Sản xuất protein tái tổ hợp có dược tính sinh học (phần II) pot

Sản xuất protein tái tổ
hợp có dược tính
sinh học (phần II)




Ki
ểm tra các điểm mạnh của quy
trình
Các tế bào là các hệ thống phản
ứng sinh học nhỏ sản xuất hiệu quả
nhiều hay ít các protein tái tổ hợp
dựa vào các yếu tố đã biết hay ch
ưa
biết. Sản phẩm quá trình lên men
chứa nhiều loại protein, mặc d
ù quy
trình đã đựơc thiết kế tốt trong giai
đoạn này. Điều này phụ thuộc rất
nhiều vào các bước tinh sạch.
Trong một quy trình hiệu quả, các
chất nền cột có thể gắn nhiều
protein (10-20% nhiều hơn hay ít
hơn số lượng mong đợi). Tốc độ
dòng chảy cột và số lượng mẫu có
khả năng chứa có thể được mất
nhiều trong suốt quá trình chạy cột
và độ sạch của quá trình phân tách.

Các bước kiểm tra cần được thực
hiện để tính toán khoảng thời gian
hiệu quả của cột và sản phẩm được
tinh sạch để xác định các điều kiện
mà protein vẫn có khả năng hoạt
động. Cuối cùng, tính hiệu quả của
quy trình phụ thuộc mạnh vào các
thông số như pH, độ dẫn điện và
tính phân cực. Nhìn chung, một cột
tinh sạch linh động thì tính hiệu
quả của quy trình càng tăng thêm.
Tính toán ở quy mô nhỏ
Một khi tính hiệu quả của quy tr
ình
đã được kiểm tra, quy trình này c
ần
lặp lại từ ba đến năm lần để xác
định các thông số, bắt đầu từ tế b
ào
nuôi cấy đến sản xuất quy mô lớn.
Mục đích là để xác định độ lập lại
và tính hiệu quả của mỗi bước liên
quan đến chất lương và đặc tính
của các chất trung gian và các chất
thuốc ở nồng độ lớn.
Sau khi vận hành thành công ở quy
mô phòng thí nghiệm, quy trình
được nâng cấp từ từ thành quy mô
pilot lớn hơn gấp 10 lần quy mô

phòng thí nghiệm và sau đó là sản
xuất ở quy mô lớn. Tất cả các
thông số của các bước đơn rẽ được
kiểm tra tất cả ngay cả khi quy
trình đã vận hành ở quy mô lớn
thành công, quy trình cần được
kiểm tra ở quy mô nhỏ một lần nữa
đễ tính toán tổ hợp các thông số kỹ
thuật trong một hệ thống đầy đủ.
Lúc này, khi quy trình nhỏ được
thẩm định lại. quá trình làm sạch
virus phải được thực hiện.
Loại bỏ virus
Một thành phần cần thiết của các
nghiên cứu thẩm định quy trình c
ủa
các sản phẩm thu nhận từ tề bào
eukaryotic là hiểu được quy trình
tinh sạch để loại bỏ các các thành
phần virus bất hoạt bị nhiễm. Các
virus nhiễm vào quy trình sinh học
được chia thành loại:

Các virus nội sinh tồn tại nh
ư
một phần của tế bào đư
ợc sử dụng
để biểu hiện sản phẩm protei
n
(retrovirus chu

ột). Các virus
không thuộc loại virus nội sinh l
à
các virus từ các nguồn b
ên ngoài
hiện diện trong các ngân hàng t
ế
bào cao cấp (nh
ư Epstein Barr
virus). Các virus ngoại sinh thư
ờng
nhiễm vào s
ản phẩm thông qua
trình sản xuất cũng như nhiễm t
ừ
nguyên li
ệu thô hay do tạp nhiễm
(parvovirus).

Ngày hôm nay các s
ản phẩm
công ngh
ệ sinh học thu nhận từ các
dòng tế bào b
ắt buộc không có
chứa bất kể thành phần virus n
ào.
Nhưng trong các quy trình s
ản xuất
hiện nay, do thiên nhiên có thể bị

nhi
ễm từ các nguồn virus ngoại
sinh. Do đó, đ
ể chắc chắn có sản
phẩm an toàn, giám định các bư
ớc
làm sạch virus phải trở thành m
ột
phần của quá trình sản xuất.
Loại nhiễm virus
Các bước làm virus phải đư
ợc giám
định trứơc giai đo
ạn I của sản phẩm
và được thực hiện bởi chuyên gia.
Phương pháp chung cho các nhà
sản xuất là sử dùng các dòng tế b
ào
chuột lang (rodent cell lines) để
giám sát các bước tinh sạch virus
để loại bỏ hay bất hoạt các virus
gây ung thư máu ở chuột (murine
leukemia virus), virus này đón
g vai
trò như là một mô hình chuyên biệt
đối với các tiểu phần giống
retrovirus được sản xuất bởi các hệ
thống biểu hiện trong dòng tế bào
chuột và để thêm vào và giám sát
bước tinh sạch parvo virus trong

