Roche lại xây dựng thành
công một phương pháp tổng hợp oseltamivir mới cũng tránh được con đường azit.
Phương pháp này được các tác giả gọi là "phương pháp thế hệ thứ hai" và có quá trình
phản ứng trình bày trên sơ đồ 4.
Phương pháp này sử dụng tert-butylamin cùng với magiê clorua để mở vòng
oxiran của epoxit 19 và sử dụng diallylamin cùng với axit p-toluensulfonic để mở
vòng aziridin của 29. Nhóm amin tự do thứ nhất tại C-4 đượ
c tạo ra bằng cách tách
loại nhóm tert-butyl dưới tác động của axit. Nhóm amin thứ hai được tạo ra do chuyển
dịch của nhóm allyl liên kết với nó sang axit 1,3-dimethylbarbituric dưới tác dụng của
hệ xúc tác đồng pha Pd(0)-phosphin. Hiệu suất tổng thể của cả quá trình đạt 61%.

Sơ đồ 4. Tổng hợp oseltamivir từ epoxit theo Harrington và các cộng sự [36]
COOEtO
O
COOEtO
COOEtO
HO
NHt-Bu
COOEtO

t-BuHN
N(allyl)
2
t-BuN
COOEtO
N
N(allyl)
2
Ac
t-Bu
COOEtO
AcHN
N(allyl)
2
COOEtO
AcHN
NH
2
. H
3
PO
4
e
19 28
29
30
33
1.
H
3

PO
4
31
32
a
b
c
d
fg, h
a) t-BuNH
2,
MgCl
2
, toluene; b) MsCl, Et
3
N, toluene; c) PhSO
3
H, (allyl)
2
NH; d) Ac
2
O, NaOAc; e) HCl / EtOH; f) TFA; g)
NDMBA, Pd(OAc)
2
, PPh
3
; h) H
3
PO
4

/ EtOH.


2.3.5. Tổng hợp oseltamivir từ axit quinic

23
Axit quinic (34) có công thức phân tử là C
7
H
12
O
6
, danh pháp IUPAC là (1S, 3R,
4S, 5R)-1,3,4,5-tetrahydroxy-cyclohexanecarboxylic acid. Cũng như axit shikimic,
axit quinic đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh tổng hợp của các hợp
chất thiên nhiên. Axit quinic được phân lập từ vỏ cây Canh ki na (Cinchona
ledgeriana), cây cà phê và một số loài thực vật khác. Trên thị trường hoá chất, axit
quinic rẻ và sẵn có hơn axit shikimic. Vì thế trong công trình công bố đầu tiên của
mình Kim và các cộng sự đã vạch ra con đường cho phép chuyển hoá axit quinic thành
các dẫn xuất của axit shikimic cần thiết cho các quá trình tổng hợp oseltamivir tiếp
theo. Phản ứng dehydrat hoá có tính ch
ọn lựa vị trí là phản ứng then chốt của hướng đi
này (phản ứng c và d, sơ đồ 5).
Sơ đồ 5: Tổng hợp với axit quinic theo Kim và các cộng sự [28].
HO
HO
OH
OR
O
O

COOH
OH
COOCH
3
OH
HO
HO
OTs
HO
c, d
COOCH
3
COOCH
3
O
e
35:
R = H
36:
R = Ts
b
34 37 8
a
a) Shing, T. K.; Tang, Y. Tetrahedron 1990, 46, 6575; b) TsCl, DMAP, pyridine; c) SO
2
Cl
2
, pyridine; d) p-TsOH, CH
3
OH;

e) DBU, THF.

Hướng đi này đã được tiếp tục bởi Rohloff và các cộng sự để xây dựng nên một
qui trình tổng hợp oseltamivir từ axit quinic ở qui mô pilot với hiệu suất tổng thể là
4,4 % qua 12 bước (hiệu suất trung bình của mỗi bước là 77 %) [29]. Các phản ứng
dẫn đến hợp chất chìa khoá 3,4-isopentyliden xetan 17 được trình bày trên sơ đồ 6.
Sơ đồ 6: Tổng hợp 3,4-isopentyliden xetan từ axit quinic theo Rohloff và các cộng sự
HO
HO
OH
O
O
COOH
OH
OR
O
O
O
O
OR
COOEt
OR
O
O
COOEt
OMs
COOEt
OMs
O
O

17
34
42
38: R = H
39: R = Ms
b
40: R = H
41: R = Ms
d
e
f
a
c
(90%)
(80%)
(42%)
(95%)
a) 2.2-DMP, TsOH; b) MsCl; c) EtOH, EtONa;
d) MsCl; e) SO
2
Cl
2
, pyridine; f) 3-pentanone, HClO
4
.


Các công trình nghiên cứu tiếp theo của Federspiel và các cộng sự (công ty
Roche) đã nâng hiệu suất của toàn bộ quá trình dẫn đến hợp chất chìa khoá epoxyt 19

24
từ 17% lên 35-38%. Các cải tiến chính được thực hiện ở các giai đoạn dehydrat hoá và
khử hoá mở vòng 3,4-isopentyliden xetan.
Sau khi đã quyết định sử dụng axit shikimic làm chất đầu để tổng hợp
oseltamivir, hãng Roche không tiếp tục các nghiên cứu theo hướng này nữa.
Sau khi dịch cúm bùng phát và đe dọa các nước ở khu vực châu Á, các trung
tâm khoa học của Đài Loan, Thái Lan, Trung quốc và Ấn Độ đã khẩn cấp tiến hành tự
tổng hợp oseltamivir từ axit shikimic. H
ọ công bố trên báo chí là đã thành công, nhưng
không cho biết các chi tiết khoa học của các công trình này, nên chúng tôi cũng không
tổng kết được các tiến bộ đã đạt được theo hướng này từ thời điểm đó.

2.3.6. Tổng hợp toàn phần
Lo sợ về nguồn axit shikimic tự nhiên là có hạn, các nhà khoa học của hãng
Roche đã nỗ lực từ rất sớm để tìm các phương pháp tổng hợp mới nhằm đi thẳng t
ới
oseltamivir mà không qua axit shikimic. Các thách thức cơ bản đặt ra trên con đường
này là sự cần thiết phải kiến thiết được 3 trung tâm cacbon có đúng cấu hình không
gian và tạo ra một nối đôi ở đúng vị trí cần thiết. Thuận lợi ở đây là khả năng chủ động
trong việc kiến thiết nhóm 3-isopentyl ete ở C-3 và các chức amin ở C-4 và C-5.
Đến nay Karpf và các cộng sự ở hãng Roche đã xây dựng thành công hai giải
pháp. Giải pháp thứ nhấ
t được các tác giả gọi là "chiến lược Furan Diels-Alder / Cộng
hợp Nitren'' [37]. Chiến lược này bắt đầu bằng phản ứng Diels-Alder giữa furan với
etyl acrylat để tạo ra hợp chất oxabicyclo 43. Công đoạn then chốt của hướng đi này là
phản ứng cộng hợp nitren sử dụng tác nhân diphenylphosphoryl azit (DPPA) (d, sơ đồ
7).
Sơ đồ 7. Tổng hợp oseltamivir theo "chiến lược Furan Diels-Alder/Cộng hợp Nitren''