Tinh sạch PROTEIN (Phần 1) pdf

Tinh sạch PROTEIN (Phần 1)



I- Giới thiệu chung
S
ự tinh sạch của protein rất quan
trọng vì từ protein tinh sạch chúng
ta có thể xác định được trình tự
acid amin, mối liên hệ về tiến hóa
gi
ữa các protein trong những cá thể
khác nhau và khảo sát các chức
năng sinh hóa của các protein đó.
Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa
protein chỉ có thể thực hiện với
những protein tinh sạch và từ
những tinh thể đó chúng ta sẽ biết
được cấu trúc bậc 4 cũng như các
đơn v
ị chức năng của protein thông
qua dữ liệu chiếu xạ tia X.
Vì vậy, quá trình tinh sạch
protein không ngừng được cải tiến
để đạt được độ tinh sạch cao nhất
nhưng nhìn chung một quá trình
tinh sạch protein cũng cần đi qua
các bước căn bản sau:
1. Nhận biết protein mục tiêu
2. Ly trích protein từ tế bào

3. Thu nhận protein mục ti
êu
dựa trên độ hoà tan, kích thư
ớc,
điện tích, và liên kết ái lực
4. Phân tách protein b
ằng điện
di trên gel
5. Xác định trọng lượng và kh
ối
lượng của protein

II. Nhận biết protein mục tiêu
Kết quả của sự tinh sạch là một
m
ẫu protein chỉ chứa đúng một loại
phân tử, ở đây là một loại protein
mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu
protein này chỉ là một phân đoạn
chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có
thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một
cơ quan riêng biệt lấy của thực vật
hay động vật. Để xác định được
protein mục tiêu từ hỗn hợp
protein, nhà sinh hóa cần thực hiện
một thử nghiệm dựa vào đặc tính
của protein đó. Nếu protein mục
tiêu là một enzyme thì thử nghiệm
sẽ được thực hiện dựa trên hoạt
tính của enzyme đó. Cụ thể như v

ới
enzyme lactate dehydrogenase, m
ột
enzyme có vai trò trong việc sản
xuất năng lượng từ glucose cũng
như tổng hợp glucose từ lactate, để
xác định enzyme này thì dựa trên
phản ứng của nó trong tế bào.

Sau đó, dựa vào khả năng hấp
thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng
340nm của Nicotinamide adenine
dinucleotide (NADH), ta có thể đo
được lượng ánh sáng được hấp thụ
ở bước sóng 340nm trong một đơn
vị thời gian để xác định hoạt tính
của enzyme lactate dehydrogenase.
Trên thực tế việc tìm ra một thử
nghiệm hiệu quả thường rất khó,
nhưng nếu có được một cách thử
nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình
tinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhi
ên,
để chắc chắn quá trình tinh sạch
hoạt động tốt, chúng ta còn c
ần một
thông số là lượng protein có trong
hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện
nay có rất nhiều phương pháp phát
hiện nhanh và chính xác nồng độ

protein. Dựa vào 2 thông số thực
nghiệm là hoạt tính enzyme và
nồng độ protein, ta có thể xác định
hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ
lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng
protein có trong mẫu thử nghiệm.
Hoạt tính riêng càng cao thì quá
trình tinh sạch càng hiệu quả hay
nói cách khác, mục tiêu của việc
tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt
tính riêng.

III. Ly trích protein từ tế bào
Khi đã tìm ra thử nghiệm ph
ù
hợp và chọn đư
ợc nguồn protein,
chúng ta cần phân đoạn dịch tế b
ào
thành nhiều phần và xác đ
ịnh xem
phần nào ch
ứa nhiều protein mục
tiêu. Quá trình tìm phân đo
ạn mục
tiêu được phát triển bằng sự m
ày
mò qua từng thí nghiệm. Bư
ớc đầu
tiên là phá vỡ màng tế bào, t

ạo
thành h
ỗn hợp đồng chất. Sau đó
phân đo
ạn hỗn hợp bằng ly tâm,
d
ịch nổi chứa phân tử có trọng
lư
ợng thấp, những phân tử có trọng
lượng cao hơn l
ắng xuống đáy ống
ly tâm. Dịch nổi lại đư
ợc ly tâm lần
nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn v
à
dịch nổi mới. Tiến trình này, đư
ợc
gọi là ly tâm phân đo
ạn, sẽ tạo
đư
ợc nhiều phân đoạn khác nhau
v
ới tỉ trọng giảm dần, mỗi phân
đoạn này chứa hàng trăm phân t
ử
protein khác nhau, sẽ đư
ợc tinh
sạch sau khi đã qua th
ử nghiệm
hoạt tính. Thông thường, một

phân
đoạn có hoạt tính cao sẽ là ngu
ồn
v
ật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch
hiệu quả.