quá trình sản xuất sản phẩm ở giai
đoạn I.
Sự bất hoạt virus có thể được thực
hiện bằng nhiệt độ, pH, chất tẩy
rửa, phóng xạ và các dung môi sự
loại bỏ virus có thể được thực hiện
bằng phương pháp lọc và chạy sắc
ký.
Trong một nghiên cứu giám sát
virus , đư
ợc thực hiện truớc khi sản
xuất các vật liệu cho giai đoạn III
củ sản phẩm, các nhà xuất sẽ chọn
một quy trình bao gồm từ hai tới
bốn bước kiểm tra bổ sung. Sự lựa
chọn virus phụ thuộc vào dòng tế
bào và nguồn gốc của môi trường
bao gồm vả hai loại virus mô hình
chuyên biệt và không chuyên biệt.
Các dòng virus được lựa chọn để
bất hoạt và loại bỏ nhiều loại virus
trong quá trình sản xuất mà v
ẫn suy
trì hoạt tính và chất lượng sản
phẩm.
Một virus đáng quan tâm là cũng
như virus được xác định cũng như
các chủng loài virus đư
ợc biệt cũng
như nhiễm vào vật liệu trong quá

trình sản xuất. Một mô hình virus
chuyên biệt cần được chính xác
nhất các chủng loại virus (cùng
chủng hay họ), có các đặc tính hoá
học và vật lý tương tự nhau. Cuối
cùng, một mô hình virus chuyên
biệt được sự dụng để đặc tính hoá
khả năng loại bỏ hay bất hoạt virus
tổng số… cho thấy tính hiệu quả
của quy trình tinh sạch.
Quan trọng là, virus trong hạn mục
là sự lựa chọn đầu tiên. Nếu sử
dụng đã biết chính xác là điều
không thể. Các nhà sản xuất chọn
một mô hình virus chuyên bi
ệt nhất
để làm một mô hình virus cần khảo
sát. Để khảo sát “sự sạch của
virus”, các nghiên cứu hỗ trợ để
tính toán sự sạch của virus của một
nhóm virus không chuyên biệt nào
đó. Những virus này được kết hợp
cac mộ hình chuyên biệt và tương
đương để tạo ra một quy trình ki
ểm
tra sự hiện diện của virus từ các bộ
gene khác nhau (DNA và RNA),
kích thước và các đặc tính bề mặt
(virus có vỏ hay không)
Nghiên cứu về sự bổ sung virus

để giám sát
Trong nghiên cứu về sự bổ sung
virus để giám sát, các bước này
nằm trong một quá trình sản xuất
với tính hiệu quả cao nhất để loại
bỏ hay bất hoạt các thành phần
virus là m
ột thách thức khi gặp phải
số lượng virus cao. Số lượng virus
cao cho phép các yếu tố khử virus
lớn hơn và cho phép gặp phải
những khó khăn khi làm sạch virus
trong một quy trình.
Với lý do đó, các văn bản hướng
dẫn cho phép lượng virus có thể bị
nhiễm vào trong vật liệu ban đầu
vào bước sản xuất phải được giám
sát càng nhiều càng tốt. Tuy nhiên
khôn phải thành phần ban đầu nào
quá trình sản xuất cũng được chấp
nhận. Thể tích cho vào phải được
giữ ở mức thấp, bình thường phải
thấp hơn 10%.
Trong khi nghiên cứu lượng cần
được thêm vào, mô hình virus đư
ợc
bổ sung trực tiếp vào các bước
thích hợp ở quy mô nhỏ đã được
tính toán trước. Những nghiên cứu
này cho phép nhà sản xuất tiên

lượng được khả năng loại bỏ toàn
bộ virus của quy trình sản xuất và
xác định quy trình sản xuất nào có
khả năng cung cấp một mức thích
hợp trong quy trình làm sạch virus
để chắc chắn rằng các sản phẩm
thuốc được an toàn.
Yếu tố khử
Cần thiết để biết có bao nhi
êu virus
có trong mẩu không qua chế biến
bởi vì qua trình phải được thiết kế
để có khả năng loại bỏ toàn bộ
virus. Bình thường virus trong mẫu
không qua chế biến được định
lượng bằng kính hiển vi điện tử
truyền qua theo một nồng độ đậm
đặc hay bằng các thực nghiệm cho
nhiễm (bioassays).
Yếu tố khử được xác định theo
log10 theo tỷ lệ giữa tổng số virus
cho vào trước khi làm sạch và tổng
số virus cho vào được đo lường
trong sản phẩm sau khi làm sạch.
Nhìn chung các đòi hỏi về yếu tố
khử được thiết kế chuyên biệt cho
các virus đã biết nhiễm vào quy
trình sản xuất.
Các tiểu phần giống như retrovirus
được sản xuất bởi các hệ thống

biểu hiện protein trong các tế bào
chuột là các mẫu phổ biến. Với
mục tiêu của yếu tố khử chuyên
biệt theo quy trình đã được thiết kế
sẳn, các nhà sản xuất bổ sung các
bước làm sạch virus vào quy trình
và thực hiện các bước có tính giám
sát để theo dõi tính hiệu quả của
quá trình làm sạch virus khi vận
hành một vài hệ thống.
Điều cơ bản của yếu tố khử và tính
hiệu quả, tính hiệu quả được đặt l
ên
hàng đầu. Một sự vận hành có thể
được tính toán theo tính hiệu quả,
không hiệu quả hay hiệu quả tương
đối. Các bước hiệu quả cung cấp
một yếu tố khử của ít nhất 4 yếu tố
và không ảnh hưởng bởi bởi sai số
trong một quy trình nhiều yếu tố.
Các bước không hiệu quả cung cấp
một yếu tố khử của một hay ít hơn
và các bước hiệu qủa ở mức tương
đối rơi vào một trong hai yếu tố có
tính quyết định.
Thiết kế quy trình vẫn còn là một
thách th
ức trong việc phát triển quy
trình ở mức độ nhỏ và các y
ếu tố có

tính phân tích bởi vì quy trình phải
thích hợp với sự sản xuất các
protein có hoạt tính trong một tiêu
chuẩn nghiêm gặt theo các quy
định an toàn dược phẩm.